Summary
Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.
Abstract
Arteriyogenez, büyüyen kollateral damarların perivasküler boşluğuna lökosit ve trombosit alımına güçlü bir şekilde bağlıdır. Arteriogenezde kollateral arterlerin ve lökositlerin analizinde standart yaklaşım ex vivo (immüno -) histolojik metodolojidir. Bununla birlikte, bu teknik kan akışı, kayma stresi, hücre-hücre etkileşimleri ve parçacık hızı gibi dinamik süreçlerin ölçülmesine izin vermez. Bu yazıda, intravital görüntüleme kullanılarak arteriyogenez sırasında büyüyen kollateral arterlerde in vivo süreçleri izlemek için bir protokol sunulmaktadır. Burada açıklanan yöntem, dinamik ölçüm için güvenilir bir araçtır ve çoklu foton uyarma mikroskobu tarafından sağlanan minimum foto-sitotoksisiteye sahip yüksek kontrastlı bir analiz sunar. Büyüyen kollateral arterleri analiz etmeden önce, femoral arterin tek taraflı bağlanması ile farelerin adduktör kasında arteriyogenez indüklendi.
Ligasyondan sonra, önceden var olan kollateral arterler, artan kayma stresi nedeniyle büyümeye başladı. Ameliyattan yirmi dört saat sonra, kollateral arterlerin üzerindeki deri ve deri altı yağları çıkarıldı ve daha ileri analizler için bir cep oluşturuldu. İn vivo görüntüleme sırasında kan akışını ve bağışıklık hücrelerini görselleştirmek için, CD41-floresein izotiyosiyanat (FITC) (trombositler) ve CD45-fikoeritrin (PE) (lökositler) antikorları, bir farenin kuyruk damarına yerleştirilen bir kateter aracılığıyla intravenöz olarak (i.v.) enjekte edildi. Bu makalede, arteriyogenez ile ilgili süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılan statik ex vivo (immüno-) histolojik analizlere alternatif veya in vivo kompleman olarak intravital multifoton görüntüleme tanıtılmaktadır. Özetle, bu yazıda immün hücre kaçakçılığını, kan akışını ve kayma stresini arka bacak arteriyogenez modelinde araştırmak için yeni ve dinamik bir in vivo yöntem anlatılmakta ve bu da değerlendirme olanaklarını önemli ölçüde artırmaktadır.
Introduction
Son yıllardaki yoğun araştırma ilgisine rağmen, kardiyovasküler hastalıklar, örneğin iskemik kalp hastalığı ve inme, hala önde gelen küresel ölüm nedenidir1. Bu hastalıkların güncel tedavileri perkütan transluminal anjiyoplasti, perkütan transluminal koroner anjiyoplasti veya bypass cerrahisi2 gibi oldukça invaziv tedavilerdir. Bu nedenle, alternatif, non-invaziv tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Vücut, kesilen kan akışını stenozun distal kısmına yönlendirmek için stenozlu veya tıkalı bir damarın etrafında doğal baypaslar oluşturabilir. Bu sürece arteriyogenez2 denir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, artan sıvı kaymasının, arteriyogenez3 sırasında önemli bir rol oynayan lökosit alımını etkilediğini göstermiştir. Arteriyogenez sırasında lökositlerin işe alımını analiz etmek için ana güncel seçenekler ex vivo (immüno -) histolojik analizler veya floresan aktive hücre sıralama (FACS) metodolojisi4'tür. Arteriyogenez sırasında lökosit dinamiklerinin değerlendirilmesini sağlamak için, bu yazıda multifoton mikroskobu ile intravital bir görüntüleme protokolü sunulmaktadır.
Lökositler, arteriyogenez3 sürecinde işe alınan başlıca kan hücreleridir. Bu protokol, kollateral arterlerde enjekte edilen anti-CD45-PE antikorları ile etiketlenmiş yapışkan lökositlerin taranmasını, bir murin arka ekstremite iskemisi model 5,6 kullanılarak femoral arter ligasyonu (FAL) ile arteriyogenezin indüksiyonundan 24 saat sonra göstermek için multifoton görüntüleme kullanır. Alternatif olarak, bağışıklık hücreleri ex vivo olarak etiketlenebilir ve intravital mikroskopi7 kullanılarak anjiyogenez üzerine yapılan çalışmalarda gösterildiği gibi farelere dikkatlice enjekte edilebilir. Damarlar ve arterler içindeki kan akışı, CD41-FITC (trombositleri etiketlemek için), dekstran-FITC (plazma) veya vasküler ağacın bir kısmının bazal zarında bulunan kollajen tip 1'i görselleştiren ikinci harmonik nesil (SHG) ile görselleştirilebilir. SHG, çoklu foton uyarımının benzersiz bir serbest etiketleme etkisidir. Multifoton görüntüleme, dokuya zarar vermeden ve hücreleri lazer güç uyarımı ile aktive etmeden uzun süreli hücre takibine izin verir. Multifoton mikroskopisi, floroforları doku / organların derinliklerine minimum fototoksisite ile uyarma kabiliyeti nedeniyle canlı hayvanlarda floresan olarak etiketlenmiş hücreleri ve yapıları görselleştirmek için tercih edilen görüntüleme yöntemidir8.
Femtosaniye aralıklarla verilen darbelerle ayarlanmış kızılötesi lazerlerin kullanılması, florokromu yalnızca odak düzleminde heyecanlandırır, odak düzlemi8'in üstünde ve altında uyarma olmaz. Böylece, çoklu foton mikroskopisi, organların içindeki dinamik biyolojik olayları incelemek için yüksek uzaysal-zamansal çözünürlük, daha az foto-hasar ve artan doku penetrasyon görüntülemesine izin verir. Canlı hayvan görüntülemesi için ideal bir mikroskopi aracıdır. Bununla birlikte, multifoton ve diğer intravital mikroskopi sanatları, kalp atışı, solunum, peristaltik hareketler, kas tonalitesi ve görüntüleme edinimini ve analizini bozan diğer fizyolojik fonksiyonlar nedeniyle doku hareketi ile sınırlıdır. Bu hareketler zamansal ve mekansal çözünürlüğü bozduğundan ve hatta bazen sonraki analizleri yasakladığından, doğru veri analizi ve yorumlamasını sağlamak için uygun şekilde ele alınmaları gerekir. Doku hareketinden kaynaklanan artefaktları azaltmak veya önlemek için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. Bu protokol, görüntü alımı sırasında doku kaymasını düzeltmek için VivoFollow9 adlı bir yerinde sürüklenme düzeltme yazılımı uygular. Bu yaklaşım, gerekli görüntü sabitlemeyi sağlayarak uzun süreli görüntüleme ve hücre izleme analizine olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Bavyera Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (etik kodla onaylanmıştır: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Bu deneyler, Alman hayvan mevzuatı yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hayvanlar ve femoral arter ligasyonu (FAL)
NOT: Steril inflamasyon ve arteriyogenezi indüklemek için 8-10 haftalık erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Farelerin hiçbiri, sırasıyla FAL veya sahte ameliyat sırasında veya sonrasında yara enfeksiyonu veya yara iyileşmesi bozukluğundan ölmedi veya acı çekmedi.
- Anestezi
NOT: MMF karışımı anestezinin enjeksiyonundan önce, fare uyuyana kadar% 5 izofluran ile anestezi yapılması önerilir.- Fareyi tartın ve MMF karışımını 5.0 mg / kg midazolam 5.0 mg / kg, medetomidin 0.5 mg / kg ve fentanil 0.05 mg / kg ile hazırlayın.
- 1 mL'lik bir şırıngayı MMF karışımı ile doldurun ve 30 G'lik bir iğne kullanarak (% 5 izofluran ile anesteziden sonra) son 100 μL s.c. hacmini enjekte edin.
- Fareyi sıcak bir pedin üzerine yerleştirin ve fare tamamen uyuşturulana kadar bekleyin. Zamanlayıcıyı 35 dakikaya ayarlayın. Bu süreden sonra, MMF karışımının dozunun yarısını (50 μL) SC enjekte edin.
- Farenin pedalını ve interdigital reflekslerini (sıkı ayak parmağı sıkışmasıyla) test ederek anestezinin derinliğini kontrol edin.
NOT: Yanıt yokluğu, yeterli bir analjezi derinliğini gösterir.
- Femoral arter ligasyonu (FAL)
NOT: Steril cerrahi aletler ve dikişler kullanın. Açmadan önce ve kapattıktan sonra cildi dezenfektanla dezenfekte edin.- Fizyolojik vücut ısısını korumak için anestezi uygulanan fareyi bir ısıtma plakasına (35-37 ° C) yerleştirin. Anestezi altında gözlerin kurumasını önlemek için her göze göz kremi (dekspantenol) uygulayın.
- Kan akışını ve perfüzyonu kontrol etmek için anestezi uygulanan fareyi FAL'dan önce ve sonra bir Lazer Doppler görüntüleme (LDI) odasına aktarın (Şekil 1A-C).
- Saçları çıkarın, cildi dezenfekte edin ve femoral artere erişmek için bir kesim yapın. Cerrahi mikroskop altında, örgülü bir ipek sütür (7-0) kullanarak farenin arka bacağındaki sağ femoral arteri bağlayın ve daha önce tarif edildiği gibi iç kontrol görevi görmek için sol femoral arterde sahte bir operasyon gerçekleştirin6 (Şekil 1D-K).
NOT: Derideki kesi, cilde yakın kan damarlarına doğrudan zarar gelmesini önlemek için küçük makasla yapılmıştır. - Örgülü ipek bir dikiş kullanarak cildi kapatın (6-0). Buprenorfin (0.1 mg / kg) s.c.'yi her 12 saatte bir, ağrı kesici için anesteziyi antagonize etmeden 10 dakika önce başlayarak uygulayın. Hayvanı ağrı sinyalleri, yani azalmış tımar aktivitesi, hareket etme isteksizliği veya ameliyat sonrası 24 saat boyunca kambur duruş için gözlemleyin.
- FAL'ı bitirdikten ve cildi kapattıktan sonra anesteziyi antagonize etmek için nalokson (1.2 mg / kg), flumazenil (0.5 mg / kg) ve atipamezol (2.5 mg / kg) kombinasyonunu enjekte edin (s.c.).
- Ameliyattan sonra, fareyi sıcak pedin üzerinde tutun ve dik bir duruş sergileyene ve kafesin etrafında normal bir şekilde yürümeye başlayana kadar hayvanı sürekli izleyin.
- Fare tamamen uyanıkken, diğer farelerle birlikte kafese geri yerleştirin ve kafesi hayvan barınağı odasına geri getirin.
2. Multifoton intravital görüntüleme için doku hazırlığı
- Kuyruk damarı enjeksiyonu
NOT: İntravital görüntüleme için hazırlığa başlamadan önce hayvanın anestezi altında olması gerekir. Damar kateterinin iğnesini sokmadan önce, kuyruğa bir cilt dezenfektanı uygulanması önerilir. Bu aynı zamanda gemileri görselleştirmeye yardımcı olacaktır.- 2 x 30 G iğne, 10 cm ince delikli polietilen boru (0,28 mm iç çap ve 0,61 mm dış çap), 1 mL şırınga ve görüntüleme sırasında daha fazla i.v. enjeksiyonu için kateteri fare kuyruğuna sabitlemek için bir histoacryl yapıştırıcı kullanarak bir kuyruk damarı enjeksiyon kateteri hazırlayın (Şekil 2A, B ve Şekil 2F).
- I.v. enjeksiyonu için antikor çözeltisini hazırlayın: CD45-PE ve CD41-FITC (20 μg / fare) 100 μL'lik son hacimde.
- Yanal olarak yerleştirilmiş kuyruk damarları için kuyruğu kontrol edin ve kuyruk damarını tanımlamak için damarı barajlayın. Kuyruğu dezenfekte edin, damar kateterini yerleştirin ve doku histoacryl yapıştırıcı kullanarak sabitleyin (Şekil 2B).
- Antikorları görüntülemeden önce (en az 15 dakika önce) ve doku hazırlığını bitirdikten sonra enjekte edin.
- Doku hazırlama
NOT: Her zaman ılık bir ped kullanın ve doku hazırlamadan önce her göze bir damla göz kremi (dekspantenol) uygulayın. Steril cerrahi aletler ve dikişler kullanın. Açmadan önce ve kapattıktan sonra cildi dezenfektanla dezenfekte edin.- Anestezi uygulanan fareyi sabit ve taşınabilir bir ped üzerine yerleştirin. Yapışkan bant kullanarak fareyi sırtüstü pozisyonda, pedin üzerine 4 noktalı sabitleme ile sabitleyin (Şekil 2B).
- İki parça modelleme kili kalıplayın ve adduktör kasının düzlemsel bir pozisyonunu sağlamak için parçaları farenin üst arka bacağının altına yerleştirin (Şekil 2B, kırmızı oklarla gösterilmiştir).
- Farenin 37 ° C'lik sabit bir vücut ısısını sağlamak için, pedi fareyle birlikte 0,64-4,0 kat yakınlaştırmalı bir cerrahi mikroskop altında bir ısıtma plakasına yerleştirin (Şekil 1L).
- Saçları her iki bacaktan da çıkarın, cildi dezenfekte edin ve cildi sağ arka bacağın daha önceki femoral arter ligasyonunun izi etrafında bir daire şeklinde kesin (Şekil 1M).
- Deri ve yağ tabakasını bacağın üstünden çıkarın (Şekil 1N, O) ve adduktör kasının etrafında bir cep oluşturmak için dikişleri kullanarak kalan cildi bir kenara çekin (Şekil 1P, Q).
- Adduktör kası ve derin arter / venin yanı sıra kollateral damarların net bir görünümünü elde etmek için deri altı yağını çıkarın (Şekil 1Q, R ).
- Kollateral damarların üstündeki yüzeysel kas tabakasını, ince forsepslerle dikkatlice diseke ederek dikkatlice çıkarmaya başlayın (Şekil 1 R).
NOT: Kollateral arter ve kollateral ven açıkça görülebilir ve görüntülemeye hazırdır (Şekil 1S). - Dokunun kurumasını önlemek için hazırlanan cebi salinle doldurun ve sahte ameliyat edilen sol arka bacak için aynı prosedürle devam edin. Görüntülemeden önce, her iki cebe de ultrasonik jel ekleyin, bu da kurumayı önler ve amaç ile optik bağlantı için daldırma ortamı görevi görür (Şekil 2C ve Şekil 2F).
3. İntravital multifoton mikroskobu
- Hazırlık
NOT: Uzun süreli görüntüleme sırasında cepleri yeniden doldurmak için sıcak bir sıcaklığı korumak için mikroskopun inkübatör odasının içinde ultrasonik jelli bir şırınga bulundurun.- Hazırlanan iki cepten salini çıkarın ve kollateral damarları örtmek için ultrasonik jel ile değiştirin (Şekil 2C).
- Antikor solüsyonunu kuyruk damarı kateterinden enjekte edin. Antikor enjeksiyonundan 15 dakika sonra, pedi sabit fare ile ısıtılmış multifoton görüntüleme odasına aktarın (Şekil 2F).
- Görüntü alımının tamamlanmasından sonra, fareyi derin narkoz altında servikal çıkık ile ötenazi yapın.
- Multifoton mikroskobu görüntü yakalama
NOT: Lazer stabilizasyonuna izin vermek için görüntülemeden 30 dakika önce mikroskobu açın. Mikroskobun en iyi optik kararlılığı için, mikroskop odasının kalıcı olarak ısıtılması önerilir.- Ti: Safir lazer kutusunun, elektronik arayüz kutularının, inkübasyon odasının ısıtma ünitesinin, floresan lambanın ve bilgisayarın anahtarını açın (Şekil 2D, E).
- Satın alma yazılımını başlatın (Müfettiş yazılımı). Dalga boyunu 800 nm'ye ayarlayın ve mikroskop deklanşörünü açın (Şekil 3A ii).
- Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunda, Cihaz Modu'nu (Tek huzme) ve Ölçüm Modu'nu (3B tarama Zaman atlamalı) seçin (Şekil 3A i).
- Anestezi uygulanan fareyi mikroskobun önceden ısıtılmış inkübasyon odasına aktarın. Alanı ultrasonik jel (adım 2.2.8) ile objektif ön lensle doğrudan temas halinde konumlandırın (Şekil 2F).
- Epifloresan mikroskop deklanşörünü açın, epifloresan aydınlatması altında kan akışını takip ederek ilgi alanını bulmak için FITC görselleştirmesi için yeterli bir filtre / dikroik ayar seçin (4). İlgilenilen alanı orta görüş alanına getirdikten sonra, epifloresan mikroskop deklanşörünü kapatın.
- xy-Scanner iletişim kutusunda aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Görüntü boyutu (554x554), Piksel (512x512), Frekans (400), Çizgi ortalaması (1) (Şekil 3A iii). Lazer gücünü (% 5) ayarlayın (Şekil 3A iv) ve yeşil (66), kırmızı (66) ve mavi (63) kanallar için fotoçarpan (PMT) kazancını ayarlayın (Şekil 3A v).
- İntravital görüntüleme ve sürüklenme düzeltme ayarları için yeterli hedef seçin (3.2.11'deki ayrıntılara bakın).
NOT: Burada seçilen objektif Nikon LWD 16x modeliydi (Şekil 3A vi). - Ölçüm Sihirbazı iletişim penceresinin sağ üst köşesindeki kırmızı düğmeye basarak önizleme alma modunu başlatarak görüntü yığını aralığını tanımlayın (Şekil 3A i).
- İyi bir görüntü elde etmek için odaklanarak ilgi alanını ve yapısını tanımlayın. Ardından, ekranı gözlemlerken, görüntü kaybolana kadar hedefi yukarı doğru hareket ettirerek odağı değiştirin ve sıfır olarak ayarlayın (first = 0). Görüntü ekrandan tekrar kaybolana kadar hedefi aşağı doğru hareket ettirerek odağı ters yönde değiştirin ve eksenel yönde son (end= 40 μm) konum olarak ayarlayın (Şekil 3A vii).
- Adım boyutunu 2 μm olarak ayarlayın. Önizleme taramasını durdurmak için Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunun sağ üst köşesindeki kırmızı düğmeyi tıklatın.
NOT: Görüntü sayısı Şekil 3A vii'de gösterildiği gibi otomatik olarak hesaplanacak ve ayarlanacaktır (21 resim). - Mikroskop canlı sürüklenme düzeltme9 ile donatılmışsa, sürüklenme düzeltme yazılımını (örneğin, VivoFollow) başlatın ve aşağıda açıklanan adımları izleyin.
- Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunda, ilk eksen aygıtı olarak Python eksenini (Python Ax) (Şekil 3A viii) seçin; Otomatik kaydetme modunu ETKİNLEŞTİRMEYİN. Otomatik kaydetme (AS) kutusunu yalnızca zaman ekseninde (Zaman Saati) işaretleyin. Python iletişim penceresini açmak için Kullanılabilir Cihazlar penceresindeki Python simgesine basın (Şekil 3A ix).
- Python iletişim kutusu Eksen ayarları'nda, Kimden (0 sıfır) ve Kime (-40) girin. Şekil 3A x'te gösterildiği gibi Adım sayısını (21) girin.
- xyz Stage Z iletişim penceresine gidin ve Tarama Aralığını her iki uçta da 200 μm büyütün: Başlat'ta (200 μm) girin ve Sonunda (-240 μm) girin, aralık otomatik olarak ayarlanır (-440 μm). Adım boyutunu (2 μm) Şekil 3A xi'de gösterildiği gibi tutun.
- VivoFollow Ön Uç iletişim kutusunu açın ve Hareket Profili kutusunu tıklayın (Şekil 3A xii).
- Denetçi Yazılımı'nın Ölçüm Sihirbazı iletişim kutusunun sol üst köşesindeki yeşil ok ucuna basarak görüntü yakalamayı başlatın (Şekil 3A i).
- Canlı sürüklenme düzeltmesi kullanılıyorsa, sapma düzeltme yapılandırmasının Şekil 3A xiii'de gösterildiği gibi görünmesi için bir iletişim kutusu arayın. Hareketsiz bir dönüm noktası referansı olarak kullanılacak edinme kanalını ayarlayın (bu protokol için, vasküler izleyici sinyalinin kaydedileceği kanal 2'yi seçin). İlk ve son z konumlarına (burada, 200 μm) eklenen maksimum düzeltme ofsetini μm cinsinden girin ve Tamam'ı tıklatın.
- VivoFollow önlü iletişim penceresinde görüntü toplama sırasında x, y ve z cinsinden geçerli sapma ofsetini gerçek zamanlı olarak izleyin Şekil 3A xiv.
- Başka bir anestezi yeniden enjeksiyon döngüsü gerektiğinde ~ 35 dakika sonra görüntüleme alımını durdurun. MMF karışımının yarım dozunu (50 μl s.c) enjekte edin ve yeşil ok ucuna tekrar basarak görüntüleme alımını yeniden başlatın (adım 3.2.11.5).
- Deneme bitene kadar bu yordamı yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multifoton mikroskopisi, lökosit takibi için hücre migrasyon adımlarının ve hızının izlenebileceği ve izlenebileceği yüksek bir mekansal-zamansal çözünürlük sunar (Şekil 4A, B). Bununla birlikte, numunenin fizyolojik hareketi, özellikle uzun süreli intravital mikroskopi görüntü kazanımları için bir zorluk teşkil etmektedir. Bu nedenle, başarılı ve istikrarlı görüntüleme elde etmek için iyi bir doku hazırlığı ve dokuyu sabitlemek için tutucular ve doku sürüklenmesi için gerçek zamanlı görüntüleme düzeltmesi gibi araçlar gereklidir. Burada, uzun süreli görüntüleme kazanımı sırasında oluşan doku sürüklenmesini düzeltmek için canlı bir sürüklenme aracı olan VivoFollow kullanıldı.
Bu aracın uygulanması, uzun süreli görüntü elde etmeye izin verir ve hız ölçümleri için hücrelerin izlenmesi için uygun olan yüksek kaliteli verilerin toplanmasını sağlar. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, sürüklenme düzeltmesi olmadan, ilgilenilen bölge kademeli olarak kayıt görünümünden uzaklaşır ve hız analizi için hücreleri izleme yeteneğini etkiler. Bununla birlikte, Şekil 3C'de gösterildiği gibi, sürüklenme düzeltme yazılımı ile kararlı filmler kaydedilebilir ve uzun bir süre boyunca daha fazla hücre izlenebilir. Sapma düzeltme yazılımı, Şekil 3D'de gösterildiği gibi, sistemin düzelttiği zaman içindeki x, y ve z ofsetlerinin görselleştirilmesini de sağlayabilir.
Resim 1: Lazer Doppler Görüntüleme kurulumu ve femoral arter ligasyonu için hazırlık ve intravital görüntüleme için doku hazırlığı. (A) LDI görüntüleme kurulumu. (B) Fare, görüntü elde etmek için LDI ısıtma odasının içine yerleştirilir. (C) Ligasyon sonrası arka ekstremite perfüzyonunu kontrol etmek için FAL'dan önce (üst panel) ve FAL'dan sonra (alt panel) sağ ve sol bacakların LDI görüntüleri. Sağ femoral arter bağlandı/tıkandı, sol femoral arter ise sham-operatif (Sham) edildi ve internal kontrol görevi gördü. Renk çubuğunda, mavi düşük kan perfüzyonunu gösterir ve kırmızı daha yüksek perfüzyonu gösterir. (D-K) Görüntüler femoral arter ligasyonunun cerrahi basamaklarını temsil eder. Ölçek çubuğu = 10 mm. (L-S) FAL sonrası intravital görüntüleme için doku hazırlığı. Görüntülenecek alan, teminat damarlarının bulunduğu siyah daire ile gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 mm. Kısaltmalar: LDI = Lazer Doppler görüntüleme; FAL = femoral arter ligasyonu; Occ = oklüzyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Multifoton intravital görüntüleme için kurulum. (A) Ven kateter hazırlığı; 1-10 cm'lik ince polietilen boru, 2: 2x 30 G iğne; 3: 1 mL şırınga ile bağlı monte edilmiş kateter; 4: doku histoacryl tutkalı; 5: iğne tutucu. (B) Her iki arka bacağı görüntüleme için hazırlanmış siyah modelleme kil (kırmızı oklar) parçaları üzerine yerleştirilmiş sırtüstü pozisyonda yerleştirilmiş fare. (C) Tıkalı (Occ) sağ arka bacak ve sol, sahte ameliyatlı arka bacak görüntüleme için hazır. (D) İnkübatör odasını ısıtmak için lazer kutularını, floresan lamba kutusunu, tüpleri gösteren çoklu foton mikroskop kurulumu. (E) Çok foton mikroskobunun inkübatör odası. (F) Mikroskop odasının içine yerleştirilen fare, ultrasonik jel ile kaplı dokuya dokunan 16x objektif ile. Antikor enjeksiyonu için kuyruk damarına sabitlenmiş ven kateterini gösteren detay. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: VivoFollow sapma düzeltme yazılımı kurulumu. (A) (i-xiv) Protokol adımı 3.2.2-3.2.11.9'da açıklandığı gibi yazılım kurulum adımları. (B) Sapma düzeltme yazılımı açılmadan sürüklenen görüntülemeyi gösteren temsili zaman serisi görüntüleri. Kollateral arter beyaz kesilen çizgilerle sınırlandırılmıştır (Video 1 ve Video 2). (C) Görüntüleme alımı sırasında canlı sapma düzeltmesi uygulandığında kararlı zaman serilerini gösteren temsili zaman serisi görüntüleri. Lökositler CD45-PE antikorları (kırmızı), trombositler CD41-FITC antikorları (yeşil) ve kollajen tip 1 SGH (mavi) ile etiketlendi. Kollateral arter beyaz kesilen çizgilerle sınırlandırılmıştır. (D) Canlı düzeltmeyi x, y ve z yönleri boyunca gösteren çizgi grafik. Kısaltmalar: PE = phycoerythrin; FITC = floresein izotiyosiyanat; SGH = ikinci harmonik nesil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili sonuçlar . (A) Şam ile ameliyat edilen (Sham) ve femoral arter ile bağlanmış arka bacakların kollateral arterlerinde ölçülen lökosit hızları. (B) Temsili görüntüler, izlenen hücreleri (macenta) ve izleri renk kodlu olarak gösterir. Renk kodu çubuğu, mavi izlerle gösterilen daha yavaş hücrelerle ve kırmızı izlerle daha hızlı hücrelerle hücre hızını temsil eder. Lökositler enjekte edilen CD45-PE antikorları (kırmızı), trombositler enjekte edilen CD41-FITC antikorları (yeşil) ve kollajen tip 1 SGH (mavi) ile etiketlendi. Üç ayrı deneyin sonuçları. Ölçek çubuğu = 20 μm. Video 3 ve Video 4'e bakın. Kısaltmalar: Occ= tıkalı/femoral arter bağlı; PE = fikoeritrin; FITC = floresein izotiyosiyanat; SGH = ikinci harmonik nesil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Sürüklenme düzeltmesi olmadan bir kollateral arterin multifoton intravital görüntülemesi. Dört boyutlu görüntüler, 554 x 554 μm piksel boyutu, 600 Hz frekans, 1100 ms/kare aralığı, 2 μm adım boyutu ve 40 μm aralığında kaydedildi. Video, VivoFollow sürüklenme düzeltme yazılımı uygulanmadan sürüklenen görüntüyü gösterir. Kollateral arter videonun alt kısmında gösterilir ve kollateral ven filmin üst kısmında 3 dakika sonra görünür. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Sürüklenme düzeltmesi uygulanarak bir kollateral arterin multifoton intravital görüntülemesi. Dört boyutlu görüntüler, 554 x 554 μm piksel boyutu, 600 Hz frekans, 1100 ms/kare aralığı, 2 μm adım boyutu ve 40 μm aralığında çekildi. Video, canlı sürüklenme düzeltme yazılımı VivoFollow ile kaydedildi ve sapma düzeltme yazılımı uygulanarak teşvik edilen görüntüleme kararlılığını gösteriyor. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: Sahte operasyondan sonra bir kollateral arterde hücre izleme görüntülemesi. Enjekte edilen anti-CD45-PE antikorları ile etiketlenmiş lökositler, sahte olarak çalıştırılan bacağın istirahat eden bir kollateral arterinde görüntülendi ve hücreleri izlemek için eklenti ile Imaris yazılımı kullanılarak izlendi. İzlenen hücreler seçildi ve macenta noktaları ile temsil edildi. İzler hücre hızına göre renk kodluydu. Daha yavaş hücreler mavi izlerle, daha hızlı hücreler ise kırmızı izlerle temsil edilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltma = PE = phycoerythrin. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 4: FAL'dan sonra bir kollateral arterde hücre izleme görüntülemesi. Anti-CD45-PE antikorları ile etiketlenmiş lökositler, FAL tarafından arteriyogenezin indüksiyonundan 24 saat sonra büyüyen bir kollateral arterde görüntülendi ve hücreleri izlemek için eklenti ile Imaris yazılımı kullanılarak izlendi. İzlenen hücreler seçildi ve macenta noktaları ile temsil edildi. İzler hücre hızına göre renk kodluydu. Daha yavaş hücreler mavi izlerle, daha hızlı hücreler ise kırmızı izlerle temsil edilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: FAL = femoral arter ligasyonu; PE = fikoeritrin. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
| Teknik Sorunlar | Önerilen çözümler | |
| Kateteri sokmak için kuyruk damarlarının görünür olmaması durumunda | • Lokal vazodilatasyonu teşvik etmek için fare kuyruğunu çevreleyen sıcak bir kompres kullanın. Damarın görünür olmasına yardımcı olacaktır. | |
| Kuyruk kateterinin antikor enjeksiyonu için sabitlenememesi durumunda | • Damara sokmak için 30 G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanın ve görüntülemeden önce antikorları ve boyaları doğrudan enjekte edin. | |
| • Bazı durumlarda (antikorlara bağlı olarak) enjeksiyon görüntülemeden 1 saat önce uygulanabilir. | ||
| Dokunun hareketi görüntüleme stabilitesini engellediğinde | • Fizyolojik karın hareketlerinden kaçınmak için farenin üst ipucu bacağını yeniden konumlandırmaya ve sabitlemeye çalışın. | |
| • Mikroskop tablasının titreşimi iptal etmek için yeterli havaya sahip olup olmadığını kontrol edin. | ||
| • Farenin derin anestezi altında olduğundan ve uyanmadığından emin olun. | ||
| • Farenin nefes almasını izleyin. Fare çok hızlı nefes aldığında, görüntüleme hareketi üzerinde bir etkisi olabilir. | ||
| Görüntü kalitesi düşmeye başladığında | • Ultrasonik jelin kurumadığından emin olun. | |
| • Ultrasonik jeli tekrar doldurun. | ||
| • Hedefin temiz olduğundan emin olun (yeni bir yeniden doldurma yapıldığında hedefteki kurutulmuş ultrasonik jeli temizleyin). | ||
| Görüntüleme için hazırlık sırasında arterler hasar gördüğünde | • Bu durumda görüntü elde etmek mümkün olmayacaktır. Denemeyi çalıştırmak mümkün değildir. | |
Tablo 1: Sorun giderme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lökosit alımının tarif edilen multifoton in vivo analizi yöntemi, (immüno-) histolojik veya FACS analizleri gibi lökosit işe alım çalışmaları için yaygın olarak kullanılan araçlara bir eki temsil etmektedir. Bu görüntüleme yöntemi ile arteriyogenez10 sırasında lökosit aderansı ve ekstravazasyonundaki dinamik süreçleri daha ayrıntılı olarak görselleştirmek mümkündür. Bu yöntemin katma değerine rağmen, sunulan protokol bazı kritik adımlar ve sınırlamalar içermektedir. Daha fazla sorun giderme ipucu için Tablo 1'e bakın. Kollateral arterler üzerindeki yüzeyel kas tabakasının çıkarılması sırasında, bu arterler hasar görebilir ve intravital görüntüleme için yararlı olmayacaktır. Kateter antikor enjeksiyonu için iyi sabitlenmiş olmalıdır; Aksi takdirde, kuyruk damarı kateterinin kayması, antikorların kuyruğun perivasküler boşluğuna ekstravazasyonuna neden olabilir, bu da antikorların enjeksiyonu için değiştirme ve ek düzeltmeyi zorlu bir görev haline getirir. İntravital mikroskopi sırasında kollateral arter ve kollateral venin doğru tanımlanması bu protokolün bir başka kritik adımını temsil eder.
İntravital mikroskopi sırasında farenin mekanik olarak havalandırılmadığı göz önüne alındığında, aşırı uzun anestezi sonucu farenin fiziksel olarak yaralanmasını önlemek için dinamik görüntüleme süresi sınırlıdır. İntravital mikroskopinin eksikliklerinden biri, solunum, kalp atışı ve peristaltik hareketler tarafından üretilen, görüntü elde etmeyi ve dolayısıyla veri analizlerinin kalitesini etkileyebilecek fare fizyolojik hareketidir. Doku tutucuların iyileştirilmesi, montajı ve fiksasyonu, hareketin etkilerini daha da azaltan adımlardır. Fizyolojik harekete ek olarak, uzun süreli görüntüleme, görüntüleme sırasında dokunun sürüklenmesine katkıda bulunabilir. Bu protokolde açıklandığı gibi, gerçek zamanlı bir doku sürüklenmesi düzeltme yazılımı olan VivoFollow, sonraki hücre takibi ve hücre hızı analizi için uygun görüntüleme verilerini elde etmek için kullanılmıştır. Bu VivoFollow yazılımı, görüntü yakalama sırasında doğrudan x, y ve z'deki numune yer değiştirmesini düzeltir. Hareketsiz anatomik yapıya dayanır, örneğin, damarlar düzeltme prosedürü için referans işaretleri olarak hizmet eden vasküler izleyicilerle görselleştirildiğinde.
Bitplane Imaris veya ImageJ eklentileri gibi başka satın alma sonrası sürüklenme düzeltme araçları mevcut olsa da, ilgili bölgenin restorasyonuna izin vermedikleri için düzeltme kapasitelerinde çok sınırlıdırlar. İlke olarak, ilgilenilen bölge görüş alanının dışına çıktığında ciddi mahsuplaşmaları düzeltemezler. Bununla birlikte, bu protokol, canlı sürüklenme düzeltmesi kullanılamadığında bile uygulanabilir ve edinme sonrası düzeltme gerekli hale gelir. Bununla birlikte, bu, personelin doku montajı ve fiksasyonu konusunda sık sık eğitilmesini gerektirir. Sonuç olarak, multifoton intravital mikroskopi, lökosit alımının dinamik bileşenlerinin daha ayrıntılı bir resmini elde etmek için (immüno-) histolojik analizler gibi statik yerleşik yöntemlere paralel olarak uygulanabilen yararlı bir dinamik yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A / SM, proje Z01) tarafından finanse edildi. Dr. Susanne Stutte'ye makaleyi okuduğu için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
