Summary
La tomografía microcomputarizada de doble fundición de resina, o DUCT, permite la visualización, digitalización y segmentación de dos sistemas tubulares simultáneamente para facilitar el análisis 3D de la arquitectura de órganos. DUCT combina la inyección ex vivo de dos resinas radiopacas seguida de la tomografía microcomputarizada y la segmentación de los datos tomográficos.
Abstract
El hígado es el órgano interno más grande en humanos y ratones, y la alta autofluorescencia presenta un desafío significativo para evaluar la arquitectura tridimensional (3D) del órgano a nivel de todo el órgano. La arquitectura hepática se caracteriza por múltiples estructuras lumenizadas ramificadas, que pueden llenarse con resina, incluidos árboles vasculares y biliares, estableciendo un patrón altamente estereotipado en el parénquima rico en hepatocitos. Este protocolo describe la tubería para realizar tomografía microcomputarizada de doble fundición de resina, o "DUCT". DUCT implica inyectar la vena porta y el conducto biliar común con dos resinas sintéticas radiopacas diferentes, seguidas de la fijación del tejido. El control de calidad mediante la limpieza de un lóbulo, o todo el hígado, con un agente de limpieza óptica, permite la preselección de muestras inyectadas adecuadamente. En la segunda parte de la tubería DUCT, se puede utilizar un lóbulo o todo el hígado para la tomografía microcomputarizada (microCT), la segmentación (semi)automatizada y la representación 3D de las redes venosas y biliares portales. MicroCT da como resultado datos de coordenadas 3D para las dos resinas, lo que permite un análisis cualitativo y cuantitativo de los dos sistemas y su relación espacial. DUCT se puede aplicar al hígado de ratón postnatal y adulto y se puede extender aún más a otras redes tubulares, por ejemplo, redes vasculares y vías respiratorias en los pulmones.
Introduction
La fundición de resina de órgano es una técnica que se remonta al siglo 171. Uno de los primeros ejemplos de fundición de resina moderna se realizó en el hígado humano a partir de una autopsia. Los conductos biliares intrahepáticos se rellenaron con un agente de contraste mezclado con gelatina, seguido de imágenes con una tomografía computarizada de rayos X2. El objetivo de la técnica DUCT es visualizar, digitalizar y analizar dos redes tubulares fundidas en resina, en tándem, en 3D.
DUCT se basa en el amplio conocimiento existente de la fundición de resina hepática monosistémica3,4,5,6,7,8 y se extiende a la visualización y análisis 3D simultáneos de dos sistemas9. DUCT avanzó la fundición de resina simple a la fundición de resina doble mezclando dos resinas radiopacas de diferente contraste e inyectando estas resinas en dos redes diferentes, específicamente el conducto biliar común y la vena porta. DUCT se puede aplicar a ratones postnatales jóvenes con resultados reproducibles ya en el día postnatal 15 (P15). En comparación con las técnicas de imagen basadas en microscopía, la principal ventaja es que la DUCT es más rápida, libre de anticuerpos y la autofluorescencia del tejido hepático no interfiere con las imágenes. Además, DUCT proporciona datos cuantitativos que describen el estado de lumenización, el diámetro interno, la conectividad de red y la perfusión. Diferenciar entre la presencia de células formadoras de luz y su morfogénesis de facto en tubos es esencial para analizar órganos en los que las células ductulares están presentes pero no forman tubos, como puede ser el caso del síndrome de Alagille10. La principal desventaja de DUCT es la penetración limitada de la resina, que es viscosa y no entra en tubos con un calibre pequeño (<5 μm). El CONDUCTO se puede aplicar para cualquier estructura tubular después de determinar el punto de entrada de la inyección, como los sistemas circulatorios arterial y venoso, las vías respiratorias, el conducto biliar extrahepático o los vasos linfáticos. Por lo tanto, podría facilitar el análisis de la arquitectura de órganos completos de otros tejidos como los pulmones y el páncreas.
Las imágenes segmentadas de MicroCT se pueden procesar utilizando software de imágenes disponible comercialmente, como ImageJ, o canalizaciones escritas a medida (por ejemplo, MATLAB). El hígado inyectado con resina se puede analizar cualitativamente para la expansión y conectividad de la red o cuantitativamente para el volumen, la longitud, la ramificación, la tortuosidad de un solo sistema y la interacción entre dos sistemas, como la distancia entre dos sistemas, o la dependencia del punto de ramificación (¿el sistema 1 se ramifica en proximidad al sistema 2?). La tubería DUCT que abarca la inyección de resina, el escaneo microCT y la segmentación de datos CT, combinada con un análisis cuantitativo detallado de los mecanismos arquitectónicos de dos sistemas tubulares, podría proporcionar un estándar para el análisis de hígado completo en modelos animales.
Protocol
El protocolo descrito en este estudio fue aprobado y sigue las reglas y regulaciones de bienestar animal de la Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Junta de Ética de Investigación Animal de Estocolmo). Los animales utilizados en este estudio fueron ratones mutantes Jag1H268Q de tipo salvaje u homocigotos en un fondo mixto de C3H / N y C57bl6J. Tanto hombres como mujeres fueron incluidos en el estudio. Los animales fueron utilizados en el día postnatal 15 o como adultos entre 3 y 8 meses.
1. Inyecciones dobles de resina
- Preparación
- Prepare la solución de resina. Para inyecciones de resina de doble sistema, prepare resinas amarillas y verdes como se describe en los pasos 1.1.2-1.1.4.
- Preparar 1 ml de alícuotas de resina diluida por ratón.
- Resina amarilla: Diluir el caucho de silicona amarilla (alta radiopacidad) con el diluyente transparente en una dilución 3: 1 para preparar resina amarilla para inyección.
- Resina verde: Mezcle el caucho de silicona azul (radiopacidad indetectable) con el diluyente transparente en una dilución 1: 1 para preparar resina azul. Para generar resina verde, mezcle la resina azul diluida con la resina amarilla diluida en una proporción de 1: 1. Vórtice la resina verde a fondo hasta que el color sea homogéneo.
NOTA: La resina azul tiene una radiopacidad muy baja que no es detectable con microCT, lo que por lo tanto requiere dilución con resina amarilla para crear dos resinas con diferentes radiopaciudades.
PRECAUCIÓN: La resina puede contener cromato de plomo, que es un carcinógeno. Produce gases venenosos en un incendio. Manipular con cuidado y desechar la resina como residuo peligroso. - Prepare dos juegos de inyección (juego de inyección #1 y set de inyección #2) con tubos como se describe en los pasos 1.1.6-1.1.11.
NOTA: Para ratones adultos (>P30 (día postnatal 30) = P30 - 2 años), use el juego de inyección # 1 (tubo PE10 con 0.6 mm de diámetro exterior) para la inyección del conducto biliar común y el conjunto de inyección # 2 (tubo PE50 con 0.96 mm de diámetro exterior) para la inyección de vena porta. Para ratones postnatales jóvenes (hasta P30), prepare dos juegos de inyección # 1, uno para el conducto biliar y otro para la inyección de la vena porta (sin juego de inyección # 2 ya que la vena porta es demasiado estrecha para acomodar el tubo PE50). - Para preparar el juego de inyección # 1, corte 30 cm de tubo de PE10 y estire un extremo del tubo a mano tirando de él hasta que se vuelva lo más delgado posible (Figura 1A, B, aproximadamente 0.15 mm de diámetro, el tubo de PE10 no estirado tiene un diámetro de 0.6 mm).
- Corte la punta del tubo de PE10 estirado en diagonal para crear una punta biselada (Figura 1B).
- Conecte el extremo no estirado del tubo de PE10 a una aguja de 30 G (Figura 1A, Conjunto de inyección #1).
- Para preparar el juego de inyección # 2, corte 30 cm de tubo de PE50 y estire un extremo del tubo a mano tirando de él hasta que se vuelva lo suficientemente delgado como para caber en la vena porta (Figura 1A, B, aproximadamente 0.7 mm, el tubo de PE50 no estirado tiene un diámetro de 0.96 mm).
- Corte la punta del tubo PE50 estirado en diagonal para crear una punta biselada (Figura 1B).
- Conecte el extremo no estirado del tubo DE PE50 a una aguja de 23 G (Figura 1A, conjunto de inyección #2).
NOTA: Cada juego de inyección solo se puede usar para una inyección, ya que la resina se endurecerá en la jeringa y el tubo. Ajuste el tamaño de la punta estirada y biselada en función del tamaño del conducto biliar común y la vena porta del ratón, dependiendo de su edad, genotipo y fenotipo. Cuando no esté seguro del tamaño y el ajuste del tubo, inserte el tubo en el conducto o recipiente apropiado después de la incisión y antes de que el tubo se llene con resina. Si el tubo es demasiado ancho para caber en el conducto/ recipiente, estírelo aún más. - Anestesiar al animal por inhalación de isoflurano (primer 4% en la cámara de inducción y ~ 2% usando el cono de la nariz).
- Coloque el ratón en un banco ventilado sobre una almohadilla de disección mientras el ratón respira isoflurano a través del cono de la nariz. Verifique que el animal esté inconsciente por un método recomendado por el instituto / IRB, por ejemplo, pellizcando una de las patas.
PRECAUCIÓN: El isoflurano puede causar somnolencia o mareos al inhalar y puede causar daño al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central a través de una exposición prolongada o repetida. No lo inhale. Manipule la sustancia en un banco ventilado y en áreas bien ventiladas.
NOTA: Es posible utilizar otro método anestesiante, siempre y cuando sea compatible con la perfusión cardíaca. - Una vez que el animal esté inconsciente, rocíe el lado ventral con etanol al 70% para evitar la interferencia de la piel.
- Usando tijeras para la piel, corte la piel, la fascia y la capa muscular comenzando en la línea media de la cavidad abdominal y corte hasta la cavidad torácica para exponer los órganos internos.
- Agarre el proceso xifoide con fórceps para levantar el esternón y corte el diafragma y la caja torácica en ambos lados para exponer el corazón y los pulmones.
- Retire la caja torácica cortando las costillas en los lados izquierdo y derecho de la caja torácica con tijeras. Tenga especial cuidado de no dañar el hígado, ya que esto resultará en una fuga de la resina.
- Usando fórceps rectos, tire del corazón hacia el hígado y corte la aurícula derecha.
- Inserte una aguja de mariposa (23 G), conectada a una bomba de perfusión peristáltica, en el ventrículo izquierdo. Perfundir el ratón transcárdicamente con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y heparina (1 U/g de peso corporal del ratón). Perfuse durante 3 min con una tasa de perfusión de 5 mL/min.
NOTA: Si el ratón está siendo perfundido correctamente, los órganos internos se volverán pálidos, especialmente el hígado. Si, en cambio, los pulmones se están volviendo blancos, la aguja se inserta en el ventrículo derecho y debe reposicionarse. Después de la perfusión, el ratón se exanguina y se puede eliminar del cono de la nariz y el isoflurano. - Apague la bomba de isoflurano.
- Inyección de resina - Fundición de resina del sistema biliar
- Mueva el ratón al microscopio de disección, el abdomen hacia arriba, la cola hacia el experimentador y aléjese del experimentador. Los hitos anatómicos de interés se representan en la Figura 2A.
- Localice la vena cava inferior (Figura 2A) moviendo el intestino hacia un lado. Use tijeras de resorte para hacer una pequeña incisión transversal en la vena cava inferior para permitir la liberación de la presión vascular hepática (Figura 2Bi).
- Exponga el conducto biliar común y la vena porta como se describe en los pasos 1.2.4-1.2.6.
- Mueva el intestino y el páncreas hacia el lado derecho (del experimentador) usando un hisopo de algodón humedecido con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Voltee el lado ventral del hígado hacia el corazón usando el hisopo de algodón humedecido por PBS para exponer la superficie visceral y la región hiliar.
- Localice el conducto biliar común que va desde la región hiliar a través del páncreas hasta el intestino en el esfínter de Oddi (Figura 2Bii, conducto biliar común delineado con la línea punteada amarilla, puntas de flecha negras apuntan al esfínter de Oddi).
NOTA: Asegúrese de que el hígado esté húmedo durante todo el procedimiento rociándolo con PBS. - Limpie el tejido circundante (área ~ 5 mm) del conducto biliar común usando fórceps rectos. Coloque el hilo de sutura de seda (tamaño 4-0, 0.17 mm, 3 - 5 cm de largo) debajo del conducto biliar común (Figura 2Bii) y ate un nudo suelto alrededor del conducto biliar común (Figura 2Biii).
NOTA: Elija un área para el nudo a medio camino entre la región hiliar y el esfínter de Oddi y a cierta distancia de la vena porta para que después de que la sutura se apriete alrededor del conducto biliar común, no interfiera con la inyección de la vena porta. - Sostenga las tijeras de resorte planas contra el conducto biliar común para hacer una incisión oblicua en el conducto biliar común en el lugar donde el conducto biliar común ingresa al páncreas y al intestino junto al esfínter de Oddi. (Figura 2Biv), la línea punteada amarilla delinea el esfínter de la región de Oddi, enfatizada por puntas de flecha negras).
NOTA: Este es un paso crucial. Hacer un corte oblicuo y no transversal, y hacer una incisión; no corte el conducto biliar. Cortar a través de todo el conducto biliar hace que la inserción del tubo sea muy difícil. - Justo antes de usar, mezcle 1 ml de resina amarilla con 50 μL del agente de curado (llenando y vaciando la jeringa de 1 ml) y llene una jeringa Luer de 1 ml con la mezcla de resina y agente de curado.
- Conecte la jeringa llena con el tubo (conjunto #1). Presione el émbolo para llenar el tubo por completo. Asegúrese de que la mezcla de resina / agente de curado gotee desde la punta del tubo.
NOTA: Evite y retire las burbujas en la jeringa y el tubo para obtener mejores resultados. - Usando fórceps, enderece el área alrededor de la incisión del conducto biliar común e inserte el tubo en la abertura del conducto biliar común (Figura 2Bv), con el borde más largo de la punta biselada hacia abajo hacia el lado dorsal del conducto biliar. Esta orientación asegura que la resina pueda salir de la abertura del tubo, que está orientada hacia arriba, hacia el conducto (Figura 2Bv).
- Apriete el nudo del hilo de seda para asegurar el tubo dentro del conducto biliar común (Figura 2Bvi).
- Inyecte la resina en el conducto biliar común. Observe la vesícula biliar y los lóbulos hepáticos individuales.
- Masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a distribuir la resina por igual. Las ramas terminales de los conductos biliares llenos de resina (en ratones de tipo salvaje) son débilmente visibles en la superficie del hígado.
NOTA: El tiempo esperado para llenar el hígado es de 30 -100 s. - Deje de inyectar la resina cuando aparezcan puntos de resina en la superficie del hígado (Figura 2Ci, puntas de flecha azules) o cuando se encuentre resistencia.
NOTA: Trabaje lo más rápido posible ya que la resina comienza a endurecerse después de agregar el agente de curado de resina. El tiempo de trabajo desde la adición del agente de curado es de aproximadamente 15 min. - Retire el tubo sacándolo del conducto biliar común y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre. Corte los extremos sueltos de la sutura de seda, para que no interfieran con la inyección de la vena porta.
- Deseche el tubo que contiene resina y la resina restante en los residuos peligrosos y la aguja en los residuos punzantes.
- Inyección de resina - Fundición de resina de vena porta
- Limpie la vena porta (área ~ 5 mm) de su tejido circundante a unos 2 cm de su entrada al hígado usando fórceps rectos. Coloque el hilo de sutura de seda (tamaño 4-0, 0.17 mm, 3 - 5 cm de largo) debajo del área despejada de la vena porta (Figura 2Ci) y ate un nudo suelto por encima (Figura 2Cii).
- Hacer una incisión longitudinal en la vena porta distal al hígado y al nudo (Figura 2Ciii).
- Mezcle 1 ml de resina verde con 50 μL del agente de curado (llenando y vaciando una jeringa de 1 ml) y llene la jeringa Luer de 1 ml con la mezcla de agente de curado de resina.
- Conecte la jeringa llena con el tubo (conjunto # 2 para ratones >P30, nuevo conjunto # 1 para ratones
- Usando fórceps, enderece la vena porta tirando del tejido circundante hacia el experimentador e inserte el tubo con el borde más largo de la punta biselada hacia el lado dorsal del vaso (Figura 2Ciii).
- Apriete el hilo de seda para asegurar el tubo en la vena porta.
- Inyecte la resina en la vena porta. Observe cómo los vasos sanguíneos se llenan de resina. Masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a distribuir la resina por igual (Figura 2Civ).
- Deje de inyectar la resina cuando todos los vasos sanguíneos estén llenos (los extremos de las venas porta son visibles en la periferia del hígado) o cuando se encuentre resistencia.
NOTA: Trabaje rápido ya que la resina comienza a endurecerse después de la adición del agente de curado. El tiempo de trabajo desde la adición del agente de curado es de aproximadamente 15 minutos para el conjunto de inyección # 1 y 25 minutos para el conjunto de inyección # 2. - Retire el tubo sacando el tubo de la vena porta y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre.
- Deseche el tubo que contiene resina y la resina restante en los residuos peligrosos y la aguja en los residuos punzantes.
- Disección y fijación hepática
- Diseccionar todo el hígado cortándolo del tejido circundante y del diafragma.
- Coloque suavemente todo el hígado en un tubo cónico vacío de 50 ml con el lado ventral hacia arriba y el lado dorsal apoyado en la pared del tubo cónico para evitar la deformación del hígado. Guarde el tubo cónico horizontalmente durante la noche a 4 °C para que la resina se endurezca por completo.
NOTA: Cualquier recipiente que sea lo suficientemente grande como para caber en el hígado se puede utilizar en lugar de 50 ml de tubo cónico. El uso de un recipiente de fondo plano aumentará la probabilidad de que el hígado no se deforme. - Separe el hígado en lóbulos individuales. Haga una selección de los lóbulos que se utilizarán para el análisis de microCT (1.4.4-1.4.5) o el control de calidad (1.4.6-1.4.8). Opcionalmente, use todo el hígado tanto para el aclaramiento óptico como para la microTC sin separarlo en lóbulos individuales.
NOTA: La arquitectura hepática de los sistemas biliar y vascular es diferente en cada lóbulo y, por lo tanto, se requieren análisis de lóbulos emparejados. El despeje óptico no interfiere con el escaneo microCT, y los lóbulos utilizados para el control de calidad se pueden escanear posteriormente con microCT. Por el contrario, las muestras escaneadas con microCT se pueden borrar ópticamente posteriormente para su comparación. Por lo tanto, todo el análisis hepático es posible. En ratones de tipo salvaje (fondo genético C3H / C57bl6), el lóbulo medial derecho se llena primero mediante inyecciones de resina, lo que lo convierte en un lóbulo adecuado para el análisis de microCT, con la mayor reproducibilidad. El lóbulo lateral izquierdo es el lóbulo más grande, en el que, por lo tanto, es fácil preseleccionar la calidad de la inyección. La selección del lóbulo (o hígado entero) utilizado para el control de calidad y la exploración microCT depende del modelo animal y la pregunta de investigación. - En una campana ventilada, prepare una solución de formaldehído al 4% (10 -20 ml por tubo). Fijar los lóbulos utilizados para microCT con formaldehído al 4% durante la noche a 4 °C y luego lavar una vez con PBS (10 -20 ml por tubo).
- Recoger los residuos de formaldehído en un contenedor separado. Mantenga los lóbulos hepáticos en PBS a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o etanol al 70% para almacenamiento a largo plazo. Continúe con la sección 2: Tomografía microcomputarizada.
PRECAUCIÓN: El formaldehído causa toxicidad aguda si se ingiere, inhala o está en contacto con la piel. El formaldehído es un líquido y vapor inflamable. Causa quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Puede causar una reacción alérgica en la piel. Fatal si se inhala (concentrado o en polvo). Puede causar irritación respiratoria. Sospechoso de causar defectos genéticos. Puede causar cáncer. Causa daño a los órganos (ojos, sistema nervioso central). Declaraciones de precaución: manténgase alejado del calor, las superficies calientes, las chispas, las llamas abiertas y otras fuentes de ignición. Prohibido fumar. Use guantes protectores y ropa protectora. En caso de derrame, quítese inmediatamente toda la ropa que esté contaminada. Si está en contacto con la piel: enjuague el área contaminada con agua. Si se inhala: retire a la persona al aire fresco y controle la respiración si se siente cómodo. Llame inmediatamente a un centro de envenenamiento / médico. Si está en los ojos: enjuague los ojos con agua durante varios minutos. Si está presente y es posible, quítese las lentes de contacto. - Para el control de calidad, fije los lóbulos restantes (al menos uno) con metanol al 50% (mezclado con agua desionizada) durante un mínimo de 4 h, balanceándose a temperatura ambiente, seguido de un balanceo nocturno de metanol al 100% a temperatura ambiente. Recoger los residuos de metanol en un contenedor separado.
PRECAUCIÓN: El metanol causa toxicidad aguda si se ingiere, inhala o está en contacto con la piel. El metanol es un líquido inflamable y vapor. Use guantes y ropa protectores. Evite respirar cuando manipule y manténgase alejado del fuego y el calor. Lave bien la piel después de usar. En caso de derrame, quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua. Si se inhala: Retire a la persona al aire fresco y manténgase cómodo para respirar. Si se inhala, se ingiere o se expone, llame a un centro de toxicología / médico. - En una campana ventilada, prepare alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml por lóbulo) solución.
- Coloque el lóbulo hepático en un tubo de polipropileno de 15 o 50 ml (dependiendo del tamaño del lóbulo) que contenga solución de BABB. Déjelo mecer a temperatura ambiente hasta que quede transparente. Este paso puede tardar entre 2-16 h dependiendo del tamaño del lóbulo.
NOTA: La solución de BABB disuelve ciertos tipos de plástico. Es seguro almacenar las muestras en tubos de polipropileno o recipientes de vidrio.
PRECAUCIÓN: El benzoato de bencilo puede causar toxicidad aguda cuando se ingiere. Es tóxico para la vida acuática con efectos duraderos. Declaraciones de precaución: lavar bien la piel después de la manipulación. Es perjudicial cuando se ingiere, en contacto con la piel o se inhala. Evite respirar humos/vapores. Lávese bien las manos después de manipularlas. No coma, beba ni fume cuando use este producto. Si se ingiere, llame a un centro de toxicología/médico si no se encuentra Bien, use en áreas ventiladas. Recoger derrames. Deseche el contenido/contenedor en una planta de eliminación de residuos aprobada. - Inspeccione la calidad de la inyección. Solo el hígado bien inyectado debe escanearse con microCT.
2. Tomografía microcomputarizada
- Preparación de muestras
- Prepare el gel de agarosa al 1% mezclando 100 ml de agua destilada y 1 g de polvo de agarosa. Coloque la mezcla en un microondas y hierva la solución hasta que el polvo de agarosa se disuelva.
- Templar el gel de agarosa al 1% a ~ 40 ° C para evitar daños térmicos en la muestra de hígado.
- Coloque el lóbulo (s) de interés en un tubo cónico de 15 ml y llénelo con el gel de agarosa al 1% hasta aproximadamente 2/3 del volumen total del tubo. Este paso minimiza el movimiento no deseado de la muestra durante la medición por TC.
- Medición por TC
NOTA: Los siguientes pasos dependen del dispositivo ct, y la configuración y las acciones específicas pueden diferir para diferentes dispositivos y fabricantes de CT. En este protocolo, el escáner de tomografía microcomputarizado utilizado estaba equipado con un tubo de rayos X de nanofoco (180 kV/15 W) y una pantalla plana dinámica de 41|100 (4048 px x 4048 px, tamaño de píxel 100 mm con binning 2) para las mediciones de TC.- Monte el tubo cónico de 15 ml con la muestra en la etapa de rotación de un dispositivo de TC y permita que se adapte térmicamente a la cámara de medición durante al menos 1 h.
- Cuando la muestra esté adaptada térmicamente, céntrela en el campo de visión (FOV).
- Optimice las distancias fuente-muestra y muestra-detector (SSD, SDD) para alcanzar una resolución de vóxel suficiente, por ejemplo, 12 μm para una muestra de hígado murino adulto o 6,5 μm para hígado
- Establezca los parámetros de adquisición (es decir, aceleración de voltaje y corriente, exposición, agrupación, promedio) siguiendo las recomendaciones del fabricante del dispositivo ct para alcanzar un nivel suficiente de señal detectada. Estos parámetros no solo dependen del dispositivo de TC, sino que también dependen de la muestra y deben optimizarse para cada muestra. En Hankeova et al.9, los ajustes fueron: tensión de aceleración de 80 kV, corriente de aceleración de 160 μA, tiempo de exposición de 400 ms y 2000 imágenes.
- Inicie una medición por TC. Utilice un software de reconstrucción tomográfica dedicado para reconstruir los datos de la TC.
3. Análisis y segmentación de datos
NOTA: Los siguientes pasos dependen del software de procesamiento de imágenes; la configuración y las acciones específicas pueden diferir según el software utilizado.
- Cargar los datos de CT: Seleccione Archivo > Importar > comando. Una selección adicional depende del formato específico de los datos de TC que se procesarán.
- Utilice la función Determinación de superficie en el panel superior para segmentar la resina en los datos mediante umbrales globales. En la ventana de diálogo, determine el valor umbral con la evaluación del histograma estableciendo la posición de la línea roja "Isovalue" para segmentar solo los recipientes llenos de resina (es decir, abarcados por la línea amarilla en el "Panel de vista previa" presentado) (Figura 3A).
- En el panel izquierdo, seleccione el módulo Crear ROI a partir de volumen/CAD/Malla para crear una región de interés (ROI) de los recipientes llenos de resina. En la ventana de diálogo, utilice la opción Crear ROI(s) desde Solid, seleccione el nombre del volumen procesado y confirme.
- Elimine la segmentación errónea de los clústeres de ruido en la región de fondo de este ROI. Marque este ROI en el panel derecho, haga clic derecho en él y seleccione el módulo Dividir ROI.
- En la ventana de diálogo, establezca el parámetro Volumen mínimo [vóxel] para excluir todas las partículas de ruido (este valor depende del experimento) y de los datos y debe optimizarse para cada muestra que se va a analizar (Figura 3B).
- Cree máscaras de canal lisas, continuas y sólidas sin artefactos en el ROI fundido con resina, por ejemplo, presencia de burbujas de aire o fugas de resina.
- En el panel izquierdo, use el módulo Suavizado, establezca el parámetro Resistencia de suavizado en 1 o 2 (dependiendo de los datos individuales, cuando los valores más altos podrían conducir a la deformación del modelo, especialmente cuando se trata de estructuras finas). Si es necesario, ejecute este proceso dos veces (Figura 3C).
- Identifique y separe los sistemas tubulares individuales en la máscara de resina segmentada.
- Cree un ROI separado para el sistema lleno de la resina más absorbente (la resina amarilla utilizada para la inyección del conducto biliar común) con valores de intensidad más altos en los datos de tc. Siga el procedimiento descrito en el paso 3.2. (Figura 3Di).
- Marque el nuevo ROI y el ROI de la máscara de resina, haga clic con el botón derecho y seleccione Restar ROI(S) y reste el nuevo ROI del ROI de la máscara de resina para crear un nuevo ROI para el sistema tubular restante (Figura 3Dii, iii).
- Exporte los ROI resultantes para ambos sistemas tubulares en varios formatos, según las preferencias del operador, para su posterior procesamiento en diferentes softwares. Además, procese los ROI resultantes en un software de gráficos de volumen para exportar la visualización final en forma de imagen o video.
Representative Results
Qué hacer
La inyección exitosa de doble resina se logra cuando tanto los conductos biliares intrahepáticos como la vasculatura de la vena porta están bien llenos. Como paso de control de calidad, la limpieza de un lóbulo (por ejemplo, el lóbulo lateral izquierdo) permite la verificación de una inyección exitosa, seguida de imágenes de lóbulos de interés. El lóbulo ópticamente despejado se puede escanear más tarde utilizando microCT; por lo tanto, es posible limpiar ópticamente todo el hígado. En el hígado de ratón bien inyectado, la vasculatura de la vena porta debe llenarse con resina hasta que la periferia del hígado y la resina deben ser visibles en las ramas laterales (Figura 4), y esta arquitectura se recapitula fielmente en datos escaneados y segmentados por microCT. Además, los conductos biliares intrahepáticos bien inyectados deben ser visibles junto a las ramas principales de la vena porta que se extienden casi hasta la periferia, y la resina debe ser visible en las ramas laterales principales. Si el lóbulo de control pasa el paso de control de calidad, los lóbulos de interés (incluido el ópticamente despejado) se pueden escanear con microCT. El resultado de los datos segmentados de un hígado bien inyectado se muestra para un ratón P15 (Figura 4A, B) y un ratón adulto (Figura 4C, D).
Qué no hacer
El tejido hepático intacto es un requisito previo para una inyección exitosa. Tenga especial cuidado al cortar la cavidad abdominal y el diafragma para no cortar accidentalmente el tejido hepático. Si hay daño físico al hígado durante este procedimiento, es muy probable que la resina se escape durante la inyección de la vena porta (Figura 5A). No es posible lograr una buena inyección del sistema vascular si el hígado está físicamente dañado.
Uno de los errores comunes es rellenar el hígado con resina que puede conducir a desafíos para la visualización o el análisis. Una de las causas del relleno insuficiente del sistema es el endurecimiento prematuro de la resina en la aguja o la punta del tubo antes de que se complete la inyección (Figura 5B, puntas de flecha azules, los soportes representan burbujas grandes). Una buena práctica es usar un juego de inyección por animal y trabajar rápido después de que el agente de curado se agrega a la resina. Si la resina se endurece durante la inyección (lo que se puede observar mediante un sistema medio lleno, aquí ejemplificado con una vasculatura de vena porta medio llena) retire el tubo, corte la punta del tubo (siempre en diagonal para crear una punta biselada) y empuje el émbolo. Si la resina comienza a gotear de nuevo, vuelva a insertar cuidadosamente el tubo y asegúrelo con la sutura. Si la resina se ha endurecido en la aguja, reemplace el tubo por completo, llénelo con resina (evitando burbujas), vuelva a insertar cuidadosamente el tubo y asegúrelo con la sutura. Puede ser difícil reemplazar el tubo, especialmente en ratones postnatales jóvenes
Por el contrario, uno o ambos sistemas se llenan en exceso de resina (Figura 5D). Es necesario controlar visualmente el hígado durante toda la inyección. La fundición del sistema biliar con resina es más desafiante que la fundición de resina de vena porta, ya que los conductos llenos de resina solo son débilmente visibles en la superficie del hígado, y es difícil evaluar cuándo el sistema está casi lleno y cuándo detenerse. Cuando aparecen pequeños puntos de resina amarilla en la superficie del hígado (Figura 2Ci, punta de flecha azul), esto es una señal de que el sistema biliar está completamente lleno y la resina está comenzando a filtrarse fuera de los conductos. Las fugas menores de resina se pueden corregir manualmente durante la segmentación de datos microCT (Figura 5D, paneles derechos).
Si la presión de inyección es demasiado alta, esto puede causar la ruptura de vasos o conductos (Figura 5E), dañando irreversiblemente la arquitectura del recipiente o conducto. El hígado no será adecuado para la exploración o análisis microCT. Para evitar el sobrellenado de resina, optimice el volumen y la presión correctos utilizados para la inyección en cada modelo de ratón. Cuando se trabaja con ratones que han sido desafiados con una dieta tóxica, modificación genética o lesión hepática que afecta los sistemas biliar o venoso, o rigidez hepática, la presión y el volumen de la inyección pueden necesitar ser ajustados ya que el volumen y la presión tolerados pueden ser diferentes de los ratones de tipo salvaje. Este protocolo describe la inyección manual de los dos sistemas, pero es posible conectar la jeringa a una bomba para estandarizar la presión de inyección. Las burbujas son otro artefacto de inyección muy común que conduce a un llenado escaso de las redes tubulares (Figura 5F-H, puntas de flecha azules). Para evitar la formación de burbujas, asegúrese de que la jeringa y el tubo no contengan burbujas, estén completamente llenos de resina y que la resina gotee de la punta del tubo antes de la inyección. Las pequeñas burbujas que aparecen como áreas negativas en los datos de microCT se pueden corregir manualmente durante los pasos posteriores al procesamiento, aunque esto es laborioso.
Fresco es lo mejor
El uso de resina amarilla fresca es un factor crucial, que afecta significativamente el contraste de las dos resinas y la segmentación de datos microCT. Cuando se utiliza la resina recién abierta (Figura 6A) hay una clara diferencia en el contraste entre los conductos biliares inyectados con resina amarilla (blanco brillante) y las venas porta inyectadas con resina verde (gris brillante). El hígado que se inyecta con resina fresca se procesa fácilmente utilizando umbrales globales automatizados. Con el almacenamiento prolongado, la resina precipita y el contraste disminuye. Después de 3 meses de almacenamiento, el contraste aún puede ser suficiente para distinguir la vena porta del conducto biliar (Figura 6B), pero la precipitación afecta la mezcla de las dos resinas, que es visible como una opacidad heterogénea en la vena porta llena (Fig. 6B, puntas de flecha azules). El contraste heterogéneo afecta negativamente al umbral automatizado y requiere correcciones manuales, lo que aumenta el tiempo de procesamiento. Si la resina tiene más de seis meses, el contraste se ha degradado hasta un punto en el que no es posible distinguir el conducto biliar inyectado de amarillo de la vena porta inyectada de color verde basándose solo en su contraste (Figura 6C). En este caso, el conducto biliar y la vena porta deben segmentarse manualmente en función de su diámetro y posición en la región hiliar y seguirse manualmente a lo largo de todos los datos de microCT. Este procedimiento es extremadamente lento y es mejor evitarlo.
Figura 1: Juego de inyección para fundición de resina. (A) El juego de inyección # 1 comprende una aguja de 30 G y un tubo de PE10 que mide ~ 30 cm de largo. El juego de inyección # 2 se compone de una aguja de 23 G y un tubo de PE50 de ~ 30 cm de largo. (B) La punta del tubo se estira y se corta en ángulo para crear una punta biselada. La regla en A y B es una regla de centímetros, con incrementos mayores de 1 cm, incrementos intermedios de 5 mm e incrementos menores de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de fundición de resina doble. (A) Esquema que muestra el sistema circulatorio venoso murino y el corazón con la aurícula derecha resaltada, que debe cortarse antes de la perfusión, y el ventrículo izquierdo en el que se debe insertar la aguja para la perfusión para lavar la sangre del sistema circulatorio. La vena cava inferior debe cortarse debajo de los riñones para aliviar la presión vascular. (B) Diagrama de flujo de inyección de resina de conducto biliar. (i) Imagen de zoom de (A) que representa dónde cortar el IVC. (ii) Imagen que representa el conducto biliar común (línea punteada amarilla) desde la región hiliar del hígado hasta el esfínter de Oddi (puntas de flecha negras), con hilo de sutura debajo del conducto biliar común despejado. (iii) Posición adecuada para el nudo suelto alrededor del conducto biliar común. (iv) La línea punteada amarilla y las puntas de flecha negras etiquetan el esfínter de Oddi, demostrando el ángulo oblicuo para la incisión y cómo debe aparecer la abertura después de la incisión del ángulo oblicuo. (v) Esquema que demuestre la orientación de la abertura cónico del tubo PE10 (hacia arriba) al insertarse. vi) Aspecto de la resina amarilla que se inyecta; la resina debe pasar fácilmente el nudo suelto. IVC: vena cava inferior; CBD, conducto biliar común. (C) Diagrama de flujo de inyección de resina de vena porta. (i) La línea punteada verde marca la vena porta de la región hiliar. Las puntas de flecha azules etiquetan el sistema biliar sobrecargado. (ii) Ubicación adecuada para nudos sueltos alrededor de la vena porta. (iii) Esquema que demuestra la abertura cónica (hacia arriba) en el momento de la inserción. iv) Aparición del hígado tras la inyección de resina verde y resina amarilla; observe el vaso sanguíneo lleno de resina en la periferia del hígado. PV, vena porta. La figura 2A se creó con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procesamiento de datos micro CT en software de gráficos de volumen. (A) Determinación de la superficie, (i) isovalor sobreestimado (la vista previa actual de la selección se muestra en color amarillo), (ii) isovalor subestimado, (iii) selección óptima del isovalor para la determinación adecuada de la superficie de la vena porta y los conductos biliares. (B) Dividir la región de interés (ROI) creada por la determinación de la superficie, (i) establecer el valor en la ventana de diálogo lo suficientemente alto como para que solo quede un segmento (el más grande), (ii) en marcos amarillos se muestran las partículas más pequeñas (excluidas). (C) Suavizado superficial de los datos, (i) la función de suavizado está en el panel izquierdo, (ii) establecer la resistencia de suavizado en 1 (máx. 2) y crear un nuevo ROI suavizado, (iii) datos suavizados. (D) Separación de sistemas tubulares individuales, (i) en la función de determinación de superficie establecer el isovalor de modo que solo se incluya el sistema biliar en la selección (la vista previa actual de la selección se muestra en color amarillo), (ii) marcar el ROI de ambos sistemas y el ROI de solo el sistema biliar y restar el ROI del sistema biliar del ROI de ambos sistemas, (iii) Vena porta mostrada en gris, el sistema biliar mostrado en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Sistemas de conducto biliar (BD) y vena porta (PV) bien inyectados. (A) Lóbulo medial derecho (RML) limpiado ópticamente del hígado postnatal día 15 (P15) inyectado con dos resinas en los dos sistemas. Barra de escala 1 mm. (B) Representación 3D de P15 RML que se muestra en (A) que representa la vasculatura de la vena porta en blanco y el sistema biliar en verde. Barra de escala 1 mm. (C) RML ópticamente despejado de hígado adulto inyectado con dos resinas en los dos sistemas. Barra de escala 1 mm. (D) Representación 3D de RML adulto que se muestra en (C) que representa la vasculatura de la vena porta en blanco y el sistema biliar en verde. H = hiliar, P = periférico. Barra de escala 1 mm. Los paneles A, B, D se adaptan con permiso de Hankeova et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Desafíos comunes de las inyecciones hepáticas de doble resina. (A) La imagen muestra un hígado que fue cortado accidentalmente durante la apertura inicial de la cavidad abdominal, y la resina se filtra a través del corte (punta de flecha azul). (B) Sistema de vena porta mal inyectado debido al endurecimiento de la resina. Las puntas de flecha azules etiquetan las ramas terminales vacías y los corchetes rojos etiquetan burbujas grandes. Barra de escala 1 mm. (C) Sistema de vena porta mal inyectado debido a una perfusión transcárdica deficiente. Las puntas de flecha azules etiquetan la sangre visible en las ramas terminales. Barra de escala 1 mm. (D) Sistema biliar sobrecargado que se manifiesta por bolas aisladas de resina. Los paneles izquierdos muestran el hígado ópticamente despejado, y los paneles derechos muestran la imagen renderizada en microCT 3D. Los contornos punteados azules representan regiones de zoom. Las puntas de flecha negras etiquetan una parte del hígado que se dañó durante el aclaramiento óptico después de la exploración microCT. Barra de escala 1 mm. (E) La alta presión durante la inyección de resina puede causar la ruptura de la vena porta (el animal en este panel lleva una mutación Jag1H268Q), marcada por puntas de flecha azules. Barra de escala 1 mm. (F) Burbujas en la resina durante la inyección de la vena porta (puntas de flecha azules) y (G) inyección del sistema biliar (punta de flecha azul), barra de escala 1 mm. (H) Escaneo microCT de burbujas (punta de flecha azul), ramas terminales mal llenas (corchetes rojos) y fuga de resina (punta de flecha amarilla), barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Contraste diferencial de resina. (A) La resina amarilla recién abierta genera suficiente contraste para distinguir la vena porta inyectada de resina (gris) y los conductos biliares (blanco). (B) Tres meses de almacenamiento de resina amarilla conducen a la precipitación de la resina, lo que resulta en una opacidad heterogénea (vena porta gris-blanca, punta de flecha azul). (C) El almacenamiento prolongado (>6 meses) de resina amarilla disminuye el contraste entre la vena porta (gris) y los conductos biliares (gris). Barra de escala 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Varios pasos críticos determinan el éxito del CONDUCTO, desde la preparación de la muestra hasta los parámetros del dispositivo de TC. Para lograr los mejores resultados, se debe utilizar resina bien contrastada, bien inyectada y sin burbujas para permitir un procesamiento digital sencillo con umbrales automatizados para obtener datos, imágenes y películas en 3D. Con el entrenamiento y siguiendo este protocolo, el 90% de las inyecciones son exitosas y dan como resultado datos reproducibles. Es importante utilizar resina amarilla fresca para lograr el mejor contraste entre los dos sistemas inyectados. La resina amarilla tiene una radiopacidad muy fuerte, mientras que la resina azul tiene una radiopacidad indetectable. Los mejores resultados se logran dentro de los primeros tres meses después de abrir una nueva botella de resina amarilla. Con el tiempo, la resina precipita, y después de un almacenamiento más largo (>6 meses), las resinas amarilla y verde ya no se distinguirán en las tomografías computarizadas. Las imágenes con un contraste deficiente requieren un rastreo y segmentación manual extenso y lento de los dos sistemas. A continuación, el tubo bien estirado es indispensable para encajar en el conducto biliar común de ratones adultos y el conducto biliar común y la vena porta de ratones postnatales. El punto de entrada para la inyección debe crearse con cuidado. Si el conducto biliar común se corta transversalmente, es probable que se desprenda del tejido circundante, impidiendo la entrada exitosa del tubo. Este paso es especialmente delicado para los ratones postnatales en los que el conducto biliar común se retrae y se "enrosca" si se ha desprendido de su tejido circundante, lo que hace que la inserción del tubo sea extremadamente difícil. La entrada e inyección del conducto biliar común puede requerir algo de práctica. Mientras prepara el tubo con resina y durante toda la inyección, evite la formación de burbujas, ya que las burbujas crearán espacio negativo en las imágenes de TC y requerirán una corrección manual que requiere mucho tiempo. Es importante masajear suavemente el hígado rodando sobre su superficie con un hisopo de algodón humedecido durante y después del procedimiento de inyección, ya que esto facilita incluso la propagación de la resina. Después de completar la inyección y la extracción del tubo, el nudo de sutura de seda debe apretarse rápida y cuidadosamente, para que la resina no fluya fuera del hígado antes de que se polimerice por completo. Para obtener imágenes microCT exitosas, la muestra debe fijarse adecuadamente en su lugar con agarosa y adaptarse térmicamente para eliminar los artefactos de movimiento en los datos de tc. Los ajustes de adquisición también son de importancia clave, que deben optimizarse para alcanzar una resolución espacial adecuada para resolver estructuras finas.
Se pueden hacer modificaciones técnicas al procedimiento de inyección para lograr la inyección en ratones más jóvenes. Actualmente, la fundición de resina de hígados de ratón más jóvenes está limitada por la disponibilidad de tubos suficientemente delgados, siendo PE10 el tubo más pequeño disponible comercialmente. Tanimizu et al. inyectaron con éxito tinta de carbono en el conducto biliar común embrionario del día 17 (E17) utilizando capilares de vidrio11. Por lo tanto, sería de interés realizar pruebas futuras de si la resina se puede suministrar a través de capilares de vidrio. La DUCT se adaptó aún más para inyectar otros sistemas tubulares como las vías respiratorias y la vasculatura de la arteria pulmonar de los pulmones9. La inyección de doble resina también podría modificarse para ser utilizada con otras resinas disponibles comercialmente, o este protocolo podría usarse para inyecciones con tinta de carbono.
Uno de los principales factores limitantes de la tubería DUCT es la viscosidad de la resina. DUCT solo se puede utilizar para la fundición de resina de estructuras tubulares por encima de un diámetro de 5 μm. En este conjunto de datos, la resina podría penetrar en tubos con el diámetro más pequeño de 5 μm9. Esta limitación de tamaño impide el análisis de conductos finos y capilares pequeños. Para avanzar aún más en la tubería de DUCT a recipientes de calibre más pequeño, se deben probar otras resinas disponibles comercialmente, o el desarrollo de nuevos agentes radiopacos de baja viscosidad puede mejorar la penetración de lúmenes.
En Hankeova et al.9, la DUCT se comparó con otras dos técnicas de uso común, las inyecciones dobles de tinta de carbono seguidas de limpieza de tejidos y fotografía estándar, e iDISCO+ con tinción de los vasos sanguíneos con actina de células musculares alfa-lisas y conductos biliares con citoqueratina 7, seguidas de imágenes 3D9. DUCT superó a los otros dos métodos en términos de análisis dual (que fue un desafío para iDISCO + debido a la alta autofluorescencia hepática), imágenes 3D y cuantificación (no posible con inyección de tinta de carbono) y lumenización (DUCT proporciona datos para la arquitectura interna de lúmenes y la perfusión del sistema). Como se mencionó anteriormente, la principal limitación de DUCT es el tamaño mínimo de lúmenes que se puede inyectar y analizar (límite de 5 μm), un parámetro en el que tanto la inyección de tinta de carbón como iDISCO + funcionaron mejor. DUCT es superior a la fundición de resina de sistema único3,5,6 porque permite el análisis de cada sistema inyectado por separado y también facilita la investigación 3D dual para estudiar la relación arquitectónica entre los dos sistemas.
DUCT se puede aplicar para estudiar dos redes tubulares cualesquiera en 3D. Como prueba de principio, se utilizó DUCT para visualizar los sistemas hepáticos biliar y porta y la vasculatura de la arteria pulmonar y las vías respiratorias en el pulmón9. Los conductos biliares intrahepáticos se desarrollan adyacentes a la vena porta, y la vena porta proporciona una plantilla estructural y un centro de señalización que regula el crecimiento y la diferenciación del árbol biliar12. En Hankeova et al.9, DUCT exploró la regeneración biliar en un modelo de ratón para la enfermedad pediátrica humana síndrome de Alagille. DUCT reveló mecanismos arquitectónicos previamente no reportados que el sistema biliar utilizó para lograr un volumen similar al de tipo salvaje9. Los ratones con síndrome de Alagille utilizaron dos estrategias diferentes: (1) en las regiones hiliar y central del hígado, el sistema biliar aumentó su ramificación, y (2) en la periferia hepática, los conductos biliares generados de novo fueron altamente tortuosos. Estos dos factores se combinaron para producir un volumen del sistema biliar casi normal, a pesar de la arquitectura anormal. Además, DUCT detectó ramificación anormal del conducto biliar que se produjo independientemente de la ramificación de la vena porta y los conductos biliares que forman puentes de conexión entre dos venas porta9. Estos fenotipos serían imposibles de detectar en la fundición de resina única y podrían malinterpretarse en secciones histológicas 2D como proliferación de conductos biliares. Por lo tanto, DUCT proporciona datos que describen la arquitectura 3D de dos redes tubulares a nivel de órgano o lóbulo completo con la posibilidad de un análisis cuantitativo cualitativo y en profundidad. DUCT podría ser un nuevo estándar para el desarrollo hepático postnatal y los análisis de regeneración hepática en diferentes modelos animales.
Disclosures
Un proyecto separado en el laboratorio de ERA está financiado por ModeRNA. ModeRNA no tuvo ningún papel en el proyecto/protocolo descrito aquí.
Acknowledgments
Agradecemos a Kari Huppert y Stacey Huppert por su experiencia y ayuda con respecto a la canulación de conductos biliares y su hospitalidad de laboratorio. También agradecemos a Nadja Schultz y Charlotte L. Mattsson por su ayuda con la canulación del conducto biliar común.
Agradecemos a las siguientes Agencias Otorgante por su apoyo:
Para trabajar en ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Swedish Foundations' Starting Grant), European Association for the Study of the Liver (Premio Daniel Alagille), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) y Vetenskapsrådet (2019-01350).
Por su trabajo en JK Lab: Reconocemos la infraestructura de investigación de CzechNanoLab respaldada por MEYS CR (LM2018110). J.K. gracias al apoyo de la subvención FSI-S-20-6353.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
