Summary
Glukoseoptagelse øges i Drosophila motoriske neuroner, der er påvirket af TAR DNA-bindende protein (TDP-43) proteinopati, som angivet af en FRET-baseret, genetisk kodet glukosesensor.
Abstract
Amyotrofisk lateral sklerose er en neurodegenerativ lidelse, der forårsager progressiv muskelsvaghed og død inden for 2-5 år efter diagnosen. Kliniske manifestationer omfatter vægttab, dyslipidæmi, og hypermetaboli; Det er dog fortsat uklart, hvordan disse vedrører motor neuron degeneration. Ved hjælp af en Drosophila model af TDP-43 proteinopati, der opsummerer flere funktioner i ALS, herunder cytoplasmaiske indeslutninger, lokomotorisk dysfunktion, og reduceret levetid, vi for nylig identificeret vidtrækkende metaboliske underskud. Blandt disse, glykolyse blev anset for at være opreguleret og genetisk interaktion eksperimenter forudsat dokumentation for en kompenserende neuroprotektive mekanisme. På trods af upregulation af phosphofructokinase, den satsbegrænsende enzym i glykolyse, viste en stigning i glykolyse ved hjælp af kost- og genetiske manipulationer sig at afbøde lokomotorisk dysfunktion og øget levetid i flyvemodeller af TDP-43 proteinopati. For yderligere at undersøge effekten på TDP-43 proteinopati på glykolytisk flux i motoriske neuroner, en tidligere rapporteret genetisk kodet, FRET-baserede sensor, FLII12Pglu-700μδ6, blev brugt. Denne sensor består af en bakteriel glukose-sensing domæne og cyan og gul fluorescerende proteiner som FRET par. Ved glukosebinding gennemgår sensoren en kropsbygningsændring, der gør det muligt for FRET at forekomme. Ved hjælp af FLII12Pglu-700μδ6, glukose optagelse viste sig at være signifikant øget i motoriske neuroner udtrykker TDP-43G298S, en ALS forårsager variant. Her viser vi, hvordan man måler glukoseoptagelse, ex vivo, i larve ventrale nerveledningspræparater, der udtrykker glukosesensoren FLII12Pglu-700μδ6 i forbindelse med TDP-43 proteinopati. Denne tilgang kan bruges til at måle glukoseoptagelse og vurdere glykolytisk flux i forskellige celletyper eller i forbindelse med forskellige mutationer, der forårsager ALS og relaterede neurodegenerative lidelser.
Introduction
Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS) er en progressiv neurodegenerativ lidelse, der i øjeblikket er uhelbredelig. ALS påvirker øvre og nedre motoriske neuroner, der fører til tab af motorisk koordination, irreversibel lammelse, respirationssvigt og eventuel død inden for 2-5 år efterdiagnosen 1. ALS er forbundet med metaboliske defekter såsom vægttab, dyslipidæmi og hypermetabolisme (gennemgået i2); Det er dog fortsat uklart, hvordan disse ændringer i stofskiftet vedrører motor neuron degeneration. En fællesnævner i ALS og relaterede neurodegenerative sygdomme er TDP-43, et nukleinsyrebindingsprotein, der er involveret i flere trin af RNA-behandling3,4,5. Selvom mutationer i TDP-43 kun påvirker 3%-5% af patienterne, findes vildt type TDP-43 protein inden for cytoplasmaiske aggregater i >97% af ALS-tilfælde (gennemgået i6). Denne patologi blev modelleret i Drosophila ved overekspression af human wildtype eller mutant TDP-43 (G298S) i motoriske neuroner, som opsummerer flere aspekter af ALS, herunder cytoplasmaiske indeslutninger, lokomotorisk dysfunktion og reduceret levetid7,8. Ved hjælp af disse modeller blev det for nylig rapporteret, at TDP-43 proteinopati forårsager en betydelig stigning i pyruvatniveauer og phosphofructokinase (PFK) mRNA, det satsbegrænsende enzym af glykolyse9. Lignende stigninger i PFK udskrifter blev fundet i patient-afledte motoriske neuroner og rygmarv, tyder på, at glykolyse er opreguleret i forbindelse med TDP-43 proteinopati. Interessant, yderligere stigning i glykolyse ved hjælp af kosten og genetiske manipulationer afbødes flere ALS fænotyper såsom lokomotorisk dysfunktion og øget levetid i flyve modeller af TDP-43 proteinopati, i overensstemmelse med en kompenserende, neuroprotektive mekanisme i degenererende motoriske neuroner.
For yderligere sondeændringer i glykolyse og måle glukoseoptagelse i Drosophila-modeller af TDP-43 proteinopati blev en tidligere rapporteret genetisk kodet FRET-baseret sensor FLII12Pglu-700μδ610 udtrykt i motoriske neuroner specifikt ved hjælp af UAS-GAL4-ekspressionssystemet. FLII12Pglu-700μδ6 glukosesensoren bruger resonansenergioverførsel mellem to varianter af grønt fluorescerende protein, cyan og gule fluorescerende proteiner (CFP og YFP) til at detektere glukose på celleniveau. Den består af et bakteriel glukosebindingsdomæne fra E. coli MglB-genet, der er smeltet til cfp og YFP i modsatte ender af molekylet. Når sensoren bindes til et glukosemolekyle, gennemgår den en kropsbygningsændring, der bringer den fælles fiskeripolitik og YFP tættere sammen og gør det muligt for FRET at forekomme, som derefter kan bruges til at kvantificere intracellulære glukoseniveauer10,11,12 ( Figur1). Her viser vi, hvordan FLII12Pglu-700μδ6 sensoren kan bruges til at bestemme ændringer i glukoseoptagelse forårsaget af TDP-43 proteinopati i motoriske neuroner. De eksperimenter, der er beskrevet her, viser, at overekspression af en ALS-associeret mutant, TDP-43G298S, i motoriske neuroner forårsager en betydelig stigning i glukoseoptagelse sammenlignet med kontroller. Denne fremgangsmåde kan anvendes i andre typer als (f.eks. SOD1, C9orf72 osv.) og/eller andre celletyper (f.eks. glia, muskler) til at bestemme ændringer i glukoseoptagelse forbundet med neurodegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgene fluer blev rapporteret i Volkenhoff et al.10 og venligst leveret af Dr. S. Schirmeier. UAS TDP-43G298S transgene linjer blev venligst leveret af Dr. T. Iwatsubo13. Rekombinant Drosophila linjer huser både UAS FLII12Pglu-700μδ6 og UAS TDP-43 transgener blev genereret i Zarnescu laboratoriet ved hjælp af standard genetiske tilgange og rapporteret i Manzo et al.9. D42 GAL4 blev brugt til at drive ekspressiksionen af glukosesensoren alene eller sammen med TDP-43G298S i motoriske neuroner. Alle fluelinjer vedligeholdes på melasse cornmeal medier, ved 25 °C i 12 timer mørk:lys cyklus.
1. Drosophila Ventral Nerve Cord (VNC) dissektioner
- Lav silikone elastomer dissektion retter.
- Hæld silikoneelastomerkomponenter i et 50 mL rør som angivet i producentens protokol og rør godt.
- Fyld 35 mm vævskulturretter med ca. 2 mL af elastomerblandingen. Brug en sprøjte til at fjerne eventuelle bobler. Dæk opvasken og læg dem på en plan overflade i en 60 °C ovn natten over for at helbrede.
- Dissekere Drosophila larver til at udsætte VNC samtidig opretholde væv levedygtighed.
- Saml en vandrende tredje instar larve, skyl med ddH2O, og derefter placere den i en dråbe HL3-buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM saccharose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7.1) på en elastomer foret fad.
- Ved hjælp af et par pinps (# 5 eller 55 pinps) under en dissekering mikroskop, pin den forreste og bageste ender af larven dorsale side op, omhyggeligt strækker larven på langs med insektnåle (Minutein Pins).
- Lav et snit lige over den bageste pin ved hjælp af et par vinklede iris saks. Lav et lodret snit, der starter fra snittet mod den forreste ende af larven.
- Tilføj et par dråber HL-3 buffer, hvis det er nødvendigt. Fjern luftrøret og resten af de flydende organer uden at forstyrre CNS. Pin klapperne strækker kroppen væggen til at udsætte CNS samtidig holde neuromuskulære system (VNCs, axoner, og neuromuskulære knudepunkter) intakt.
2. Billedopkøb
- Optimer billedparametrene.
- Tænd for mikroskopet og laserne, før du starter dissektioner. Billeder skal erhverves ved hjælp af et opretstående konfokalt mikroskop med en 40x vand nedsænkning linse. Brug en 405 nm laser til at ophidse den fælles fiskeripolitik og erhverve billederne i både den fælles fiskeripolitik (465-499 nm) og FRET(535-695 nm) detektionskanaler.
- Optimer anskaffelsesparametre som scanningshastighed (6), gennemsnit (2), målsætning (40x), zoom (1x), pinhole størrelse (1 AU) og rumlig opløsning (512 x 512). Juster forstærkningen, så signalet er i det optimale dynamikområde. De samme parametre skal bruges til alle genotyper.
- Billede motoriske neuroner inden for VNC.
- Placer silikoneskålen med den dissekerede prøve under linsen. Sænk objektivet, så det kommer i kontakt med trehalose-saccharose HL3-buffer (se 1.2.1). Det er vigtigt at sikre, at linsen er helt nedsænket i bufferen. Tilføj mere buffer, hvis det er nødvendigt.
- Brug kanalerne CFP og FRET til manuelt at vælge en optisk sektion, der består af mindst 6 motoriske neuroner i fokus, der er placeret langs VNC-midterlinjen. De motoriske neuroner identificeres baseret på ekspressiksatoren og position langs den forreste bageste akse.
- Erhverve billeder hver 10 s i 10 min. Disse billeder repræsenterer grundlinjen.
- Stimulere med glukose suppleret HL-3.
- Fjern trehalose-saccharose indeholdende HL3-buffer ved hjælp af en Pasteur pipette og erstatte den med 5 mM glukose suppleret HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM saccharose, 5 mM glukose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Dette trin skal udføres med stor omhu, for at undgå flytning af VNC så meget som muligt.
- Erhverve billeder hver 10 s for en anden 10 min. Disse billeder repræsenterer stimuleringsfasen.
- Gem billederne som .czi-filer eller en hvilken som helst filtype, der understøttes af billedbehandlingssoftwaren, med et filnavn, herunder dato, genetisk baggrund, eksperimentel tilstand (baseline eller stimulering) og anvendte kanaler.
- Genbrug parametrene til at afbilde alle genotyperne (Figur 2A).
3. Billedbehandling og valg af investeringsafkast
- Åbn czi-filerne i Fiji/ImageJ , og angiv Farvetilstand: Gråtoneskala, vælg Vis stak med: Hyperstack, og vælg Opdel kanaler i separate Vinduer.
- Behandle billeder ved hjælp af drift korrektion plugins: turboreg og stackreg. Hver kanal rettesseparat ved at vælge Stackreg under Plugins og derefter vælge Transformation: Oversættelse.
- Vælg manuelt de interesseområder(INVESTERINGSAFKAST) for at udtrække den gennemsnitlige grå værdi for hver kanal.
- Vælg INVESTERINGSAFKAST ved at spore alle motoriske neuroner, der forbliver i fokus i hele tidsserien. Brug ROI manager til at gemme hver motor neuron skitse.
- Brug funktionen Multimål til at måle den gennemsnitlige grå værdi i hvert investeringsafkast på hvert tidspunkt. Kopier de investeringsafkast, der spores fra den første kanal, til den anden kanal for billedet før stimulering.
- Gentag denne proces for post-stimulation billeder i hver kanal ved hjælp af de samme celler / ROIs valgt til pre-stimulation billede.
4. Dataanalyse
- Beregn FRET/CFP-forholdet ved hjælp af de gennemsnitlige grå værdier for FRET- og FFP-kanalerne. Ændringer i FRET/CFP-forholdet afspejler ændringer i den intracellulære glukosekoncentration.
- Plot FRET/CFP-nøgletal for hvert investeringsafkast og klokkeslæt i forhold til klokkeslæt. Inden for hver VNC vil nogle af ROI'erne udvise et fald i FRET / CFP-nøgletal efter stimulering.
BEMÆRK: Dette fortolkes som en manglende evne til nogle neuroner til at optagelse glukose, muligvis på grund af stress forårsaget af dissektioner og er derfor elimineret fra analysen. De resterende FRET/CFP-nøgletal for hvert investeringsafkast og tidspunkt beregnes i gennemsnit for at generere et enkelt FRET/CFP-forhold pr. gangpunkt pr. genotype (glukosesensor alene og glukosesensor med TDP-43G298S). Disse enkelte FRET/FFP-nøgletal bruges til alle efterfølgende normaliseringer. 31 ROI'er blev analyseret for glukosesensorkontroller, og 24 ROI'er blev analyseret for TDP-43G298S.
- Plot FRET/CFP-nøgletal for hvert investeringsafkast og klokkeslæt i forhold til klokkeslæt. Inden for hver VNC vil nogle af ROI'erne udvise et fald i FRET / CFP-nøgletal efter stimulering.
- Oprindelig normalisering: Beregn gennemsnittet af FRET/CFP-nøgletal for de første 10 min (baseline), og normaliser derefter individuelle FRET/FFP-nøgletal for hvert gangpunkt i hele eksperimentet til basisgennemsnittet på 10 min (se figur 2B).
- Normalisering af tidsfrister: Normaliser TDP-43G298S FRET/CFP-forholdet til FRET/CFP-forhold fra glukosesensor alene på hvert tidspunkt (se figur 3A).
- Søjlegrafer: For baseline versus stimulation sammenligninger i form af søjle grafer, skal du bruge FRET / CFP nøgletal fra 5-10 min (baseline) og 15-20 min (stimulation) for hver genotype. Normalisere stimuleringsforholdet til grundforholdet (se figur 3B).
5. Statistiske analyser
- Vurder de normaliserede datasæt ved hjælp af Mann-Whitney-korrektion (for baseline- og timepoint-normaliseringer) eller Kruskall-Walis-testen (for søjlediagramrepræsentation af stimulering versus baseline FRET/CFP-nøgletal).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Billedopsamling af glukosesensoren i ventralnervens (VNC), ex vivo
For at bestemme forskelle i glukoseoptagelse i en Drosophila-model af ALS baseret på TDP-43 blev der anvendt en genetisk kodet FRET-baseret glukosesensor. Sensoren bestod af cfp og YFP smeltet til glukosebindingsdomænet fra E. coli MglB-genet. Glukosebinding fremkalder en kropsbygningsændring, som kan detekteres ved fluorescens resonansenergioverførsel (FRET) mellem den fælles fiskeripolitik og YFP 10,11,12. Når glukose ikke er bundet til sensoren, forårsager excitation af den fælles fiskeripolitik kun cfp-emission, og når glukose binder, kan YFP-signalet detekteres på grund af FRET, der forekommer mellem den fælles fiskeripolitik og YFP (figur 1A). D42 GAL4 føreren blev brugt til at udtrykke sensoren alene eller sammen med ALS-associerede mutant TDP-43G298S i motoriske neuroner via den tværpolitiske UAS-GAL4 udtrykssystem14. Tredje instar larver blev dissekeret i HL3 buffer uden glukose og fastgjort til at udsætte neuromuskulære system, herunder VNC stadig forbundet til neuromuskulære vejkryds via motor neuron axons. VNC blev afbildet ved hjælp af en 40x vand nedsænkning linse med en rumlig opløsning på 512 x 512 pixels (se Protokol og Figur 1B). CFP- og FRET-signalerne blev erhvervet i henholdsvis 465-499 nm og 535-695 nm efter excitation af den fælles fiskeripolitik med 405 nm laseren. Skiven, der skal afbildes, blev valgt baseret på det plan, hvor VNC var synlig med mindst seks motoriske neuroner i fokus langs midterlinjen. Det valgte plan blev afbildet i 10 min, indfange et billede hver 10 s til at bestemme baseline fluorescens. Czi-filerne blev gemt som: genotype_sample #_baseline. Efter at 10 min tid kurset var afsluttet for baseline betingelser, blev bufferen erstattet med glukose suppleret HL3. Billedet blev omfokuseret for at finde det samme plan, der blev afbildet under oprindelige forhold. De samme billedindstillinger blev brugt til alle prøver. VNC blev derefter afbildet igen i 10 min erhverve et nyt billede hver 10 s og gemt som: genotype_sample # _post stimulation for yderligere analyser.
Billedanalyse
En betydelig udfordring med levende billeddannelse eksperimenter er den drift, at VNCs gennemgår i løbet af 20 min billeddannelse interval. For at løse dette problem, en drift korrektion plugin, Stackreg blev brugt i FIJI forud for billedanalyse og ROI udvælgelse (se Protokol og Figur 2A). 6-8 individuelle celler/ROI'er blev udvalgt fra hver VNC og skitseret ved hjælp af FRET/YFP-kanalen. Valgene blev kopieret til den fælles fiskeripolitiks kanal, og de gennemsnitlige grå værdier blev målt ved hjælp af funktionen multimål. Kvantificeringerne blev udført ved først at i gennemsnit fret/ffp-forholdet pr. tidspunkt og derefter beregne gennemsnittet for hele 10 min pr. genotype. Disse gennemsnit blev derefter brugt til at normalisere FRET/FFP-nøgletallene på hvert tidspunkt og afbildet over tid for at generere en første evaluering af dataene (figur 2B). Ved hjælp af denne normaliseringsmetode blev det konstateret, at ved stimulering, kontrol motoriske neuroner udtrykker glukose sensor alene, udviser en lille, men betydelig stigning i glukoseoptagelse (3,9%,P-værdi < 0,0001), mens motoriske neuroner udtrykker TDP-43G298S viser en betydeligt højere glukoseoptagelse (16,76%,P-værdi < 0,0001). Disse data er i overensstemmelse med TDP-43 proteinopati forårsager øget glukose optagelse i motoriske neuroner, som tidligere vist i reference9.
Dataanalyser - måling af glukoseoptagelse i motoriske neuroner i Drosophila VNC
For at få yderligere indsigt i forskelle mellem kontroller og TDP-43G298S mutant motor neuroner, hver FRET / CFP forholdet blev normaliseret til kontrol på hvert tidspunkt (Figur 3A). Dette giver mulighed for en sammenligning i glukoseoptagelse mellem ALS motoriske neuroner, der udtrykker TDP-43G298S og styrer motoriske neuroner, der udtrykker glukosesensoren alene i realtid. Under oprindelige betingelser var der ingen forskel mellem genotyperne. Ved stimulering med glukose blev der dog observeret en hurtig (7,31% efter 1 min glukosepåføring) og en signifikant stigning (12,76% efter 10 min,P-værdi < 0,0001) i glukoseoptagelse i TDP-43G298S sammenlignet med kontrollen.
Søjlediagrammer tilbyder en alternativ tilgang til at illustrere forskelle mellem genotyper (TDP-43G298S versus kontrol) før og efter glukosestimulering (Figur 3B). Dette blev gjort ved at normalisere FRET/CFP-forholdet for begge forhold til basislinjen for de respektive genotyper og ved at afbilde det gennemsnitlige forhold for de sidste 5 min baseline og stimulationsbilleddannelse. Ved stimulering viser neuroner, der udtrykker glukosesensor alene, en lille, men signifikant stigning i FRET/CFP-forholdet (3,83 % ± 0,08 %,P-værdi < 0,0001) sammenlignet med baseline. Mens neuroner, der udtrykker TDP-43G298S, udviste en signifikant stigning i FRET/CFP-forholdet ved stimulering (14,73 % ± 0,08 %, <P-værdi 0,0001) sammenlignet med basislinjen. Nettoforskellen i FRET/CFP-forholdet mellem motoriske neuroner, der udtrykker TDP-43G298S og glukosesensor alene, er 10,9%(P-værdi = 0,005). Denne analyse viser også, at nøgletallene stabilisere omkring de sidste 5 min af hver gang-kursus billeddannelse, så denne tidsramme blev valgt til grafen. Denne analyse giver et overblik på højt niveau over resultaterne, herunder statistisk signifikante forskelle mellem genotyper og behandlinger i en graf.
Figur 1: FRET sensor og billedopsamling. (A) FRET-baserede Glukose sensor diagram bruges til at måle glukose optagelse i motoriske neuroner. Glukosebinding forårsager FRET. (B) Diagram over neuromuskulær junction (NMJ) dissektion, der viser område afbilledet i VNC. Billeder til venstre, der viser TDP-43G298S før og efter glukosestimulering i både FRET (YFP) og CFP-kanaler. Skalastænger: 20 μm. Forstørrelse: 40x. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billedanalyse af glukosesensor i forbindelse med TDP-43 mutant. (A) Repræsentative billeder af FRET- og FFP-signaler i glukosesensorkontroller og TDP-43G298S-prøver under baseline- og stimuleringsforhold. En repræsentativ motor neuron er skitseret i hvert billede som et eksempel på et investeringsafkast. Skalastænger: 20 μm. Forstørrelse: 40x. (B) De gennemsnitlige forhold mellem FRET/FFP i glukosesensor og TDP-43 mutantmotorneuroner over 20 min billeddannelse. Forholdet blev normaliseret til det gennemsnitlige oprindelige forhold for hver genotype (se den oprindelige normalisering i protokollen). De viste værdier er gennemsnittet på 25-30 motoriske neuroner (ROI) fra 5 VNCs pr. genotype. Mann-Whitney blev brugt til at vurdere statistisk signifikans. =P-værdi < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dataanalyse af glukosesensor i forbindelse med TDP-43G298S. (A) FRET/CFP-forholdet mellem TDP-43G298S normaliseres til glukosesensorkontrol på hvert tidspunkt. Mann-Whitney blev brugt til at vurdere statistisk signifikans. =P-værdi < 0,0001. (B) Bar graf repræsentation af glukose optagelse i Glukose Sensor kontrol og TDP-43G298S viser en betydelig stigning i glukose optagelse i kontrol motoriske neuroner ved stimulering og i forbindelse med TDP-43G298S i forhold til kontrol. Kruskall-Walis blev brugt til at vurdere statistisk signifikans. ** =P-værdi < 0,01, **** =P-værdi < 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den teknik, der er beskrevet i detaljer her, kan anvendes til at måle glukoseoptagelse i en bestemt celletype af interesse for levende Drosophila ved hjælp af FLII12Pglu-700μδ6, en FRET-baseret sensor, der kan registrere ændringer i glukoseniveauer til et millimolarområde10,11,12. Denne sensor er tidligere blevet brugt sammen med UAS-GAL4-systemet til at målrette sit udtryk mod bestemte celletyper, herunder neuroner9,10. I denne undersøgelse blev D42 GAL4 brugt til at udtrykke FLII12Pglu-700μδ6 alene eller sammen med sygdomsrelaterede TDP-43G298S for at demonstrere, hvordan denne tilgang kan bruges til at evaluere glukoseoptagelse i ALS motoriske neuroner. Desuden kan denne metode anvendes bredt til at afbilde et væld af fluorescerende sensorer i larven VNC.
Kritiske trin i protokollen omfatter maksimering af signal-til-støj-forholdet. Til dette formål blev billedopsamlingsparametrene indstillet således, at fluorescensen ikke overmættet, og hele spektret af signalintensitet kan kvantificeres. Billedbehandling parametre såsom gain, scanning hastighed, pinhole størrelse, og zoom forblev uændret i hele undersøgelsen. Forsøgene blev udført over flere dage; I hvert forsøgblev både genotyperne, dvs. Imaging Drosophila larve CNS ved hjælp af en vand nedsænkning linse kunne give anledning til optiske fly ændringer over tid. Der bør udvises forsigtighed for at undgå drastiske ændringer i optensopplanet ved hjælp af tilstrækkelig buffer. Prøver med ændringer i fokus blev kasseret.
Selvom betingelserne og parametrene opretholdes uændret under eksperimenterne, kræver denne teknik en ændring i bufferen under billeddannelse. Efter 10 minutters billeddannelse skal glukosefri buffer erstattes med glukose suppleret HL-3 buffer, hvilket kan ændre det optiske brændplan. Linsen skal re-fokuseret til det samme fokusplan, således at det samme sæt celler er afbildet før og efter glukose tilskud. En delmængde af motoriske neuroner udviste et fald i FRET / CFP nøgletal efter stimulering. Dette indikerer, at nogle neuroner ikke optagelse glukose, muligvis på grund af stress forårsaget af dissektion og blev fjernet fra analysen.
Valg af investeringsafkast, billedbehandling og kvantificering blev udført ved hjælp af Fiji/ImageJ. Mens ROI vælges manuelt i det første billede af serien, er det afgørende at korrigere mindre drift i tide bortfalder billeddannelse for at holde ROI ufravigelig i hele billedbehandling serien. Et open source-afdriftskorrektions-plugin, Stackreg, blev brugt til at tage højde for dette problem.
Tilgængelighed af den rigtige excitation laser er en stor begrænsning for denne teknik. Selvom 436 nm excitation laser er ideel til denne glukosesensor, har vi vist, at sensoren kan bruges med 405 nm excitation laser, som er mere bredt tilgængelig. En anden begrænsning af denne teknik er, at den kan bruges til at måle glukosedynamikken, men ikke absolutte glukosekoncentrationer. En potentiel alternativ strategi til måling af absolutte glukoseniveauer er iGlucoSnFR-TS, en levetid glukosesensor, som kan kalibreres til at måle absolutte glukosekoncentrationer15.
Glukose er en vigtig energikilde i hjernen og er nødvendig for fysiologiske funktioner. Defekter i glukosemetabolismen har været forbundet med flere patologiske tilstande (gennemgået i16). Drosophila er en kraftfuld genetisk model, der bruges til at studere neurodegenerative lidelser17. Der er dog begrænsede teknikker til rådighed til direkte måling af glukoseniveauer i Drosophila. Denne FRET-baserede glukosesensor giver et direkte mål for intracellulære ændringer i glukoseniveauet. På trods af nogle eksperimentelle udfordringer og begrænsninger kan denne sensor med succes bruges til at studere glukosedynamik i specifikke celletyper (f.eks. motoriske neuroner, glia, muskler) i forskellige sygdomsmodeller, herunder flere typer ALS og relaterede neurodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Stefanie Schirmeier og Takeshi Iwatsubo for at give Drosophila stammer. Vi takker også Patricia Jansma for at hjælpe med billeddannelse i Marley Imaging Core på University of Arizona. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (til DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (til EM) og Undergraduate Biology Research Program (til HB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H.
