Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

يتم زيادة امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية Drosophila المتضررة من بروتين تار ملزمة الحمض النووي (TDP-43) اعتلال البروتين، كما هو مبين من قبل FRET القائم، ومستشعر الجلوكوز المشفرة وراثيا.

Abstract

التصلب الجانبي الضموري هو اضطراب تنكسي عصبي يسبب ضعف العضلات التدريجي والموت في غضون 2-5 سنوات بعد التشخيص. المظاهر السريرية تشمل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض; ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. باستخدام نموذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43 الذي يلخص العديد من ميزات ALS بما في ذلك إدراج السيتوبلازمي ، والخلل الحركي ، وانخفاض العمر ، حددنا مؤخرا عجزا استقلابيا واسع النطاق. ومن بين هذه العوامل، تبين أن التحليل الجليكولي منظم وأن تجارب التفاعل الجيني قدمت أدلة على وجود آلية تعويضية لاعصاب. في الواقع ، على الرغم من تنظيم فوسبهوفروكتوكيناز ، وهو معدل يحد من الإنزيم في انحلال الجليكوليسيس ، فقد ثبت أن زيادة في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعب الغذائي والجيني تخفف من الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43. لمزيد من التحقيق في تأثير على اعتلال البروتين TDP-43 على تدفق الجليكوليك في الخلايا العصبية الحركية، تم استخدام جهاز استشعار مشفر وراثيا، FRET المستندة إلى، FLII12Pglu-700μδ6. يتكون هذا المستشعر من مجال استشعار الجلوكوز البكتيري والبروتينات الفلورية السماوي والأصفر كزوج FRET. عند ربط الجلوكوز ، يخضع المستشعر لتغيير تشكيلي يسمح بحدوث FRET. باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، تم العثور على امتصاص الجلوكوز أن تكون زيادة كبيرة في الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43G298S،وهو البديل المسببة ALS. هنا، نعرض كيفية قياس امتصاص الجلوكوز، ex vivo، في مستحضرات الحبل العصبي البطني اليرقات التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 في سياق اعتلال البروتين TDP-43. يمكن استخدام هذا النهج لقياس امتصاص الجلوكوز وتقييم التدفق الجليكوليكي في أنواع مختلفة من الخلايا أو في سياق الطفرات المختلفة التي تسبب المرض والاضطرابات العصبية التنكسية ذات الصلة.

Introduction

التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي غير قابل للشفاء حاليا. ALS يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية مما يؤدي إلى فقدان التنسيق الحركي, الشلل الذي لا رجعة فيه, فشل الجهاز التنفسي, والموت في نهاية المطاف في غضون 2-5 سنوات من التشخيص1. ويرتبط ALS مع العيوب الأيضية مثل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض (استعرضت في2); ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه التعديلات في التمثيل الغذائي إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. القاسم المشترك في ALS والأمراض العصبية التنكسية ذات الصلة هو TDP-43 ، وهو بروتين ملزم حمض النوى تشارك في عدة خطوات من تجهيز الحمض النووي الريبي3،4،5. على الرغم من أن الطفرات في TDP-43 تؤثر فقط على 3٪ -5٪ من المرضى، تم العثور على بروتين TDP-43 البري من النوع داخل المجاميع السيتوبلازمية في >97٪ من حالات ALS (تمت مراجعتها في6). وقد تم تصميم هذا المرض في Drosophila عن طريق الإفراط في التعبير عن النمط البري البشري أو TDP-43 المتحولة (G298S) في الخلايا العصبية الحركية ، والتي تلخص جوانب متعددة من ALS ، بما في ذلك التضمين السيتوبلازمي ، والخلل الحركي وانخفاض عمر7،8. باستخدام هذه النماذج, أفيد مؤخرا أن اعتلال البروتين TDP-43 يسبب زيادة كبيرة في مستويات بيروفات وفوسففروكوكيناز (PFK) مرنا, معدل الحد من انزيم تحلل9. تم العثور على زيادات مماثلة في نصوص PFK في الخلايا العصبية الحركية المشتقة من المريض والحبل الشوكي ، مما يشير إلى أن انحلال الجليكوليسيس يتم تنظيمه في سياق اعتلال البروتين TDP-43. ومن المثير للاهتمام أن زيادة أخرى في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعبات الغذائية والجينية خففت من العديد من الأنماط الظاهرية ل ALS مثل الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43 ، بما يتفق مع آلية تعويضية واعصاب في تتدهور الخلايا العصبية الحركية.

لمزيد من التغييرات التحقيق في انحلال الجليكوليسيس وقياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43، تم التعبير عن جهاز استشعار مشفرة وراثيا سابقا FRET المستندة FLII12Pglu-700μδ610 في الخلايا العصبية الحركية على وجه التحديد باستخدام نظام التعبير UAS-GAL4. يستخدم مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 نقل الطاقة بالرنين بين متغيرين من البروتين الفلوري الأخضر، بروتينات الفلورسنت السماوي والأصفر (CFP و YFP) للكشف عن الجلوكوز على المستوى الخلوي. وهو يتألف من مجال ملزم الجلوكوز البكتيرية من الجين E. coli MglB تنصهر على CFP وYFP على طرفي نقيض من الجزيء. عندما ملزمة جزيء الجلوكوز، وأجهزة الاستشعار يخضع لتغيير تشكيلي جلب CFP وYFP أقرب معا والسماح FRET أن يحدث، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحديد مستويات الجلوكوز داخل الخلايا10،11،12 ( الشكل1). هنا، نعرض كيف يمكن استخدام مستشعر FLII12Pglu-700μδ6 لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز الناجمة عن اعتلال البروتين TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية. التجارب الموصوفة هنا تبين أن الإفراط في التعبير عن متحولة المرتبطة ALS, TDP-43G298S, في الخلايا العصبية الحركية يسبب زيادة كبيرة في امتصاص الجلوكوز بالمقارنة مع الضوابط. ويمكن استخدام هذا النهج في أنواع أخرى من ALS (مثل، SOD1، C9orf72، الخ) و / أو أنواع الخلايا الأخرى (مثل غليا، العضلات) لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز المرتبطة بالتنكس العصبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأبلغ عن الذباب المعدل وراثيا من نوع UAS FLII12Pglu-700μδ6 في فولكنهوف وآخرون10، وكرم الدكتور س. شيرماير بتقديمه. تم توفير خطوط UAS TDP-43G298S المعدلة وراثيا من قبل الدكتور ت. إيواتسوبو13. تم إنشاء خطوط Drosophila المؤتلفة التي تؤوي كلا من UAS FLII12Pglu-700μδ6 وUAS TDP-43 transgenes في مختبر Zarnescu باستخدام النهج الجينية القياسية وتم الإبلاغ عنها في مانزووآخرون. تم استخدام D42 GAL4 لدفع التعبير عن مستشعر الجلوكوز وحده أو جنبا إلى جنب مع TDP-43G298S في الخلايا العصبية الحركية. يتم الحفاظ على جميع خطوط الطيران على وسائط دقيق الذرة دبس، في 25 درجة مئوية في 12 ساعة الظلام: دورة الضوء.

1. Drosophila الحبل العصبي البطني (VNC) تشريح

  1. جعل السيليكون أطباق تشريح الاستومر.
    1. صب مكونات elastomer السيليكون في أنبوب 50 مل كما هو مبين في بروتوكول الشركة المصنعة ويحرك جيدا.
    2. ملء 35 مم أطباق زراعة الأنسجة مع ما يقرب من 2 مل من خليط الاستومر. استخدام حقنة لإزالة أي فقاعات. تغطية الأطباق ووضعها على سطح مستو في فرن 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج.
  2. تشريح يرقات Drosophila لفضح VNC مع الحفاظ على صلاحية الأنسجة.
    1. جمع تجول اليرقة نجمة الثالثة، شطف مع DDH2O، ومن ثم وضعه في قطرة من HL3 العازلة (70 mM NaCl، 5 M M KCl، 20 mM MgCl2، 10 MM NaHCO3، 115 mM السكروز، 5 mM trehalose، 5 mM HEPES؛ pH 7.1) على طبق مبطن elastomer.
    2. باستخدام زوج من ملقط (# 5 أو 55 ملقط) تحت مجهر تشريح ، قم بتدوين النهايات الأمامية والخلفية للجانب الظهري لليرقة لأعلى ، ومد اليرقة بعناية بالطول مع دبابيس الحشرات (دبابيس Minutein).
    3. جعل شق فقط فوق دبوس الخلفي باستخدام زوج من مقص قزحية الزاوية. قم بقطع عمودي بدءا من الشق باتجاه الطرف الأمامي لليرقة.
    4. إضافة بضع قطرات من HL-3 العازلة إذا لزم الأمر. إزالة القصبة الهوائية وبقية الأعضاء العائمة دون إزعاج الجهاز العصبي المركزي. دبوس اللوحات تمتد جدار الجسم لفضح الجهاز العصبي المركزي مع الحفاظ على النظام العصبي العضلي (VNCs، محاور عصبية، وتقاطعات العصبية والعضلية) سليمة.

2. الحصول على صورة

  1. تحسين معلمات التصوير.
    1. قم بتشغيل المجهر وأشعة الليزر قبل البدء في التشريح. يجب الحصول على الصور باستخدام مجهر كونفوجكال مستقيم مع عدسة غمر المياه 40x. استخدام ليزر 405 نانومتر لإثارة CFP والحصول على الصور في كل من CFP (465-499 نانومتر) و FRET (535-695 نانومتر) قنوات الكشف.
    2. تحسين معلمات الامتلاك مثل سرعة المسح الضوئي (6) والمتوسط (2) والهدف (40x) والتكبير (1x) وحجم الثقب (1 AU) والدقة المكانية (512 × 512). ضبط كسب بحيث تكون الإشارة في النطاق الديناميكي الأمثل. يجب استخدام نفس المعلمات لكافة الأنماط الجينية.
  2. صورة الخلايا العصبية الحركية داخل VNC.
    1. ضع طبق السيليكون مع العينة المفرخة تحت العدسة. خفض العدسة بحيث يأتي في اتصال مع trehalose-السكروز HL3 العازلة (انظر 1.2.1). من المهم جدا التأكد من أن العدسة مغمورة بالكامل في المخزن المؤقت. إضافة المزيد من المخزن المؤقت إذا لزم الأمر.
    2. استخدام قنوات CFP و FRET لتحديد يدويا قسم البصرية التي تتكون من ما لا يقل عن 6 الخلايا العصبية الحركية في التركيز، وتقع على طول خط الوسط VNC. يتم تحديد الخلايا العصبية الحركية على أساس التعبير عن جهاز استشعار الجلوكوز والموقف على طول المحور الأمامي الخلفي.
    3. الحصول على الصور كل 10 ق لمدة 10 دقيقة. تمثل هذه الصور خط الأساس.
  3. حفز مع الجلوكوز تكمل HL-3.
    1. إزالة تريهالوز-السكروز التي تحتوي على HL3 العازلة باستخدام ماصة باستور واستبداله مع 5 MM الجلوكوز تكمل HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM السكروز, 5 MM الجلوكوز, 5 M HEPES, pH 7.1). هذه الخطوة تحتاج إلى أن يتم بعناية كبيرة، لتجنب حركة VNC قدر الإمكان.
    2. الحصول على الصور كل 10 ق لمدة 10 دقائق أخرى. تمثل هذه الصور مرحلة التحفيز.
  4. احفظ الصور كملفات .czi أو أي نوع ملف مدعوم من برنامج التصوير باسم ملف يتضمن التاريخ والخلفية الوراثية والحالة التجريبية (الأساس أو التحفيز) والقنوات المستخدمة.
  5. إعادة استخدام المعلمات لتصوير كافة الأنماط الجينية(الشكل 2A).

3. معالجة الصور واختيار عائد الاستثمار

  1. فتح الملفات czi في فيجي / ImageJ وتعيين وضع اللون: تدرج الرمادي، اختر عرض المكدس مع : Hyperstack، وحدد تقسيم القنوات في نوافذ منفصلة.
  2. معالجة الصور باستخدام الإضافات تصحيح الانجراف: turboreg و stackreg. يتم تصحيح كل قناة بشكل منفصل عن طريق تحديد Stackreg ضمن الإضافات، ثم اختر التحويل: ترجمة.
  3. حدد يدويا مناطق الاهتمام (ROIs) لاستخراج متوسط القيمة الرمادية لكل قناة.
    1. اختيار ROIs عن طريق تتبع جميع الخلايا العصبية الحركية التي لا تزال في التركيز على مدى سلسلة زمنية كاملة. استخدام مدير عائد الاستثمار لحفظ كل مخطط الخلايا العصبية الحركية.
    2. استخدم الدالة Multi-measure لقياس متوسط القيمة الرمادية في كل عائد استثمار في كل نقطة زمنية. نسخ ROIs تتبع من القناة الأولى إلى القناة الثانية لصورة ما قبل التحفيز.
    3. كرر هذه العملية لصور ما بعد التحفيز في كل قناة باستخدام نفس الخلايا / ROIs المحددة لصورة التحفيز المسبق.

4. تحليل البيانات

  1. حساب نسبة FRET/CFP، باستخدام القيم الرمادية المتوسطة لقنوات FRET وCFP. تعكس التغيرات في نسب FRET/CFP التعديلات في تركيز الجلوكوز داخل الخلايا.
    1. نسب المؤامرة FRET/CFP لكل عائد استثمار ونقطة زمنية مقابل وقت. داخل كل VNC بعض من ROIs سوف تظهر انخفاضا في نسب FRET / CFP بعد التحفيز.
      ملاحظة: يتم تفسير هذا على أنه عدم قدرة بعض الخلايا العصبية على امتصاص الجلوكوز ، ربما بسبب الإجهاد الناجم عن التشريح وبالتالي يتم استبعاده من التحليل. أما نسب FRET/CFP المتبقية لكل عائد استثمار ونقطة زمنية في المتوسط فيولد نسبة واحدة من FRET/CFP لكل نقطة زمنية لكل نمط جيني (مستشعر الجلوكوز وحده ومستشعر الجلوكوز مع TDP-43G298S). وتستخدم هذه النسب FRET/CFP واحد لجميع التطبيع اللاحقة. تم تحليل 31 ROIs لضوابط استشعار الجلوكوز وتم تحليل 24 ROIs ل TDP-43G298S.
  2. تطبيع خط الأساس: حساب متوسط نسب FRET/CFP لأول 10 دقائق (خط الأساس)، ومن ثم تطبيع نسب FRET/CFP الفردية لكل نقطة زمنية من التجربة بأكملها إلى متوسط خط الأساس 10 دقيقة (انظر الشكل 2B).
  3. تطبيع نقطة التوقيت: تطبيع نسب TDP-43G298S FRET/CFP إلى نسب FRET/CFP من مستشعر الجلوكوز وحده في كل نقطة زمنية (انظر الشكل 3A).
  4. الرسوم البيانية الشريطية: بالنسبة لمقارنات خط الأساس مقابل التحفيز في شكل رسوم بيانية شريطية، استخدم نسب FRET/CFP من 5-10 دقائق (خط الأساس) و15-20 دقيقة (التحفيز) لكل نمط جيني. تطبيع نسبة التحفيز إلى نسبة خط الأساس (انظر الشكل 3B).

5. التحليلات الإحصائية

  1. تقييم مجموعات البيانات العادية باستخدام تصحيح Mann-Whitney (لتطبيع خط الأساس والنقطة الزمنية) أو اختبار Kruskall-Walis (لتمثيل الرسم البياني الشريطي للتحفيز مقابل نسب FRET/CFP الأساسية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الحصول على صورة من جهاز استشعار الجلوكوز في الحبل العصبي البطني (VNC)، ex vivo
لتحديد الاختلافات في امتصاص الجلوكوز في نموذج Drosophila من ALS على أساس TDP-43 ، تم استخدام مستشعر الجلوكوز المشفر وراثيا القائم على FRET. يتألف جهاز الاستشعار CFP وYFP تنصهر في مجال ربط الجلوكوز من الجين E. coli MglB. الجلوكوز ملزمة يثير تغيير تشكيلي، والتي يمكن الكشف عنها عن طريق نقل الطاقة الرنين مضان (FRET) بين CFP و YFP 10،11،12. عندما الجلوكوز غير ملزمة إلى جهاز الاستشعار، يسبب الإثارة CFP انبعاثات CFP فقط، وعندما يربط الجلوكوز، يمكن الكشف عن إشارة YFP بسبب FRET التي تحدث بين CFP وYFP (الشكل 1A). تم استخدام سائق D42 GAL4 للتعبير عن جهاز الاستشعار وحده أو جنبا إلى جنب مع ALS المرتبطة متحولة TDP-43G298S في الخلايا العصبية الحركية عبر نظام التعبير UAS-GAL4 ثنائي الأطراف14. تم تشريح يرقات النجوم الثالثة في المخزن المؤقت HL3 دون الجلوكوز وعلقت لفضح النظام العصبي العضلي ، بما في ذلك VNC لا تزال متصلة بتقاطعات العصبية والعضلية عبر محاور عصبية حركية. تم تصوير VNC باستخدام عدسة غمر المياه 40x مع دقة مكانية من 512 × 512 بكسل (انظر البروتوكول والشكل 1B). تم الحصول على إشارات CFP و FRET في 465-499 نانومتر و 535-695 نانومتر ، على التوالي ، بعد إثارة CFP مع ليزر 405 نانومتر. تم اختيار الشريحة التي سيتم تصويرها على أساس الطائرة حيث كان VNC مرئيا مع ما لا يقل عن ست خلايا عصبية محركية في التركيز على طول الخط الوسطي. تم تصوير الطائرة المختارة لمدة 10 دقائق ، والتقاط صورة كل 10 ق لتحديد مضان خط الأساس. تم حفظ الملفات czi كما يلي: genotype_sample#_baseline. بعد الانتهاء من الدورة الزمنية 10 دقيقة لظروف خط الأساس، تم استبدال العازلة مع HL3 المكمل الجلوكوز. تم إعادة تركيز الصورة للعثور على نفس المستوى الذي تم تصويرها في ظل ظروف خط الأساس. تم استخدام إعدادات الصورة نفسها لجميع العينات. ثم تم تصوير VNC مرة أخرى لمدة 10 دقائق للحصول على صورة جديدة كل 10 ق وحفظها على النحو التالي: genotype_sample # _post التحفيز لمزيد من التحليلات.

تحليل الصور
هناك تحد كبير في تجارب التصوير الحي هو الانجراف الذي تتعرض له VNCs خلال فترة التصوير التي 20 دقيقة. لمعالجة هذه المشكلة، وهو البرنامج المساعد تصحيح الانجراف، تم استخدام Stackreg في فيجي قبل تحليل الصور واختيار العائد على الاستثمار (انظر البروتوكول والشكل 2A). تم اختيار 6-8 خلايا فردية / ROIs من كل VNC وتم تحديدها باستخدام قناة FRET / YFP. تم نسخ التحديدات إلى قناة CFP، وتم قياس القيم الرمادية المتوسطة باستخدام الدالة متعددة المقاييس. تم إجراء الكميات عن طريق حساب متوسط نسب FRET/CFP في كل نقطة زمنية أولا ، ثم حساب المتوسط لكامل 10 دقيقة لكل نمط جيني. ثم استخدمت هذه المعدلات لتطبيع نسب FRET / CFP في كل نقطة زمنية ورسمت مع مرور الوقت لتوليد التقييم الأول للبيانات(الشكل 2B). باستخدام هذا النهج التطبيع، وجد أنه عند التحفيز، والسيطرة على الخلايا العصبية الحركية التعبير عن استشعار الجلوكوز وحدها، وتظهر زيادة صغيرة ولكن كبيرة في امتصاص الجلوكوز (3.9٪،قيمة P < 0.0001) في حين أن الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43G298S تظهر امتصاص الجلوكوز أعلى بكثير (16.76٪،قيمة P < 0.0001). هذه البيانات تتفق مع اعتلال البروتين TDP-43 مما تسبب في زيادة امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية، كما هو مبين سابقا في المرجع9.

تحليلات البيانات - قياس امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية في Drosophila VNC
للحصول على مزيد من الأفكار حول الاختلافات بين الضوابط و TDP-43G298S الخلايا العصبية الحركية المتحولة، تم تطبيع كل FRET / CFP نسبة إلى السيطرة في كل نقطة زمنية(الشكل 3A). وهذا يسمح للمقارنة في امتصاص الجلوكوز بين الخلايا العصبية الحركية ALS التعبير عن TDP-43G298S والسيطرة على الخلايا العصبية الحركية التعبير عن استشعار الجلوكوز وحدها في الوقت الحقيقي. وفي ظل ظروف خط الأساس، لم يكن هناك فرق بين الأنماط الجينية. ومع ذلك، عند التحفيز مع الجلوكوز، سريعة (7.31٪ بعد 1 دقيقة من تطبيق الجلوكوز) وزيادة كبيرة (12.76٪ بعد 10 دقيقة، Pقيمة < 0.0001) في امتصاص الجلوكوز لوحظ في TDP-43G298S بالمقارنة مع السيطرة.

تقدم الرسوم البيانية الشريطية نهجا بديلا لتوضيح الاختلافات بين الأنماط الجينية (TDP-43G298S مقابل عناصر التحكم) قبل وبعد تحفيز الجلوكوز(الشكل 3B). وقد تم ذلك عن طريق تطبيع نسبة FRET/CFP لكلا الشرطين إلى خط الأساس للأنماط الجينية المعنية ورسم متوسط النسبة لآخر 5 دقائق من تصوير خط الأساس والتحفيز، على التوالي. عند التحفيز، تظهر الخلايا العصبية التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز وحده زيادة صغيرة ولكنها كبيرة في نسبة FRET/CFP (3.83٪ ± 0.08٪،قيمة P < 0.0001) مقارنة بخط الأساس. في حين أظهرت الخلايا العصبية التي تعبر عن TDP-43G298S زيادة كبيرة في نسبة FRET / CFP عند التحفيز (14.73٪ ± 0.08٪،قيمة P < 0.0001) بالمقارنة مع خط الأساس. الفرق الصافي في نسب FRET / CFP بين الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43G298S ومستشعر الجلوكوز وحده هو 10.9٪(قيمة P = 0.005). يظهر هذا التحليل أيضا أن النسب تستقر حول آخر 5 دقائق من كل تصوير للدورة الزمنية ، لذلك تم اختيار هذا الإطار الزمني للرسم البياني. يقدم هذا التحليل نظرة عامة رفيعة المستوى على النتائج، بما في ذلك الاختلافات الهامة إحصائيا بين الأنماط الجينية والعلاجات في رسم بياني واحد.

Figure 1
الشكل 1: FRET الاستشعار واكتساب الصورة. (أ) FRET المستندة إلى مخطط استشعار الجلوكوز المستخدمة لقياس امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية. يسبب ربط الجلوكوز حدوث FRET. (ب) رسم تخطيطي لتشريح التقاطع العصبي العضلي (NMJ) يظهر المنطقة المصورة في VNC. صور إلى اليسار تظهر TDP-43G298S قبل وبعد تحفيز الجلوكوز في كل من قنوات FRET (YFP) وCFP. أشرطة المقياس: 20 ميكرومتر. التكبير: 40x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل صورة من استشعار الجلوكوز في سياق TDP-43 متحولة. (أ) صور تمثيلية من إشارات FRET وCFP في ضوابط استشعار الجلوكوز وعينات TDP-43G298S في ظل ظروف خط الأساس والتحفيز. ويرد بيان الخلايا العصبية الحركية التمثيلية في كل صورة كمثال على عائد الاستثمار. أشرطة المقياس: 20 ميكرومتر. التكبير: 40x. (B) متوسط نسب FRET / CFP في مستشعر الجلوكوز والخلايا العصبية الحركية المتحولة TDP-43 أكثر من 20 دقيقة من التصوير. وتم تسوية النسب إلى متوسط نسبة خط الأساس لكل نوع جيني (انظر تطبيع خط الأساس في البروتوكول). القيم المعروضة هي متوسط 25-30 خلية عصبية محركية (ROI) من 5 VNCs لكل نمط جيني. (مان ويتني) استخدم لتقييم الأهمية الإحصائية. =قيمة P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل بيانات جهاز استشعار الجلوكوز في سياق TDP-43G298S. (أ)يتم تطبيع نسب FRET / CFP من TDP-43G298S إلى التحكم في مستشعر الجلوكوز في كل نقطة زمنية. (مان ويتني) استخدم لتقييم الأهمية الإحصائية. =قيمة P < 0.0001. (ب)تمثيل الرسم البياني الشريط لامتصاص الجلوكوز في التحكم في استشعار الجلوكوز و TDP-43G298S يظهر زيادة كبيرة في امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية السيطرة على التحفيز وفي سياق TDP-43G298S مقارنة مع الضوابط. وقد استخدم كروسكال واليس لتقييم الأهمية الإحصائية. ** =قيمة P < 0.01، **** =قيمة P < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن تطبيق هذه التقنية الموضحة بالتفصيل هنا لقياس امتصاص الجلوكوز في نوع معين من الخلايا من الاهتمام في Drosophila الحية باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، وهو جهاز استشعار FRET القائم الذي يمكن الكشف عن التغيرات في مستويات الجلوكوز إلى نطاق ميليمولار10،11،12. وقد سبق استخدام هذا الاستشعار بالاشتراك مع نظام UAS-GAL4 لاستهداف تعبيره لأنواع محددة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية9،10. في هذه الدراسة، تم استخدام D42 GAL4 للتعبير عن FLII12Pglu-700μδ6 من تلقاء نفسها أو جنبا إلى جنب مع المرض المرتبط TDP-43G298S لإظهار كيف يمكن استخدام هذا النهج لتقييم امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية ALS. وعلاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لتصوير العديد من أجهزة الاستشعار الفلورية في VNC اليرقات.

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد. وتحقيقا لهذه الغاية، تم تعيين معلمات الحصول على الصور بحيث لا تكون الفلورسينس مشبعة بشكل مفرط، ويمكن قياس النطاق الكامل لكثافة الإشارة كميا. وظلت معلمات التصوير مثل الكسب وسرعة المسح الضوئي وحجم الثقب والتكبير دون تغيير طوال الدراسة. وقد أجريت التجارب على مدى عدة أيام؛ ومع ذلك، في كل تجربة تم تصوير كل من الأنماط الجينية، أي عناصر التحكم و TDP-43G298S معا لمراعاة التباين. تصوير DROSOPHILA اليرقات CNS باستخدام عدسة الغمر المياه يمكن أن تؤدي إلى تغييرات الطائرة البصرية مع مرور الوقت. وينبغي توخي الحذر لتجنب التغيرات الجذرية في مستوى البصريات باستخدام العازلة كافية. تم تجاهل العينات التي لها تغييرات في التركيز.

على الرغم من أن يتم الاحتفاظ الشروط والمعلمات دون تغيير طوال التجارب، تتطلب هذه التقنية تغيير في المخزن المؤقت أثناء التصوير. بعد 10 دقيقة من التصوير يجب استبدال العازلة الخالية من الجلوكوز مع الجلوكوز تكمل HL-3 العازلة، والتي قد تغير الطائرة المحورية البصرية. يجب إعادة تركيز العدسة على نفس المستوى البؤري بحيث يتم تصوير نفس المجموعة من الخلايا قبل وبعد مكملات الجلوكوز. وأظهرت مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحركية انخفاضا في نسب FRET / CFP بعد التحفيز. وهذا يشير إلى أن بعض الخلايا العصبية لا امتصاص الجلوكوز، وربما بسبب الإجهاد الناجم عن تشريح وتم القضاء عليها من التحليل.

وقد أجري اختيار عائد الاستثمار ومعالجة الصور وتحديد كميتها باستخدام فيجي/إيمجج. في حين يتم اختيار عائد الاستثمار يدويا في الصورة الأولى من هذه السلسلة ، فمن الأهمية بمكان لتصحيح الانجراف طفيفة في التصوير الفاصل الزمني للحفاظ على عائد الاستثمار دائما في جميع أنحاء سلسلة التصوير. تم استخدام مكون إضافي تصحيح الانجراف مفتوح المصدر، Stackreg، لحساب هذه المشكلة.

توافر الليزر الإثارة الحق هو قيد كبير على هذه التقنية. على الرغم من أن ليزر الإثارة 436 نانومتر مثالي لاستشعار الجلوكوز هذا ، فقد أظهرنا أنه يمكن استخدام المستشعر مع ليزر الإثارة 405 نانومتر ، وهو متاح على نطاق أوسع. وهناك قيد آخر على هذه التقنية هو أنه يمكن استخدامها لقياس ديناميات الجلوكوز ولكن ليس تركيزات الجلوكوز المطلقة. وهناك استراتيجية بديلة محتملة لقياس مستويات الجلوكوز المطلقة هي iGlucoSnFR-TS، وهو جهاز استشعار الجلوكوز مدى الحياة، والتي يمكن معايرة لقياس تركيزات الجلوكوزالمطلقة 15.

الجلوكوز هو مصدر رئيسي للطاقة في الدماغ وهو مطلوب للوظائف الفسيولوجية. وقد ارتبطت عيوب في استقلاب الجلوكوز مع العديد من الحالات المرضية (استعرضت في16). Drosophila هو نموذج وراثي قوي يستخدم لدراسة الاضطرابات العصبية17. ومع ذلك، هناك تقنيات محدودة المتاحة لقياس مستويات الجلوكوز مباشرة في Drosophila. يوفر مستشعر الجلوكوز القائم على FRET مقياسا مباشرا للتغيرات داخل الخلايا في مستويات الجلوكوز. على الرغم من بعض التحديات التجريبية والقيود يمكن استخدام هذا الاستشعار بنجاح لدراسة ديناميات الجلوكوز في أنواع محددة من الخلايا (على سبيل المثال، الخلايا العصبية الحركية، غليا، العضلات) في نماذج الأمراض المختلفة، بما في ذلك أنواع متعددة من المرض والاضطرابات العصبية التنكسية ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر ستيفاني شيرماير و تاكيشي إيواتسوبو على توفير سلالات دروسوفيلا. كما نشكر باتريشيا جانسما على مساعدتها في التصوير في مارلي إيماج كور في جامعة أريزونا. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH NS091299، NS115514 (إلى DCZ)، زمالة HHMI جيليام (إلى EM) وبرنامج أبحاث البيولوجيا الجامعية (إلى HB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
  2. Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
  3. Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
  4. Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
  5. Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
  6. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  7. Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
  8. Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
  9. Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
  10. Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
  11. Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
  12. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
  13. Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
  16. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
  17. Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).

Tags

علم الأعصاب، العدد 174، مستشعر الجلوكوز، ALS، Drosophila، TDP-43، اعتلال البروتين
قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج <em>Drosophila</em> من اعتلال البروتين TDP-43
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo,… More

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter