Summary
6-羟基多巴胺（6-OHDA）模型已经使用了几十年，以推进对帕金森病的理解。在该协议中，我们展示了如何通过在内侧前脑束中注射6-OHDA来执行大鼠的单侧黑质纹状体病变，评估运动缺陷并使用步进测试预测病变。
Abstract
帕金森病 （PD） 的运动症状 - 运动迟缓、运动障碍和休息时震颤 - 是黑质 （SNc） 中多巴胺能神经元神经变性和多巴胺能纹状体缺陷的结果。动物模型已被广泛用于在实验室中模拟人类病理学。啮齿动物是PD最常用的动物模型，因为它们易于处理和维护。此外，PD的解剖学和分子，细胞和药理学机制在啮齿动物和人类中是相似的。将神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）输注到大鼠的内侧前脑束（MFB）中再现多巴胺能神经元的严重破坏并模拟PD症状。该协议演示了如何在PD的大鼠模型中对MFB中6-OHDA进行单侧显微注射，并通过步进测试显示了6-OHDA诱导的运动缺陷和预测的多巴胺能病变。6-OHDA导致对侧前肢进行的步数显着受损。
Introduction
PD 的主要神经病理学特征是黑质 （SNc） 中多巴胺能神经元的慢性进行性神经变性以及存在含有α-突触核蛋白的路易体1。当 SNc 多巴胺能神经元通过纹状体通路将其轴突投射到纹状体中时，SNc 中神经元的神经变性导致纹状体中多巴胺能缺陷2。纹状体中多巴胺的缺失导致直接和间接运动控制途径的活动失衡，这是PD的主要运动症状的原因：运动障碍（运动缓慢），运动迟缓（开始运动困难），肌肉僵硬和休息时的震颤3，4，5。
由于参与PD发作的分子和生理机制仍未完全了解，目前可用的主要治疗方法旨在通过药物治疗，深部脑刺激6，7，遗传疗法8和细胞移植来缓解运动症状9。因此，临床前研究对于阐明PD发病的机制以及发现早期诊断的新方法和新疗法以防止或阻止受PD10影响的神经元变性至关重要。
动物模型已被广泛用于在实验室中模拟人类病理学，为医学和科学的进步做出了贡献11，12，13，14。然而，必须强调的是，动物模型的正确选择是研究成功的基础。因此，动物模型必须在三个主要方面进行验证：i）面部有效性，其中动物模型必须具有人类病理学的特征;ii）建设性有效性，其中动物模型必须具有坚实的理论基础;iii）预测有效性，其中动物模型必须以与临床治疗类似的方式对治疗做出反应。
目前，几种动物被用作PD的动物模型。主要群体包括哺乳动物，如啮齿动物，灵长类动物，迷你猪，狗和猫，以及其他群体，如果蝇和斑马鱼。啮齿动物是PD最经典的动物模型，由于其易于处理和维护而使用最多。此外，PD的解剖学和分子，细胞和药理学机制在啮齿动物和人类中是相似的15。
Kin及其同事在2019年发表的一篇综述分析了2000年代用于PD的主要动物模型方法，发现最常用的动物模型涉及神经毒素，如6-羟基多巴胺（6-OHDA）和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）。这两种神经毒素都会导致黑纹状体通路中多巴胺能神经元的线粒体失调，导致细胞死亡16。另一种广泛使用的模型涉及通过参与PD发作的特定基因的突变进行遗传操作，从而导致线粒体失调17。神经毒素模型通常用于评估和比较治疗方法，而遗传模型用于研究预防性疗法和特发性PD15的发展。
神经毒素MPTP在20世纪80年代中期被发现会导致帕金森综合征，此前有七名患者使用该物质并表现出严重的PD症状。除了症状之外，患者对L-DOPA的治疗也有反应，这使得研究人员将分子直接与PD联系起来。该病例于1986年发表后，一些研究人员开始在临床前PD研究中使用MPTP18。研究人员发现，作为一种亲脂性分子，MPTP可以穿过血脑屏障（BBB）并转化为MPP + 19。这种有毒物质积聚在神经元内，对线粒体呼吸链的复合物1造成损害，导致多巴胺能神经元死亡20。
6-OHDA神经毒素模型于196821年首次用于诱导黑纹状体通路单胺神经元的变性。6-OHDA模型通常用于引起黑纹状体通路中的神经变性，因为它是一种多巴胺类似物，对含儿茶酚胺的细胞有毒。6-OHDA进入大脑后，它可能被多巴胺能神经元中的多巴胺转运蛋白（DAT）吸收，导致黑纹状体通路变性22。由于6-OHDA不穿透BBB，因此必须直接通过脑内立体定向注射给药23。去甲肾上腺素再摄取抑制剂通常与 6-OHDA 显微注射相结合，以保留去甲肾上腺素能纤维，并提供更具选择性的多巴胺能神经元变性24。
DAT吸收6-OHDA后，它会积聚在神经元的细胞质基质中，产生活性氧（ROS）并导致细胞死亡15。经常使用6-OHDA的三种不同病变模型：i）SNc25，26的病变;ii）纹状体病变27，28;iii）MFB29，30的病变。纹状体引起的病变导致SNpc中多巴胺能神经元的缓慢和逆行变性。相反，在SNpc和MFB中引起的病变导致神经元的快速和完全变性，导致更晚期的帕金森症状31。
单侧或双侧注射 6-OHDA 可导致多巴胺能神经元的神经变性。6-OHDA并不总是对神经元造成严重损害;有时，注射会导致部分损坏，这也用于模拟PD32的早期阶段。单侧注射更常用，因为该模型能够评估动物的运动缺陷，并通过安非他明/阿扑吗啡诱导的旋转和步进测试等测试预测细胞损失29。双侧注射最常用于评估空间记忆和识别33。
苯丙胺/阿扑吗啡诱导的旋转试验是一种行为试验，通常用于预测黑纹状体通路中的细胞损失。它被定义为重复施用多巴胺激动剂导致6-OHDA病变动物旋转行为加剧的过程34。旋转行为包括量化单侧病变啮齿动物中苯丙胺诱导的同侧旋转或阿扑吗啡诱导的对侧旋转。药物诱导的旋转行为受到批评，因为旋转与人类的PD症状不对应，并且可能受到耐受性，致敏和“启动”等变量的影响35。
启动是这些行为测试中最关键的因素之一。据报道，一些病例中，单剂量的左旋多巴导致旋转行为失败36。此外，与苯丙胺诱导试验和阿扑吗啡诱导试验联合应用并行使用相关的另一个关键因素是，由于作用机制不同，它们测量不同的终点，反映了不同信号传导机制和途径的失活。此外，苯丙胺诱导的试验更准确地测量高于50-60%的黑质纹状体病变，而阿扑吗啡诱导的试验对于80%以上的病变更准确37。
步进测试已成为一种行为测试，表明与多巴胺能神经元变性和治疗效果相关的缺陷。它能够分析由多巴胺能神经元中的6-OHDA病变引起的运动障碍，而无需药物诱导的程序。此外，自1995年以来，该测试已经得到很好的建立和广泛使用，当时Olsson等人首次对其进行了描述。1999年，Chang等人还分析 并比较了大鼠在步进试验中的表现与6-OHDA引起的变性水平，发现在步进试验中表现较差的动物也具有更显着的多巴胺能神经元变性。
步进试验是预测6-OHDA病变大鼠严重多巴胺能黑质纹状体损伤的极好方法。有证据表明，当 SNc 中的多巴胺能损失程度为 >90%39 时，在步进试验期间，6-OHDA 输注的对侧前肢会出现运动功能障碍。本文介绍了用于进行立体定向手术的方案，方法和材料，用于将6-OHDA单侧输注到大鼠的MFB中，以及如何通过步进测试预测由毒素引起的多巴胺能病变。
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Protocol
所有涉及动物的程序都遵循国家动物实验控制委员会（CONCEA）和阿鲁卡法（第11.794/2008号法律）的道德原则，并得到当地伦理委员会（CEUA-FFCLRP/USP（18.5.35.59.5）的批准。
1. 药物制备
- 用氯胺酮/西拉嗪麻醉
注意：氯胺酮的剂量为70mg / kg，木拉嗪的剂量为10mg / kg。- 要使用氯胺酮100mg / mL溶液和木拉嗪20mg / mL溶液制备1 mL麻醉剂，将0.35mL氯胺酮溶液，0.25mL木肼嗪溶液和0.4mL 0.9%无菌盐水溶液混合。以2 mL / kg的最终体积施用麻醉液。
注意：氯胺酮和木肼可以产生镇静60-80分钟。如果动物仍然有反射（例如，后腿俯仰和/或眨眼反射），则额外给予个体剂量的10%。
- 要使用氯胺酮100mg / mL溶液和木拉嗪20mg / mL溶液制备1 mL麻醉剂，将0.35mL氯胺酮溶液，0.25mL木肼嗪溶液和0.4mL 0.9%无菌盐水溶液混合。以2 mL / kg的最终体积施用麻醉液。
- 丙咪嗪
注意：使用的丙咪嗪的个体剂量为20mg / kg。- 要制备1mL丙咪嗪20mg / mL溶液，将20mg丙咪嗪和1mL0.9%无菌盐水溶液混合。以1 mL / kg的最终体积施用丙咪嗪溶液。
- 美洛昔康
注意：使用美洛昔康的个体剂量为1mg / kg。- 要制备1 mL美洛昔康1 mg / mL溶液，将0.05 mL美洛昔康2%和0.95mL0.9%无菌盐水溶液混合。以1 mL / kg的最终体积施用美洛昔康溶液，每天一次，持续两天。
- 抗坏血酸0.1%
- 要制备1 mL 0.1%抗坏血酸，将1mg抗坏血酸和1mL0.9%无菌盐水溶液混合。
- 6-羟基多巴胺
注意：6-OHDA是一种神经毒素，用于选择性地破坏大脑中的多巴胺能和去甲肾上腺素能神经元。避免直接接触皮肤和眼睛、鼻子和嘴巴的粘膜。处理 6-OHDA 时，请戴上双丁腈手套、实验室外套、一次性防护服、护目镜、外科口罩或面罩。毒素的总输注体积为4μL/动物，个体量为10μg6-OHDA/动物。- 为了以2.5mg / mL的终浓度制备1mL 6-OHDA，混合2.5mg 6-OHDA和1mL含有0.1%抗坏血酸的0.9%盐水溶液（如上所述）。
注意：6-OHDA对光敏感，暴露在强光下时降解速度更快。它必须妥善处理并储存在避光的环境中。如果溶液的颜色为红色，请将其丢弃。
- 为了以2.5mg / mL的终浓度制备1mL 6-OHDA，混合2.5mg 6-OHDA和1mL含有0.1%抗坏血酸的0.9%盐水溶液（如上所述）。
- 盐酸利多卡因（2%）
- 准备2%利多卡因溶液，用于动物局部施用。
注意：可以施加的最大剂量为7mg / kg。
- 准备2%利多卡因溶液，用于动物局部施用。
- 聚抗生素悬浮液
注意：含有链霉素和青霉素的聚抗生素悬浮液（见 材料表）必须在施用时用整个体积的稀释剂制备，其安瓿与粉末一起伴随小瓶。- 卸下橡胶塞上的金属制动盘。用酒精对橡胶塞进行消毒。
- 使用针头为23 G的注射器，将稀释剂注入小瓶中。取出针头并用力摇晃小瓶，直到悬浮液完全均质化。将少量空气注入小瓶中，并抽出所需体积的悬浮液。
- 进行深度肌内注射，在注射药物之前拉动柱塞，以确保没有到达血管。
注：最终应用的悬浮液体积为0.5 mL/kg。
2. 准备材料
注意：处理化学品时，请始终遵循材料安全数据表中提供的说明。
- 立体定位装置
- 将立体定位设备放在稳定干净的工作台上，并有适当的照明进行手术。用70%乙醇消毒设备。
- 检查设备的耳朵和门牙条是否正确对齐。放置一条保暖毯，在手术期间放置动物，以便在手术过程中保持温暖。用精确的直肠探头监测动物的温度。
注意：热毯应处于37.5°C，以便动物保持37°C的身体温度。
- 微量输液系统
- 将汉密尔顿注射器（50μL或根据需要）填充（70-80%），连接到医用级聚乙烯微管和针头上，并用双蒸馏水（ddH 2 O）检查是否泄漏。
- 将空气拉过系统，使单个气泡将注射器中的ddH2O与微管中的6-OHDA溶液分开。
注意：该程序避免了用6-OHDA污染汉密尔顿注射器，并允许在同一实验日使用几只大鼠。 - 将 Hamilton 注射器放在输液泵上，使其牢固地连接，注射器的柱塞平行于将要移动以推动它的框架。将输液泵设置为0.5μL / min的速度，以便4μL6-OHDA的总施用持续8分钟。通过确认没有泄漏并且根据先前设定的时间和体积进行输液来测试输液系统。
- 将附着在微管上的输液针连接到立体定位臂末端的装置上，并检查针头是否与表面成180°角。确保针是直的，而不是弯曲的。
注意：仔细检查所有描述的程序，因为如果输液系统中的任何项目不能正常工作，可能会危及手术的成功。
- 缝合
- 手术后使用无菌尼龙不可吸收缝合线和3/8圆针缝合切口。
- 术后恢复站点
- 放置一个干净且无菌的外壳盒，可以监测动物，直到完全恢复（对触摸和操作做出反应）。在盒子里放一个热毯进行体温调节。
注意：由于体温调节很重要，如有必要，请包括补充热源以保持体温。
- 放置一个干净且无菌的外壳盒，可以监测动物，直到完全恢复（对触摸和操作做出反应）。在盒子里放一个热毯进行体温调节。
3. 外科手术
注意：在该协议中，成年雄性Sprague-Dawley大鼠（200-250g）被保持在温度（22±2°C），空气交换（15-20次交换/小时）和明暗循环（12小时/ 12小时）的受控条件下，与3或4只动物分组，可自由获得食物和水。
- 称量动物体重，以监测手术后几天内的体重变化。计算要施用的药物的剂量。
- 术前30分钟（麻醉前约10-15分钟）腹膜内注射丙咪嗪，使用27G针头和1mL注射器。
注意：丙咪嗪会阻断去甲肾上腺素转运蛋白（NAT）并阻止去甲肾上腺素能神经元对6-OHDA的摄取，使病变对多巴胺能神经元更具选择性40。 - 在给予丙咪嗪10-15分钟后，使用27G针头和1mL注射器进行腹膜内氯胺酮/木拉嗪麻醉。等到动物完全麻醉。验证当动物对后腿捏合没有反应并且没有表现出眨眼反射时，动物处于深度麻醉状态。
- 剃掉头部区域的大鼠皮毛，在那里会发生切口。
- 将大鼠置于立体定位装置中。
- 将头部放在门牙杆上，并将门槛固定在耳际线以下3.3毫米处。
- 将耳杆定位，一次一侧。放置门牙杆和耳杆，使颅骨的顶部笔直且平行于表面。
- 调整鼻夹并测试头部是否牢固且不会向任何一侧移动。
- 将无菌眼药膏涂抹在大鼠眼睛上，以防止角膜变干。
- 将聚维酮碘涂抹在要切口的区域，以对部位进行消毒。
- 局部利多卡因用于切口区域的镇痛;不要超过7毫克/公斤。
- 使用27 G针头和1mL注射器皮下给药美洛昔康。
注意：美洛昔康是一种非甾体抗炎镇痛药，可帮助动物在手术后恢复。 - 使用23 G针头和1mL注射器肌肉注射多抗生素悬浮液。
注意：多抗生素悬浮液作为预防性治疗给药，以避免术后恢复中可能的细菌感染。 - 通过用镊子捏住后爪来检查动物是否处于深度麻醉状态，方法是检查眨眼反射或后肢反射。
- 用手术刀在发生显微注射的区域做一个~1.5厘米的切口。
注意：无菌技术从此时开始应用，直到伤口闭合。 - 用棉签和棉签清洁颅骨区域，直到可以看到Bregma和Lambda。用消毒的细笔标记Bregma和Lambda。
- 检查Bregma和Lambda的背腹（DV）坐标是否相似。如果它们不同，则重新调整立体定位装置中的大鼠，因为大鼠的头部位置不正确。
- 记下Bregma的前后（AP）和中外侧（ML）坐标。
- 移动到右侧 MFB 的 AP 和 ML 坐标，依次为 41：AP：-4.3 毫米，ML：距 Bregma 1.6 毫米。
- 用无菌的细笔标记钻孔区域。
- 用消毒的钻头，慢慢刺穿动物的头骨，注意不要伤害硬脑膜。
- 将显微注射针放在硬脑膜上，并记下DV坐标。取一根细针，轻轻地将硬脑膜破裂。将针头插入MFB的DV坐标（8.3mm腹侧），在那里将进行显微注射。
- 操作显微注射泵，将 6-OHDA 溶液释放到 MFB 中。显微注射完成后，检查汉密尔顿注射器，看看是否注射了4μL的6-OHDA。
注意：显微注射应持续8分钟。 - 施用6-OHDA后，等待10分钟，然后取出针头，以避免药物回流。从动物的大脑中慢慢取出显微注射针头。
- 再次用聚维酮碘消毒切口区域。
- 用约3-4个手术结缝合切口区域。
注意：结不应太强或太松。 - 将大鼠从立体定位装置中取出，并将其放在干净的盒子中，以便在热毯上进行恢复，直到动物从麻醉中完全恢复。每15分钟观察一次动物，直到它从麻醉中完全清醒。
4. 术后程序
- 在手术后四天内监测动物的体重。术后每天一次皮下注射美洛昔康，持续两天，调整每天体重的剂量。
注意：所有动物应在手术后第三天评估是否需要镇痛药。 - 每天检查切口至少四天，以确保它们没有被感染。寻找热，肿胀，疼痛，分泌物和发红，直到切口愈合。
- 通过监测动物的体重来检查食欲和水的消耗。给予湿饲料，以鼓励动物进食。手术后至少四天每天观察一般身体状况，态度和活动能力。手术后7-10天取下缝线。
注意：如果达到道德程序中定义的终点，则应对动物实施安乐死。
5. 步进测试
- 训练
注意：动物应在测试前训练三天。根据下面描述的协议，训练应每天进行两次，一次在早上，一次在下午，或者两次训练之间间隔至少2小时。使用计时器跟踪时间。- 第 1 天
- 在第一次会议中，通过戴上手套处理大鼠约1-2分钟，让大鼠熟悉处理者/实验者。
- 在第二个会话中，交替将大鼠保持20秒并将其放在协议表上20秒。重复此训练步骤3分钟，以使大鼠熟悉步进测试的实验设置。
- 第 2 天
- 在第一个会话中，将大鼠的两个前爪放在协议表上，用一只手握住它的后爪和背部。将大鼠头朝下倾斜，角度为45°，与实验表的平坦表面成45°。在桌子上从头到尾水平移动，让老鼠用两只爪子踩在桌子上（在4秒内覆盖90厘米）。用手套将老鼠抱10秒，让它休息;重复此模式3分钟。
- 在第二个会话中，将大鼠的一个前爪放在协议表上，用一只手握住另一个前爪，用另一只手握住大鼠的背部和后爪（见步骤5.1.2.1）。在4秒内水平移动桌子上的头到尾，让老鼠用它自由的爪子踩踏。将老鼠戴上手套10秒，让它休息，然后用另一个前爪重复，然后是休息时间。重复此模式，在两个前爪之间交替，休息3分钟。
- 重复训练步骤3次，每次1分钟。
- 第 3 天
- 在第一个会话中，按照步骤 5.1.2.2 中描述的过程进行一次前爪。用另一个前爪重复上述步骤，然后是休息时间。重复此模式，在两个前爪之间交替，休息3分钟。
- 在第二个会话中，按照步骤 5.1.2.2 中描述的过程进行操作。
- 第 1 天
- 测试
注意：踏步试验在手术前，立体定位手术后2周和4周进行，以评估对侧前肢的运动障碍和6-OHDA可能引起的损伤。- 将大鼠保持在与表面45°的角度，使其后肢固定，并且如上所述，在训练的第3天，只允许其中一个前肢在平台上休息。
- 在4秒内将老鼠向前拖动90厘米的距离，右爪或左爪放在表面上。
- 做笔记并量化每个爪子在每个方向上采取的正手调整步骤的数量。
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Representative Results
多巴胺能病变评估
步进试验能够评估病变前肢对侧的运动障碍，并选择可能由6-OHDA输注诱导的黑纹状体通路病变的动物（图1）。对侧前肢步进试验术前和术后2周和4周的表现的比较揭示了时间（术前，术后2 周和4周）和治疗（假手术和6-OHDA病变）之间的相互作用（F2，74 = 93.63;p <0.0001;双向重复测量方差分析）。Bonferroni的 事后 测试显示，与手术后第二周和第四周接受假手术的动物相比，在右侧MFB中接受6-OHDA的动物与病变对侧的步骤数显着减少（p <0.0001）（图1）。结果与先前研究的结果一致35。
重要的是要注意，当多巴胺能病变不完整时，步进测试的结果将不会达到本研究中提出的结果的成功程度。先前发表的一项研究在按照本研究中使用的相同方案进行6-OHDA显微注射手术后，对具有部分多巴胺能病变的动物进行酪氨酸羟化酶（TH）的步进试验和免疫组织化学。他们在步进试验（4-8步）中发现部分缺陷是~60%神经元部分多巴胺能病变的结果39。
图 1：单侧将 6-OHDA 或载体输注到右侧 MFB 的术前和术后对侧步进试验的评估。 数据显示，在手术后第二周和第四周，接受6-OHDA的动物前肢对侧的步数显着减少（****p<0.0001与假手术后;双向重复测量方差分析，Bonferroni 事后）。以均值表示的数据±均值的标准误差。载体为0.9%含0.1%抗坏血酸的盐水溶液。结果基于假组的14只动物和6-OHDA组中的25只动物。缩写：P = 术前。2 = 手术后两周。4 = 手术后四周;6-羟基多巴胺 = 6-羟基多巴胺;MFB = 内侧前脑束。 请点击此处查看此图的放大版本。
同侧前肢步进试验术前和术后2周和4周的表现比较没有发现时间（术前，术后2周和4周）和治疗（假手术和6-OHDA病变）之间的任何相互作用（F2，74 = 0.4492;p = 0.6399;双向重复测量方差分析）。Bonferroni的 事后 测试显示，与假动物相比，在右侧MFB中接受6-OHDA的动物与病变同侧的步骤数没有任何显着差异（图2）。
图2：单侧将6-OHDA或载体输注到右侧MFB的术前和术后同侧步进试验的评估。 数据显示，接受6-OHDA的动物在手术后第二周和第四周没有显着减少前肢同侧到病变的前肢的步骤数（p >0.05 vs. 假手术后;双向重复测量方差分析，Bonferroni 事后）。以均值表示的数据±均值的标准误差。载体为0.9%含0.1%抗坏血酸的盐水溶液。结果基于假组的14只动物和6-OHDA组中的25只动物。缩写：P = 术前。2 = 手术后两周。4 = 手术后四周;6-羟基多巴胺 = 6-羟基多巴胺;MFB = 内侧前脑束。 请点击此处查看此图的放大版本。
与先前对6-OHDA病变动物的研究42一致，比较两个半球纹状体的TH的组织学分析（图3）可以可靠地评估纹状体中的DA缺陷。因此，该行为方案可以与免疫组织化学方法结合使用，用于涉及PD实验模型的研究中。
图3：PD的6-OHDA实验模型中TH标记的代表性图像，包括前纹状体和黑质致密性。 全景图像显示了病变的延伸，插图缩放描绘了免疫染色的神经支配e细胞体。（A）纹状动脉冠状动脉部分的图像显示右半球6-OHDA引起的部分损伤。（B）同一动物的黑质和腹侧被盖区冠状切片的图像也显示病变延伸。（C）纹状动脉冠状动脉部分的图像，显示右半球6-OHDA完全诱导的损伤。（D）同一动物的黑质和腹侧被盖区冠状切片的图像也显示病变延伸。比例尺 = 全景视图下为 1.3 mm，内陷变焦时为 65 μm。缩写： 6-OHDA = 6-羟基多巴胺;TH = 酪氨酸羟化酶;PD = 帕金森病;NL = 非病变;L = 病变。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
本文描述了一种在MFB中对6-OHDA进行单侧微输注手术的方案，能够在黑纹状体通路的神经元中引起强大的病变并在动物中产生运动障碍。还描述了用于执行步进测试的方案，这是一种易于应用且无创的测试，可用于证明病变的成功并评估前肢运动障碍。正如代表性结果所示，接受6-OHDA的动物显示出与损伤对侧调整步骤的次数减少，这意味着6-OHDA受伤的动物在输液手术后2周内表现出强烈的运动障碍。运动障碍 - 几种治疗疾病的重点 - 是PD的主要运动症状之一。动物模型中运动障碍的发展对于PD的临床前研究具有重要意义。此外，这些结果类似于Chang等人报告的结果37，他们证实，通过免疫组织化学，步骤数较少的动物具有较高百分比的多巴胺能神经元死亡。因此，表现出较少次数对侧调整步骤的动物更容易出现多巴胺能损伤。
手术和病变成功的评估也可以通过其他行为测试来证实，例如苯丙胺/阿扑吗啡诱导的旋转43，升高的身体摆动测试（EBST），走廊测试，圆柱体测试，组织标记技术，如TH免疫组织化学，甚至通过HPLC42定量纹状体中的多巴胺。其他方法在注射剂量6-OHDA和术后时间间隔方面有所不同，以进行行为评估。最近的一篇综述43 总结了使用这种方法的最新文章，以及它们之间的剂量，行为测试和术后间隔的差异。由6-OHDA诱导的PD模型不模拟与疾病相关的所有病理过程，例如路易体的积累，而是模拟纹状体 - 黑道的多巴胺能神经元的死亡。这使得研究治疗该疾病症状的新疗法成为可能，这可能导致受这种疾病影响的患者的生活质量的改善。
尽管是使用最广泛的模型，但6-OHDA模型与当前所有PD模型一样具有其局限性。该模型的缺点是不能完全代表疾病病理学中涉及的分子机制，例如α-突触核蛋白的积累和路易体的形成。该模型模拟了黑纹状体通路的多巴胺能神经元的死亡，对应于疾病的晚期阶段，仅导致运动症状的发作。这使得它不适合研究其自然发展15，32。本文中描述的6-OHDA模型通常具有低死亡率的特点。术后恢复对于预防由于侵入性手术和神经退行性病变的结合而导致的高死亡率至关重要44。通过在术后恢复期间通过营养补充，补液和外部温度控制进行额外护理来降低死亡率45。这些措施的结合已被证明可以大大降低甚至消除死亡率30，46。死亡的常见原因是将针头插入大脑中的错误坐标处。在这个微妙的外科手术过程中仔细检查坐标至关重要。这将避免针头对其他大脑结构（例如下丘脑）的损害，这可能会损害动物的进食和饮水行为，导致营养不良和脱水47。
最后，必须强调的是，尽管氯胺酮-木肼嗪麻醉方案已建立并用于啮齿动物实验48，但一些证据表明，这些麻醉剂的组合可能不足以长时间的手术。此外，氯胺酮-木绰嗪敏感性可能因小鼠和大鼠的不同菌株而异49，50。另一种方法可能是通过吸入异氟醚诱导麻醉。一项研究表明，异氟醚诱导的麻醉比氯胺酮-西拉嗪的矫正反射丧失更快。此外，使用氯胺酮 - 西拉嗪麻醉的大鼠中有60%在手术过程中表现出连续的脚趾捏反射，即使补充剂量也是如此。相比之下，用异氟醚麻醉的动物表现出孤立的尾部捏反射病例，这些反射在体积调整后消失51。
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Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP，拨款2017/00003-0）的支持。我们感谢提高高等教育人员的协调（CAPES）。我们感谢Anthony R. West博士，Heinz Steiner博士和Kuei Y. Tseng博士的支持和指导。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-OHDA | Sigma Aldrich | H4381 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1 |
| 70% Alcohol | |||
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | 795437 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB |
| Cotton | |||
| Drill or tap | |||
| Gauze | |||
| Hamilton syringe 50 uL | Hamilton | 80539 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539 |
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| Xylazine (Anasedan) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN |
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