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Neuroscience

Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

L’absorption du glucose est augmentée dans les motoneurones de la drosophile affectés par la protéinopathie de la protéine de liaison à l’ADN TAR (TDP-43), comme l’indique un capteur de glucose génétiquement codé à base de FRET.

Abstract

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative provoquant une faiblesse musculaire progressive et la mort dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic. Les manifestations cliniques comprennent la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme; cependant, on ne sait toujours pas comment ceux-ci sont liés à la dégénérescence des motoneurones. En utilisant un modèle de drosophile de la protéopathie TDP-43 qui récapitule plusieurs caractéristiques de la SLA, y compris les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite, nous avons récemment identifié de vastes déficits métaboliques. Parmi ceux-ci, la glycolyse s’est avérée être régulée à la hausse et les expériences d’interaction génétique ont fourni des preuves d’un mécanisme neuroprotecteur compensatoire. En effet, malgré la régulation à la hausse de la phosphofructokinase, l’enzyme limitant le taux dans la glycolyse, il a été démontré qu’une augmentation de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques atténuait le dysfonctionnement locomoteur et augmentait la durée de vie dans les modèles de mouches de la protéinopathie TDP-43. Pour étudier plus avant l’effet de la protéinopathie TDP-43 sur le flux glycolytique dans les motoneurones, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment, FLII12Pglu-700μδ6, a été utilisé. Ce capteur est composé d’un domaine de détection du glucose bactérien et de protéines fluorescentes cyan et jaunes comme la paire FRET. Lors de la liaison au glucose, le capteur subit un changement conformationnel permettant à FRET de se produire. En utilisant FLII12Pglu-700μδ6, l’absorption de glucose s’est avérée significativement augmentée dans les motoneurones exprimant TDP-43G298S, une variante causant la SLA. Ici, nous montrons comment mesurer l’absorption de glucose, ex vivo,dans les préparations larvaires du cordon nerveux ventral exprimant le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Cette approche peut être utilisée pour mesurer l’absorption du glucose et évaluer le flux glycolytique dans différents types de cellules ou dans le contexte de diverses mutations causant la SLA et les troubles neurodégénératifs connexes.

Introduction

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive qui est actuellement incurable. La SLA affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs entraînant une perte de coordination motrice, une paralysie irréversible, une insuffisance respiratoire et la mort éventuelle dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic1. La SLA est associée à des défauts métaboliques tels que la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme (examinés en2); cependant, on ne sait toujours pas comment ces altérations du métabolisme sont liées à la dégénérescence des motoneurones. Un dénominateur commun dans la SLA et les maladies neurodégénératives connexes est le TDP-43, une protéine de liaison aux acides nucléiques impliquée dans plusieurs étapes du traitement de l’ARN3,4,5. Bien que les mutations du TDP-43 n’affectent que 3% à 5% des patients, la protéine TDP-43 de type sauvage se trouve dans les agrégats cytoplasmiques dans >97% des cas de SLA (examinés dans6). Cette pathologie a été modélisée chez la drosophile par surexpression de type sauvage humain ou de TDP-43 mutant (G298S) dans les motoneurones, qui récapitule de multiples aspects de la SLA, notamment les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite7,8. En utilisant ces modèles, il a été récemment rapporté que la protéinopathie TDP-43 provoque une augmentation significative des niveaux de pyruvate et d’ARNm phosphofructokinase (PFK), l’enzyme limitant le taux de glycolyse9. Des augmentations similaires des transcriptions de PFK ont été trouvées dans les motoneurones et la moelle épinière dérivés du patient, suggérant que la glycolyse est régulée à la hausse dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Fait intéressant, une augmentation supplémentaire de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques a atténué plusieurs phénotypes de la SLA tels que le dysfonctionnement locomoteur et l’augmentation de la durée de vie dans les modèles de mouche de la protéinopathie TDP-43, compatible avec un mécanisme neuroprotecteur compensatoire dans les motoneurones en dégénérescence.

Pour sonder davantage les changements dans la glycolyse et mesurer l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéinopathie TDP-43, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment FLII12Pglu-700μδ610 a été exprimé dans les motoneurones spécifiquement en utilisant le système d’expression UAS-GAL4. Le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 utilise le transfert d’énergie par résonance entre deux variantes de protéines fluorescentes vertes, les protéines fluorescentes cyan et jaunes (CFP et YFP) pour détecter le glucose au niveau cellulaire. Il s’agit d’un domaine de liaison au glucose bactérien du gène E. coli MglB fusionné à CFP et YFP aux extrémités opposées de la molécule. Lorsqu’il est lié à une molécule de glucose, le capteur subit un changement conformationnel rapprochant CFP et YFP et permettant à FRET de se produire, qui peut ensuite être utilisé pour quantifier les niveaux de glucose intracellulaire10,11,12 ( Figure1). Ici, nous montrons comment le capteur FLII12Pglu-700μδ6 peut être utilisé pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose causés par la protéinopathie TDP-43 dans les motoneurones. Les expériences décrites ici montrent que la surexpression d’un mutant associé à la SLA, TDP-43G298S,dans les motoneurones provoque une augmentation significative de l’absorption de glucose par rapport aux témoins. Cette approche peut être utilisée dans d’autres types de SLA (p. ex. SOD1, C9orf72, etc.) et/ou d’autres types de cellules (p. ex. glie, muscles) pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose associés à la neurodégénérescence.

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Protocol

Les mouches transgéniques UAS FLII12Pglu-700μδ6 ont été signalées dans Volkenhoff et al.10 et aimablement fournies par le Dr S. Schirmeier. Les lignées transgéniques UAS TDP-43G298S ont été aimablement fournies par le Dr T. Iwatsubo13. Des lignées recombinantes de drosophiles abritant à la fois des transgènes UAS FLII12Pglu-700μδ6 et UAS TDP-43 ont été générées dans le laboratoire Zarnescu en utilisant des approches génétiques standard et rapportées dans Manzo et al.9. D42 GAL4 a été utilisé pour piloter l’expression du capteur de glucose seul ou avec TDP-43G298S dans les motoneurones. Toutes les lignes de mouche sont maintenues sur des milieux de semoule de maïs à la mélasse, à 25 °C en 12 h de cycle sombre/lumière.

1. Dissections du cordon nerveux ventral de la drosophile (VNC)

  1. Fabriquez des plats de dissection en élastomère de silicone.
    1. Versez les composants en élastomère de silicone dans un tube de 50 mL comme indiqué dans le protocole du fabricant et remuez bien.
    2. Remplir des boîtes de culture tissulaire de 35 mm avec environ 2 mL du mélange d’élastomères. Utilisez une seringue pour enlever les bulles. Couvrir les plats et les placer sur une surface plane dans un four à 60 °C pendant la nuit pour durcir.
  2. Disséquez les larves de drosophiles pour exposer le VNC tout en maintenant la viabilité des tissus.
    1. Recueillir une larve errante du troisième stade, rincer avec ddH2O, puis la placer dans une goutte de tampon HL3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM de saccharose, 5 mM de tréhalose, 5 mM HEPES; pH 7,1) sur un plat tapissé d’élastomère.
    2. À l’aide d’une paire de pinces (#5 ou 55 forceps) sous un microscope à dissection, épinglez les extrémités antérieure et postérieure de la larve dorsale vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes (Minutein Pins).
    3. Faites une incision juste au-dessus de l’épingle postérieure à l’aide d’une paire de ciseaux à iris inclinés. Faites une coupe verticale à partir de l’incision vers l’extrémité antérieure de la larve.
    4. Ajoutez quelques gouttes de tampon HL-3 si nécessaire. Retirez la trachée et le reste des organes flottants sans perturber le SNC. Épinglez les volets qui étirent la paroi corporelle pour exposer le SNC tout en gardant le système neuromusculaire (VNC, axones et jonctions neuromusculaires) intact.

2. Acquisition d’images

  1. Optimisez les paramètres d’imagerie.
    1. Allumez le microscope et les lasers avant de commencer les dissections. Les images doivent être acquises à l’aide d’un microscope confocal vertical avec une lentille d’immersion dans l’eau 40x. Utilisez un laser de 405 nm pour exciter la CFP et acquérir les images dans les canaux de détection CFP (465-499 nm) et FRET (535-695 nm).
    2. Optimisez les paramètres d’acquisition tels que la vitesse de numérisation (6), la moyenne (2), l’objectif (40x), le zoom (1x), la taille du sténopé (1 UA) et la résolution spatiale (512 x 512). Ajustez le gain de manière à ce que le signal se trouve dans la plage dynamique optimale. Les mêmes paramètres doivent être utilisés pour tous les génotypes.
  2. Image des motoneurones au sein du VNC.
    1. Placez le plat en silicone avec l’échantillon disséqué sous la lentille. Abaissez la lentille de manière à ce qu’elle entre en contact avec le tampon HL3 tréhalose-saccharose (voir 1.2.1). Il est essentiel de s’assurer que la lentille est complètement immergée dans le tampon. Ajoutez plus de tampon si nécessaire.
    2. Utilisez les canaux CFP et FRET pour sélectionner manuellement une section optique composée d’au moins 6 motoneurones au point, situés le long de la ligne médiane VNC. Les motoneurones sont identifiés en fonction de l’expression du capteur de glucose et de la position le long de l’axe antérieur-postérieur.
    3. Acquérir des images toutes les 10 s pendant 10 min. Ces images représentent la ligne de base.
  3. Stimuler avec du glucose supplémenté HL-3.
    1. Retirer le tréhalose-saccharose contenant un tampon HL3 à l’aide d’une pipette Pasteur et le remplacer par du HL-3 supplémenté de glucose de 5 mM (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM de saccharose, 5 mM de glucose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Cette étape doit être effectuée avec le plus grand soin, afin d’éviter autant que possible le mouvement du VNC.
    2. Acquérez des images toutes les 10 s pendant 10 minutes supplémentaires. Ces images représentent la phase de stimulation.
  4. Enregistrez les images en tant que fichiers .czi ou tout type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie avec un nom de fichier comprenant la date, le fond génétique, l’état expérimental (ligne de base ou stimulation) et les canaux utilisés.
  5. Réutilisez les paramètres pour imager tous les génotypes (Figure 2A).

3. Traitement de l’image et sélection du retour sur investissement

  1. Ouvrez les fichiers czi dans Fiji/ImageJ et définissez Mode couleur: Niveaux de gris,choisissez Afficher la pile avec : Hyperstack, et sélectionnez Diviser les canaux en fenêtres séparées.
  2. Traitez les images à l’aide des plugins de correction de dérive: turboreg et stackreg. Chaque canal est corrigé séparément en sélectionnant Stackreg sous Plugins, puis choisissez Transformation: Translation.
  3. Sélectionnez manuellement les régions d’intérêt (ROI) pour extraire la valeur grise moyenne de chaque canal.
    1. Choisissez les ROI en traçant tous les motoneurones qui restent au centre de l’attention sur toute la série chronologique. Utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer chaque contour de motoneurone.
    2. Utilisez la fonction Multi-mesure pour mesurer la valeur grise moyenne dans chaque retour sur investissement à chaque point temporel. Copiez les retours sur investissement tracés du premier canal vers le deuxième canal pour l’image de pré-stimulation.
    3. Répétez ce processus pour les images post-stimulation dans chaque canal en utilisant les mêmes cellules/ROI sélectionnés pour l’image de pré-stimulation.

4. Analyse des données

  1. Calculez le rapport FRET/CFP en utilisant les valeurs grises moyennes pour les canaux FRET et CFP. Les changements dans les rapports FRET/CFP reflètent des altérations de la concentration intracellulaire de glucose.
    1. Tracez les ratios FRET/CFP pour chaque retour sur investissement et point de temps par rapport au temps. Dans chaque VNC, certains des ROI présenteront une baisse des rapports FRET/CFP après la stimulation.
      REMARQUE: Ceci est interprété comme une incapacité de certains neurones à absorber le glucose, peut-être en raison du stress causé par des dissections et sont donc éliminés de l’analyse. Les rapports FRET/CFP restants pour chaque ROI et point de temps sont moyennés pour générer un seul rapport FRET/CFP par point de temps et par génotype (capteur de glucose seul et capteur de glucose avec TDP-43G298S). Ces rapports FRET/CFP uniques sont utilisés pour toutes les normalisations ultérieures. 31 ROI ont été analysés pour les contrôles des capteurs de glucose et 24 ROI ont été analysés pour le TDP-43G298S.
  2. Normalisation de base : calculez la moyenne des rapports FRET/CFP pendant les 10 premières minutes (ligne de base), puis normalisez les rapports FRET/CFP individuels pour chaque point temporel de l’ensemble de l’expérience à la moyenne de référence de 10 minutes (voir Figure 2B).
  3. Normalisation des points temporels : Normalisez les rapports FRET/CFP TDP-43G298S par rapport aux rapports FRET/CFP à partir du capteur de glucose seul à chaque point temporel (voir Figure 3A).
  4. Graphiques à barres : Pour les comparaisons entre les lignes de base et la stimulation sous forme de graphiques à barres, utilisez des rapports FRET/CFP de 5 à 10 minutes (ligne de base) et de 15 à 20 minutes (stimulation) pour chaque génotype. Normaliser le rapport de stimulation par rapport au rapport de référence (voir la figure 3B).

5. Analyses statistiques

  1. Évaluez les ensembles de données normalisées à l’aide de la correction de Mann-Whitney (pour les normalisations de base et de points temporels) ou du test de Kruskall-Walis (pour la représentation graphique à barres de la stimulation par rapport aux rapports FRET/CFP de base).

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Representative Results

Acquisition d’images du capteur de glucose dans le cordon nerveux ventral (VNC), ex vivo
Pour déterminer les différences dans l’absorption du glucose dans un modèle de drosophile de la SLA basé sur le TDP-43, un capteur de glucose à base de FRET génétiquement codé a été utilisé. Le capteur comprenait CFP et YFP fusionnés au domaine de liaison au glucose à partir du gène E. coli MglB. La liaison au glucose provoque un changement conformationnel, qui peut être détecté par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) entre le CFP et YFP 10,11,12. Lorsque le glucose n’est pas lié au capteur, l’excitation CFP provoque uniquement l’émission de CFP, et lorsque le glucose se lie, le signal YFP peut être détecté en raison de FRET se produisant entre CFP et YFP (Figure 1A). Le pilote D42 GAL4 a été utilisé pour exprimer le capteur seul ou avec le mutant TDP-43G298S associé à la SLA dans les motoneurones via le système d’expression bipartite UAS-GAL414. Les larves du troisième stade ont été disséquées dans un tampon HL3 sans glucose et épinglées pour exposer le système neuromusculaire, y compris le VNC toujours connecté aux jonctions neuromusculaires via les axones des motoneurones. Le VNC a été photographié à l’aide d’une lentille à immersion dans l’eau 40x avec une résolution spatiale de 512 x 512 pixels (voir Protocole et Figure 1B). Les signaux CFP et FRET ont été acquis dans les 465-499 nm et 535-695 nm, respectivement, après excitation CFP avec le laser 405 nm. La tranche à imager a été choisie en fonction du plan où le VNC était visible avec un minimum de six motoneurones au point le long de la ligne médiane. Le plan sélectionné a été imagé pendant 10 minutes, capturant une image toutes les 10 s pour déterminer la fluorescence de base. Les fichiers czi ont été enregistrés sous : genotype_sample#_baseline. Une fois le cours de 10 minutes terminé pour les conditions de base, le tampon a été remplacé par du GLUCOSE supplémenté HL3. L’image a été recentrée pour trouver le même plan que celui qui a été imagé dans des conditions de référence. Les mêmes paramètres d’image ont été utilisés pour tous les échantillons. Le VNC a ensuite été imagé à nouveau pendant 10 minutes en acquérant une nouvelle image toutes les 10 s et enregistré sous la forme : genotype_sample#_post stimulation pour des analyses ultérieures.

Analyse d’images
Un défi important avec les expériences d’imagerie en direct est la dérive que subissent les VNC pendant l’intervalle d’imagerie de 20 minutes. Pour résoudre ce problème, un plugin de correction de dérive, Stackreg, a été utilisé dans FIJI avant l’analyse d’image et la sélection du retour sur investissement (voir Protocole et Figure 2A). 6 à 8 cellules/ROI individuels ont été sélectionnés dans chaque VNC et décrits à l’aide du canal FRET/YFP. Les sélections ont été copiées dans le canal CFP et les valeurs grises moyennes ont été mesurées à l’aide de la fonction multi-mesures. Les quantifications ont été effectuées en faisant d’abord la moyenne des rapports FRET/CFP par point de temps, puis en calculant la moyenne pour l’ensemble des 10 minutes par génotype. Ces moyennes ont ensuite été utilisées pour normaliser les rapports FRET/CFP à chaque point temporel et tracées dans le temps pour générer une première évaluation des données(Figure 2B). En utilisant cette approche de normalisation, il a été constaté que lors de la stimulation, les motoneurones contrôlants exprimant le capteur de glucose seuls présentent une augmentation faible mais significative de l’absorption de glucose (3,9%,valeur P < 0,0001) tandis que les motoneurones exprimant TDP-43G298S montrent une absorption de glucose significativement plus élevée (16,76%,valeur P < 0,0001). Ces données sont cohérentes avec la protéinopathie TDP-43 provoquant une augmentation de l’absorption du glucose dans les motoneurones, comme indiqué précédemment dans la référence9.

Analyses de données - mesure de l’absorption du glucose dans les motoneurones dans le VNC de la drosophile
Pour mieux comprendre les différences entre les témoins et les motoneurones mutants TDP-43G298S, chaque rapport FRET/CFP a été normalisé au contrôle à chaque point temporel(Figure 3A). Cela permet une comparaison de l’absorption du glucose entre les motoneurones de la SLA exprimant le TDP-43G298S et les motoneurones de contrôle exprimant le capteur de glucose seul en temps réel. Dans les conditions initiales, il n’y avait aucune différence entre les génotypes. Cependant, lors de la stimulation avec du glucose, une augmentation rapide (7,31% après 1 min d’application de glucose) et significative (12,76% après 10 min,valeur P < 0,0001) de l’absorption du glucose a été observée dans le TDP-43G298S par rapport au témoin.

Les graphiques à barres offrent une approche alternative pour illustrer les différences entre les génotypes (TDP-43G298S par rapport aux témoins) avant et après la stimulation du glucose(Figure 3B). Cela a été fait en normalisant le rapport FRET/CFP pour les deux conditions par rapport à la ligne de base des génotypes respectifs et en traçant le rapport moyen pour les 5 dernières minutes d’imagerie de base et d’imagerie de stimulation, respectivement. Lors de la stimulation, les neurones exprimant le capteur de glucose seul montrent une augmentation faible mais significative du rapport FRET/CFP (3,83% ± 0,08%,la valeur P < 0,0001) par rapport à la ligne de base. Alors que les neurones exprimant TDP-43G298S ont montré une augmentation significative du rapport FRET/CFP lors de la stimulation (14,73% ± 0,08%,la valeur P < 0,0001) par rapport à la ligne de base. La différence nette dans les rapports FRET/CFP entre les motoneurones exprimant le TDP-43G298S et le capteur de glucose seul est de 10,9%(valeur P = 0,005). Cette analyse montre également que les ratios se stabilisent autour des 5 dernières minutes de chaque imagerie temporelle, de sorte que cette période a été choisie pour le graphique. Cette analyse fournit un aperçu de haut niveau des résultats, y compris des différences statistiquement significatives entre les génotypes et les traitements dans un graphique.

Figure 1
Figure 1: Capteur FRET et acquisition d’images. (A) Diagramme de capteur de glucose basé sur FRET utilisé pour mesurer l’absorption de glucose dans les motoneurones. La liaison au glucose provoque l’apparition de FRET. (B) Diagramme de la dissection de la jonction neuromusculaire (NMJ) montrant la zone imagée dans le VNC. Images à gauche montrant le TDP-43G298S avant et après la stimulation du glucose dans les canaux FRET (YFP) et CFP. Barres d’échelle: 20 μm. Grossissement: 40x. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Analyse d’image du capteur de glucose dans le contexte du mutant TDP-43. (A) Images représentatives des signaux FRET et CFP dans les commandes des capteurs de glucose et les échantillons TDP-43G298S dans les conditions de base et de stimulation. Un motoneurone représentatif est décrit dans chaque image comme un exemple de retour sur investissement. Barres d’échelle: 20 μm. Grossissement: 40x. (B) Les rapports moyens fret/CFP dans le capteur de glucose et les motoneurones mutants TDP-43 sur 20 min d’imagerie. Les ratios ont été normalisés par rapport au rapport de référence moyen pour chaque génotype (voir la normalisation de base dans le Protocole). Les valeurs indiquées sont la moyenne de 25 à 30 motoneurones (ROI) à partir de 5 VNC par génotype. Mann-Whitney a été utilisé pour évaluer la signification statistique. =Valeur P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Analyse des données du capteur de glucose dans le contexte du TDP-43G298S. (A) Les rapports FRET/CFP du TDP-43G298S sont normalisés au contrôle du capteur de glucose à chaque point temporel. Mann-Whitney a été utilisé pour évaluer la signification statistique. =Valeur P < 0,0001. (B) La représentation graphique à barres de l’absorption du glucose dans le contrôle du capteur de glucose et le TDP-43G298S montre une augmentation significative de l’absorption du glucose dans les motoneurones témoins lors de la stimulation et dans le contexte du TDP-43G298S par rapport aux témoins. Kruskall-Walis a été utilisé pour évaluer la signification statistique. ** =Valeur P < 0,01, **** =Valeur P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La technique décrite en détail ici peut être appliquée pour mesurer l’absorption du glucose dans un type cellulaire spécifique d’intérêt chez la drosophile vivante en utilisant FLII12Pglu-700μδ6, un capteur basé sur FRET qui peut détecter les changements dans les niveaux de glucose à une gamme millimolaire10,11,12. Ce capteur a déjà été utilisé en conjonction avec le système UAS-GAL4 pour cibler son expression sur des types de cellules spécifiques, y compris les neurones9,10. Dans cette étude, D42 GAL4 a été utilisé pour exprimer FLII12Pglu-700μδ6 seul ou avec le TDP-43G298S associé à la maladie pour démontrer comment cette approche peut être utilisée pour évaluer l’absorption du glucose dans les motoneurones de la SLA. De plus, cette méthode peut être largement appliquée pour imager une multitude de capteurs fluorescents dans le VNC larvaire.

Les étapes critiques du protocole incluent la maximisation du rapport signal/bruit. À cette fin, les paramètres d’acquisition d’images ont été définis de manière à ce que la fluorescence ne soit pas sursaturée et que toute la gamme d’intensité du signal puisse être quantifiée. Les paramètres d’imagerie tels que le gain, la vitesse de numérisation, la taille du sténopé et le zoom sont restés inchangés tout au long de l’étude. Les expériences ont été réalisées sur plusieurs jours; cependant, dans chaque expérience, les génotypes, c’est-à-dire les témoins et le TDP-43G298S, ont été imagés ensemble pour tenir compte de la variabilité. L’imagerie du SNC larvaire de la drosophile à l’aide d’une lentille d’immersion dans l’eau pourrait donner lieu à des changements du plan optique au fil du temps. Il faut veiller à éviter les changements drastiques dans le plan optique en utilisant un tampon suffisant. Les échantillons dont la mise au point a changé ont été rejetés.

Bien que les conditions et les paramètres soient maintenus inchangés tout au long des expériences, cette technique nécessite un changement de tampon pendant l’imagerie. Après 10 minutes d’imagerie, le tampon sans glucose doit être remplacé par un tampon HL-3 supplémenté en glucose, ce qui pourrait modifier le plan focal optique. La lentille doit être recentrée sur le même plan focal afin que le même ensemble de cellules soit imagé avant et après la supplémentation en glucose. Un sous-ensemble de motoneurones a présenté une baisse des rapports FRET/CFP après la stimulation. Cela indique que certains neurones n’absorbent pas le glucose, peut-être en raison du stress causé par la dissection et ont été éliminés de l’analyse.

La sélection du retour sur investissement, le traitement et la quantification des images ont été effectués à l’aide de Fiji/ImageJ. Bien que le retour sur investissement soit sélectionné manuellement dans la première image de la série, il est essentiel de corriger les dérives mineures dans l’imagerie en accéléré pour maintenir le retour sur investissement invariable tout au long de la série d’imagerie. Un plugin de correction de dérive open-source, Stackreg, a été utilisé pour expliquer ce problème.

La disponibilité du bon laser d’excitation est une limitation majeure de cette technique. Bien que le laser d’excitation de 436 nm soit idéal pour ce capteur de glucose, nous avons montré que le capteur peut être utilisé avec le laser d’excitation de 405 nm, qui est plus largement disponible. Une autre limitation de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour mesurer la dynamique du glucose, mais pas les concentrations absolues de glucose. Une stratégie alternative potentielle pour mesurer les niveaux absolus de glucose est iGlucoSnFR-TS, un capteur de glucose à vie, qui peut être étalonné pour mesurer les concentrations absolues de glucose15.

Le glucose est une source majeure d’énergie dans le cerveau et est nécessaire pour les fonctions physiologiques. Les défauts du métabolisme du glucose ont été associés à plusieurs conditions pathologiques (examinées dans16). La drosophile est un modèle génétique puissant utilisé pour étudier les troubles neurodégénératifs17. Cependant, il existe peu de techniques disponibles pour mesurer directement les niveaux de glucose chez la drosophile. Ce capteur de glucose basé sur FRET fournit une mesure directe des changements intracellulaires dans les niveaux de glucose. Malgré certains défis et limites expérimentaux, ce capteur peut être utilisé avec succès pour étudier la dynamique du glucose dans des types cellulaires spécifiques (par exemple, les motoneurones, la glie, les muscles) dans divers modèles de maladies, y compris plusieurs types de SLA et de troubles neurodégénératifs connexes.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions Stefanie Schirmeier et Takeshi Iwatsubo d’avoir fourni des souches de drosophiles. Nous remercions également Patricia Jansma d’avoir aidé à l’imagerie dans le Marley Imaging Core de l’Université de l’Arizona. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (à DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (à EM) et le undergraduate Biology Research Program (à HB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurosciences Numéro 174 capteur de glucose SLA Drosophile,TDP-43 protéinopathie
Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de <em>drosophile</em> de la protéopathie TDP-43
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Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo,… More

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

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