Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Измерение поглощения глюкозы в моделях дрозофилы протеинопатии TDP-43

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

Поглощение глюкозы увеличивается в моторных нейронах Drosophila, пораженных протеинопатией белка, связывающего ДНК(TDP-43), о чем свидетельствует генетически закодированный датчик глюкозы на основе FRET.

Abstract

Боковой амиотрофический склероз является нейродегенеративным расстройством, вызывающим прогрессирующую мышечную слабость и смерть в течение 2-5 лет после постановки диагноза. Клинические проявления включают потерю веса, дислипидемию и гиперметаболизм; однако остается неясным, как они связаны с дегенерацией двигательных нейронов. Используя модель дрозофилы протеинопатии TDP-43, которая повторяет несколько особенностей БАС, включая цитоплазматические включения, двигательную дисфункцию и снижение продолжительности жизни, мы недавно выявили широкий спектр метаболических дефицитов. Среди них было обнаружено, что гликолиз регулируется, и эксперименты с генетическим взаимодействием предоставили доказательства компенсаторного нейропротекторного механизма. Действительно, несмотря на повышение регуляции фосфофруктокиназы, ограничивающего скорость фермента при гликолизе, было показано, что увеличение гликолиза с использованием диетических и генетических манипуляций смягчает двигательную дисфункцию и увеличивает продолжительность жизни в моделях протеинопатии TDP-43. Для дальнейшего изучения влияния протеинопатии TDP-43 на гликолитический поток в двигательных нейронах был использован ранее зарегистрированный генетически закодированный датчик на основе FRET FLII12Pglu-700μδ6. Этот датчик состоит из бактериального глюкозочувствительного домена и голубых и желтых флуоресцентных белков в качестве пары FRET. При связывании глюкозы датчик претерпевает конформационное изменение, позволяющее возникать FRET. Используя FLII12Pglu-700μδ6, было обнаружено, что поглощение глюкозы значительно увеличивается в двигательных нейронах, экспрессирующих TDP-43G298S,вариант, вызывающий БАС. Здесь мы покажем, как измерить поглощение глюкозы, ex vivo,в препаратах личиночного вентрального нервного канатика, экспрессирующих датчик глюкозы FLII12Pglu-700μδ6 в контексте протеинопатии TDP-43. Этот подход может быть использован для измерения поглощения глюкозы и оценки гликолитического потока в различных типах клеток или в контексте различных мутаций, вызывающих БАС и связанные с ним нейродегенеративные расстройства.

Introduction

Боковой амиотрофический склероз (БАС) является прогрессирующим нейродегенеративным расстройством, которое в настоящее время неизлечимо. БАС поражает верхние и нижние двигательные нейроны, что приводит к потере двигательной координации, необратимому параличу, дыхательной недостаточности и возможной смерти в течение 2-5 лет после постановки диагноза1. БАС связан с метаболическими дефектами, такими как потеря веса, дислипидемия и гиперметаболизм (рассмотрено в2); однако остается неясным, как эти изменения в метаболизме связаны с дегенерацией двигательных нейронов. Общим знаменателем при БАС и связанных с ним нейродегенеративных заболеваниях является TDP-43, белок, связывающий нуклеиновые кислоты, участвующий в нескольких стадиях обработки РНК3,4,5. Хотя мутации в TDP-43 затрагивают только 3-5% пациентов, белок TDP-43 дикого типа обнаруживается в цитоплазматических агрегатах в >97% случаев БАС (рассмотрен в6). Эта патология была смоделирована у дрозофилы путем сверхэкспрессии человеческого дикого типа или мутантного TDP-43 (G298S) в двигательных нейронах, который рекапитулирует множественные аспекты БАС, включая цитоплазматические включения, двигательную дисфункцию и снижение продолжительности жизни7,8. Используя эти модели, недавно сообщалось, что протеинопатия TDP-43 вызывает значительное повышение уровня пирувата и мРНК фосфофруктокиназы (PFK), ограничивающего скорость фермента гликолиза9. Аналогичное увеличение транскриптов PFK было обнаружено в производных от пациента двигательных нейронах и спинном мозге, что свидетельствует о том, что гликолиз повышается в контексте протеинопатии TDP-43. Интересно, что дальнейшее увеличение гликолиза с использованием диетических и генетических манипуляций смягчило несколько фенотипов БАС, таких как двигательная дисфункция и увеличение продолжительности жизни в моделях протеинопатии TDP-43, что согласуется с компенсаторным, нейропротекторным механизмом в дегенерирующих двигательных нейронах.

Для дальнейшего исследования изменений в гликолизе и измерения поглощения глюкозы в моделях дрозофилы протеинопатии TDP-43 ранее зарегистрированный генетически закодированный датчик на основе FRET FLII12Pglu-700μδ610 был экспрессирован в двигательных нейронах, специально используя систему экспрессии UAS-GAL4. Датчик глюкозы FLII12Pglu-700μδ6 использует резонансный перенос энергии между двумя вариантами зеленого флуоресцентного белка, голубых и желтых флуоресцентных белков (CFP и YFP) для обнаружения глюкозы на клеточном уровне. Он состоит из бактериального глюкозосвязывающего домена из гена E. coli MglB, слитого с CFP и YFP на противоположных концах молекулы. При связывании с молекулой глюкозы датчик претерпевает конформационное изменение, сближающее CFP и YFP и позволяющее возникать FRET, которое затем может быть использовано для количественной оценки внутриклеточных уровней глюкозы10,11,12 (рисунок 1). Здесь мы покажем, как датчик FLII12Pglu-700μδ6 может быть использован для определения изменений в поглощении глюкозы, вызванных протеинопатией TDP-43 в двигательных нейронах. Эксперименты, описанные здесь, показывают, что сверхэкспрессия мутанта, связанного с БАС, TDP-43G298S,в двигательных нейронах вызывает значительное увеличение поглощения глюкозы по сравнению с контрольной группой. Этот подход может быть использован в других типах БАС (например, SOD1, C9orf72 и т.д.) и/или других типах клеток (например, глия, мышцы) для определения изменений в поглощении глюкозы, связанных с нейродегенерацией.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Трансгенные мухи UAS FLII12Pglu-700μδ6 были зарегистрированы в Volkenhoff et al.10 и любезно предоставлены доктором С. Ширмайером. Трансгенные линии UAS TDP-43G298S были любезно предоставлены доктором Т. Ивацубо13. Рекомбинантные линии Drosophila, содержащие трансгены UAS FLII12Pglu-700μδ6 и UAS TDP-43, были сгенерированы в лаборатории Zarnescu с использованием стандартных генетических подходов и сообщены в Manzo et al.9. D42 GAL4 использовался для управления экспрессией датчика глюкозы отдельно или вместе с TDP-43G298S в двигательных нейронах. Все линии мух поддерживаются на мелассе кукурузной муки при 25 °C в 12-часовом цикле темный:светлый.

1. Рассечение дрозофилы вентрального нервного нерва (VNC)

  1. Сделайте силиконовую эластомерную рассеченную посуду.
    1. Налейте силиконовые эластомерные компоненты в трубку объемом 50 мл, как указано в протоколе производителя, и хорошо перемешайте.
    2. Наполните 35 мм посуду для посева тканей примерно 2 мл эластомерной смеси. Используйте шприц, чтобы удалить пузырьки. Накройте посуду и поместите ее на ровную поверхность в духовку с температурой 60 °C на ночь, чтобы вылечить.
  2. Рассекайте личинок Drosophila, чтобы обнажить VNC при сохранении жизнеспособности тканей.
    1. Соберите блуждающую третью личинку звезды, промойте ddH2O, а затем поместите ее в каплю HL3-буфера (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 20 мМ MgCl2,10 мМ NaHCO3,115 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES; рН 7,1) на блюде с эластомерной подкладкой.
    2. Используя пару щипцов (No 5 или 55 щипцов) под рассекающим микроскопом, прижмите передний и задний концы спинной стороны личинки вверх, осторожно растягивая личинку вдоль с помощью булавок насекомых (Minutein Pins).
    3. Сделайте разрез чуть выше задней булавки, используя пару наклонных ножниц для радужной оболочки. Сделайте вертикальный разрез, начиная от разреза по направлению к переднему концу личинки.
    4. При необходимости добавьте несколько капель буфера HL-3. Удалите трахею и остальные плавающие органы, не нарушая ЦНС. Закрепите лоскуты, растягивающие стенку тела, чтобы обнажить ЦНС, сохраняя при этом нервно-мышечную систему (VNC, аксоны и нервно-мышечные соединения) неповрежденной.

2. Получение изображений

  1. Оптимизируйте параметры изображения.
    1. Включите микроскоп и лазеры перед началом вскрытия. Изображения должны быть получены с помощью вертикального конфокального микроскопа с 40-кратной линзой погружения в воду. Используйте 405-нм лазер для возбуждения CFP и получения изображений в каналах обнаружения CFP (465-499 нм) и FRET (535-695 нм).
    2. Оптимизируйте параметры сбора, такие как скорость сканирования (6), среднее (2), объектив (40x), масштабирование (1x), размер точечного отверстия (1 а.е.) и пространственное разрешение (512 x 512). Отрегулируйте коэффициент усиления таким образом, чтобы сигнал находился в оптимальном динамическом диапазоне. Одни и те же параметры должны использоваться для всех генотипов.
  2. Изображение двигательных нейронов в VNC.
    1. Поместите силиконовую посуду с рассеченным образцом под линзу. Опустите линзу так, чтобы она соприкасалась с буфером трегалозы-сахарозы HL3 (см. 1.2.1). Очень важно убедиться, что объектив полностью погружен в буфер. При необходимости добавьте дополнительный буфер.
    2. Используйте каналы CFP и FRET, чтобы вручную выбрать оптический участок, который состоит по крайней мере из 6 моторных нейронов в фокусе, расположенных вдоль средней линии VNC. Двигательные нейроны идентифицируются на основе экспрессии датчика глюкозы и положения вдоль передне-задней оси.
    3. Получайте изображения каждые 10 с в течение 10 минут. Эти изображения представляют базовую линию.
  3. Стимулируют с помощью глюкозы, дополненной HL-3.
    1. Удалите трегалозу-сахарозу, содержащую HL3-буфер, с помощью пипетки Пастера и замените ее 5 мМ глюкозы с добавлением HL-3 (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 20 мМ MgCl2,10 мМ NaHCO3,115 мМ сахарозы, 5 мМ глюкозы, 5 мМ HEPES, рН 7,1). Этот шаг нужно выполнять с большой осторожностью, чтобы максимально избежать движения ВНК.
    2. Получайте изображения каждые 10 с в течение еще 10 минут. Эти изображения представляют фазу стимуляции.
  4. Сохраните изображения в виде файлов .czi или любого типа файлов, поддерживаемого программным обеспечением для обработки изображений, с именем файла, включая дату, генетический фон, экспериментальное состояние (базовый уровень или стимуляция) и используемые каналы.
  5. Повторно используйте параметры для изображения всех генотипов(рисунок 2A).

3. Обработка изображений и выбор ROI

  1. Откройте файлы czi в Fiji/ImageJ и установите цветовой режим: оттенки серого,выберите View Stack with: Hyperstackи выберите Разделить каналы на отдельные окна.
  2. Обрабатывайте изображения с помощью плагинов коррекции дрейфа: turboreg и stackreg. Каждый канал исправляется отдельно, выбрав Stackreg в разделе Плагины,а затем выбрав Трансформация: Перевод.
  3. Вручную выберите интересующие регионы (ROI), чтобы извлечь среднее значение серого цвета для каждого канала.
    1. Выберите РЕНТАБЕЛЬНОСТЬ инвестиций, отслеживая все двигательные нейроны, которые остаются в фокусе в течение всего временного ряда. Используйте менеджер ROI для сохранения контура каждого двигательного нейрона.
    2. Используйте функцию Multi-measure для измерения среднего значения серого цвета в каждом ROI в каждый момент времени. Скопируйте ROI, отслеживаемые от первого канала ко второму каналу для изображения перед стимуляцией.
    3. Повторите этот процесс для изображений постстимуляции в каждом канале, используя те же клетки/ROI, выбранные для изображения до стимуляции.

4. Анализ данных

  1. Рассчитайте соотношение FRET/CFP, используя средние значения серого цвета для каналов FRET и CFP. Изменения в соотношении FRET/CFP отражают изменения внутриклеточной концентрации глюкозы.
    1. Построение соотношений FRET/CFP для каждой рентабельности инвестиций и точки времени в зависимости от времени. В каждом VNC некоторые из ROI будут демонстрировать снижение соотношения FRET / CFP после стимуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это интерпретируется как неспособность некоторых нейронов поглощать глюкозу, возможно, из-за стресса, вызванного рассечениями, и поэтому исключаются из анализа. Остальные соотношения FRET/CFP для каждого ROI и временной точки усредняются для получения одного соотношения FRET/CFP на точку времени на генотип (только датчик глюкозы и датчик глюкозы с TDP-43G298S). Эти единичные соотношения FRET/CFP используются для всех последующих нормализаций. 31 ROI были проанализированы для элементов управления датчиками глюкозы и 24 ROI были проанализированы для TDP-43G298S.
  2. Базовая нормализация: Рассчитайте среднее значение соотношений FRET/CFP за первые 10 мин (исходный уровень), а затем нормализуйте отдельные соотношения FRET/CFP для каждой временной точки всего эксперимента до 10-минутного базового среднего значения (см. Рисунок 2B).
  3. Нормализация точки времени: Нормализуйте отношение TDP-43G298S FRET/CFP к соотношению FRET/CFP только с помощью датчика глюкозы в каждой точке времени (см. Рисунок 3A).
  4. Гистограммы: Для сравнения исходного уровня и стимуляции в виде гистограмм используйте соотношения FRET/CFP от 5-10 мин (исходный уровень) и 15-20 мин (стимуляция) для каждого генотипа. Нормализуйте отношение стимуляции к базовому соотношению (см. рисунок 3B).

5. Статистический анализ

  1. Оцените нормализованные наборы данных с помощью коррекции Манна-Уитни (для нормализации исходного уровня и временных точек) или теста Крусколла-Валиса (для гистограммного представления стимуляции по сравнению с базовыми соотношениями FRET/CFP).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Получение изображения датчика глюкозы в вентральном нервном канатике (VNC), ex vivo
Для определения различий в поглощении глюкозы в модели дрозофилы БАС на основе TDP-43 был использован генетически закодированный датчик глюкозы на основе FRET. Датчик содержал CFP и YFP, слитые с доменом связывания глюкозы из гена E. coli MglB. Связывание глюкозы вызывает конформационное изменение, которое может быть обнаружено путем флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) между CFP и YFP 10,11,12. Когда глюкоза не связана с датчиком, возбуждение CFP вызывает только эмиссию CFP, а когда глюкоза связывается, сигнал YFP может быть обнаружен из-за FRET, возникающего между CFP и YFP(рисунок 1A). Драйвер D42 GAL4 использовался для экспрессии датчика отдельно или вместе с ALS-ассоциированным мутантом TDP-43G298S в двигательных нейронах через двудольную систему экспрессии UAS-GAL414. Третьи личинки были рассечены в буфере HL3 без глюкозы и закреплены, чтобы обнажить нервно-мышечную систему, включая VNC, все еще связанный с нервно-мышечными соединениями через аксоны двигательных нейронов. VNC был сфотографирован с помощью 40-кратного водоемного объектива с пространственным разрешением 512 x 512 пикселей (см. Протокол и рисунок 1B). Сигналы CFP и FRET были получены в 465-499 нм и 535-695 нм соответственно после возбуждения CFP лазером 405 нм. Срез для изображения был выбран на основе плоскости, где VNC был виден с минимум шестью двигательными нейронами в фокусе вдоль средней линии. Выбранную плоскость визуализировали в течение 10 мин, захватывая изображение каждые 10 с для определения базовой флуоресценции. Файлы czi были сохранены как: genotype_sample#_baseline. После того, как 10-минутный курс был завершен для исходных условий, буфер был заменен глюкозой, дополненной HL3. Изображение было перефокусировано, чтобы найти ту же плоскость, которая была изображена в базовых условиях. Для всех образцов использовались одинаковые настройки изображения. Затем VNC снова визуализировали в течение 10 минут, получая новое изображение каждые 10 с и сохраняя как: genotype_sample # _post стимуляции для дальнейшего анализа.

Анализ изображений
Значительной проблемой экспериментов с визуализацией в реальном времени является дрейф, который VNC подвергают в течение 20-минутного интервала визуализации. Чтобы решить эту проблему, плагин коррекции дрейфа Stackreg использовался в FIJI до анализа изображений и выбора ROI (см. Протокол и рисунок 2A). 6-8 отдельных ячеек/ROI были выбраны из каждого VNC и очерчены с использованием канала FRET/YFP. Выделенные области были скопированы в канал CFP, а средние значения серого цвета были измерены с помощью функции нескольких измерений. Количественные оценки выполнялись путем сначала усреднения соотношений FRET/CFP на момент времени, а затем расчета среднего значения за все 10 мин на генотип. Эти средние значения затем использовались для нормализации соотношений FRET/CFP в каждой точке времени и строились с течением времени для получения первой оценки данных(рисунок 2B). Используя этот подход к нормализации, было обнаружено, что при стимуляции контрольные двигательные нейроны, экспрессирующие только датчик глюкозы, демонстрируют небольшое, но значительное увеличение поглощения глюкозы (3,9%,значение P < 0,0001), в то время как двигательные нейроны, экспрессирующие TDP-43G298S, демонстрируют значительно более высокое поглощение глюкозы (16,76%,значение P < 0,0001). Эти данные согласуются с протеинопатией TDP-43, вызывающей повышенное поглощение глюкозы в двигательных нейронах, как ранее показано в ссылке9.

Анализ данных - измерение поглощения глюкозы в двигательных нейронах в Drosophila VNC
Чтобы получить дальнейшее представление о различиях между контрольной группой и мутантными моторными нейронами TDP-43G298S, каждое соотношение FRET/CFP было нормализовано для контроля в каждый моментвремени (рисунок 3A). Это позволяет сравнивать поглощение глюкозы между моторными нейронами БАС, экспрессирующими TDP-43G298S, и контрольными моторными нейронами, экспрессирующими только датчик глюкозы в режиме реального времени. В исходных условиях не было никакой разницы между генотипами. Однако при стимуляции глюкозой наблюдалось быстрое (7,31% после 1 мин применения глюкозы) и значительное увеличение (12,76% через 10 мин,значение P < 0,0001) поглощения глюкозы в TDP-43G298S по сравнению с контролем.

Гистограммы предлагают альтернативный подход к иллюстрированию различий между генотипами (TDP-43G298S по сравнению с контрольной группой) до и после стимуляции глюкозой(рисунок 3B). Это было сделано путем нормализации соотношения FRET/CFP для обоих состояний к исходному уровню соответствующих генотипов и построения среднего соотношения за последние 5 мин исходной и стимулирующей визуализации, соответственно. При стимуляции нейроны, экспрессирующие только датчик глюкозы, показывают небольшое, но значительное увеличение соотношения FRET/CFP (3,83% ± 0,08%,значение P < 0,0001) по сравнению с исходным уровнем. Принимая во внимание, что нейроны, экспрессирующие TDP-43G298S, показали значительное увеличение соотношения FRET/CFP при стимуляции (14,73% ± 0,08%,значение P < 0,0001) по сравнению с исходным уровнем. Чистая разница в соотношениях FRET/CFP между моторными нейронами, экспрессирующими TDP-43G298S, и только датчиком глюкозы составляет 10,9%(значение P = 0,005). Этот анализ также показывает, что соотношения стабилизируются примерно в течение последних 5 минут каждой визуализации временного курса, поэтому этот временной интервал был выбран для графика. Этот анализ обеспечивает высокоуровневый обзор результатов, включая статистически значимые различия между генотипами и методами лечения на одном графике.

Figure 1
Рисунок 1:Датчик FRET и получение изображения. (A)Диаграмма датчика глюкозы на основе FRET, используемая для измерения поглощения глюкозы в двигательных нейронах. Связывание глюкозы вызывает FRET. (B) Диаграмма рассечения нервно-мышечного соединения (NMJ), показывающая область, изображенную в VNC. Изображения слева, показывающие TDP-43G298S до и после стимуляции глюкозой в каналах FRET (YFP) и CFP. Шкала: 20 мкм. Увеличение: 40x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Анализ изображения датчика глюкозы в контексте мутанта TDP-43. (A) Репрезентативные изображения сигналов FRET и CFP в контрольных элементах управления датчиками глюкозы и образцах TDP-43G298S в исходных условиях и условиях стимуляции. Репрезентативный двигательный нейрон очерчен на каждом изображении в качестве примера ROI. Шкала баров: 20 мкм. Увеличение: 40x. (B) Средние соотношения FRET/CFP в датчике глюкозы и мутантных моторных нейронах TDP-43 за 20 мин визуализации. Коэффициенты были нормализованы к среднему исходному соотношению для каждого генотипа (см. нормализацию исходных условий в Протоколе). Показанные значения представляют собой среднее значение 25-30 моторных нейронов (ROI) из 5 ВНК на генотип. Манн-Уитни использовался для оценки статистической значимости. =Значение P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Анализ данных датчика глюкозы в контексте TDP-43G298S. (A)Соотношение FRET/CFP TDP-43G298S нормализуется для контроля датчика глюкозы в каждый момент времени. Манн-Уитни использовался для оценки статистической значимости. =Значение P < 0,0001. (B)Гистограммное представление поглощения глюкозы в контроле датчиков глюкозы и TDP-43G298S показывает значительное увеличение поглощения глюкозы в контрольных двигательных нейронах при стимуляции и в контексте TDP-43G298S по сравнению с контрольной группой. Крусколл-Валис использовался для оценки статистической значимости. ** =значение P < 0,01, **** =значение P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, подробно описанный здесь, может быть применен для измерения поглощения глюкозы в определенном типе клеток, представляющих интерес для живой дрозофилы, с использованием FLII12Pglu-700μδ6, датчика на основе FRET, который может обнаруживать изменения уровня глюкозы в миллимолярномдиапазоне10,11,12. Этот датчик ранее использовался в сочетании с системой UAS-GAL4 для нацеливания его экспрессии на конкретные типы клеток, включая нейроны9,10. В этом исследовании D42 GAL4 использовался для экспрессии FLII12Pglu-700μδ6 самостоятельно или вместе с ассоциированным заболеванием TDP-43G298S, чтобы продемонстрировать, как этот подход может быть использован для оценки поглощения глюкозы в двигательных нейронах БАС. Кроме того, этот метод может быть широко применен для изображения множества флуоресцентных датчиков в личиночном VNC.

Критические шаги в протоколе включают максимизацию отношения сигнал/шум. С этой целью параметры захвата изображения были установлены таким образом, чтобы флуоресценция не была перенасыщенной, а весь диапазон интенсивности сигнала можно было количественно оценить. Параметры изображения, такие как коэффициент усиления, скорость сканирования, размер точечного отверстия и зум, оставались неизменными на протяжении всего исследования. Эксперименты проводились в течение нескольких дней; однако в каждом эксперименте оба генотипа, т.е. контроль и TDP-43G298S, были изображены вместе, чтобы учесть изменчивость. Визуализация личинок ЦНС Drosophila с использованием погружной линзы воды может привести к изменениям оптической плоскости с течением времени. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать резких изменений в оптической плоскости, используя достаточный буфер. Образцы с изменениями фокуса были отброшены.

Хотя условия и параметры сохраняются неизменными на протяжении всех экспериментов, этот метод требует изменения буфера во время визуализации. После 10 мин визуализации буфер без глюкозы должен быть заменен буфером HL-3, дополненным глюкозой, который может изменить оптическую фокальную плоскость. Хрусталик должен быть перефокусирован на одну и ту же фокальную плоскость, чтобы один и тот же набор клеток был изображен до и после приема добавок глюкозы. Подмножество двигательных нейронов показало снижение соотношения FRET/CFP после стимуляции. Это указывает на то, что некоторые нейроны не поглощают глюкозу, возможно, из-за стресса, вызванного рассечением, и были исключены из анализа.

Выбор ROI, обработка изображений и количественная оценка были выполнены с использованием Fiji/ImageJ. Хотя окупаемость инвестиций выбирается вручную в первом изображении серии, крайне важно исправить незначительный дрейф в покадровой визуализации, чтобы сохранить рентабельность инвестиций неизменной на протяжении всей серии изображений. Плагин с открытым исходным кодом для коррекции дрейфа, Stackreg, был использован для учета этой проблемы.

Наличие правильного лазера возбуждения является основным ограничением этой техники. Хотя лазер возбуждения 436 нм идеально подходит для этого датчика глюкозы, мы показали, что датчик можно использовать с лазером возбуждения 405 нм, который более широко доступен. Другим ограничением этого метода является то, что его можно использовать для измерения динамики глюкозы, но не абсолютных концентраций глюкозы. Потенциальной альтернативной стратегией измерения абсолютного уровня глюкозы является iGlucoSnFR-TS, пожизненный датчик глюкозы, который может быть откалиброван для измерения абсолютных концентраций глюкозы15.

Глюкоза является основным источником энергии в мозге и необходима для физиологических функций. Дефекты метаболизма глюкозы были связаны с несколькими патологическими состояниями (рассмотрено в16). Дрозофила является мощной генетической моделью, используемой для изучения нейродегенеративных расстройств17. Тем не менее, существуют ограниченные методы, доступные для непосредственного измерения уровня глюкозы у дрозофилы. Этот датчик глюкозы на основе FRET обеспечивает прямое измерение внутриклеточных изменений уровня глюкозы. Несмотря на некоторые экспериментальные проблемы и ограничения, этот датчик может быть успешно использован для изучения динамики глюкозы в определенных типах клеток (например, двигательных нейронах, глии, мышцах) в различных моделях заболеваний, включая несколько типов БАС и связанных с ними нейродегенеративных расстройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Стефани Ширмайер и Такеши Ивацубо за предоставление штаммов дрозофилы. Мы также благодарим Патрисию Янсму за помощь в визуализации в Marley Imaging Core в Университете Аризоны. Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения NIH NS091299, NS115514 (для DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (для EM) и Программой исследований биологии бакалавриата (для HB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
  2. Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
  3. Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
  4. Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
  5. Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
  6. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  7. Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
  8. Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
  9. Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
  10. Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
  11. Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
  12. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
  13. Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
  16. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
  17. Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).

Tags

Неврология выпуск 174 датчик глюкозы БАС дрозофила,TDP-43 протеинопатия
Измерение поглощения глюкозы в моделях <em>дрозофилы</em> протеинопатии TDP-43
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo,… More

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter