Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62974
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi brugen af enkeltmolekylebilleddannelsesmetoden, DNA Curtains, til at studere den biofysiske mekanisme af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA.

Abstract

Fusionsgenerne som følge af kromosomtranslokation er fundet i mange solide tumorer eller leukæmi. EWS-FLI1, som tilhører FUS/EWS/TAF15 (FET) familien af fusions-oncoproteiner, er et af de hyppigst involverede fusionsgener i Ewing-sarkom. Disse FET-familiefusionsproteiner har typisk et lavkompleksitetsdomæne (LCD) af FET-protein ved deres N-terminal og et DNA-bindende domæne (DBD) ved deres C-terminal. EWS-FLI1 er blevet bekræftet at danne biomolekylære kondensater på dets målbindende loci på grund af LCD-LCD- og LCD-DBD-interaktioner, og disse kondensater kan rekruttere RNA-polymerase II for at forbedre gentranskription. Hvordan disse kondensater samles på deres bindingssteder er dog stadig uklart. For nylig blev en enkeltmolekyle biofysikmetode - DNA Gardiner - anvendt til at visualisere disse samlingsprocesser af EWS-FLI1 kondensater. Her diskuteres de detaljerede eksperimentelle protokol- og dataanalysemetoder til anvendelse af DNA-gardiner til undersøgelse af de biomolekylære kondensater, der samles på mål-DNA.

Introduction

Transkriptionel regulering er et afgørende skridt for præcis genekspression i levende celler. Mange faktorer, såsom kromosomal modifikation, transkriptionsfaktorer (TF'er) og ikke-kodende RNA'er, deltager i denne komplicerede proces 1,2,3. Blandt disse faktorer bidrager TF'er til specificiteten af transkriptionel regulering ved at genkende og binde til specifikke DNA-sekvenser kendt som promotorer eller forstærkere og efterfølgende rekruttere andre funktionelle proteiner til at aktivere eller undertrykke transkription 4,5,6,7. Hvordan disse TF'er formår at søge efter deres målsteder i det menneskelige genom og interagere med DNA belagt med histoner og ikke-histon-DNA-bindende proteiner har forvirret forskere i årtier. I de sidste par år er flere klassiske modeller til målsøgningsmekanismen for TF'er blevet bygget til at beskrive, hvordan de "glider", "hopper", "hopper" eller "intersegmentoverførsel" langs DNA-kæden 8,9,10,11. Disse modeller er fokuseret på søgeadfærden på DNA'et fra et enkelt TF-molekyle. Nylige undersøgelser viser imidlertid, at nogle TF'er gennemgår væske-væskefaseseparation (LLPS) enten alene i kernen eller med Mediatorkomplekset12. De observerede dråber af TF'er er forbundet med promotor- eller forstærkerregionerne, hvilket fremhæver rollen som biomolekylær kondensatdannelse i transkription og det tredimensionelle genom13,14,15. Disse biomolekylære kondensater er forbundet med membran-manglende rum in vivo og in vitro. De dannes via LLPS, hvor modulære biomakromolekyler og iboende uordnede regioner (IDR'er) af proteiner er to hoveddrivkræfter for multivalente interaktioner16. Således søger TF'er ikke kun DNA, men fungerer også synergistisk inden for disse kondensater 4,17,18. Til dato forbliver den biofysiske egenskab af disse transkriptionskondensater på DNA uklar.

Derfor havde denne undersøgelse til formål at anvende en enkeltmolekylemetode - DNA-gardiner - til direkte at afbilde dannelsen og dynamikken af transkriptionskondensaterne dannet af TF'er på DNA in vitro. DNA Curtains, en high throughput in vitro imaging platform til at studere interaktionen mellem proteiner og DNA, er blevet anvendt i DNA-reparation 19,20,21, målsøgning22 og LLPS17,23,24. Flowcellen af DNA-gardiner er belagt med biotinylerede lipiddobbeltlag for at passivere overfladen og tillade biomolekylerne at diffundere på overfladen. De nanofabrikerede zig-zag-mønstre begrænser bevægelsen af DNA. Biotinylerede Lambda DNA-substrater kan justere langs barrierekanterne og strækkes af den orienterede bufferstrøm. De samme start- og slutsekvenser af alle molekylerne tillader sporing af proteinet på DNA og beskriver positionsfordelingen af bindingsbegivenhederne25,26. Desuden hjælper kombinationen af DNA-gardiner med total intern refleksionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) med at minimere baggrundsstøj og detektere signaler på et enkeltmolekyleniveau. DNA Gardiner kan således være en lovende metode til at undersøge dynamikken i transkriptionskondensatdannelse på DNA-motiver. Dette papir beskriver eksemplet på et FUS / EWS / TAF15 (FET) familie fusion oncoprotein, EWS-FLI1, genereret af kromosomal translokation. Lambda DNA indeholdende 25× GGAA - bindingssekvensen af EWS-FLI127- blev brugt som DNA-substrat i DNA Curtains-eksperimenterne til at observere, hvordan EWS-FLI1-molekyler gennemgår LLPS på DNA. Dette manuskript diskuterer den eksperimentelle protokol og dataanalysemetoder i detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af lipid bilayer master mix

