Summary
Qui, descriviamo l'uso del metodo di imaging a singola molecola, DNA Curtains, per studiare il meccanismo biofisico dell'assemblaggio dei condensati EWS-FLI1 sul DNA.
Abstract
I geni di fusione risultanti dalla traslocazione cromosomica sono stati trovati in molti tumori solidi o leucemia. EWS-FLI1, che appartiene alla famiglia FUS/EWS/TAF15 (FET) di oncoproteine di fusione, è uno dei geni di fusione più frequentemente coinvolti nel sarcoma di Ewing. Queste proteine di fusione della famiglia FET ospitano tipicamente un dominio a bassa complessità (LCD) di proteina FET al loro N-terminale e un dominio di legame al DNA (DBD) al loro C-terminale. È stato confermato che EWS-FLI1 forma condensati biomolecolari nei suoi loci di legame bersaglio a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, e questi condensati possono reclutare RNA polimerasi II per migliorare la trascrizione genica. Tuttavia, il modo in cui questi condensati vengono assemblati nei loro siti di legame rimane poco chiaro. Recentemente, un metodo biofisico a singola molecola - DNA Curtains - è stato applicato per visualizzare questi processi di assemblaggio dei condensati EWS-FLI1. Qui, il protocollo sperimentale dettagliato e gli approcci di analisi dei dati sono discussi per l'applicazione di DNA Curtains nello studio dei condensati biomolecolari che si assemblano sul DNA bersaglio.
Introduction
La regolazione trascrizionale è un passo cruciale per una precisa espressione genica nelle cellule viventi. Molti fattori, come la modificazione cromosomica, i fattori di trascrizione (TF) e gli RNA non codificanti, partecipano a questo complicato processo 1,2,3. Tra questi fattori, i TF contribuiscono alla specificità della regolazione trascrizionale riconoscendo e legandosi a specifiche sequenze di DNA note come promotori o enhancer e successivamente reclutando altre proteine funzionali per attivare o reprimere la trascrizione 4,5,6,7. Il modo in cui questi TF riescono a cercare i loro siti bersaglio nel genoma umano e interagire con il DNA rivestito di istoni e proteine leganti il DNA non istoniche ha lasciato perplessi gli scienziati per decenni. Negli ultimi anni, sono stati costruiti diversi modelli classici per il meccanismo di ricerca target dei TF per descrivere come "scivolano", "saltano", "saltano" o "trasferimento intersegmento" lungo la catena del DNA 8,9,10,11. Questi modelli sono focalizzati sul comportamento di ricerca sul DNA di una singola molecola di TF. Tuttavia, studi recenti dimostrano che alcuni TF subiscono la separazione di fase liquido-liquido (LLPS) da soli nel nucleo o con il complesso Mediator12. Le goccioline osservate di TF sono associate alle regioni promotore o enhancer, evidenziando il ruolo della formazione di condensati biomolecolari nella trascrizione e nel genoma tridimensionale13,14,15. Questi condensati biomolecolari sono legati a compartimenti privi di membrana in vivo e in vitro. Sono formati tramite LLPS, in cui le biomacromolecole modulari e le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) delle proteine sono due principali forze trainanti delle interazioni multivalenti16. Pertanto, i TF non solo cercano il DNA, ma funzionano anche sinergicamente all'interno di questi condensati 4,17,18. Ad oggi, la proprietà biofisica di questi condensati di trascrizione sul DNA rimane poco chiara.
Pertanto, questo studio mirava ad applicare un metodo a singola molecola - DNA Curtains - per visualizzare direttamente la formazione e la dinamica dei condensati di trascrizione formati dai TF sul DNA in vitro. DNA Curtains, una piattaforma di imaging in vitro ad alto rendimento per studiare l'interazione tra proteine e DNA, è stata applicata nella riparazione del DNA 19,20,21, nella ricerca target22 e nella LLPS17,23,24. La cella di flusso di DNA Curtains è rivestita con doppi strati lipidici biotinilati per passivare la superficie e consentire alle biomolecole di diffondersi sulla superficie. I modelli a zig-zag nanofabbricati limitano il movimento del DNA. I substrati di DNA lambda biotinilato possono allinearsi lungo i bordi della barriera ed essere allungati dal flusso tampone orientato. Le stesse sequenze iniziali e finali di tutte le molecole permettono il tracciamento della proteina sul DNA e descrivono la distribuzione di posizione degli eventi di legame25,26. Inoltre, la combinazione di DNA Curtains con microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) aiuta a ridurre al minimo il rumore di fondo e rilevare i segnali a livello di singola molecola. Pertanto, DNA Curtains potrebbe essere un metodo promettente per studiare la dinamica della formazione di condensati di trascrizione su motivi di DNA. Questo articolo descrive l'esempio di un'oncoproteina di fusione della famiglia FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, generata dalla traslocazione cromosomica. Il DNA lambda contenente 25× GGAA - la sequenza di legame di EWS-FLI127 - è stato utilizzato come substrato del DNA negli esperimenti DNA Curtains per osservare come le molecole EWS-FLI1 subiscono LLPS sul DNA. Questo manoscritto discute in dettaglio il protocollo sperimentale e i metodi di analisi dei dati.
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Protocol
1. Preparazione del master mix lipidico a doppio strato
- Risciacquare i flaconcini di vetro con acqua bidistillata (ddH2O) e etanolo al 99% e asciugarli in un forno di essiccazione a 60 °C.
- Preparare la miscela lipidica principale sciogliendo 1 g di 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 100 mg di lipidi polietilenglicolati (PEGilati) (18:1 di 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi (polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) (PEG2000 DOPE) e 25 mg di lipidi biotinilati (18:1 di 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(cap biotinil) (sale di sodio) (Biotinyl Cap DOPE)) in 10 ml di cloroformio.
- Preparare 1 mL di aliquote della miscela madre lipidica per flaconcino e conservarle a -20 °C in flaconcini di vetro puliti.
NOTA: Conservare il lipide disciolto in flaconcini di vetro e coprire il cappuccio del flaconcino con parafilm durante la conservazione.
2. Preparazione della soluzione liposomica
- Risciacquare un flaconcino di vetro da 2 mL con ddH2O e etanolo al 99% e asciugarlo accuratamente in un forno di essiccazione a 60 °C.
- Risciacquare una siringa di vetro da 250 μL con cloroformio e quindi trasferire 200 μL della miscela madre lipidica nel flaconcino di vetro asciutto.
- Utilizzare una pistola a spruzzo ad azoto per far fluire delicatamente N2 ruotando continuamente il flaconcino in una direzione.
NOTA: L'N2 aiuterà a far evaporare il cloroformio e i lipidi residui formeranno un film sottile sulla parete della fiala di vetro. Regolare il flusso di azoto in modo che sia molto delicato all'inizio e aumentare il flusso quando appare un film bianco nella fiala; Completa questo processo di evaporazione entro 5 minuti. - Trasferire il flaconcino di vetro in un forno di essiccazione sottovuoto a temperatura ambiente (RT) per 16-24 ore per la completa rimozione del cloroformio dai lipidi.
- Aggiungere 2 mL di tampone lipidico fresco (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 100 mM NaCl) al flaconcino di vetro e sciogliere i lipidi a RT per 2 ore. Vortice la soluzione più volte e trasferirla in un tubo di coltura in polipropilene da 5 ml.
- Sonicare la soluzione lipidica sul ghiaccio con un sonicatore a micropunta per formare piccole vescicole unilamellari, utilizzando le seguenti impostazioni: 6 s on-12 s off (20% ampiezza) per 6 cicli, poi 6 s on-6 s off (30% ampiezza) per 3 cicli, infine 10 s on (40% ampiezza).
NOTA: L'aumento della temperatura durante la sonicazione potrebbe provocare lo scoppio di schiuma e distruggere i liposomi. Pertanto, controllare lo stato della schiuma e la temperatura e reintegrare frequentemente il ghiaccio. - Filtrare i liposomi attraverso un filtro a siringa in nylon da 0,22 μm, aliquota, e conservarlo a 4 °C.
NOTA: Poiché la loro mobilità diminuisce con la conservazione prolungata, i liposomi devono essere utilizzati in 2-3 mesi o preparati freschi prima dell'uso.
3. Clonaggio di sequenza e biotinilazione del DNA lambda
- Inserimento dei motivi leganti in Lambda DNA
- Digerire il frammento target contenente i motivi leganti e il DNA Lambda con NheI e XhoI. Ligare il frammento bersaglio con DNA lambda usando la ligasi T4 durante la notte a RT.
- Coltura di cellule E.coli VCS257 in terreno LB privo di antibiotici fino a quando l'OD600 raggiunge 0,6. Conservare i batteri a 4 °C per un uso successivo.
- Riscaldare la soluzione di legatura a 65 °C per 20 minuti per denaturare la T4 ligasi.
- Scongelare l'estratto di fago lambda, mescolarlo delicatamente con il prodotto legato mediante pipettaggio con punte smussate e incubare la miscela a RT per 2 ore.
- Aggiungere 500 μL di tampone SM (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl e 8 mM MgCl2, filtrati attraverso un filtro da 0,22 μM) e 20 μL di cloroformio nella miscela di imballaggio dal punto 3.1.4, mescolare bene e centrifugare la soluzione.
NOTA: L'attività dell'estratto confezionato può essere mantenuta a 4 °C per periodi prolungati. - Preparare la miscela di reazione mescolando 10 μL di estratto di imballaggio con 90 μL di tampone SM e 100 μL di cellule VCS257 (dal punto 3.1.2) insieme e incubare la miscela a 37 °C per 15 minuti.
NOTA: La concentrazione della soluzione di confezionamento dipende dalla densità delle placche fagiche il giorno successivo; Può essere diluito o aggiunto secondo necessità. - Prendere ~ 5 ml di agar superiore fuso (22 g / L di brodo NZCYM con 15 g / L di agar) in un tubo da 15 ml. Non appena l'agar superiore si raffredda a ~42 °C, aggiungere lentamente la miscela di reazione (dal punto 3.1.6) usando una pipetta smussata e versare il liquido su una piastra di agar LB priva di antibiotici. Conservare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per tutta la notte.
- Confermare le placche positive tra le placche fagiche trasparenti sulla piastra di agar superiore mediante PCR. Trasferire le placche positive su una nuova piastra di agar superiore con una pipetta e conservare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per tutta la notte.
- Aggiungere 400 μL di cellule VCS257 in 400 μL di tampone contenente 10 mM MgCl 2 e 10 mM CaCl2, inoculare una placca in questa miscela cellulare e incubarla in uno shaker a 37 °C a 250 rpm per 15 minuti.
- Aggiungere 800 μL di questa sospensione contenente la placca fagica a 200 mL di brodo NZCYM in un matraccio da 2 L e incubarlo in uno shaker a 37 °C a 125 giri/min.
- Misurare OD600 della sospensione batterica dopo ~4 ore di coltivazione. Tieni presente che il valore OD600 aumenterà prima e poi scenderà a un minimo a ~ 0,2. Interrompere l'incubazione quando il valore OD 600 sta per aumentare di nuovo, aggiungere500 μL di cloroformio e agitare a 80 giri / min per altri 5 minuti.
NOTA: L'aumento di OD600 dopo la depressione si verificherà rapidamente; quindi, il valore OD600 deve essere misurato più spesso quando diminuisce a 0,3 per evitare un'eccessiva crescita cellulare VCS257 nella coltura. - Trasferire la coltura fagica in un flacone da 500 ml, aggiungere 11,7 g di NaCl e agitare il flacone. Incubare la bottiglia sul ghiaccio per 10 min.
- Trasferire la sospensione equamente in quattro tubi da 50 ml. Centrifugare i tubi a 12.000 x g per 10 minuti.
NOTA: Tutte queste fasi di centrifugazione di cui al punto 3.1 devono essere eseguite a 4 °C. - Trasferire i surnatanti in quattro nuove provette da 50 ml e centrifugare nuovamente alla stessa velocità per 5 minuti.
- Raccogliere i surnatanti e aggiungere il 10% (p/v) di polvere di PEG8000 e ruotare a 4 °C per incubare per 30 minuti.
- Centrifugare le sospensioni dal punto 3.1.15 a 12.000 x g per 15 minuti per ottenere i pellet fagici.
- Risospendere i pellet in 1 mL di tampone di diluizione fagica (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl e 10 mM MgCl2) in quattro provette e versare tutti i 4 mL di queste miscele in un tubo da 50 ml.
- Aggiungere la RNasi A (10 mg/ml) e la DNasi I (4 mg/ml) alle concentrazioni finali di 20 μg/mL e 5 μg/mL e incubare a 37 °C per 30 minuti per degradare gli acidi nucleici in eccesso.
- Aggiungere 4,5 mL di Tris-HCl da 300 mM (pH 7,5), 2,76 mL di acido etilendiamminatetraacetico 0,5 M, 1,67 mL di dodecilsolfato di sodio al 10% (SDS) e 75 μL di proteinasi K (10 mg/ml) nella provetta, e incubare a 65 °C per 10 minuti.
- Aggiungere 4,5 ml di acetato di potassio 3 M preraffreddato e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
- Centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti e centrifugare il surnatante per altri 5 minuti a 10.000 x g.
- Aggiungere il 70% del volume di isopropanolo nel surnatante raccolto (dal punto 3.1.21) con sufficiente miscelazione, incubare a RT per 2 minuti, quindi centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti. Scartare l'isopropanolo e girare di nuovo per 5 minuti.
NOTA: Il pellet di DNA verrà spalmato prima della prima centrifugazione di 10 minuti; Il pellet sarà concentrato sul fondo del tubo dopo la seconda centrifugazione di 5 minuti. - Lavare il DNA precipitato con 2-3 ml di etanolo al 70% e centrifugare di nuovo per 1 minuto. Asciugare il pellet a 4 °C per 2 ore, quindi risospendere il DNA in 500 μL di tampone TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM EDTA) durante la notte a RT.
- Trasferire il DNA in un tubo da 1,5 ml e farlo girare a 18.000 x g per 3 minuti. Trasferire il DNA in una nuova provetta da 1,5 ml. Aliquot il DNA Lambda purificato e conservarlo a -20 °C.
- Preparazione del DNA di biotina-lambda
- Fondere 50 μL di DNA Lambda purificato con motivi clonati a 65 °C per 10 minuti.
NOTA: Poiché Lambda DNA è lungo ~48 kbp, deve essere riscaldato prima del pipettaggio per evitare rotture del DNA. - Mescolare 50 μL di DNA lambda, 1 μL di primer alla biotina (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) e 54 μL di ddH2O insieme. Co-incubare la miscela a 65 °C per 5 minuti e lasciarla raffreddare sul banco a RT.
- Aggiungere 12 μL di tampone 10x T4 ligasi e 3 μL di T4 ligasi e incubare a RT per diverse ore o durante la notte.
- Aggiungere un volume uguale di miscela fenolo-cloroformio (1:1) al prodotto di legatura, mescolare bene immediatamente e centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti a RT.
- Trasferire con cautela la fase acquosa superiore contenente il DNA in una nuova provetta, aggiungere un volume uguale di cloroformio, mescolare bene e quindi centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti.
- Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo, aggiungere un volume uguale di isopropanolo e il 10% del volume di acetato di sodio 3 M e incubare a RT per 2 minuti. Centrifugare la miscela a 12.000 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante, lavare il pellet con etanolo al 75% e quindi centrifugare a 12.000 x g per 5 minuti.
- Rimuovere l'etanolo al 75%, asciugare all'aria il DNA a RT per 10 minuti e utilizzare 120 μL di tampone TE per dissolvere il DNA.
- Aggiungere 60 μL di tampone A (30% (p/v) PEG8000 e 30 mM MgCl 2) a 120 μL della soluzione dal punto3.2.8 e ruotare a 4 °C per 20-24 ore.
- Centrifugare la miscela a 18.000 g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Utilizzare 180 μL di etanolo preraffreddato al 75% per lavare il pellet e ripetere il punto 3.2.10.
- Asciugare il pellet a RT e utilizzare 100 μL di tampone TE150 per sciogliere il DNA.
- Fondere 50 μL di DNA Lambda purificato con motivi clonati a 65 °C per 10 minuti.
4. Barriere a zig-zag nanofabbricate
- Pulire i vetrini in acetone per 20 minuti mediante sonicazione e trasferirli in un nuovo contenitore di vetro con 1 M NaOH per la sonicazione per altri 20 minuti. Mescolare 90 mL di H 2 SO4 con 30 mL di H 2 O2e immergere i vetrini in questa miscela per 30 minuti. Risciacquare i vetrini con acetone e isopropanolo e asciugare i vetrini con N2.
NOTA: La miscelazione di H 2 SO4 e H 2 O2è un processo esotermico; prendere adeguate precauzioni di sicurezza durante l'operazione. - Rivestire il vetrino pulito con polimetilmetacrilato (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa e lo strato superiore di rivestimento protettivo conduttivo in successione. Utilizzare la litografia a fascio di elettroni per scrivere le barriere a zig-zag (Figura 1A).
- Lavare i vetrini con ddH2 O per rimuovere il rivestimento protettivo conduttivo e asciugare i vetrini con N2.
- Depositare uno strato di 30 nm di cromo (Cr) utilizzando una macchina magnetron sputtering e rimuovere gli strati rimanenti di PMMA con acetone.
NOTA: Una cella di flusso può essere riutilizzata per più di 20 esperimenti DNA Curtains. Per riutilizzare la cella di flusso, lavarla con etanolo, detergente e NaOH.
5. Purificazione della proteina EWS-FLI1
NOTA: L'osservazione di 500 nM EWS-FLI1 su DNA lambda con motivi GGAA 25× serve come buon esempio per l'applicazione di tende di DNA alla formazione di condensa. EWS-FLI1 è una proteina di fusione che combina l'N-terminale di EWSR1 (1-265) e il C-terminale di FLI1 (220-453). Un tag mCherry è stato fuso al terminale N della proteina di fusione EWS-FLI1 per la visualizzazione.
- Clonare il gene EWS-FLI1 in un vettore pRSF ricostituito o in qualsiasi altro vettore di espressione procariotica adatto.
- Trasformare il plasmide che codifica 7x His-mCherry-EWSFLI1 nel ceppo E.coli BL21(DE3); far crescere una singola colonia in 5 mL di terreno LB a 37 °C durante la notte. Quando il valore OD600 raggiunge 0,6-0,8 dopo il trasferimento a 2 L di mezzo LB, aggiungere 0,5 mM IPTG e agitare la coltura cellulare a 18 °C per 16-18 ore.
- Centrifugare la coltura per rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M urea; 10 mM imidazolo; 1,5 mM beta-mercaptoetanolo (β-ME); e 5% glicerolo).
- Dopo la sonicazione e la centrifugazione a 18000 × g per ~ 30 minuti, caricare il surnatante sulla resina Ni-NTA equilibrata in un volume 5 volte di tampone di lisi, quindi lavare la resina con un volume 10 volte di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urea, 40 mM imidazolo, 1,5 mM β-ME e 5% glicerolo).
- Eluire la proteina legata con 15 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urea, 500 mM imidazolo, 1,5 mM β-ME e glicerolo al 5%) e concentrare l'eluizione a ~500 μL.
- Caricare la soluzione proteica concentrata su una colonna di filtrazione in gel e analizzare i prodotti mediante elettroforesi su gel SDS-poliacrilammide. Congelare rapidamente la proteina purificata in azoto liquido e conservare a -80 °C.
6. Preparazione di una cella di flusso DNA Curtains
- Preparare una cella di flusso con barriere nanofabbricate a zig-zag per un esperimento DNA Curtains e determinare la direzione del flusso. Per fare ciò, collegare i tubi di ingresso e uscita nella direzione corretta.
- Lavare la cella di flusso con 2,5 ml di tampone lipidico utilizzando due siringhe da 3 ml. Assicurarsi che non vi siano bolle nella cella di flusso.
- Rimuovere la siringa dall'uscita e iniettare 1 mL della soluzione liposomica (40 μL di stock di liposomi dalla sezione 2 e 960 μL di tampone lipidico) tre volte con 5 minuti di incubazione dopo ogni iniezione.
- Per la fase di guarigione, lavare lentamente la cella di flusso con 2,5 ml di tampone lipidico e incubare a RT per 30 minuti.
NOTA: Il tempo di guarigione può essere più lungo se necessario; Se compaiono bolle, eseguire la doppia correzione ripetendo i passaggi 5.3 e 5.4 per rimuovere le bolle. - Preparare 30 mL di tampone sieroalbumina bovina (BSA) (40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitolo e 0,5 mg/mL BSA per passivazione superficiale). Dopo 30 minuti di guarigione, lavare la cella di flusso con 2,5 mL di tampone BSA dal lato di uscita.
NOTA: Il brodo BSA è una soluzione da 20 mg/ml conservata a 4 °C e deve essere utilizzata entro 1-2 settimane. La concentrazione di BSA nel tampone può essere regolata in base alle condizioni della superficie. - Iniettare 800 μL di tampone streptavidina (10 μL di 1 mg/mL di stock di streptavidina, 790 μL di tampone BSA) nella cella di flusso dal lato di ingresso in due fasi con 10 minuti di incubazione dopo ogni fase.
NOTA: La streptavidina ancorano il DNA sui lipidi a causa della sua multivalenza facendo da ponte tra i lipidi biotinilati e il DNA biotinilato. - Lavare la cella di flusso con 2,5 ml di tampone BSA per rimuovere tutte le molecole libere di streptavidina.
- Diluire il DNA della biotina-lambda con motivi clonati della sezione 3 utilizzando tampone BSA (2,5 μL di DNA e 998 μL di tampone BSA). Iniettare Lambda DNA 4 volte lentamente ad intervalli di 5 minuti.
- Accendere il microscopio e il sistema scientifico Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) durante l'iniezione. Lavare il tubo con 10 ml di ddH2O. Risciacquare il prisma e il connettore del tubo con acqua, detergente per cuvette liquido al 2% e etanolo al 99%. Preparare il tampone di imaging aggiungendo KCl e colorante DNA a doppio filamento nel tampone BSA per ottenere concentrazioni finali di 150 mM e 0,5 nM, rispettivamente, e prendere almeno 20 mL del tampone di imaging in una siringa da 30 mL.
- Impostare la cella di flusso sullo stadio del microscopio e collegarla al sistema microfluidico.
- Utilizzare una portata di 0,03 ml / min per lavare le molecole di DNA alla barriera per 10 minuti, incubare per 30 minuti con il flusso interrotto e quindi spegnerlo per consentire al DNA di diffondersi lateralmente.
NOTA: Lo scopo di questa incubazione di 30 minuti è quello di lasciare che la molecola di DNA si distribuisca più uniformemente davanti alla barriera attraverso la semplice diffusione perché le molecole di DNA tendono ad accumularsi sul lato della barriera che è chiuso all'ingresso in cui vengono lavate. Il tempo di incubazione può essere regolato secondo necessità.
7. Imaging della formazione di condensazione EWS-FLI1 su tende di DNA
- Apri il software di imaging, trova e segna le posizioni dei modelli a zig-zag 3 × 3 sotto campo luminoso.
- Accendere il flusso a 0,2 ml/min per colorare il DNA con il colorante DNA a doppio filamento per 10 minuti.
- Diluire mCherry-EWS-FLI1 con il tampone di imaging fino alla concentrazione di 100 nM in 100 μL nel tubo.
- Caricare il campione proteico attraverso la valvola con una siringa di vetro da 100 μL e modificare la portata a 0,4 mL/min.
- Accendere il laser a 488 nm e pre-scansionare ogni regione per verificare lo stato di distribuzione del DNA; selezionare la regione in cui le molecole di DNA si distribuiscono uniformemente. Impostare la potenza del laser al 10% per il laser a 488 nm e al 20% per il laser a 561 nm. Utilizzare il misuratore di potenza per misurare la potenza reale del laser vicino al prisma: 4,5 mW per il laser a 488 nm e 16,0 mW per il laser a 561 nm.
- Acquisizione di immagini
- Inizia ad acquisire immagini a intervalli di 2 s con laser a 488 nm e 561 nm contemporaneamente.
- Cambiare la valvola dalla modalità manuale alla modalità di iniezione per consentire al tampone di imaging di lavare il campione proteico nella cella di flusso dopo 60 secondi.
NOTA: Questo processo richiederà ~ 30 s e il campo visivo sarà coperto con segnali mCherry non appena le proteine EWS-FLI1 raggiungeranno la cella di flusso. - Per rimuovere EWS-FLI1 libero, continuare a lavare la cella di flusso con il buffer di imaging per 5 minuti con solo il laser a 561 nm acceso. Arrestare il flusso e incubare a 37 °C per 10 minuti.
- Accendere il flusso a 0,4 mL/min per consentire al DNA di estendersi e acquisire immagini a intervalli di 2 s tra fotogrammi diversi per ottenere dati ad alta produttività della formazione di condensato EWS-FLI1.
8. Analisi dell'intensità per mCherry-EWS-FLI1
- Importare i dati come sequenze di immagini nel software ImageJ, selezionare la puncta a 25× siti GGAA in un quadrato di 8× 8 pixel e salvare l'immagine in .tif formato.
- Calcola l'intensità come somma dell'intensità nel quadrato di 8×8 pixel, inclusa l'intera punteggia, e rimuovi lo sfondo sottraendo l'intensità dello sfondo in un'area della stessa dimensione vicino al quadrato 8 x 8 pixel.
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Representative Results
Lo schema delle tende DNA è mostrato nella Figura 1A, nella Figura 1B e nella Figura 1D. La sequenza bersaglio clonata contenente 25 ripetizioni ininterrotte di GGAA si trova nel promotore NORB1 nel sarcoma di Ewing. Questa sequenza target è cruciale per il reclutamento di EWS-FLI128. Le molecole di EWS-FLI1 sono state visualizzate rilevando i segnali EWS-FLI1 marcati con mCherry ottenuti con un laser a 561 nm (Figura 1C e Figura 1E). Dopo che è stato impostato un esperimento DNA Curtains, la formazione in vitro di condensati biomolecolari di EWS-FLI1 nei 25× siti GGAA del substrato del DNA potrebbe essere visualizzata direttamente (Figura 1B-E). La specificità di mCherry-EWS-FLI1 utilizzato in DNA Curtains è stata confermata da un saggio di spostamento della mobilità elettroforetica utilizzando un modello di DNA contenente 25× GGAA e senza GGAA separatamente (Figura 2A). Inoltre, la concentrazione di EWS-FLI1 è stata titolata da 20 nM a 500 nM ed è stata determinata l'intensità del puncta nei 25× siti GGAA. Rispetto all'intensità di mCherry-FLI1DBD, l'intensità di EWS-FLI1 è aumentata drasticamente, mentre la variazione dell'intensità di FLI1DBD è stata trascurabile quando le proteine erano sature per coprire i 25× siti GGAA. Pertanto, questi risultati suggeriscono fortemente che EWS-FLI1 abbia formato condensati sul DNA (Figura 2B-E).
Figura 1: Formazione di condensato EWS-FLI1 su DNA lambda contenente 25× motivi GGAA. (a) Schema delle tende di DNA. (B e D) Due strategie per rilevare l'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 (500 nM) sul DNA lambda: (B) Continuare a lavare per 10 minuti;(D)incubare per 10 minuti. (C ed E) Immagine rappresentativa al microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale a campo largo delle tende del DNA: (C) Strategia di rilevamento in B; (E) Strategia di rilevamento in D. Il DNA C (ii) ed E (ii) viene ingrandito per mostrare la distinta punteggiatura formata su un singolo substrato di DNA. I substrati del DNA sono DNA Lambda con motivi GGAA 25×. I numeri "1, 2, 3, 4" rappresentano diverse posizioni di puncta su un DNA Lambda e "3" è dove è stata clonata la sequenza di microsatelliti GGAA di 25×. Barre della scala = 4,9 μm (C, E (i)) e 0,7 μm (C, E (ii)). Questa cifra è stata modificata da 24. Abbreviazione: dsDNA = DNA a doppio filamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Eventi di legame del dominio distaccato di mCherry-EWS-FLI1 su 25× ripetizioni GGAA. (A) (i) mCherry-EWS-FLI1. (ii) Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica di mCherry-EWS-FLI1: il dsDNA a 306 bp marcato con 5' Quasar670 è stato incubato con mCherry-EWS-FLI1 a diverse concentrazioni a temperatura ambiente per 30 minuti in tampone di reazione contenente 40 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT e0,2 mg/ml di albumina sierica bovina. I campioni sono stati caricati ed eseguiti su gel di agarosio all'1,3% per 25 minuti, 120 V. (B-D) Immagini al microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale a campo ampio di 25× GGAA con tende a DNA dopo incubazione con 500 nM mCherry (B), 500 nM mCherry-EWSLCD (C) o 500 nM mCherry-FLI1DBD (D). (E) Distribuzione dell'intensità dei segnali EWSFLI1 (ciano) e FLI1DBD (nero) nella regione del sito bersaglio (25× GGAA) rispetto alla concentrazione proteica. Questa cifra è stata modificata da 24. Abbreviazioni: LCD = dominio a bassa complessità; DBD = dominio di legame del DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Poiché gli approcci a singola molecola sono estremamente sensibili al contenuto del sistema di reazione, è necessario investire uno sforzo supplementare per garantire una buona qualità di tutti i materiali e le soluzioni durante gli esperimenti di DNA Curtains, in particolare i lipidi preparati nelle sezioni 1 e 2 e i tamponi utilizzati nella sezione 5. I reagenti di purezza superiore devono essere utilizzati per preparare i tamponi e i tamponi devono essere preparati di recente per il saggio a singola molecola.
Quando EWS-FLI1 marcato con mCherry da 500 nM è stato scaricato nella camera, diversi magenta puncta sono apparsi sul DNA di Lambda contenente le sequenze GGAA di 25×. Si noti che c'è stata una distribuzione consecutiva non specifica dei segnali magenta su tutto il DNA anche dopo 10 minuti di lavaggio con tampone bianco (Figura 1B,C). È interessante notare che le molecole di EWS-FLI1 sono state riorganizzate sul DNA durante l'incubazione di 10 minuti senza il flusso tampone e raccolte in diversi puncta (Figura 1D,E). Uno di questi puncta si è formato nel sito GGAA clonato del 25×, mentre tutti gli altri si sono formati nelle regioni contenenti un'alta densità di motivi GGAA consecutivi. Questo fenomeno suggerisce fortemente che la procedura di incubazione senza flusso consente alle molecole EWS-FLI1 di cercare i loci e assemblarsi sul DNA più velocemente.
Diversi esperimenti di controllo devono essere eseguiti per chiarire come questi condensati si sono formati sulle tende di DNA. Abbiamo purificato mCherry, mCherry-EWSLCD e mCherry-FLI1DBD e seguito la stessa procedura per iniettare queste proteine nella camera. Né mCherry (Figura 2B) né mCherry-EWSLCD (Figura 2C) hanno lasciato alcun segnale sul DNA, indicando che il FLI1DBD di EWS-FLI1 era necessario per l'interazione con il DNA. Per confermare che la separazione di fase è avvenuta in DNA Curtains a concentrazioni proteiche così basse, la concentrazione di mCherry-EWS-FLI1 è stata titolata da 25 nM a 500 nM, e l'intensità di ciascun puncta su una molecola di DNA è stata determinata nel sito del clone (Figura 2E). Un confronto con l'intensità di fusione TF FLI1DBD marcato con mCherry ha rivelato che, sebbene le intensità puncta di EWS-FLI1 e FLI1-DBD fossero simili a basse concentrazioni proteiche, l'intensità di EWS-FLI1 è aumentata drammaticamente mentre quella di FLI1DBD è rimasta bassa anche quando la concentrazione ha raggiunto 500 nM. Questi risultati suggeriscono che le molecole EWS-FLI1 si legano alla sequenza GGAA di 25× e si assemblano in un condensato su di essa attraverso interazioni LCD. Un singolo FLI1DBD può legare 2x motivi GGAA e oligomeri di ordine superiore legarsi a sequenze altamente ripetitive a bassa affinità27. Il segnale mCherry-FLI1DBD sulla sequenza GGAA 25× proveniva da un cluster proteico piuttosto che da una singola molecola proteica. Sebbene mCherry-FLI1DBD potesse legare i 25× siti GGAA, non è riuscito ad assemblarsi come condensato sul DNA, confermando che l'interazione LCD-LCD era necessaria per la separazione di fase (Figura 2D,E).
I metodi a singola molecola consentono ai ricercatori di studiare le dinamiche all'interno dei condensati dei fattori di trascrizione. Il metodo DNA Curtains presenta alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi a singola molecola come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET)29, l'imaging a super-risoluzione 30 e la pinzetta ottica31,32. In primo luogo, il metodo DNA Curtains consente la ricostituzione del meccanismo di trascrizione su DNA genomico lungo in vitro e l'osservazione in tempo reale della formazione di condensato di trascrizione con acquisizione di dati ad alto rendimento. In secondo luogo, le molecole di DNA allineate consentono la mappatura della posizione dei condensati su ciascun filamento di DNA. Pertanto, le sequenze di DNA preferite per la formazione di puncta possono essere facilmente determinate.
Inoltre, l'acquisizione a lungo termine è fattibile con DNA Curtains, consentendo la misurazione dell'on-rate (k on) e off-rate (koff) di un puntum. Tuttavia, DNA Curtains ha alcuni difetti tecnici intrinseci, che richiedono l'esame collettivo delle prove provenienti da diversi metodi. Da un lato, la risoluzione delle tende di DNA può raggiungere solo 0,18 μm o ~ 1.000 bp perché il lungo modello di DNA lambda ha una restrizione rispetto al limite di diffrazione, che può ostacolare la differenziazione di due segnali di fluorescenza vicini. D'altra parte, il flusso viene utilizzato per estendere il DNA a doppio filamento (dsDNA) e la forza applicata sulla biomolecola può influenzare la proprietà di diffusione delle proteine che si legano al DNA. Le cortine di DNA a doppio legame possono ancorare entrambe le estremità del dsDNA e registrare il movimento delle proteine senza flusso, che è una soluzione degna di nota33. Per riassumere, approfondire la nostra comprensione dell'assemblaggio dinamico di condensati biomolecolari sul DNA in tempo reale farà luce non solo sul meccanismo biofisico delle LLPS, ma anche sulla biologia di base dei processi cellulari correlati a LLPS, come la regolazione della trascrizione genica24.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
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