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Neuroscience

टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के ड्रोसोफिला मॉडल में ग्लूकोज तेज मापना

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

डीआरओफिला मोटर न्यूरॉन्स में ग्लूकोज तेज बढ़ जाता है जो टार डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन (टीडीपी-43) प्रोटीनोपैथी से प्रभावित होता है, जैसा कि एक FRET-आधारित, आनुवंशिक रूप से इनकोडेड ग्लूकोज सेंसर द्वारा इंगित किया गया है।

Abstract

एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस एक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो निदान के बाद 2-5 वर्षों के भीतर प्रगतिशील मांसपेशियों की कमजोरी और मृत्यु का कारण बनता है। नैदानिक अभिव्यक्तियों में वजन घटाने, डिस्लिपिडेमिया और हाइपरमेटाबोलिज्म शामिल हैं; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि ये मोटर न्यूरॉन अध: पतन से कैसे संबंधित हैं। टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के ड्रोसोफिला मॉडल का उपयोग करना जो साइटोप्लाज्मिक समावेशन, लोकोमोटर डिसफंक्शन और कम उम्र सहित एएलएस की कई विशेषताओं को पुनः प्राप्त करता है, हमने हाल ही में व्यापक मेटाबोलिक घाटे की पहचान की है। इनमें से, ग्लाइकोलिसिस को उपनल पाया गया और आनुवंशिक बातचीत प्रयोगों ने एक प्रतिपूरक न्यूरोप्रोटेक्टिव तंत्र के लिए सबूत प्रदान किए। दरअसल, फॉस्फोफ्रक्टोकिनेज के अपरेगुलेशन के बावजूद, ग्लायकोलिसिस में एंजाइम को सीमित करने की दर, आहार और आनुवंशिक जोड़तोड़ का उपयोग करके ग्लायकोलिसिस में वृद्धि को लोकोमोटर डिसफंक्शन को कम करने और टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के फ्लाई मॉडल में बढ़ी हुई उम्र को दिखाया गया था। मोटर न्यूरॉन्स में ग्लाइकोलिटिक फ्लक्स पर टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी पर प्रभाव की जांच करने के लिए, पहले से रिपोर्ट किए गए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड, FRET-आधारित सेंसर, FLII12Pglu-700μμ6 का उपयोग किया गया था। इस सेंसर में एक बैक्टीरियल ग्लूकोज-सेंसिंग डोमेन और सायन और येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन को FRET जोड़ी के रूप में शामिल किया गया है । ग्लूकोज बाध्यकारी पर, सेंसर एक अनुरूप परिवर्तन से गुजरता है जो FRET होने की अनुमति देता है। FLII12Pglu-700μ6 का उपयोग करना, ग्लूकोज तेज टीडीपी-43G298S,एक एएलएस के कारण संस्करण व्यक्त मोटर न्यूरॉन्स में काफी वृद्धि हुई पाई गई। यहां, हम दिखाते हैं कि टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के संदर्भ में ग्लूकोज सेंसर FLII12Pglu-700μ6 को व्यक्त करते हुए लार्वा वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड तैयारियों में ग्लूकोज तेज, पूर्व वीवोको कैसे मापना है। इस दृष्टिकोण का उपयोग ग्लूकोज तेज को मापने और विभिन्न कोशिका प्रकारों में ग्लाइकोलिटिक फ्लक्स का आकलन करने या एएलएस और संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के कारण विभिन्न म्यूटेशन के संदर्भ में किया जा सकता है।

Introduction

एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) एक प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव डिसऑर्डर है जो वर्तमान में लाइलाज है। एएलएस ऊपरी और निचले मोटर न्यूरॉन्स को प्रभावित करता है जिससे मोटर समन्वय, अपरिवर्तनीय पक्षाघात, श्वसन विफलता और निदान1के 2-5 वर्षों के भीतर अंतिम मृत्यु हो जाती है। एएलएस मेटाबोलिक दोषों जैसे वजन घटाने, डिस्लिपिडेमिया और हाइपरमेटाबोलिज्म(2में समीक्षा) से जुड़ा हुआ है; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि चयापचय में ये परिवर्तन मोटर न्यूरॉन अध: पतन से कैसे संबंधित हैं। एएलएस और संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में एक आम भाजक टीडीपी-43 है, जो आरएनए प्रसंस्करण3,4,5के कई चरणों में शामिल एक न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग प्रोटीन है। हालांकि टीडीपी-43 में उत्परिवर्तन केवल 3%-5% रोगियों को प्रभावित करते हैं, जंगली प्रकार टीडीपी-43 प्रोटीन एएलएस मामलों के >97% में साइटोप्लाज्मिक समुच्चय के भीतर पाया जाता है(6में समीक्षा की गई)। इस विकृति को ड्रोसोफिला में मोटर न्यूरॉन्स में मानव वाइल्डटाइप या उत्परिवर्ती टीडीपी-43 (G298S) के अतिव्यक्तता द्वारा मॉडलिंग की गई थी, जो एएलएस के कई पहलुओं को पुनः प्राप्त करता है, जिसमें साइटोप्लाज्मिक समावेशन, लोकोमोटर डिसफंक्शन और कम उम्र7,8शामिल हैं। इन मॉडलों का उपयोग करते हुए, हाल ही में यह बताया गया था कि टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी पाइरुवेट स्तर और फॉस्फोफ्रक्टोकिनेज (पीएफके) एमआरएनए में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनती है, जो ग्लायकोलिसिस9के एंजाइम को सीमित करता है। पीएफके ट्रांसक्रिप्ट में इसी तरह की वृद्धि रोगी-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स और रीढ़ की हड्डी में पाई गई, जिससे यह सुझाव मिलता है कि ग्लायकोलिसिस टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के संदर्भ में उपनियमित है। दिलचस्प बात यह है कि आहार और आनुवंशिक जोड़तोड़ का उपयोग करके ग्लाइकोलिसिस में और वृद्धि ने कई एएलएस फेनोटाइप जैसे लोकोमोटर डिसफंक्शन और टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के फ्लाई मॉडल में बढ़ी हुई उम्र को कम किया, जो मोटर न्यूरॉन्स को खराब करने में एक प्रतिपूरक, न्यूरोप्रोटेक्टिव तंत्र के अनुरूप है।

ग्लाइकोलिसिस में परिवर्तन की आगे जांच करने और टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के ड्रोसोफिला मॉडल में ग्लूकोज तेज को मापने के लिए, पहले से रिपोर्ट किए गए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड FRET-आधारित सेंसर FLII12Pglu-700μ610 मोटर न्यूरॉन्स में विशेष रूप से यूएएस-GAL4 अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके व्यक्त किया गया था। FLII12Pglu-700μμ6 ग्लूकोज सेंसर सेलुलर स्तर पर ग्लूकोज का पता लगाने के लिए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सियान और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFP और YFP) के दो वेरिएंट के बीच प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का उपयोग करता है । इसमें ई. कोलाई एमजीएलबी जीन से अणु के विपरीत सिरों पर सीएफपी और वाईएफपी से जुड़े बैक्टीरियल ग्लूकोज बाइंडिंग डोमेन होते हैं। ग्लूकोज अणु से बंधे होने पर, सेंसर सीएफपी और वाईएफपी को एक साथ करीब लाने और एफआरटी को होने की अनुमति देता है, जिसका उपयोग तब इंट्रासेलुलर ग्लूकोज के स्तर10, 11,12 (चित्रा 1)को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम बताते हैं कि मोटर न्यूरॉन्स में टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के कारण ग्लूकोज तेज में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए FLII12Pglu-700μμ6 सेंसर का उपयोग कैसे किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रयोगों से पता चलता है कि मोटर न्यूरॉन्स में एएलएस से जुड़े उत्परिवर्ती, टीडीपी-43जी298एसकी अतिव्यक्तता नियंत्रण की तुलना में ग्लूकोज तेज में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनती है। न्यूरोडिजेनरेशन से जुड़े ग्लूकोज तेज में बदलाव निर्धारित करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग अन्य प्रकार के एएलएस (जैसे, एसओडी 1, C9orf72, आदि) और/या अन्य सेल प्रकार (जैसे, ग्लिया, मांसपेशियों) में किया जा सकता है।

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Protocol

यूएएस FLII12Pglu-700μμ6 ट्रांसजेनिक मक्खियों वोल्केनहॉफ एट अल में सूचित किया गया था।10 और कृपया डॉ एस शिर्मेयर द्वारा प्रदान की गई। यूएएस टीडीपी-43जी298एस ट्रांसजेनिक लाइनों को डॉ टी इवात्सुबो13द्वारा कृपया प्रदान किया गया । Recombinant Drosophila दोनों UAS FLII12Pglu-700μ6 और UAS TDP-४३ ट्रांसजीन को शरण लाइनों Zarnescu प्रयोगशाला में मानक आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्पन्न किया गया और Manzo एट अल में रिपोर्ट9। D42 GAL4 का उपयोग अकेले ग्लूकोज सेंसर की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए या मोटर न्यूरॉन्स में टीडीपी-43G298S के साथ किया गया था। सभी फ्लाई लाइनों को 12 घंटे के अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर, शीरा कॉर्नमील मीडिया पर बनाए रखा जाता है: प्रकाश चक्र।

1. ड्रोसोफिला वेंट्रल नर्व कॉर्ड (वीएनसी) विच्छेदन

  1. सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन व्यंजन बनाएं।
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में एक 50 एमएल ट्यूब में सिलिकॉन इलास्टोमर घटकों डालो और अच्छी तरह से हलचल।
    2. इलास्टोमर मिश्रण के लगभग 2 एमएल के साथ 35 मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन भरें। किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। व्यंजनों को कवर करें और उन्हें इलाज के लिए रात भर 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक स्तर की सतह पर रखें।
  2. ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखते हुए वीएनसी को बेनकाब करने के लिए ड्रोसोफिला लार्वा को विच्छेदन करें।
    1. एक भटक तीसरे इंस्टार लार्वा लीजिए, डीएच2ओ के साथ कुल्ला, और फिर इसे एलएल 3-बफर (70 mm NaCl, 5 mCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM सुक्रोज, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; पीएच 7.1) की एक बूंद में एक elastomer लाइन डिश पर जगह है।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत संदंश (#5 या 55 संदंश) की एक जोड़ी का उपयोग करना, लार्वा पृष्ठीय पक्ष के पूर्वकाल और पीछे के सिरों को पिन करें, सावधानी से कीट पिन (मिनटिन पिन) के साथ लार्वा लंबाई खींचते हैं।
    3. कोण आईरिस कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर पीछे पिन के ठीक ऊपर एक चीरा बनाओ। लार्वा के पूर्वकाल के अंत की ओर चीरा से शुरू एक ऊर्ध्वाधर कटौती करें।
    4. जरूरत पड़ने पर एचएल-3 बफर की कुछ बूंदें डालें। सीएनएस को परेशान किए बिना श्वासनली और बाकी तैरते अंगों को हटा दें। न्यूरोमस्कुलर सिस्टम (वीएनसीएस, एक्सॉन और न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों) को बरकरार रखते हुए सीएनएस को बेनकाब करने के लिए शरीर की दीवार को खींचने वाले फ्लैप को पिन करें।

2. छवि अधिग्रहण

  1. इमेजिंग मापदंडों का अनुकूलन करें।
    1. विच्छेदन शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप और लेजर चालू करें। छवियों को 40x पानी विसर्जन लेंस के साथ एक ईमानदार कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहीत किया जाना चाहिए। सीएफपी को उत्तेजित करने और सीएफपी (465-499 एनएम) और FRET (535-695 एनएम) डिटेक्शन चैनलों दोनों में छवियों को प्राप्त करने के लिए 405 एनएम लेजर का उपयोग करें।
    2. स्कैन स्पीड (6), औसत (2), ऑब्जेक्टिव (40x), ज़ूम (1x), पिनहोल साइज (1 एयू) और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन (512 x 512) जैसे अधिग्रहण मापदंडों को ऑप्टिमाइज़ करें। लाभ को इस तरह समायोजित करें कि सिग्नल इष्टतम गतिशील रेंज में है। सभी जीनोटाइप के लिए एक ही पैरामीटर का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. VNC के भीतर छवि मोटर न्यूरॉन्स।
    1. लेंस के नीचे विच्छेदित नमूने के साथ सिलिकॉन डिश रखें। लेंस को कम करें ताकि यह ट्रेहलोस-सुक्रोज एचएल3 बफर के संपर्क में आए (1.2.1 देखें)। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि लेंस बफर में पूरी तरह से जलमग्न है। यदि आवश्यक हो तो अधिक बफर जोड़ें।
    2. वीएनसी मिडलाइन के साथ स्थित फोकस में कम से कम 6 मोटर न्यूरॉन्स वाले ऑप्टिकल सेक्शन का चयन करने के लिए सीएफपी और वीआरटी चैनलों का उपयोग करें। मोटर न्यूरॉन्स ग्लूकोज सेंसर और पूर्वकाल पीछे धुरी के साथ स्थिति की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचान कर रहे हैं ।
    3. 10 मिनट के लिए हर 10 एस छवियों का अधिग्रहण करें। ये छवियां बेसलाइन का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  3. ग्लूकोज पूरक एचएल-3 के साथ उत्तेजित करें।
    1. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके एचएल 3-बफर युक्त ट्रेहलोस-सुक्रोज को हटाएं और इसे 5 एमएल ग्लूकोज पूरक एचएल-3 (70 mM NaCl) के साथ बदलें, 5 एमएमएम केसीएल, 20 एमएमएम एमजीसीएल2,10 एमएम नाएचसीओ3,115 एमएम सुक्रोज, 5 एमएम ग्लूकोज, 5 एमएम एचईपीई, पीएच 7.1)। इस कदम को बड़ी सावधानी से करने की जरूरत है, ताकि जितना संभव हो वीएनसी के आंदोलन से बचा जा सके ।
    2. एक और 10 मिनट के लिए हर 10 एस छवियों को प्राप्त करें। ये छवियां उत्तेजना चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  4. इमेज, जेनेटिक बैकग्राउंड, प्रायोगिक स्थिति (बेसलाइन या उत्तेजना) और उपयोग किए गए चैनलों सहित फाइल नाम के साथ इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा समर्थित .czi फ़ाइल या किसी भी फ़ाइल प्रकार के रूप में छवियों को सहेजें।
  5. सभी जीनोटाइप(चित्रा 2 ए)को छवि देने के लिए मापदंडों का पुन: उपयोग करें।

3. इमेज प्रोसेसिंग और आरओआई चयन

  1. फिजी/इमेजजे में सीजी फाइल खोलें और कलर मोडसेट करें: ग्रेस्केल,व्यू स्टैक का चयन करें: हाइपरस्टैक,और अलग-अलग विंडोज में स्प्लिट चैनलोंका चयन करें।
  2. बहाव सुधार प्लगइन्स का उपयोग करके छवियों को संसाधित करें: टर्बोरेग और स्टैक्रेग। प्लगइन्सके तहत स्टैकरेग का चयन करके प्रत्येक चैनल को अलग से ठीक किया जाता है, और फिर परिवर्तन: अनुवादका चयन करें।
  3. प्रत्येक चैनल के मतलब ग्रे मूल्य निकालने के लिए मैन्युअल रूप से रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें।
    1. पूरे समय श्रृंखला पर ध्यान केंद्रित करने में रहने वाले सभी मोटर न्यूरॉन्स का पता लगाकर आरओआई चुनें। प्रत्येक मोटर न्यूरॉन रूपरेखा को बचाने के लिए आरओआई प्रबंधक का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक आरओआई में मतलब ग्रे मूल्य को मापने के लिए मल्टी-उपाय फ़ंक्शन का उपयोग करें। पूर्व उत्तेजना छवि के लिए पहले चैनल से दूसरे चैनल के लिए पता लगाया ROIs कॉपी करें।
    3. पूर्व उत्तेजना छवि के लिए चयनित एक ही कोशिकाओं/ROIs का उपयोग कर प्रत्येक चैनल में उत्तेजना के बाद छवियों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं ।

4. डेटा विश्लेषण

  1. FRET/CFP अनुपात की गणना, FRET और CFP चैनलों के लिए मतलब ग्रे मूल्यों का उपयोग कर । FRET/CFP अनुपात में परिवर्तन इंट्रासेलुलर ग्लूकोज एकाग्रता में परिवर्तन को प्रतिबिंबित करते हैं ।
    1. प्रत्येक आरओआई और समय बिंदु बनाम समय के लिए प्लॉट FRET/CFP अनुपात । हर वीएनसी के भीतर कुछ आरओआई उत्तेजना के बाद FRET/CFP अनुपात में एक बूंद का प्रदर्शन करेंगे ।
      नोट: यह ग्लूकोज तेज करने के लिए कुछ न्यूरॉन्स की असमर्थता के रूप में व्याख्या की है, संभवतः विच्छेदन की वजह से तनाव के कारण और इसलिए विश्लेषण से समाप्त कर रहे हैं । प्रत्येक आरओआई और टाइम पॉइंट के लिए शेष FRET/CFP अनुपात जीनोटाइप प्रति टाइम पॉइंट प्रति एक FRET/CFP अनुपात उत्पन्न करने के लिए औसतित हैं (ग्लूकोज सेंसर अकेले और ग्लूकोज सेंसर टीडीपी-43G298Sके साथ) । इन एकल FRET/CFP अनुपात का उपयोग बाद के सभी सामान्यीकरण के लिए किया जाता है । ग्लूकोज सेंसर नियंत्रण के लिए 31 आरओआई का विश्लेषण किया गया और टीडीपी-43जी298Sके लिए 24 आरओआई का विश्लेषण किया गया ।
  2. बेसलाइन सामान्यीकरण: पहले 10 मिनट (बेसलाइन) के लिए FRET/CFP अनुपात के औसत की गणना करें, और फिर पूरे प्रयोग के प्रत्येक समय बिंदु के लिए व्यक्तिगत FRET/CFP अनुपात को 10 मिनट बेसलाइन औसत (चित्रा 2Bदेखें) को सामान्य करें ।
  3. टाइमपॉइंट सामान्यीकरण: टीडीपी-43G298S FRET/CFP अनुपात को हर समय बिंदु पर अकेले ग्लूकोज सेंसर से FRET/CFP अनुपात को सामान्य करें (चित्रा 3Aदेखें)।
  4. बार रेखांकन: बार रेखांकन के रूप में बेसलाइन बनाम उत्तेजना तुलना के लिए, प्रत्येक जीनोटाइप के लिए 5-10 मिनट (बेसलाइन) और 15-20 मिनट (उत्तेजना) से FRET/CFP अनुपात का उपयोग करें । बेसलाइन अनुपात के लिए उत्तेजना अनुपात को सामान्य करें (चित्रा 3 Bदेखें)।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. मान-व्हिटनी सुधार (बेसलाइन और टाइमपॉइंट नॉर्मलेशन के लिए) या क्रुस्कऑल-वालिस परीक्षण (बेसलाइन FRET/CFP अनुपात बनाम उत्तेजना के बार ग्राफ प्रतिनिधित्व के लिए) का उपयोग करके सामान्यीकृत डेटा सेट का मूल्यांकन करें।

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Representative Results

वेंट्रल नर्व कॉर्ड (वीएनसी), पूर्व वीवो में ग्लूकोज सेंसर की छवि अधिग्रहण
टीडीपी-43 के आधार पर एएलएस के ड्रोसोफिला मॉडल में ग्लूकोज तेज में अंतर निर्धारित करने के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड FRET-आधारित ग्लूकोज सेंसर का उपयोग किया गया था। सेंसर में सीएफपी और वाईएफपी को ई. कोलाई एमजीएलबी जीन से ग्लूकोज बाध्यकारी डोमेन में शामिल किया गया था । ग्लूकोज बाइंडिंग एक अनुरूप परिवर्तन को प्रकाश में जाता है, जिसका पता सीएफपी और वाईएफपी 10, 11, 12के बीच फ्लोरेसेंस रेसेंस एनर्जी ट्रांसफर (एफईआरटी) द्वारा लगाया जा सकता है। जब ग्लूकोज सेंसर से बाध्य नहीं होता है, तो सीएफपी उत्तेजन केवल सीएफपी उत्सर्जन का कारण बनता है, और जब ग्लूकोज बांधता है, तो सीएफपी और वाईएफपी(चित्रा 1 ए)के बीच होने वाले FRET के कारण वाईएफपी सिग्नल का पता लगाया जा सकता है। D42 GAL4 ड्राइवर का उपयोग सेंसर को अकेले या एक साथ एएलएस से जुड़े उत्परिवर्ती टीडीपी-43G298S के साथ मोटर न्यूरॉन्स में द्विपक्षीय यूएएस-GAL4 अभिव्यक्ति प्रणाली14के माध्यम से व्यक्त करने के लिए किया गया था । तीसरे इंस्टार लार्वा को ग्लूकोज के बिना एचएल 3 बफर में विच्छेदित किया गया था और न्यूरोमस्कुलर सिस्टम को बेनकाब करने के लिए टिकी थी, जिसमें वीएनसी अभी भी मोटर न्यूरॉन एक्सॉन के माध्यम से न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों से जुड़ा हुआ है। वीएनसी को 512 x 512 पिक्सल के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ 40x पानी विसर्जन लेंस का उपयोग करके चित्रित किया गया था (प्रोटोकॉल और चित्रा 1Bदेखें)। सीएफपी और FRET संकेतों क्रमशः 465-499 एनएम और 535-695 एनएम में अधिग्रहीत किए गए थे, 405 एनएम लेजर के साथ CFP उत्तेजन के बाद। छवि के लिए टुकड़ा विमान के आधार पर चुना गया था, जहां वीएनसी मिडलाइन के साथ ध्यान में छह मोटर न्यूरॉन्स की एक ंयूनतम के साथ दिखाई दे रहा था । चयनित विमान 10 मिनट के लिए छवि थी, एक छवि पर कब्जा हर 10 एस बेसलाइन फ्लोरेसेंस निर्धारित करने के लिए । सीजेआई फाइलों के रूप में सहेजा गया: genotype_sample #_baseline । बेसलाइन स्थितियों के लिए 10 मिनट का समय पाठ्यक्रम पूरा होने के बाद, बफर को ग्लूकोज पूरक एचएल 3 के साथ बदल दिया गया था। छवि को उसी विमान को खोजने के लिए फिर से केंद्रित किया गया था जिसे बेसलाइन परिस्थितियों में चित्रित किया गया था। सभी नमूनों के लिए एक ही छवि सेटिंग्स का उपयोग किया गया था। VNC तो 10 मिनट के लिए फिर से छवि एक नई छवि हर 10 एस प्राप्त करने और के रूप में बचाया गया था: आगे विश्लेषण के लिए genotype_sample #_post उत्तेजना ।

छवि विश्लेषण
लाइव इमेजिंग प्रयोगों के साथ एक महत्वपूर्ण चुनौती बहाव है कि 20 मिनट इमेजिंग अंतराल के दौरान VNCs गुजरना है । इस समस्या को हल करने के लिए, इमेज एनालिसिस और आरओआई चयन (प्रोटोकॉल और चित्रा 2 एदेखें) से पहले फिजी में एक बहाव सुधार प्लगइन, स्टैकग्रेग का उपयोग किया गया था। प्रत्येक वीएनसी से 6-8 व्यक्तिगत कोशिकाओं/आरओआई का चयन किया गया था और वीआरटी/वाईएफपी चैनल का उपयोग करके रेखांकित किया गया था । चयन CFP चैनल के लिए नकल की गई, और मतलब ग्रे मूल्यों बहु उपाय समारोह का उपयोग कर मापा गया । क्वांटिफिकेशन पहले प्रति टाइम पॉइंट FRET/CFP अनुपात का औसत करके किया गया था, और फिर पूरे 10 मिनट प्रति जीनोटाइप के लिए औसत की गणना की गई थी । इन औसत तो हर समय बिंदु पर FRET/CFP अनुपात को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया और समय के साथ साजिश रची डेटा का पहला मूल्यांकन उत्पन्न करने के लिए(चित्रा 2B)। इस सामान्यीकरण दृष्टिकोण का उपयोग करना, यह पाया गया कि उत्तेजना पर, अकेले ग्लूकोज सेंसर व्यक्त करने वाले मोटर न्यूरॉन्स को नियंत्रित करते हुए, ग्लूकोज तेज (3.9%, पीवैल्यू < 0.0001) में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित करते हैं, जबकि टीडीपी-43जी298एस को व्यक्त करने वाले मोटर न्यूरॉन्स काफी अधिक ग्लूकोज तेज (16.76%, पीमूल्य < 0.001)। ये डेटा टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के अनुरूप हैं जिससे मोटर न्यूरॉन्स में ग्लूकोज में वृद्धि हुई है, जैसा कि पहले संदर्भ9में दिखाया गया था।

डेटा विश्लेषण - ड्रोसोफिला वीएनसी में मोटर न्यूरॉन्स में ग्लूकोज तेज की माप
नियंत्रण और TDP-43G298S उत्परिवर्ती मोटर न्यूरॉन्स के बीच मतभेदों में आगे अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, प्रत्येक FRET/CFP अनुपात प्रत्येक समय बिंदु(चित्रा 3A)पर नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया गया था । यह टीडीपी-43G298S व्यक्त करने वाले एएलएस मोटर न्यूरॉन्स के बीच ग्लूकोज तेज में तुलना के लिए अनुमति देता है और वास्तविक समय में अकेले ग्लूकोज सेंसर व्यक्त करने वाले मोटर न्यूरॉन्स को नियंत्रित करता है। बेसलाइन परिस्थितियों में जीनोटाइप में कोई अंतर नहीं था । हालांकि, ग्लूकोज के साथ उत्तेजना पर, नियंत्रण की तुलना में टीडीपी-43जी298एस में ग्लूकोज तेज में एक तेजी से (ग्लूकोज आवेदन के 1 मिनट के बाद 7.31%) और महत्वपूर्ण वृद्धि (10 मिनट के बाद 12.76%, पीवैल्यू < 0.0001) ग्लूकोज तेज में देखी गई।

बार रेखांकन ग्लूकोज उत्तेजना(चित्रा 3B)से पहले और बाद में जीनोटाइप (टीडीपी-43G298S बनाम नियंत्रण) के बीच मतभेदों को दर्शाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। यह दोनों स्थितियों के लिए FRET/CFP अनुपात को संबंधित जीनोटाइप के आधार रेखा तक सामान्य बनाकर और पिछले 5 मिनट के बेसलाइन और उत्तेजना इमेजिंग के लिए औसत अनुपात की साजिश रचने के द्वारा किया गया था । उत्तेजना पर, अकेले ग्लूकोज सेंसर व्यक्त न्यूरॉन्स FRET में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाने के ± CFP अनुपात (३.८३% ± ०.०८%, पीमूल्य < ०.०००१) बेसलाइन की तुलना में । जबकि टीडीपी-43G298S व्यक्त न्यूरॉन्स ने बेसलाइन की तुलना में उत्तेजना (14.73% ± 0.08%, पीवैल्यू < 0.0001) पर FRET/CFP अनुपात में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई। टीडीपी-43G298S और ग्लूकोज सेंसर को व्यक्त करने वाले मोटर न्यूरॉन्स के बीच FRET/CFP अनुपात में शुद्ध अंतर 10.9% (पीवैल्यू = 0.005) है। इस विश्लेषण से यह भी पता चलता है कि अनुपात हर बार-कोर्स इमेजिंग के अंतिम 5 मिनट के आसपास स्थिर होता है, इसलिए इस समय सीमा को ग्राफ के लिए चुना गया था। यह विश्लेषण परिणामों का एक उच्च स्तरीय अवलोकन प्रदान करता है, जिसमें एक ग्राफ में जीनोटाइप और उपचार के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर शामिल हैं।

Figure 1
चित्रा 1:FRET सेंसर और छवि अधिग्रहण। (A)FRET आधारित ग्लूकोज सेंसर आरेख मोटर न्यूरॉन्स में ग्लूकोज तेज मापने के लिए इस्तेमाल किया । ग्लूकोज बाध्यकारी होने का कारण बनता है। (ख)न्यूरोमस्कुलर जंक्शन का आरेख (एनएमजे) विच्छेदन वीएनसी में चित्रित क्षेत्र दिखा रहा है । बाएं से छवियां टीडीपी-43G298S से पहले और दोनों FRET (YFP) और CFP चैनलों में ग्लूकोज उत्तेजना के बाद दिखा । स्केल बार: 20 माइक्रोन आवर्धन: 40x. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:टीडीपी-43 म्यूटेंट के संदर्भ में ग्लूकोज सेंसर का छवि विश्लेषण। (A)ग्लूकोज सेंसर नियंत्रण में FRET और CFP संकेतों की प्रतिनिधि छवियां और आधारभूत और उत्तेजना की स्थिति के तहत TDP-43G298S नमूने । एक प्रतिनिधि मोटर न्यूरॉन एक आरओआई का एक उदाहरण के रूप में प्रत्येक छवि में उल्लिखित है। स्केल बार: 20 माइक्रोन आवर्धन: 40x.(ख)ग्लूकोज सेंसर में FRET/CFP के औसत अनुपात और इमेजिंग के 20 मिनट से अधिक TDP-४३ उत्परिवर्ती मोटर न्यूरॉन्स । अनुपात प्रत्येक जीनोटाइप के लिए औसत आधारभूत अनुपात के लिए सामान्यीकृत किया गया (प्रोटोकॉल में बेसलाइन सामान्यीकरण देखें)। दिखाए गए मूल्य 5 वीएनोक प्रति जीनोटाइप से 25-30 मोटर न्यूरॉन्स (आरओआई) का औसत हैं। मान-व्हिटनी का उपयोग सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। = पीमूल्य < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:टीडीपी-43G298Sके संदर्भ में ग्लूकोज सेंसर का डेटा विश्लेषण । (A)टीडीपी-43जी298एस के FRET/CFP अनुपात को प्रत्येक समय बिंदु पर ग्लूकोज सेंसर नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया जाता है । मान-व्हिटनी का उपयोग सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। = पीमूल्य < 0.0001। (ख)ग्लूकोज सेंसर नियंत्रण और टीडीपी-43G298S में ग्लूकोज तेज का बार ग्राफ प्रतिनिधित्व नियंत्रण मोटर न्यूरॉन्स में उत्तेजना पर और नियंत्रण की तुलना में टीडीपी-43G298S के संदर्भ में ग्लूकोज तेज में एक महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चलता है । क्रुस्केल-वालिस का उपयोग सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। ** = पीमूल्य < 0.01, ****= पीमूल्य < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां विस्तार से वर्णित तकनीक को FLII12Pglu-700μ6 का उपयोग करके लाइव ड्रोसोफिला में एक विशिष्ट सेल प्रकार की रुचि में ग्लूकोज तेज को मापने के लिए लागू किया जा सकता है, एक एफईआरटी आधारित सेंसर जो ग्लूकोज के स्तर में परिवर्तन का पता लगा सकता है एक मिलीमोलर रेंज10,11,12। इस सेंसर का उपयोग पहले यूएएस-GAL4 प्रणाली के साथ मिलकर किया गया है ताकि इसकी अभिव्यक्ति को विशिष्ट सेल प्रकारों तक लक्षित किया जा सके, जिसमें न्यूरॉन्स9,10शामिल हैं। इस अध्ययन में, D42 GAL4 का उपयोग FLII12Pglu-700μ6 को अपने दम पर या टीडीपी-43G298S से जुड़े रोग के साथ व्यक्त करने के लिए किया गया था ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि एएलएस मोटर न्यूरॉन्स में ग्लूकोज तेज का मूल्यांकन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग कैसे किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि को लार्वा वीएनसी में फ्लोरोसेंट सेंसर की एक भीड़ को छवि देने के लिए मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करना शामिल है। इस उद्देश्य के लिए, छवि अधिग्रहण पैरामीटर इस तरह निर्धारित किए गए थे कि फ्लोरेसेंस अधिक अनुभवित नहीं है, और सिग्नल तीव्रता की पूरी श्रृंखला को निर्धारित किया जा सकता है। लाभ, स्कैनिंग गति, पिनहोल आकार और ज़ूम जैसे इमेजिंग पैरामीटर पूरे अध्ययन में अपरिवर्तित रहे। प्रयोग कई दिनों में किए गए थे; हालांकि, प्रत्येक प्रयोग में दोनों जीनोटाइप, यानी, नियंत्रण और TDP-43G298S एक साथ छवि के लिए परिवर्तनशीलता के लिए खाते थे । इमेजिंग ड्रोसोफिला लार्वा सीएनएस पानी विसर्जन लेंस का उपयोग कर समय के साथ ऑप्टिक विमान परिवर्तन को जन्म दे सकता है । पर्याप्त बफर का उपयोग करके ऑप्टिक विमान में भारी परिवर्तन से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। फोकस में बदलाव वाले नमूनों को छोड़ दिया गया ।

हालांकि शर्तों और मापदंडों प्रयोगों भर में अपरिवर्तित बनाए रखा जाता है, इस तकनीक इमेजिंग के दौरान बफर में परिवर्तन की आवश्यकता है । इमेजिंग के 10 मिनट के बाद ग्लूकोज मुक्त बफर ग्लूकोज पूरक एचएल-3 बफर, जो ऑप्टिक फोकल विमान बदल सकता है के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । लेंस को एक ही फोकल प्लेन में फिर से केंद्रित किया जाना चाहिए ताकि ग्लूकोज पूरकता से पहले और बाद में कोशिकाओं के एक ही सेट को इमेज किया जा सके। मोटर न्यूरॉन्स के एक सबसेट उत्तेजना के बाद FRET/CFP अनुपात में एक बूंद का प्रदर्शन किया । यह इंगित करता है कि कुछ न्यूरॉन्स ग्लूकोज तेज नहीं करते हैं, संभवतः विच्छेदन के कारण तनाव के कारण और विश्लेषण से समाप्त हो गए थे।

फिजी/इमेजजे का उपयोग करके आरओआई चयन, छवि प्रसंस्करण और परिमाणीकरण किया गया था। जबकि आरओआई को श्रृंखला की पहली छवि में मैन्युअल रूप से चुना जाता है, इमेजिंग श्रृंखला में आरओआई को अपरिवर्तनीय रखने के लिए समय चूक इमेजिंग में मामूली बहाव को सही करना महत्वपूर्ण है। इस समस्या के लिए एक खुले-सोर्स बहाव सुधार प्लगइन, स्टैकरेग का उपयोग किया गया था।

सही उत्तेजन लेजर की उपलब्धता इस तकनीक के लिए एक प्रमुख सीमा है। हालांकि 436 एनएम उत्तेजन लेजर इस ग्लूकोज सेंसर के लिए आदर्श है, हमने दिखाया है कि सेंसर का उपयोग 405 एनएम उत्तेजन लेजर के साथ किया जा सकता है, जो अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध है। इस तकनीक के लिए एक और सीमा यह है कि यह ग्लूकोज गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन पूर्ण ग्लूकोज सांद्रता नहीं है । पूर्ण ग्लूकोज के स्तर को मापने के लिए एक संभावित वैकल्पिक रणनीति iGlucoSnFR-S, एक आजीवन ग्लूकोज सेंसर है, जिसे पूर्ण ग्लूकोज सांद्रता15को मापने के लिए कैलिब्रेट किया जा सकता है।

ग्लूकोज मस्तिष्क में ऊर्जा का एक प्रमुख स्रोत है और शारीरिक कार्यों के लिए आवश्यक है। ग्लूकोज चयापचय में दोष कई रोग स्थितियों(16में समीक्षा) के साथ जुड़ा हुआ है । ड्रोसोफिला एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल है जो न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है17. हालांकि, ड्रोसोफिलामें ग्लूकोज के स्तर को सीधे मापने के लिए सीमित तकनीकें उपलब्ध हैं। यह FRET आधारित ग्लूकोज सेंसर ग्लूकोज के स्तर में इंट्रासेलुलर परिवर्तन का सीधा उपाय प्रदान करता है। कुछ प्रयोगात्मक चुनौतियों और सीमाओं के बावजूद इस सेंसर का उपयोग विभिन्न रोग मॉडलों में विशिष्ट कोशिका प्रकारों (जैसे, मोटर न्यूरॉन्स, ग्लिया, मांसपेशियों) में ग्लूकोज गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है, जिसमें कई प्रकार के एएलएस और संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार शामिल हैं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम ड्रोसोफिला उपभेदों को प्रदान करने के लिए स्टेफनी शिर्मेयर और ताकेशी इवात्सुबो को धन्यवाद देते हैं। हम भी एरिजोना विश्वविद्यालय में मार्ले इमेजिंग कोर में इमेजिंग के साथ सहायता के लिए पेट्रीसिया जन्मा का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान एनआईएच एनएस091299, NS115514 (DCZ), एचएचएमआई गिलम फैलोशिप (ईएम) और स्नातक जीव विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम (एचबी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

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References

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टीडीपी-43 प्रोटीनोपैथी के <em>ड्रोसोफिला</em> मॉडल में ग्लूकोज तेज मापना
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Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

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