  1. Skyl hætteglas med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og 99% ethanol, og tør dem i en 60 °C tørreovn.
  2. Lav lipidmasterblandingen ved at opløse 1 g 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 100 mg polyethylenglycol-reagerede (PEGylerede) lipider (18:1 af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy (polyethylenglycol)-2000] (ammoniumsalt) (PEG2000 DOPE) og 25 mg biotinylerede lipider (18:1 af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap biotinyl) (natriumsalt) (Biotinyl Cap DOPE)) i 10 ml chloroform.
  3. Der fremstilles 1 ml alikvoter af lipidmasterblandingen pr. hætteglas, og de opbevares ved -20 °C i hætteglas med rent glas.
    BEMÆRK: Opbevar det opløste lipid i hætteglas af glas, og dæk hætteglashætten med parafilm under opbevaring.

2. Fremstilling af liposomopløsning

  1. Skyl et hætteglas med 2 ml glas med ddH2O og 99% ethanol og tør det grundigt i en 60 °C tørreovn.
  2. Skyl en 250 μL glassprøjte med chloroform, og overfør derefter 200 μL af lipidmasterblandingen til hætteglasset med tørt glas.
  3. Brug en nitrogensprøjtepistol til at strømme N2 forsigtigt, mens hætteglasset kontinuerligt roteres i en retning.
    BEMÆRK: N2 hjælper med at fordampe chloroformen, og de resterende lipider danner en tynd film på glashætteglassets væg. Juster nitrogenstrømmen til at være meget blid i starten, og øg strømmen, når der vises en hvid film i hætteglasset; gennemfør denne fordampningsproces inden for 5 min.
  4. Overfør hætteglasset til en vakuumtørreovn ved stuetemperatur (RT) i 16-24 timer for fuldstændig fjernelse af chloroformen fra lipiderne.
  5. Der tilsættes 2 ml frisk lipidbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 100 mM NaCl) til hætteglasset og lipiderne opløses ved RT i 2 timer. Vortex opløsningen flere gange og overfør den til et 5 ml polypropylenkulturrør.
  6. Sonikere lipidopløsningen på is med en mikrospids sonikator til dannelse af små unilamellar vesikler ved hjælp af følgende indstillinger: 6 s on-12 s off (20% amplitude) i 6 cyklusser, derefter 6 s on-6 s off (30% amplitude) i 3 cyklusser, endelig 10 s på (40% amplitude).
    BEMÆRK: Temperaturstigningen under sonikering kan resultere i sprængning af skum og ødelægge liposomerne. Kontroller derfor skummets tilstand og temperaturen og genopfyld isen ofte.
  7. Liposomerne filtreres gennem et 0,22 μm nylonsprøjtefilter, aliquot, og opbevar det ved 4 °C.
    BEMÆRK: Da deres mobilitet falder ved langvarig opbevaring, skal liposomerne bruges i 2-3 måneder eller tilberedes frisk før brug.

3. Sekvenskloning og biotinylering af Lambda DNA

  1. Indsættelse af bindingsmotiverne i Lambda DNA
    1. Fordøje målfragmentet, der indeholder bindingsmotiverne og Lambda DNA med NheI og XhoI. Ligate målfragmentet med Lambda DNA ved hjælp af T4 ligase natten over på RT.
    2. Kultur E.coli VCS257 celler i antibiotikafri LB medium, indtil OD600 når 0,6. Bakterierne opbevares ved 4 °C til senere brug.
    3. Ligeringsopløsningen opvarmes ved 65 °C i 20 minutter for at denaturere T4-ligase.
    4. Optø Lambda-fagekstraktet, bland det forsigtigt med det ligerede produkt ved pipettering med stumpe spidser, og inkuber blandingen ved RT i 2 timer.
    5. Der tilsættes 500 μL SM-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl og 8 mM MgCl2, filtreret gennem et 0,22 μm filter) og 20 μL chloroform i emballageblandingen fra trin 3.1.4, blandes godt og centrifugeres opløsningen.
      BEMÆRK: Emballageekstraktets aktivitet kan opretholdes ved 4 °C i længere perioder.
    6. Reaktionsblandingen fremstilles ved at blande 10 μL emballageekstrakt med 90 μL SM-buffer og 100 μL VCS257-celler (fra trin 3.1.2) sammen, og blandingen inkuberes ved 37 °C i 15 min.
      BEMÆRK: Emballageopløsningskoncentrationen afhænger af tætheden af fagpladerne den følgende dag; Det kan fortyndes eller tilsættes efter behov.
    7. Tag ~ 5 ml smeltet top agar (22 g / L NZCYM bouillon med 15 g / L agar) i et 15 ml rør. Så snart den øverste agar er kølet ned til ~42 °C, tilsættes reaktionsblandingen (fra trin 3.1.6) langsomt ved hjælp af en stump pipette og hældes væsken på en antibiotikafri LB-agarplade. Opbevar pladen i en 37 °C inkubator natten over.
    8. Bekræft de positive plaques blandt de gennemsigtige fagplader på den øverste agarplade ved PCR. Overfør de positive plaques til en ny top agar plade med en pipette og opbevar pladen i en 37 ° C inkubator natten over.
    9. Der tilsættes 400 μL VCS257-celler i 400 μL buffer indeholdende 10 mM MgCl 2 og 10 mM CaCl2, poder en plak i denne celleblanding, og inkuberes i en 37 °C shaker ved 250 o/min i 15 min.
    10. Tilsæt 800 μL af denne suspension indeholdende fagpladen til 200 ml NZCYM bouillon i en 2 L kolbe og inkuber den i en 37 ° C shaker ved 125 o / min.
    11. MålOD 600 af bakteriesuspensionen efter ~ 4 timers dyrkning. Husk, at OD600-værdien først stiger og derefter falder til et trug på ~ 0,2. Stop inkubationen, når OD 600-værdien er ved at stige igen, tilsæt500 μL chloroform, og ryst ved 80 o / min i yderligere 5 minutter.
      BEMÆRK: Stigningen i OD600 efter truget vil ske hurtigt; derfor skal OD600-værdien måles oftere, når den falder til 0,3 for at undgå overdreven VCS257-cellevækst i kulturen.
    12. Overfør fagkulturen til en 500 ml flaske, tilsæt 11,7 g NaCl, og ryst flasken. Inkuber flasken på is i 10 min.
    13. Overfør suspensionen ligeligt i fire 50 ml rør. Centrifuger rørene ved 12.000 x g i 10 min.
      BEMÆRK: Alle disse centrifugeringstrin i punkt 3.1 skal udføres ved 4 °C.
    14. Overfør supernatanterne til fire nye 50 ml rør og centrifuge igen med samme hastighed i 5 min.
    15. Saml supernatanterne, tilsæt 10% (w/v) PEG8000-pulver, og drej ved 4 °C for at inkubere i 30 min.
    16. Suspensionerne centrifugeres fra trin 3.1.15 ved 12.000 x g i 15 minutter for at opnå fagpillerne.
    17. Pellets resuspenderes i 1 ml fagfortyndingsbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl og 10 mM MgCl2) i fire rør, og hæld alle 4 ml af disse blandinger i et 50 ml rør.
    18. Der tilsættes RNase A (10 mg/ml) og DNase I (4 mg/ml) til 20 μg/ml og 5 μg/ml slutkoncentrationer og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter for at nedbryde overskydende nukleinsyrer.
    19. Der tilsættes 4,5 ml 300 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,76 ml 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1,67 ml 10% natriumdodecylsulfat (SDS) og 75 μL proteinase K (10 mg/ml) i røret, og inkuberes ved 65 °C i 10 min.
    20. Tilsæt 4,5 ml forkølet 3 M kaliumacetat, og inkuber på is i 10 min.
    21. Centrifuge ved 8.000 x g i 10 min, og drej supernatanten i yderligere 5 minutter ved 10.000 x g.
    22. Der tilsættes 70 % isopropanol i det opsamlede supernatant (fra trin 3.1.21) med tilstrækkelig blanding, inkuberes ved RT i 2 min., og centrifugeres derefter ved 8.000 x g i 10 min. Kassér isopropanol og drej igen i 5 min.
      BEMÆRK: DNA-pelleten smøres inden de første 10 minutters centrifugering; Pelleten koncentreres i bunden af røret efter den anden 5 minutters centrifugering.
    23. Vask det udfældede DNA med 2-3 ml 70% ethanol og drej ned igen i 1 min. Pelleten tørres ved 4 °C i 2 timer, og DNA'et suspenderes derefter i 500 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA) natten over ved RT.
    24. Overfør DNA'et til et 1,5 ml rør og drej det ved 18.000 x g i 3 min. Overfør DNA'et til et nyt 1,5 ml rør. Aliquot det rensede Lambda DNA og opbevar det ved -20 °C.
  2. Biotin-Lambda DNA-præparat
    1. Smelt 50 μL renset Lambda-DNA med klonede motiver ved 65 °C i 10 min.
      BEMÆRK: Da Lambda DNA er ~ 48 kbp lang, skal den opvarmes inden pipettering for at undgå DNA-brud.
    2. Bland 50 μL Lambda DNA, 1 μL Biotinprimer (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) og 54 μL ddH2Osammen. Co-inkubere blandingen ved 65 °C i 5 minutter og lade den stå på bænken for at køle ned til RT.
    3. Tilsæt 12 μL 10x T4 ligasebuffer og 3 μL T4 ligase, og inkuber ved RT i flere timer eller natten over.
    4. Der tilsættes et tilsvarende volumen phenolchloroform (1:1)-blanding til ligeproduktionsproduktet, blandes godt med det samme og centrifugeres ved 12.000 x g i 2 minutter ved RT.
    5. Overfør den øvre vandige fase indeholdende DNA'et omhyggeligt til et nyt rør, tilsæt et lige stort volumen chloroform, bland godt og centrifuger derefter ved 12.000 x g i 2 minutter.
    6. Overfør den øvre vandige fase til et nyt rør, tilsæt et lige stort volumen isopropanol og 10% af volumenet af 3 M natriumacetat, og inkuber ved RT i 2 min. Centrifuger blandingen ved 12.000 x g i 5 min.
    7. Fjern supernatanten, vask pelleten med 75% ethanol, og centrifuger derefter ved 12.000 x g i 5 min.
    8. Fjern 75% ethanol, lufttør DNA'et ved RT i 10 min, og brug 120 μL TE-buffer til at opløse DNA'et.
    9. Der tilsættes 60 μL buffer A (30 % (w/v) PEG8000 og 30 mM MgCl 2) til 120 μL af opløsningen fra trin3.2.8, og der roteres ved 4 °C i 20-24 timer.
    10. Blandingen centrifugeres ved 18.000 g i 5 min., og supernatanten fjernes.
    11. Brug 180 μL forkølet 75% ethanol til at vaske pelleten, og gentag trin 3.2.10.
    12. Tør pelleten ved RT, og brug 100 μL TE150-buffer til at opløse DNA'et.

4. Nanofabrikerede zig-zag-barrierer

  1. Rengør dias i acetone i 20 minutter ved sonikering og overfør dem til en ny glasbeholder med 1 M NaOH til sonikering i yderligere 20 minutter. Bland 90 ml H2SO4 med 30 ml H 2 O2, og nedsænk diasene i denne blanding i 30 min. Skyl diasene med acetone og isopropanol og tør diasene med N2.
    BEMÆRK: Blanding af H 2 SO4 og H 2 O2er en eksoterm proces; tage passende sikkerhedsforanstaltninger under operationen.
  2. Belæg det rensede dias med polymethylmethacrylat (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa og det øverste lag af ledende beskyttende belægning efter hinanden. Brug elektronstrålelitografi til at skrive zig-zag-barriererne (figur 1A).
  3. Dias vaskes med ddH 2 Ofor at fjerne den ledende beskyttende belægning og tørre diasene med N2.
  4. Deponer et 30 nm lag krom (Cr) ved hjælp af en magnetronforstøvningsmaskine, og fjern de resterende PMMA-lag med acetone.
    BEMÆRK: En flowcelle kan genbruges til mere end 20 DNA-gardineksperimenter. For at genbruge flowcellen skal du vaske den med ethanol, vaskemiddel og NaOH.

5. Oprensning af EWS-FLI1-protein

BEMÆRK: Observationen af 500 nM EWS-FLI1 på Lambda DNA med 25× GGAA-motiver tjener som et godt eksempel på anvendelse af DNA-gardiner til kondensatdannelse. EWS-FLI1 er et fusionsprotein, der kombinerer N-terminalen af EWSR1 (1-265) og C-terminalen af FLI1 (220-453). Et mCherry-mærke blev smeltet sammen med N-terminalen af EWS-FLI1-fusionsproteinet til visualisering.

  1. Klon EWS-FLI1-genet til en rekonstitueret pRSF-vektor eller enhver anden egnet prokaryotekspressionsvektor.
  2. Omdan plasmidet der koder for 7x His-mCherry-EWSFLI1 til E.coli BL21 (DE3) stammen; vokse en enkelt koloni i 5 ml LB medium ved 37 ° C natten over. Når OD600-værdien når 0,6-0,8 efter overførsel til 2 L LB-medium, tilsættes 0,5 mM IPTG og cellekulturen rystes ved 18 °C i 16-18 timer.
  3. Centrifuger kulturen for at fjerne supernatanten og resuspendere cellerne med lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M urinstof; 10 mM imidazol; 1,5 mM beta-mercaptoethanol (β-ME); og 5% glycerol).
  4. Efter sonikering og centrifugering ved 18000 × g i ~ 30 minutter indlæses supernatanten på Ni-NTA-harpiksækvilibreret i et 5 gange volumen lysisbuffer, og vask derefter harpiksen med et 10 gange volumen vaskebuffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urinstof, 40 mM imidazol, 1,5 mM β-ME og 5% glycerol).
  5. Elute det bundne protein med 15 ml elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urinstof, 500 mM imidazol, 1,5 mM β-ME og 5% glycerol) og koncentrer elutionen til ~500 μL.
  6. Læg den koncentrerede proteinopløsning på en gelfiltreringskolonne og analyser produkterne ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Det rensede protein fryses hurtigt i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.

6. Forberedelse af en DNA Curtains flowcell

  1. Forbered en flowcelle med zig-zag nanofabrikerede barrierer til et DNA-gardineksperiment og bestem strømningsretningen. For at gøre dette skal du tilslutte indgangs- og udgangsrørene i den rigtige retning.
  2. Flowcellen vaskes med 2,5 ml lipidbuffer ved hjælp af to 3 ml sprøjter. Sørg for, at der ikke er nogen boble i flowcellen.
  3. Fjern sprøjten fra udgangen, og injicer 1 ml liposomopløsning (40 μL liposombestand fra sektion 2 og 960 μL lipidbuffer) tre gange med 5 minutters inkubation efter hver injektion.
  4. Til helingstrinnet vaskes flowcellen langsomt med 2,5 ml lipidbuffer og inkuberes ved RT i 30 min.
    BEMÆRK: Helingstiden kan være længere, hvis det er nødvendigt; Hvis der opstår bobler, skal du udføre dobbeltheling ved at gentage trin 5.3 og 5.4 for at fjerne boblerne.
  5. Der forberedes 30 ml bovin serumalbumin (BSA) buffer (40 mM Tris-HCI (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol og 0,5 mg/ml BSA til overfladepassivering). Efter 30 minutters heling vaskes flowcellen med 2,5 ml BSA-buffer fra udgangssiden.
    BEMÆRK: BSA-stammen er en 20 mg/ml opløsning opbevaret ved 4 °C og skal anvendes inden for 1-2 uger. BSA-koncentrationen i bufferen kan justeres i henhold til overfladetilstanden.
  6. Der injiceres 800 μL ststeptavidinbuffer (10 μL af en 1 mg/ml streptavidinbestand, 790 μL BSA-buffer) i flowcellen fra inputsiden i to trin med 10 minutters inkubation efter hvert trin.
    BEMÆRK: Streptavidinen forankrer DNA'et på lipiderne på grund af dets multivalens ved at bygge bro mellem de biotinylerede lipider og det biotinylerede DNA.
  7. Flowcellen vaskes med 2,5 ml BSA-buffer for at fjerne alle frie streptavidinmolekyler.
  8. Biotin-Lambda-DNA'et fortyndes med klonede motiver fra afsnit 3 ved hjælp af BSA-buffer (2,5 μL DNA og 998 μL BSA-buffer). Injicer Lambda DNA 4 gange langsomt med 5 minutters intervaller.
  9. Tænd mikroskopet og det videnskabelige komplementære metaloxid halvledersystem (sCMOS) under injektionen. Vask slangen med 10 ml ddH 2 O. Skyl prismet og slangestikket med vand,2% flydende kuvetterenser og 99% ethanol. Forbered billedbufferen ved at tilføje KCl og dobbeltstrenget DNA-farvestof i BSA-bufferen for at opnå endelige koncentrationer på henholdsvis 150 mM og 0,5 nM, og optag mindst 20 ml billedbuffer i en 30 ml sprøjte.
  10. Opsæt flowcellen på mikroskoptrinnet, og tilslut den til det mikrofluidiske system.
  11. Brug en strømningshastighed på 0,03 ml/min til at skylle DNA-molekylerne til barrieren i 10 minutter, inkubere i 30 minutter med flowet stoppet, og sluk det derefter for at lade DNA'et diffundere sideværts.
    BEMÆRK: Formålet med denne 30 minutters inkubation er at lade DNA-molekylet fordele sig mere jævnt foran barrieren gennem simpel diffusion, fordi DNA-molekyler har tendens til at akkumulere på den side af barrieren, der er lukket for inputtet, hvor de skylles ind. Inkubationstiden kan justeres efter behov.

7. Billeddannelse af EWS-FLI1 kondensdannelse på DNA-gardiner

  1. Åbn billedbehandlingssoftwaren, find og marker positionerne for 3 × 3 zig-zag mønstre under lysfelt.
  2. Tænd for flowet ved 0,2 ml/min for at plette DNA'et med det dobbeltstrengede DNA-farvestof i 10 min.
  3. Fortynd mCherry-EWS-FLI1 med billedbufferen til koncentrationen af 100 nM i 100 μL i røret.
  4. Proteinprøven fyldes gennem ventilen med en 100 μL glassprøjte, og strømningshastigheden ændres til 0,4 ml/min.
  5. Tænd for 488 nm laseren og pre-scan hver region for at kontrollere DNA-distributionstilstanden; vælg det område, hvor DNA-molekylerne fordeler sig jævnt. Indstil lasereffekten til 10% for 488 nm laseren og 20% for 561 nm laseren. Brug effektmåleren til at måle den reelle lasereffekt nær prismet: 4,5 mW for 488 nm laseren og 16,0 mW for 561 nm laseren.
  6. Erhvervelse af billeder
    1. Begynd at hente billeder med 2 s intervaller med både 488 nm og 561 nm lasere samtidigt.
    2. Skift ventilen fra manuel tilstand til injektionstilstand for at lade billedbufferen skylle proteinprøven ind i flowcellen efter 60 s.
      BEMÆRK: Denne proces vil tage ~ 30 s, og synsfeltet vil blive dækket af mCherry-signaler, så snart EWS-FLI1-proteinerne når flowcellen.
    3. For at fjerne gratis EWS-FLI1 skal du fortsætte med at vaske flowcellen med billedbufferen i 5 minutter med kun 561 nm laseren tændt. Stop flowet og inkuber ved 37 °C i 10 min.
    4. Tænd for flowet med 0,4 ml/min for at lade DNA'et strække sig, og anskaf billeder med 2 s intervaller mellem forskellige rammer for at opnå data med høj kapacitet for EWS-FLI1-kondensatdannelse.

8. Intensitetsanalyse for mCherry-EWS-FLI1

  1. Importer dataene som billedsekvenser til ImageJ-software, vælg puncta på 25× GGAA-websteder i en firkant på 8× 8 pixels, og gem billedet i .tif format.
  2. Beregn intensiteten som summen af intensiteten i kvadratet på 8×8 pixel, inklusive hele punctaen, og fjern baggrunden ved at trække baggrundsintensiteten i et område af samme størrelse nær kvadratet på 8 x 8 pixel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skemaet over DNA-gardiner er vist i figur 1A, figur 1B og figur 1D. Den klonede målsekvens indeholdende 25 uafbrudte gentagelser af GGAA findes i NORB1-promotoren i Ewing-sarkom. Denne målsekvens er afgørende for EWS-FLI1 rekruttering28. EWS-FLI1-molekyler blev visualiseret ved at detektere de mCherry-mærkede EWS-FLI1-signaler opnået med en 561 nm laser (figur 1C og figur 1E). Efter at et DNA-gardineksperiment blev oprettet, kunne in vitro-dannelsen af biomolekylære kondensater af EWS-FLI1 på 25× GGAA-stederne i DNA-substratet visualiseres direkte (figur 1B-E). Specificiteten af mCherry-EWS-FLI1, der anvendes i DNA-gardiner, blev bekræftet af et elektroforetisk mobilitetsskiftassay ved hjælp af en DNA-skabelon indeholdende 25× GGAA og uden GGAA separat (figur 2A). Derudover blev koncentrationen af EWS-FLI1 titreret fra 20 nM til 500 nM, og intensiteten af puncta på 25× GGAA-lokaliteterne blev bestemt. Sammenlignet med intensiteten af mCherry-FLI1DBD steg intensiteten af EWS-FLI1 dramatisk, mens ændringen i intensiteten af FLI1DBD var ubetydelig, når proteinerne blev mættet til at dække de 25× GGAA-steder. Derfor tyder disse resultater stærkt på, at EWS-FLI1 dannede kondensater på DNA (figur 2B-E).

Figure 1
Figur 1: EWS-FLI1 kondensatdannelse på Lambda DNA indeholdende 25× GGAA motiver. (A) Skematisk af DNA-gardiner. (B og D) To strategier til påvisning af EWS-FLI1-kondensater (500 nM), der samles på Lambda-DNA: (B) Fortsæt vask i 10 min;(D)inkubere i 10 min. (C og E) Repræsentativt bredt felt total intern refleksion fluorescens mikroskopi billede af DNA Gardiner: (C) Detektionsstrategi i B; (E) Detektionsstrategi i D. C (ii) og E (ii) DNA zoomes ind for at vise den distinkte puncta dannet på et enkelt DNA-substrat. DNA-substrater er Lambda DNA med 25× GGAA-motiver. Tallene "1, 2, 3, 4" repræsenterer forskellige positioner af puncta på et Lambda DNA, og "3" er, hvor 25× GGAA mikrosatellitsekvensen blev klonet. Skalabjælker = 4,9 μm (C, E (i)) og 0,7 μm (C, E (ii)). Dette tal er ændret fra 24. Forkortelse: dsDNA = dobbeltstrenget DNA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Bindende begivenheder i det løsrevne domæne mCherry-EWS-FLI1 på 25× GGAA gentager. (A) (i) mCherry-EWS-FLI1. (ii) Elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse af mCherry-EWS-FLI1: 306-bp dsDNA mærket med 5' Quasar670 blev inkuberet med mCherry-EWS-FLI1 i forskellige koncentrationer under stuetemperatur i 30 minutter i reaktionsbuffer indeholdende 40 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT og0,2 mg/ml bovin serumalbumin. Prøverne blev indlæst og kørt på 1,3% agarosegel i 25 min, 120 V. (B-D) Wide-field total intern refleksion fluorescens mikroskopi billeder af 25× GGAA med DNA Gardiner efter inkubation med 500 nM mCherry (B), 500 nM mCherry-EWSLCD (C) eller 500 nM mCherry-FLI1DBD (D). (E) Intensitetsfordeling af EWSFLI1 (cyan) og FLI1DBD (sort) signaler på målstedet (25× GGAA) region vs. proteinkoncentration. Dette tal er ændret fra 24. Forkortelser: LCD = domæne med lav kompleksitet; DBD = DNA-bindende domæne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da enkeltmolekyletilgange er ekstremt følsomme over for indholdet af reaktionssystemet, skal der investeres ekstra indsats for at sikre god kvalitet af alle materialer og opløsninger under DNA-gardinerforsøgene, især lipiderne fremstillet i afsnit 1 og 2 og de buffere, der anvendes i afsnit 5. Reagenser af højere renhed skal anvendes til fremstilling af buffere, og buffere skal være frisklavede til enkeltmolekyleassay

Da 500 nM mCherry-mærket EWS-FLI1 blev skyllet ind i kammeret, dukkede flere magenta puncta op på Lambda DNA indeholdende 25× GGAA-sekvenserne. Bemærk, at der var en på hinanden følgende ikke-specifik fordeling af magentasignaler gennem hele DNA'et, selv efter 10 minutters vask med blankbuffer (figur 1B, C). Interessant nok blev EWS-FLI1-molekyler omarrangeret på DNA under 10 minutters inkubation uden bufferstrømmen og samlet i flere puncta (figur 1D, E). En af disse punktera blev dannet på det klonede 25× GGAA-sted, mens alle andre blev dannet i regionerne, der indeholdt en høj tæthed af på hinanden følgende GGAA-motiver. Dette fænomen antyder kraftigt, at inkubationsproceduren uden flow tillader EWS-FLI1-molekyler at søge i loci og samle sig hurtigere på DNA.

Der skal udføres flere kontroleksperimenter for at afklare, hvordan disse kondensater dannes på DNA-gardiner. Vi rensede mCherry, mCherry-EWSLCD og mCherry-FLI1DBD og fulgte den samme procedure for at injicere disse proteiner i kammeret. Hverken mCherry (figur 2B) eller mCherry-EWSLCD (figur 2C) efterlod nogen signaler på DNA, hvilket indikerer, at FLI1DBD af EWS-FLI1 var nødvendig for interaktionen med DNA. For at bekræfte, at faseseparation forekom i DNA-gardiner ved så lave proteinkoncentrationer, blev koncentrationen af mCherry-EWS-FLI1 titreret fra 25 nM til 500 nM, og intensiteten af hver puncta på et DNA-molekyle blev bestemt på klonstedet (figur 2E). En sammenligning med intensiteten af fusion TF FLI1DBD mærket med mCherry afslørede, at selvom punktintensiteterne af EWS-FLI1 og FLI1-DBD var ens ved lave proteinkoncentrationer, steg intensiteten af EWS-FLI1 dramatisk, mens FLI1DBD forblev lav, selv når koncentrationen nåede 500 nM. Disse resultater tyder på, at EWS-FLI1-molekyler binder til 25× GGAA-sekvensen og samles til et kondensat på det gennem LCD-interaktioner. En enkelt FLI1DBD kan binde 2x GGAA-motiver, og højere ordens oligomerer binder til meget gentagne sekvenser med lav affinitet27. mCherry-FLI1DBD-signalet på 25× GGAA-sekvensen var fra en proteinklynge snarere end et individuelt proteinmolekyle. Selvom mCherry-FLI1DBD kunne binde de 25× GGAA-steder, kunne det ikke samles som et kondensat på DNA, hvilket bekræftede, at LCD-LCD-interaktionen var nødvendig for faseseparation (figur 2D, E).

Enkeltmolekylemetoder gør det muligt for forskere at studere dynamikken inde i transkriptionsfaktorkondensater. DNA Curtains-metoden har nogle fordele sammenlignet med andre enkeltmolekylemetoder såsom enkeltmolekyle fluorescensresonansenergioverførsel (smFRET)29, superopløsningsbilleddannelse 30 og optisk pincet31,32. For det første giver DNA-gardinmetoden mulighed for rekonstitution af transkriptionsmaskineriet på lang genomisk DNA in vitro og realtidsobservation af transkriptionskondensatdannelse med dataindsamling med høj kapacitet. For det andet tillader justerede DNA-molekyler kortlægning af kondensaternes position på hver DNA-streng. Således kan de foretrukne DNA-sekvenser til puncta-dannelse let bestemmes.

Desuden er langsigtet erhvervelse mulig med DNA-gardiner, hvilket giver mulighed for måling af on-rate (k on) og off-rate (koff) af et punkt. Ikke desto mindre har DNA Curtains nogle iboende tekniske defekter, hvilket nødvendiggør, at beviserne fra forskellige metoder skal undersøges kollektivt. På den ene side kan opløsningen af DNA-gardiner kun nå 0,18 μm eller ~ 1.000 bp, fordi den lange Lambda DNA-skabelon har en begrænsning med hensyn til diffraktionsgrænsen, hvilket kan hindre differentieringen af to nærliggende fluorescenssignaler. På den anden side bruges strømmen til at udvide dobbeltstrenget DNA (dsDNA), og den kraft, der påføres biomolekylet, kan påvirke diffusionsegenskaben af proteinerne, der binder til DNA'et. Dobbeltbundne DNA-gardiner kan forankre begge ender af dsDNA og registrere bevægelsen af proteiner uden flow, hvilket er en bemærkelsesværdig løsning33. For at opsummere vil uddybning af vores forståelse af den dynamiske samling af biomolekylære kondensater på DNA i realtid kaste lys over ikke kun den biofysiske mekanisme i LLPS, men også på den grundlæggende biologi af LLPS-relaterede cellulære processer, såsom gentranskriptionsregulering24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS488LS
561 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS561LS
Agar Rhawn R003215-50g
biotinylated DOPE Avanti 870273P
Bovine Serum Albumin Sigma A7030
Chloroform Amresco 1595C027
Coating Electra 92 Allresist GmbH AR-PC 5090.02 The conductive protective coating
Deoxyribonuclease I bovine Sigma D5139-2MG
DOPC Avanti 850375P
DTT Sigma D9779
Glass coverslip Fisher Scientific 12-544-7
Hellmanex III Sigma Z805939-1EA
KCl Sigma 60130
Lambda DNA NEB N3013S
Lambda Packing Extracts Epicentre MP5120
MgCl2 Sigma M2670
NaCl Sigma s3014
Nanoport Idex N-333-01
NheI-HF NEB R3131S
Nikon Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
NZCYM Broth Sigma N3643-250G
PEG-2000 DOPE Avanti 880130P-1G
PEG-8000 Amresco 25322-68-3
PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% Allresist GmbH AR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2% Allresist GmbH AR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS camera PHOTOMETRICS Prime95B
proteinase K NEB P8107S
Silica glass slide G.Finkenbeiner
Six-way injection valve Idex MXP9900-000
Streptavidin Thermo S888 Diluted with ddH2O
Syringe pump Harvard Apparatus Pump11 Elite
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Tris base Sigma T6066
XhoI NEB R0146V
YOYO-1 Iodide (491/509) Invitrogen Y3601 Diluted with DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).

Tags

Biokemi udgave 175
Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z.… More

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z. Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA. J. Vis. Exp. (175), e62974, doi:10.3791/62974 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter