Summary
Glucoseopname is verhoogd in Drosophila motorneuronen die worden beïnvloed door TAR DNA-bindend eiwit (TDP-43) proteïnopathie, zoals aangegeven door een FRET-gebaseerde, genetisch gecodeerde glucosesensor.
Abstract
Amyotrofische laterale sclerose is een neurodegeneratieve aandoening die progressieve spierzwakte en de dood veroorzaakt binnen 2-5 jaar na de diagnose. Klinische manifestaties omvatten gewichtsverlies, dyslipidemie en hypermetabolisme; het blijft echter onduidelijk hoe deze zich verhouden tot degeneratie van motorneuronen. Met behulp van een Drosophila-model van TDP-43-proteïnopathie dat verschillende kenmerken van ALS samenvat, waaronder cytoplasmatische insluitsels, locomotorische disfunctie en verminderde levensduur, hebben we onlangs brede metabole tekorten geïdentificeerd. Onder deze bleek glycolyse upregulated te zijn en genetische interactie-experimenten leverden bewijs voor een compenserend neuroprotectief mechanisme. Inderdaad, ondanks upregulatie van fosfoofructokinase, het snelheidsbeperkende enzym in glycolyse, werd aangetoond dat een toename van glycolyse met behulp van voedings- en genetische manipulaties locomotorische disfunctie en verhoogde levensduur in vliegmodellen van TDP-43 proteïnopathie. Om het effect op TDP-43 proteïnopathie op glycolytische flux in motorneuronen verder te onderzoeken, werd een eerder gerapporteerde genetisch gecodeerde, OP FRET gebaseerde sensor, FLII12Pglu-700μδ6, gebruikt. Deze sensor bestaat uit een bacterieel glucose-sensing domein en cyaan en gele fluorescerende eiwitten als het FRET-paar. Bij glucosebinding ondergaat de sensor een conformatieverandering waardoor FRET kan optreden. Met behulp van FLII12Pglu-700μδ6 bleek de glucoseopname significant verhoogd te zijn in motorneuronen die TDP-43G298Stot expressie brengen, een ALS-veroorzakende variant. Hier laten we zien hoe de glucoseopname ex vivokan worden gemeten in larvale ventrale zenuwstrengpreparaten die de glucosesensor FLII12Pglu-700μδ6 tot expressie brengen in de context van TDP-43-proteïnopathie. Deze benadering kan worden gebruikt om de glucoseopname te meten en de glycolytische flux te beoordelen in verschillende celtypen of in de context van verschillende mutaties die ALS en gerelateerde neurodegeneratieve aandoeningen veroorzaken.
Introduction
Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die momenteel ongeneeslijk is. ALS beïnvloedt de bovenste en onderste motorneuronen, wat leidt tot verlies van motorische coördinatie, onomkeerbare verlamming, ademhalingsfalen en uiteindelijke dood binnen 2-5 jaar na diagnose1. ALS wordt geassocieerd met metabole defecten zoals gewichtsverlies, dyslipidemie en hypermetabolisme (beoordeeld in2); het blijft echter onduidelijk hoe deze veranderingen in het metabolisme zich verhouden tot degeneratie van motorneuronen. Een gemene deler bij ALS en gerelateerde neurodegeneratieve ziekten is TDP-43, een nucleïnezuurbindend eiwit dat betrokken is bij verschillende stappen van RNA-verwerking3,4,5. Hoewel mutaties in TDP-43 slechts 3%-5% van de patiënten treffen, wordt wild-type TDP-43-eiwit gevonden in cytoplasmatische aggregaten in >97% van de ALS-gevallen (beoordeeld in6). Deze pathologie werd gemodelleerd in Drosophila door overexpressie van het menselijke wildtype of mutant TDP-43 (G298S) in motorneuronen, die meerdere aspecten van ALS samenvatten, waaronder cytoplasmatische insluitsels, locomotorische disfunctie en verminderde levensduur7,8. Met behulp van deze modellen werd onlangs gemeld dat TDP-43 proteïnopathie een significante toename van pyruvaatspiegels en fosfoructokinase (PFK) mRNA veroorzaakt, het snelheidsbeperkende enzym glycolyse9. Vergelijkbare toenames in PFK-transcripten werden gevonden in patiënt-afgeleide motorneuronen en ruggenmerg, wat suggereert dat glycolyse upregulated is in de context van TDP-43 proteïnopathie. Interessant is dat een verdere toename van glycolyse met behulp van voedings- en genetische manipulaties verschillende ALS-fenotypen zoals locomotorische disfunctie en verhoogde levensduur in vliegmodellen van TDP-43-proteïnopathie verminderde, consistent met een compenserend, neuroprotectief mechanisme in degenererende motorneuronen.
Om veranderingen in glycolyse verder te onderzoeken en de glucoseopname in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie te meten, werd een eerder gerapporteerde genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde sensor FLII12Pglu-700μδ610 uitgedrukt in motorneuronen specifiek met behulp van het UAS-GAL4-expressiesysteem. De FLII12Pglu-700μδ6 glucosesensor maakt gebruik van resonantie-energieoverdracht tussen twee varianten van groen fluorescerend eiwit, cyaan en gele fluorescerende eiwitten (CFP en YFP) om glucose op cellulair niveau te detecteren. Het bestaat uit een bacterieel glucosebindend domein van het E. coli MglB-gen gefuseerd met CFP en YFP aan tegenovergestelde uiteinden van het molecuul. Wanneer de sensor aan een glucosemolecuul wordt gebonden, ondergaat deze een conformatieverandering die CFP en YFP dichter bij elkaar brengt en FRET mogelijk maakt, die vervolgens kan worden gebruikt om intracellulaire glucosespiegels10,11,12 te kwantificeren(figuur 1). Hier laten we zien hoe de FLII12Pglu-700μδ6-sensor kan worden gebruikt om veranderingen in glucoseopname veroorzaakt door TDP-43-proteïnopathie in motorneuronen te bepalen. De hier beschreven experimenten tonen aan dat overexpressie van een ALS-geassocieerde mutant, TDP-43G298S, in motorneuronen een significante toename van de glucoseopname veroorzaakt in vergelijking met controles. Deze aanpak kan worden gebruikt in andere soorten ALS (bijv. SOD1, C9orf72, enz.) en/of andere celtypen (bijv. glia, spieren) om veranderingen in glucoseopname geassocieerd met neurodegeneratie te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgene vliegen werden gemeld in Volkenhoff et al.10 en vriendelijk verstrekt door Dr. S. Schirmeier. De UAS TDP-43G298S transgene lijnen werden vriendelijk geleverd door Dr. T. Iwatsubo13. Recombinante Drosophila-lijnen met zowel UAS FLII12Pglu-700μδ6- als UAS TDP-43-transgenen werden gegenereerd in het Zarnescu-laboratorium met behulp van standaard genetische benaderingen en gerapporteerd in Manzo et al.9. D42 GAL4 werd gebruikt om de expressie van de glucosesensor alleen of samen met TDP-43G298S in motorneuronen aan te sturen. Alle vlieglijnen worden gehandhaafd op melasse maïsmeel media, op 25 °C in 12 uur donker:licht cyclus.
1. Drosophila Ventral Nerve Cord (VNC) dissecties
- Maak siliconen elastomeer dissectie gerechten.
- Giet siliconenelastomeercomponenten in een buis van 50 ml zoals aangegeven in het protocol van de fabrikant en roer goed.
- Vul 35 mm weefselkweekschalen met ongeveer 2 ml van het elastomeermengsel. Gebruik een spuit om eventuele bubbels te verwijderen. Dek de gerechten af en leg ze een nacht op een vlakke ondergrond in een oven van 60 °C om uit te harden.
- Ontleed Drosophila-larven om de VNC bloot te leggen met behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel.
- Verzamel een zwervende derde instar larve, spoel af met ddH2O en plaats deze vervolgens in een druppel HL3-buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM sucrose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7,1) op een met elastomeer beklede schaal.
- Gebruik een tang (# 5 of 55 tang) onder een ontleedmicroscoop, pin de voorste en achterste uiteinden van de dorsale kant van de larve naar boven en rek de larve voorzichtig in de lengte uit met insectenpennen (Minutein Pins).
- Maak een incisie net boven de achterste pin met een schuine irisschaar. Maak een verticale snede vanaf de incisie naar het voorste uiteinde van de larve.
- Voeg indien nodig een paar druppels HL-3-buffer toe. Verwijder de luchtpijp en de rest van de drijvende organen zonder het CZS te verstoren. Pin de flappen die de lichaamswand uitrekken om het CZS bloot te leggen terwijl het neuromusculaire systeem (VBC's, axonen en neuromusculaire juncties) intact blijft.
2. Beeldverwerving
- Optimaliseer de beeldparameters.
- Schakel de microscoop en lasers in voordat u begint met dissecties. Beelden moeten worden verkregen met behulp van een rechtopstaande confocale microscoop met een 40x waterdompelingslens. Gebruik een 405 nm laser om CFP te prikkelen en de beelden te verkrijgen in zowel de CFP (465-499 nm) als de FRET (535-695 nm) detectiekanalen.
- Optimaliseer acquisitieparameters zoals scansnelheid (6), gemiddelde (2), objectief (40x), zoom (1x), pinhole-grootte (1 AU) en ruimtelijke resolutie (512 x 512). Stel de versterking zo in dat het signaal zich in het optimale dynamische bereik bevindt. Dezelfde parameters moeten worden gebruikt voor alle genotypen.
- Beeld motorneuronen binnen de VNC.
- Plaats de siliconen schaal met het ontleedde monster onder de lens. Laat de lens zo zakken dat deze in contact komt met de trehalose-sucrose HL3-buffer (zie 1.2.1). Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de lens volledig in de buffer wordt ondergedompeld. Voeg indien nodig meer buffer toe.
- Gebruik de CFP- en FRET-kanalen om handmatig een optische sectie te selecteren die bestaat uit ten minste 6 motorneuronen in focus, gelegen langs de VNC-middellijn. De motorneuronen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van de glucosesensor en positie langs de voorste-achterste as.
- Verkrijg afbeeldingen om de 10 s gedurende 10 minuten. Deze afbeeldingen vertegenwoordigen de basislijn.
- Stimuleer met glucose aangevuld met HL-3.
- Verwijder de trehalose-sucrose bevattende HL3-buffer met behulp van een Pasteur pipet en vervang deze door 5 mM glucose aangevuld HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM sucrose, 5 mM glucose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Deze stap moet met grote zorg worden uitgevoerd, om de beweging van de VNC zoveel mogelijk te voorkomen.
- Verkrijg afbeeldingen om de 10 s voor nog eens 10 minuten. Deze beelden vertegenwoordigen de stimulatiefase.
- Sla de afbeeldingen op als .czi-bestanden of elk bestandstype dat wordt ondersteund door de beeldvormingssoftware met een bestandsnaam inclusief datum, genetische achtergrond, experimentele toestand (basislijn of stimulatie) en gebruikte kanalen.
- Hergebruik de parameters om alle genotypen in beeld te brengen(Figuur 2A).
3. Beeldverwerking en ROI-selectie
- Open de czi-bestanden in Fiji / ImageJ en stel Color Mode: Grayscalein, kies View Stack with: Hyperstacken selecteer Split Channels into Separate Windows.
- Verwerk beelden met behulp van de driftcorrectie plug-ins: turboreg en stackreg. Elk kanaal wordt afzonderlijk gecorrigeerd door Stackreg te selecteren onder Plug-insen vervolgens Transformatie: Vertalingte kiezen.
- Selecteer handmatig de interessegebieden (ROI's) om de gemiddelde grijswaarde van elk kanaal te extraheren.
- Kies de ROI's door alle motorneuronen te traceren die gedurende de hele tijdreeks in focus blijven. Gebruik de ROI-manager om elk motorneuronoverzicht op te slaan.
- Gebruik de functie Multi-measure om de gemiddelde grijswaarde in elke ROI op elk tijdstip te meten. Kopieer de ROI's die van het eerste kanaal naar het tweede kanaal zijn getraceerd voor het beeld vóór de stimulatie.
- Herhaal dit proces voor de poststimulatiebeelden in elk kanaal met dezelfde cellen/ROIs die zijn geselecteerd voor het pre-stimulatiebeeld.
4. Data-analyse
- Bereken de FRET/CFP-verhouding met behulp van de gemiddelde grijswaarden voor de FRET- en CFP-kanalen. Veranderingen in de FRET/CFP-verhoudingen weerspiegelen veranderingen in de intracellulaire glucoseconcentratie.
- Plot FRET/CFP-ratio's voor elke ROI en elk tijdspunt versus tijd. Binnen elke VNC zullen sommige van de ROIs een daling van de FRET / CFP-ratio's vertonen na stimulatie.
OPMERKING: Dit wordt geïnterpreteerd als een onvermogen van sommige neuronen om glucose op te nemen, mogelijk als gevolg van stress veroorzaakt door dissecties en daarom uit de analyse worden verwijderd. De resterende FRET/CFP-verhoudingen voor elke ROI en elk tijdstip worden gemiddeld om een enkele FRET/CFP-verhouding per tijdspunt per genotype te genereren (glucosesensor alleen en glucosesensor met TDP-43G298S). Deze enkele FRET/CFP-verhoudingen worden gebruikt voor alle volgende normalisaties. 31 ROI's werden geanalyseerd voor glucosesensorcontroles en 24 ROI's werden geanalyseerd voor TDP-43G298S.
- Plot FRET/CFP-ratio's voor elke ROI en elk tijdspunt versus tijd. Binnen elke VNC zullen sommige van de ROIs een daling van de FRET / CFP-ratio's vertonen na stimulatie.
- Baseline normalisatie: Bereken het gemiddelde van fret/cfp-ratio's voor de eerste 10 minuten (baseline) en normaliseer vervolgens individuele FRET/CFP-ratio's voor elk tijdstip van het hele experiment tot het 10 min baselinegemiddelde (zie figuur 2B).
- Timepoint normalisatie: Normaliseer TDP-43G298S FRET/CFP ratio's naar FRET/CFP ratio's van glucose sensor alleen op elk tijdstip (zie Figuur 3A).
- Staafdiagrammen: Voor vergelijkingen tussen basislijn en stimulatie in de vorm van staafdiagrammen, gebruikt u FRET / CFP-verhoudingen van 5-10 minuten (basislijn) en 15-20 minuten (stimulatie) voor elk genotype. Normaliseer de stimulatieverhouding naar de uitgangswaarde (zie figuur 3B).
5. Statistische analyses
- Evalueer de genormaliseerde datasets met behulp van Mann-Whitney-correctie (voor baseline- en tijdpuntnormalisaties) of Kruskall-Walis-test (voor staafdiagramweergave van stimulatie versus baseline FRET / CFP-verhoudingen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beeldacquisitie van de glucosesensor in het ventrale zenuwkoord (VNC), ex vivo
Om verschillen in glucoseopname te bepalen in een Drosophila-model van ALS op basis van TDP-43, werd een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde glucosesensor gebruikt. De sensor bestond uit CFP en YFP gefuseerd met het glucosebindende domein van het E. coli MglB-gen. Glucosebinding veroorzaakt een conformatieverandering, die kan worden gedetecteerd door fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) tussen het GVB en YFP 10,11,12. Wanneer glucose niet aan de sensor is gebonden, veroorzaakt CFP-excitatie alleen CFP-emissie en wanneer glucose bindt, kan het YFP-signaal worden gedetecteerd als gevolg van FRET tussen CFP en YFP(Figuur 1A). De D42 GAL4 driver werd gebruikt om de sensor alleen of samen met de ALS-geassocieerde mutant TDP-43G298S in motorneuronen uit te drukken via het bipartiete UAS-GAL4 expressiesysteem14. Derde instarlarven werden ontleed in HL3-buffer zonder glucose en vastgepind om het neuromusculaire systeem bloot te leggen, inclusief de VNC die nog steeds verbonden is met de neuromusculaire juncties via motorneuronen axonen. De VNC is in beeld gebracht met een 40x waterdompelingslens met een ruimtelijke resolutie van 512 x 512 pixels (zie Protocol en Figuur 1B). CFP- en FRET-signalen werden verkregen in respectievelijk de 465-499 nm en 535-695 nm, na CFP-excitatie met de 405 nm-laser. Het te verbeelden segment werd gekozen op basis van het vlak waar de VNC zichtbaar was met minimaal zes motorneuronen in focus langs de middellijn. Het geselecteerde vlak werd gedurende 10 minuten afgebeeld en legde elke 10 s een afbeelding vast om de basisfluorescentie te bepalen. De czi-bestanden zijn opgeslagen als: genotype_sample#_baseline. Nadat het tijdsverloop van 10 minuten voor baselinecondities was voltooid, werd de buffer vervangen door glucose aangevuld met HL3. De afbeelding werd opnieuw scherpgesteld om hetzelfde vlak te vinden dat onder basislijnomstandigheden werd afgebeeld. Voor alle voorbeelden werden dezelfde afbeeldingsinstellingen gebruikt. De VNC werd vervolgens gedurende 10 minuten opnieuw afgebeeld en kreeg elke 10 s een nieuw beeld en werd opgeslagen als: genotype_sample #_post stimulatie voor verdere analyses.
Beeldanalyse
Een belangrijke uitdaging bij live imaging-experimenten is de drift die VBC's ondergaan tijdens het beeldinterval van 20 minuten. Om dit probleem op te lossen, werd stackreg gebruikt in FIJI voorafgaand aan beeldanalyse en ROI-selectie (zie Protocol en Figuur 2A). 6-8 individuele cellen/ROIs werden geselecteerd uit elke VNC en geschetst met behulp van het FRET/YFP-kanaal. Selecties werden gekopieerd naar het CFP-kanaal en de gemiddelde grijswaarden werden gemeten met behulp van de multi-measure functie. Kwantificeringen werden uitgevoerd door eerst het gemiddelde te nemen van de FRET/CFP-verhoudingen per tijdspunt en vervolgens het gemiddelde voor de gehele 10 minuten per genotype te berekenen. Deze gemiddelden werden vervolgens gebruikt om de FRET/CFP-verhoudingen op elk tijdstip te normaliseren en in de loop van de tijd uitgezet om een eerste evaluatie van de gegevens te genereren (figuur 2B). Met behulp van deze normalisatiebenadering bleek dat bij stimulatie motorneuronen die alleen glucosesensor tot expressie brengen, een kleine maar significante toename van de glucoseopname vertonen (3,9%,P-waarde < 0,0001), terwijl motorneuronen die TDP-43G298S tot expressie brengen een significant hogere glucoseopname vertonen (16,76%,P-waarde < 0,0001). Deze gegevens komen overeen met TDP-43-proteïnopathie die een verhoogde glucoseopname in motorneuronen veroorzaakt, zoals eerder weergegeven in referentie9.
Data-analyse - meting van glucoseopname in motorneuronen in de Drosophila VNC
Om meer inzicht te krijgen in de verschillen tussen controles en TDP-43G298S mutante motorneuronen, werd elke FRET/CFP-verhouding genormaliseerd naar de controle op elk tijdstip(Figuur 3A). Dit maakt een vergelijking in glucoseopname mogelijk tussen ALS-motorneuronen die TDP-43G298S tot expressie brengen en controlemotorneuronen die de glucosesensor alleen in realtime tot expressie brengen. Onder baseline omstandigheden was er geen verschil tussen de genotypen. Bij stimulatie met glucose werd echter een snelle (7,31% na 1 min glucosetoepassing) en significante toename (12,76% na 10 min,P-waarde < 0,0001) in glucoseopname waargenomen in TDP-43G298S in vergelijking met de controle.
Staafdiagrammen bieden een alternatieve benadering voor het illustreren van verschillen tussen genotypen (TDP-43G298S versus controles) voor en na glucosestimulatie(figuur 3B). Dit werd gedaan door de FRET/CFP-verhouding voor beide omstandigheden te normaliseren tot de basislijn van de respectieve genotypen en de gemiddelde verhouding voor respectievelijk de laatste 5 minuten van baseline en stimulatiebeeldvorming uit te zetten. Bij stimulatie vertonen neuronen die alleen glucosesensor tot expressie brengen een kleine maar significante toename van de FRET / CFP-verhouding (3,83% ± 0,08%,P-waarde < 0,0001) in vergelijking met de basislijn. Terwijl neuronen die TDP-43G298S tot expressie brachten een significante toename van de FRET / CFP-verhouding vertoonden bij stimulatie (14,73% ± 0,08%,P-waarde < 0,0001) in vergelijking met de basislijn. Het netto verschil in FRET/CFP-verhoudingen tussen motorneuronen die TDP-43G298S tot expressie brengen en glucosesensor alleen is 10,9%(P-waarde = 0,005). Deze analyse laat ook zien dat de verhoudingen stabiliseren rond de laatste 5 minuten van elke tijdsverloopbeelding, dus dit tijdsbestek werd gekozen voor de grafiek. Deze analyse geeft een overzicht op hoog niveau van de resultaten, inclusief statistisch significante verschillen tussen genotypen en behandelingen in één grafiek.
Figuur 1: FRET sensor en beeldacquisitie. (A)FRET-gebaseerd glucosesensordiagram dat wordt gebruikt om de glucoseopname in motorneuronen te meten. Glucosebinding zorgt ervoor dat FRET optreedt. (B) Diagram van neuromusculaire junctie (NMJ) dissectie met het gebied afgebeeld in de VNC. Beelden links van TDP-43G298S voor en na glucosestimulatie in zowel FRET (YFP) als CFP kanalen. Schaalbalken: 20 μm. Vergroting: 40x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldanalyse van glucosesensor in de context van TDP-43 mutant. (A) Representatieve beelden van FRET- en CFP-signalen in glucosesensorcontroles en TDP-43G298S-monsters onder basislijn- en stimulatieomstandigheden. Een representatief motorneuron wordt in elke afbeelding geschetst als een voorbeeld van een ROI. Schaalstaven: 20 μm. Vergroting: 40x. (B) De gemiddelde verhoudingen van FRET / CFP in glucosesensor en TDP-43 gemuteerde motorneuronen gedurende 20 minuten beeldvorming. Ratio's werden genormaliseerd tot de gemiddelde baseline ratio voor elk genotype (zie baseline normalisatie in het Protocol). De getoonde waarden zijn het gemiddelde van 25-30 motorneuronen (ROI) van 5 VHC's per genotype. Mann-Whitney werd gebruikt om statistische significantie te evalueren. =P-waarde < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Data-analyse van glucosesensor in de context van TDP-43G298S. (A) FRET / CFP-verhoudingen van TDP-43G298S worden genormaliseerd tot glucosesensorcontrole op elk tijdstip. Mann-Whitney werd gebruikt om statistische significantie te evalueren. =P-waarde < 0,0001. (B)Staafdiagramweergave van glucoseopname in glucosesensorregulatie en TDP-43G298S toont een significante toename van glucoseopname in controlemotorneuronen bij stimulatie en in de context van TDP-43G298S in vergelijking met controles. Kruskall-Walis werd gebruikt om statistische significantie te evalueren. ** =P-waarde < 0,01, **** =P-waarde < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier in detail beschreven techniek kan worden toegepast om de glucoseopname te meten in een specifiek celtype van belang in levende Drosophila met behulp van FLII12Pglu-700μδ6, een fret-gebaseerde sensor die veranderingen in glucosespiegels kan detecteren tot een millimolair bereik10,11,12. Deze sensor is eerder gebruikt in combinatie met het UAS-GAL4-systeem om de expressie ervan te richten op specifieke celtypen, waaronder neuronen9,10. In deze studie werd D42 GAL4 gebruikt om FLII12Pglu-700μδ6 uit te drukken op zichzelf of samen met ziekte geassocieerdE TDP-43G298S om aan te tonen hoe deze aanpak kan worden gebruikt om de opname van glucose in ALS-motorneuronen te evalueren. Bovendien kan deze methode breed worden toegepast om een veelheid aan fluorescerende sensoren in de larvale VNC in beeld te brengen.
Kritieke stappen in het protocol omvatten het maximaliseren van de signaal-ruisverhouding. Hiertoe werden beeldacquisitieparameters zo ingesteld dat de fluorescentie niet oververzadigd is en het volledige bereik van signaalintensiteit kan worden gekwantificeerd. Beeldparameters zoals versterking, scansnelheid, pinhole-grootte en zoom bleven gedurende het hele onderzoek ongewijzigd. De experimenten werden gedurende meerdere dagen uitgevoerd; in elk experiment werden echter zowel de genotypen, d.w.z. controles en TDP-43G298S samen afgebeeld om rekening te houden met variabiliteit. Beeldvorming drosophila larvaal CZS met behulp van een onderdompelingslens in water kan in de loop van de tijd aanleiding geven tot veranderingen in het optische vlak. Er moet voor worden gezorgd dat drastische veranderingen in het optische vlak worden voorkomen door voldoende buffer te gebruiken. Monsters met veranderingen in focus werden weggegooid.
Hoewel de omstandigheden en parameters gedurende de experimenten ongewijzigd blijven, vereist deze techniek een verandering in buffer tijdens de beeldvorming. Na 10 minuten beeldvorming moet de glucosevrije buffer worden vervangen door een hl-3-buffer aangevuld met glucose, waardoor het optische brandpuntsvlak kan veranderen. De lens moet opnieuw worden gericht op hetzelfde brandpuntsvlak, zodat dezelfde set cellen voor en na glucosesuppletie in beeld wordt gebracht. Een subset van motorneuronen vertoonde een daling van de FRET / CFP-verhoudingen na stimulatie. Dit geeft aan dat sommige neuronen geen glucose opnemen, mogelijk als gevolg van stress veroorzaakt door dissectie en werden geëlimineerd uit de analyse.
ROI-selectie, beeldverwerking en kwantificering werden uitgevoerd met behulp van Fiji / ImageJ. Hoewel ROI handmatig wordt geselecteerd in de eerste afbeelding van de serie, is het van cruciaal belang om kleine afwijkingen in time-lapse-beeldvorming te corrigeren om de ROI onveranderlijk te houden in de hele imaging-serie. Een open-source plug-in voor driftcorrectie, Stackreg, werd gebruikt om dit probleem te verklaren.
De beschikbaarheid van de juiste excitatielaser is een belangrijke beperking van deze techniek. Hoewel 436 nm excitatielaser ideaal is voor deze glucosesensor, hebben we aangetoond dat de sensor kan worden gebruikt met de 405 nm excitatielaser, die breder verkrijgbaar is. Een andere beperking van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om glucosedynamiek te meten, maar niet om absolute glucoseconcentraties. Een mogelijke alternatieve strategie om absolute glucosespiegels te meten is iGlucoSnFR-TS, een levenslange glucosesensor, die kan worden gekalibreerd om absolute glucoseconcentraties te meten15.
Glucose is een belangrijke bron van energie in de hersenen en is nodig voor fysiologische functies. Defecten in het glucosemetabolisme zijn in verband gebracht met verschillende pathologische aandoeningen (beoordeeld in16). Drosophila is een krachtig genetisch model dat wordt gebruikt om neurodegeneratieve aandoeningen tebestuderen 17. Er zijn echter beperkte technieken beschikbaar om glucosespiegels in Drosophiladirect te meten. Deze op FRET gebaseerde glucosesensor biedt een directe meting van intracellulaire veranderingen in glucosespiegels. Ondanks enkele experimentele uitdagingen en beperkingen kan deze sensor met succes worden gebruikt om glucosedynamica in specifieke celtypen (bijv. Motorneuronen, glia, spieren) te bestuderen in verschillende ziektemodellen, waaronder meerdere soorten ALS en gerelateerde neurodegeneratieve aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Stefanie Schirmeier en Takeshi Iwatsubo voor het leveren van Drosophila-soorten. We bedanken ook Patricia Jansma voor het assisteren bij beeldvorming in de Marley Imaging Core aan de Universiteit van Arizona. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (naar DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (naar EM) en het Undergraduate Biology Research Program (naar HB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H.
