Summary
受 TAR DNA 结合蛋白 （TDP-43） 蛋白病影响 的果蝇 运动神经元中的葡萄糖摄取增加，如基于 FRET 的遗传编码葡萄糖传感器所示。
Abstract
肌萎缩性侧索硬化症是一种神经退行性疾病，在诊断后 2-5 年内导致进行性肌无力和死亡。临床表现包括体重减轻、血脂异常和代谢亢进。然而，目前尚不清楚这些与运动神经元变性的关系。使用TDP-43蛋白病的 果蝇 模型，该模型概括了ALS的几个特征，包括细胞质包涵体，运动功能障碍和寿命缩短，我们最近发现了广泛的代谢缺陷。其中，糖酵解被发现是上调的，遗传相互作用实验为代偿性神经保护机制提供了证据。事实上，尽管磷酸果糖激酶（糖酵解中的限速酶）的上调，但使用饮食和遗传操作增加糖酵解被证明可以减轻运动功能障碍并延长TDP-43蛋白病苍蝇模型的寿命。为了进一步研究TDP-43蛋白病对运动神经元糖酵解通量的影响，使用了先前报道的遗传编码的基于FRET的传感器FLII12Pglu-700μδ6。该传感器由细菌葡萄糖传感域和青色和黄色荧光蛋白组成，作为FRET对。葡萄糖结合后，传感器发生构象变化，允许发生FRET。使用FLII12Pglu-700μδ6，发现表达TDP-43G298S的运动神经元（一种引起ALS的变异体）的葡萄糖摄取显着增加。在这里，我们展示了如何在TDP-43蛋白病的背景下测量表达葡萄糖传感器FLII12Pglu-700μδ6的幼虫腹侧神经索制剂中的葡萄糖摄取， 离体。这种方法可用于测量葡萄糖摄取并评估不同细胞类型或导致ALS和相关神经退行性疾病的各种突变的糖酵解通量。
Introduction
肌萎缩性侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，目前无法治愈。ALS 影响上下运动神经元，导致运动协调丧失、不可逆性瘫痪、呼吸衰竭，并在诊断后 2-5 年内最终死亡1。ALS与代谢缺陷有关，例如体重减轻，血脂异常和代谢亢进（第2篇综述）;然而，目前尚不清楚这些代谢变化与运动神经元变性的关系。ALS和相关神经退行性疾病的一个共同点是TDP-43，这是一种参与RNA处理3，4，5的几个步骤的核酸结合蛋白。虽然TDP-43的突变仅影响3%-5%的患者，但在>97%的ALS病例的细胞质聚集体中发现了野生型TDP-43蛋白（在6中回顾）。这种病理学是通过运动神经元中人类野生型或突变TDP-43（G298S）的过表达在果蝇中建模的，这概括了ALS的多个方面，包括细胞质包涵体，运动功能障碍和寿命缩短7，8。使用这些模型，最近报道TDP-43蛋白病导致丙酮酸水平和磷酸果糖糖激酶（PFK）mRNA（糖酵解9的限速酶）显着增加。在患者来源的运动神经元和脊髓中发现了PFK转录本的类似增加，这表明在TDP-43蛋白病的背景下糖酵解被上调。有趣的是，使用饮食和遗传操作进一步增加糖酵解减轻了几种ALS表型，如运动功能障碍和TDP-43蛋白病苍蝇模型中寿命的增加，与退行性运动神经元的补偿性神经保护机制一致。
为了进一步探索糖酵解的变化并测量TDP-43蛋白病果蝇模型中的葡萄糖摄取，先前报道的基于FRET的遗传编码传感器FLII12Pglu-700μδ610专门使用UAS-GAL4表达系统在运动神经元中表达。FLII12Pglu-700μδ6葡萄糖传感器使用两种绿色荧光蛋白变体（青色和黄色荧光蛋白（CFP和YFP）之间的共振能量转移来检测细胞水平的葡萄糖。它由来自大肠杆菌MglB基因的细菌葡萄糖结合结构域组成，该基因融合到分子两端的CFP和YFP。当与葡萄糖分子结合时，传感器经历构象变化，使CFP和YFP更紧密地结合在一起并允许FRET发生，然后可用于量化细胞内葡萄糖水平10，11，12（图1）。在这里，我们展示了FLII12Pglu-700μδ6传感器如何用于确定由运动神经元中TDP-43蛋白病引起的葡萄糖摄取变化。这里描述的实验表明，与对照组相比，运动神经元中ALS相关突变体TDP-43G298S的过表达会导致葡萄糖摄取显着增加。这种方法可用于其他类型的ALS（例如，SOD1，C9orf72等）和/或其他细胞类型（例如，神经胶质细胞，肌肉），以确定与神经变性相关的葡萄糖摄取的变化。
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Protocol
UAS FLII12Pglu-700μδ6转基因苍蝇在Volkenhoff等人10 中报道，并由S. Schirmeier博士提供。UAS TDP-43G298S 转基因系由T. Iwatsubo13博士提供。在Zarnescu实验室使用标准遗传方法产生了含有UAS FLII12Pglu-700μδ6和UAS TDP-43转基因的重组 果蝇 系，并在Manzo等人中报道。D42 GAL4用于单独或与TDP-43G298S 一起驱动运动神经元中葡萄糖传感器的表达。所有飞线保持在糖蜜玉米粉培养基上，在25°C下12小时黑暗：光循环。
1. 果蝇 腹侧神经索（VNC）解剖
- 制作有机硅弹性体解剖皿。
- 按照制造商协议中的指示，将有机硅弹性体成分倒入 50 mL 管中，搅拌均匀。
- 用约2mL弹性体混合物填充35mm组织培养皿。使用注射器去除任何气泡。盖上盘子，将它们放在60°C烤箱的水平表面上过夜以固化。
- 解剖 果蝇 幼虫以暴露VNC，同时保持组织活力。
- 收集游荡的三龄幼虫，用ddH2O冲洗，然后将其滴入HL3缓冲液（70mM NaCl，5 mM KCl，20 mM MgCl2，10mM NaHCO 3，115 mM蔗糖，5 mM海藻糖，5 mM HEPES;pH 7.1）放在弹性体衬里皿上。
- 在解剖显微镜下使用一对镊子（#5或55镊子），将幼虫背侧的前端和后端朝上，用昆虫别针（Minutein Pins）小心地纵向拉伸幼虫。
- 使用一把倾斜的虹膜剪刀在后针上方做一个切口。从切口开始垂直切口，朝向幼虫的前端。
- 如果需要，加入几滴HL-3缓冲液。切除气管和其他漂浮器官，而不会干扰中枢神经系统。将伸展体壁的皮瓣固定在内膜上，以暴露中枢神经系统，同时保持神经肌肉系统（VNC、轴突和神经肌肉接头）完好无损。
2. 图像采集
- 优化成像参数。
- 在开始解剖之前打开显微镜和激光器。必须使用带有40x水浸透镜的直立共聚焦显微镜获取图像。使用405 nm激光激发CFP并采集CFP（465-499 nm）和FRET（535-695 nm）检测通道中的图像。
- 优化采集参数，如扫描速度 （6）、平均 （2）、物镜 （40 倍）、变焦 （1 倍）、针孔尺寸 （1 AU） 和空间分辨率 （512 x 512）。调整增益，使信号处于最佳动态范围内。所有基因型必须使用相同的参数。
- 对 VNC 内的运动神经元进行成像。
- 将装有解剖样品的硅胶盘放在透镜下。降低晶状体，使其与海藻糖 - 蔗糖HL3缓冲液接触（见1.2.1）。确保镜头完全浸没在缓冲器中至关重要。如果需要，添加更多缓冲区。
- 使用 CFP 和 FRET 通道手动选择由至少 6 个聚焦运动神经元组成的光学部分，该部分位于 VNC 中线。运动神经元是根据葡萄糖传感器的表达和沿前后轴的位置来识别的。
- 每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像表示基线。
- 用补充葡萄糖的HL-3刺激。
- 使用巴斯德移液管除去含有HL3缓冲液的海藻糖蔗糖，并用5 mM葡萄糖补充HL-3（70mM NaCl，5 mM KCl，20 mM MgCl2，10mM NaHCO3，115mM蔗糖，5 mM葡萄糖，5 mM HEPES，pH 7.1）代替。需要非常小心地执行此步骤，以尽可能避免VNC的移动。
- 每 10 秒采集一次图像，再持续 10 分钟。这些图像代表刺激阶段。
- 将图像另存为.czi文件或成像软件支持的任何文件类型，文件名包括日期，遗传背景，实验条件（基线或刺激）和使用的通道。
- 重复使用这些参数对所有基因型进行成像（图2A）。
3. 图像处理和投资回报率选择
- 在 Fiji/ImageJ 中打开 czi 文件并设置"颜色模式：灰度"，选择"查看堆栈方式：超堆栈"，然后选择"将通道拆分为单独的窗口"。
- 使用漂移校正插件处理图像：涡轮reg和堆栈。通过选择"插件"下的"Stackreg"，然后选择"转换：转换"，可以单独更正每个通道。
- 手动选择感兴趣区域 （ROI） 以提取每个通道的平均灰度值。
- 通过追踪在整个时间序列中保持焦点的所有运动神经元来选择ROI。使用 ROI 管理器保存每个运动神经元轮廓。
- 使用 多指标 函数可以测量每个时间点每个 ROI 中的平均灰度值。将从第一通道跟踪的ROI复制到第二通道，以获得预刺激图像。
- 使用为刺激前图像选择的相同细胞/ROI，对每个通道中的刺激后图像重复此过程。
4. 数据分析
- 使用 FRET 和 CFP 通道的平均灰度值计算 FRET/CFP 比率。FRET/CFP比率的变化反映了细胞内葡萄糖浓度的变化。
- 绘制每个 ROI 和时间点与时间的 FRET/CFP 比率。在每个VNC中，一些投资回报率将在刺激后表现出FRET /CFP比率的下降。
注意：这被解释为某些神经元无法摄取葡萄糖，可能是由于解剖引起的压力，因此从分析中消除。对每个ROI和时间点的剩余FRET/CFP比值进行平均，以生成每个基因型（单独的葡萄糖传感器和带有TDP-43G298S的葡萄糖传感器）的每个时间点的单个FRET/CFP比率。这些单一的FRET/CFP比率用于所有后续归一化。分析了31个葡萄糖传感器对照的投资回报率，分析了24个TDP-43G298S的投资回报率。
- 绘制每个 ROI 和时间点与时间的 FRET/CFP 比率。在每个VNC中，一些投资回报率将在刺激后表现出FRET /CFP比率的下降。
- 基线归一化：计算前10分钟（基线）的FRET/CFP比率的平均值，然后将整个实验的每个时间点的单个FRET/CFP比率归一化为10分钟基线平均值（见图2B）。
- 时间点归一化：在每个时间点，单独通过葡萄糖传感器对TDP-43G298S FRET/CFP比值进行归一化（见图3A）。
- 条形图：对于条形图形式的基线与刺激比较，对每种基因型使用5-10分钟（基线）和15-20分钟（刺激）的FRET/CFP比率。将刺激比与基线比率归一化（见图3B）。
5. 统计分析
- 使用Mann-Whitney校正（用于基线和时间点归一化）或Kruskal-Walis检验（用于刺激与基线FRET / CFP比率的条形图表示）评估归一化数据集。
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Representative Results
腹侧神经索（VNC）中葡萄糖传感器的图像采集， 离体
为了确定基于TDP-43的ALS果蝇模型中葡萄糖摄取的差异，使用了基于FRET的遗传编码葡萄糖传感器。该传感器由CFP和YFP组成，从大肠杆菌MglB基因融合到葡萄糖结合域。葡萄糖结合引发构象变化，这可以通过CFP和YFP 10，11，12之间的荧光共振能量转移（FRET）来检测。当葡萄糖不结合到传感器时，CFP激发仅引起CFP发射，当葡萄糖结合时，由于CFP和YFP之间发生的FRET，可以检测到YFP信号（图1A）。D42 GAL4驱动用于通过二分UAS-GAL4表达系统14单独或与ALS相关的突变体TDP-43G298S一起表达运动神经元中的传感器。在没有葡萄糖的HL3缓冲液中解剖三龄幼虫，并固定以暴露神经肌肉系统，包括仍然通过运动神经元轴突连接到神经肌肉接头的VNC。VNC使用空间分辨率为512 x 512像素的40倍水浸透镜进行成像（参见协议和图1B）。在用405 nm激光激发CFP后，分别在465-499 nm和535-695 nm中采集CFP和FRET信号。要成像的切片是根据VNC可见的平面选择的，其中沿中线至少有六个运动神经元聚焦。将选定的平面成像10分钟，每10秒捕获一张图像以确定基线荧光。czi 文件保存为：genotype_sample#_baseline。在基线条件下完成10分钟时间疗程后，用葡萄糖补充HL3代替缓冲液。重新对焦图像，以找到在基线条件下成像的同一平面。所有样本都使用相同的图像设置。然后，将VNC再次成像10分钟，每10秒采集一张新图像，并保存为：genotype_sample#_post刺激以进行进一步分析。
图像分析
实时成像实验的一个重大挑战是VNC在20分钟的成像间隔内经历的漂移。为了解决这个问题，在图像分析和ROI选择之前，在斐济使用了漂移校正插件Stackreg（参见协议和 图2A）。从每个VNC中选择6-8个单独的单元/ROI，并使用FRET / YFP通道进行概述。将选择复制到CFP通道，并使用多测量函数测量平均灰度值。通过首先平均每个时间点的FRET / CFP比率进行定量，然后计算每个基因型整个10分钟的平均值。然后使用这些平均值对每个时间点的FRET / CFP比率进行归一化，并随时间绘制以生成数据的第一次评估（图2B）。使用这种归一化方法，发现在刺激下，单独表达葡萄糖传感器的对照运动神经元表现出葡萄糖摄取的小而显着增加（3.9%，P值 <0.0001），而表达TDP-43G298S 的运动神经元显示出显着更高的葡萄糖摄取（16.76%，P值 <0.0001）。这些数据与TDP-43蛋白病一致，导致运动神经元中的葡萄糖摄取增加，如先前的参考文献9所示。
数据分析 - 测量果蝇VNC中运动神经元中的葡萄糖摄取
为了进一步了解对照组和TDP-43G298S突变运动神经元之间的差异，在每个时间点将每个FRET / CFP比值归一化为对照组（图3A）。这允许实时比较表达TDP-43G298S的ALS运动神经元与单独表达葡萄糖传感器的控制运动神经元之间的葡萄糖摄取。在基线条件下，基因型之间没有差异。然而，在用葡萄糖刺激时，与对照组相比，TDP-43G298S观察到葡萄糖摄取迅速（葡萄糖应用1分钟后为7.31%）和显着增加（10分钟后为12.76%，P值<0.0001）。
条形图提供了一种替代方法来说明葡萄糖刺激之前和之后基因型（TDP-43G298S 与对照组）之间的差异（图3B）。这是通过将两种条件的FRET / CFP比值归一化到各自基因型的基线并分别绘制基线和刺激成像最后5分钟的平均比率来完成的。在刺激时，单独表达葡萄糖传感器的神经元与基线相比，仅表达葡萄糖传感器的FRET / CFP比率（3.83%±0.08%，P值 <0.0001）略有但显着增加。而表达TDP-43G298S 的神经元在刺激时表现出FRET / CFP比值显着增加（14.73%±0.08%，P值 <0.0001）。表达TDP-43G298S 的运动神经元与仅葡萄糖传感器之间的FRET/CFP比率的净差异为10.9%（P值 = 0.005）。该分析还表明，该比率在每个时间过程成像的最后5分钟左右稳定，因此为图形选择了此时间范围。该分析提供了结果的高级概述，包括一个图表中基因型和治疗之间的统计学显着差异。
图1：FRET传感器和图像采集。（A）基于FRET的葡萄糖传感器图，用于测量运动神经元中的葡萄糖摄取。葡萄糖结合导致FRET发生。（B） 神经肌肉接头 （NMJ） 解剖图，显示 VNC 中成像的区域。左侧的图像显示了FRET（YFP）和CFP通道中葡萄糖刺激之前和之后的TDP-43G298S。比例尺：20 μm。 放大倍率：40 倍。请单击此处查看此图的大图。
图2：TDP-43突变体背景下葡萄糖传感器的图像分析。 （A） 在基线和刺激条件下，葡萄糖传感器对照组和TDP-43G298S 样品中FRET和CFP信号的代表性图像。每个图像中都概述了一个具有代表性的运动神经元，作为ROI的示例。比例尺：20μm.放大倍率：40倍（B）在20分钟的成像过程中葡萄糖传感器和TDP-43突变运动神经元中FRET/CFP的平均比率。将比率归一化为每种基因型的平均基线比率（见《议定书》中的基线归一化）。显示的值是每个基因型来自5个VNC的25-30个运动神经元（ROI）的平均值。曼-惠特尼用于评估统计学意义。= P值 < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：TDP-43G298S背景下葡萄糖传感器的数据分析。 （A） TDP-43G298S 的 FRET/CFP 比率在每个时间点都归一化为血糖传感器控制。曼-惠特尼用于评估统计学意义。= P值 < 0.0001。（B） 与对照组相比，在葡萄糖传感器对照组和 TDP-43G298S 中，在 TDP-43G298S 的刺激和背景下，对照运动神经元中葡萄糖摄取的条形图表示显著增加。Kruskall-Walis用于评估统计学意义。** = P值 < 0.01，**** = P值 < 0.0001。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
这里详细描述的技术可以应用于使用FLII12Pglu-700μδ6测量活果蝇感兴趣的特定细胞类型的葡萄糖摄取，FLII12Pglu-700μδ6是基于FRET的传感器，可以检测葡萄糖水平的变化到毫摩尔范围10，11，12。该传感器以前曾与UAS-GAL4系统结合使用，以将其表达靶向特定的细胞类型，包括神经元9，10。在这项研究中，D42 GAL4用于单独表达FLII12Pglu-700μδ6或与疾病相关的TDP-43G298S一起表达，以证明这种方法如何用于评估ALS运动神经元中的葡萄糖摄取。此外，该方法可以广泛地应用于对幼虫VNC中的多种荧光传感器进行成像。
该协议的关键步骤包括最大化信噪比。为此，设置了图像采集参数，使荧光不会过饱和，并且可以量化信号强度的全范围。在整个研究中，增益、扫描速度、针孔尺寸和变焦等成像参数保持不变。实验在几天内进行;然而，在每个实验中，基因型（即对照组和TDP-43G298S） 一起成像以解释变异性。使用水浸透镜对 果蝇 幼虫中枢神经系统进行成像可能会随着时间的推移而引起视平面变化。应注意通过使用足够的缓冲液来避免视平面发生剧烈变化。焦点变化的样品被丢弃。
虽然条件和参数在整个实验过程中保持不变，但该技术需要在成像过程中改变缓冲液。成像10分钟后，葡萄糖游离缓冲液必须替换为补充葡萄糖的HL-3缓冲液，这可能会改变视焦平面。晶状体必须重新聚焦到相同的焦平面，以便在补充葡萄糖之前和之后对同一组细胞进行成像。刺激后，运动神经元的一部分表现出FRET / CFP比率的下降。这表明一些神经元不摄取葡萄糖，可能是由于解剖引起的压力，并从分析中消除。
使用斐济/ImageJ进行ROI选择，图像处理和量化。虽然在系列的第一张图像中手动选择ROI，但纠正延时成像中的微小漂移以保持整个成像系列中的投资回报率不变至关重要。一个开源的漂移校正插件Stackreg被用来解决这个问题。
正确激发激光的可用性是该技术的主要限制。虽然436nm激发激光器是这种葡萄糖传感器的理想选择，但我们已经证明该传感器可以与405nm激发激光器一起使用，后者更广泛地使用。该技术的另一个限制是它可用于测量葡萄糖动力学，但不能用于测量绝对葡萄糖浓度。测量绝对葡萄糖水平的潜在替代策略是iGlucoSnFR-TS，这是一种终身葡萄糖传感器，可以对其进行校准以测量绝对葡萄糖浓度15。
葡萄糖是大脑中能量的主要来源，是生理功能所必需的。葡萄糖代谢缺陷与几种病理状况有关（在16中回顾）。果蝇 是一种强大的遗传模型，用于研究神经退行性疾病17。然而，可用于直接测量 果蝇葡萄糖水平的技术有限。这种基于FRET的葡萄糖传感器可以直接测量细胞内葡萄糖水平的变化。尽管存在一些实验挑战和局限性，但该传感器可以成功地用于研究各种疾病模型中特定细胞类型（例如，运动神经元，神经胶质细胞，肌肉）的葡萄糖动力学，包括多种类型的ALS和相关神经退行性疾病。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Stefanie Schirmeier和Takeshi Iwatsubo提供 果蝇 菌株。我们还感谢Patricia Jansma协助亚利桑那大学Marley Imaging Core的成像工作。这项工作由美国国立卫生研究院NIH NS091299，NS115514（到DCZ），HHMI Gilliam奖学金（到EM）和本科生生物学研究计划（到HB）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
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