Summary
ここでは、1分子イメージング法であるDNAカーテンを使用して、DNA上に集合するEWS-FLI1凝縮物の生物物理学的メカニズムを研究します。
Abstract
染色体転座に起因する融合遺伝子は、多くの固形腫瘍または白血病で発見されています。融合癌タンパク質のFUS/EWS/TAF15(FET)ファミリーに属するEWS-FLI1は、ユーイング肉腫において最も頻繁に関与する融合遺伝子の1つです。これらのFETファミリー融合タンパク質は、通常、N末端にFETタンパク質の低複雑性ドメイン(LCD)を、C末端にDNA結合ドメイン(DBD)を持っています。EWS-FLI1は、LCD-LCDおよびLCD-DBD相互作用により、その標的結合遺伝子座で生体分子凝縮物を形成することが確認されており、これらの縮合物はRNAポリメラーゼIIを動員して遺伝子転写を増強することができます。しかし、これらの縮合物が結合部位でどのように組み立てられるかは不明である。最近、EWS-FLI1凝縮物のこれらの組み立てプロセスを視覚化するために、単一分子生物物理学的方法であるDNAカーテンが適用されました。ここでは、標的DNA上に集合する生体分子凝縮物の研究におけるDNAカーテンの適用について、詳細な実験プロトコルとデータ解析アプローチについて説明します。
Introduction
転写調節は、生細胞における正確な遺伝子発現のための重要なステップです。染色体修飾、転写因子(TF)、ノンコーディングRNAなどの多くの要因が、この複雑なプロセスに関与しています1,2,3。これらの因子の中で、TFは、プロモーターまたはエンハンサーとして知られる特定のDNA配列を認識して結合し、続いて転写を活性化または抑制するために他の機能タンパク質を動員することにより、転写調節の特異性に寄与する4,5,6,7。これらのTFがヒトゲノム内の標的部位を検索し、ヒストンおよび非ヒストンDNA結合タンパク質でコーティングされたDNAと相互作用する方法は、何十年にもわたって科学者を困惑させてきました。過去数年間で、TFの標的検索メカニズムに関するいくつかの古典的なモデルが構築され、TFがDNA鎖に沿ってどのように「スライド」、「ホップ」、「ジャンプ」、または「セグメント間移動」するかを説明してきました8、9、10、11。これらのモデルは、単一のTF分子のDNAに対する検索挙動に焦点を当てています。しかし、最近の研究では、一部のTFは、核内で単独で、またはメディエーター複合体12とともに液-液相分離(LLPS)を受けることが示されています。観察されたTFの液滴は、プロモーターまたはエンハンサー領域に関連しており、転写および三次元ゲノムにおける生体分子凝縮物形成の役割を強調している13、14、15。これらの生体分子凝縮物は、in vivoおよびin vitroで膜欠損コンパートメントに結合しています。それらはLLPSを介して形成され、モジュール式の生体高分子とタンパク質の天然変性領域(IDR)が多価相互作用の2つの主要な原動力です16。したがって、TFはDNAを検索するだけでなく、これらの縮合物内で相乗的に機能します4,17,18。今日まで、DNA上のこれらの転写縮合物の生物物理学的特性は不明のままです。
そこで本研究では、1分子法であるDNAカーテンを適用して、TFがDNA上で形成する転写凝縮物の形成と動態をin vitroで直接イメージングすることを目的としていました。タンパク質とDNAの相互作用を研究するためのハイスループットインビトロイメージングプラットフォームであるDNA Curtainsは、DNA修復19、20、21、ターゲットサーチ22、およびLLPS17、23、24に適用されています。DNAカーテンのフローセルは、ビオチン化脂質二重層でコーティングされており、表面を不動態化し、生体分子を表面に拡散させます。ナノ加工されたジグザグパターンは、DNAの動きを制限します。ビオチン化Lambda DNA基質は、バリアエッジに沿って整列し、配向したバッファー流によって引き伸ばすことができます。すべての分子の同じ開始配列と終了配列により、DNA上のタンパク質の追跡が可能になり、結合イベントの位置分布が記述されます25,26。さらに、DNAカーテンと全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)の組み合わせにより、バックグラウンドノイズを最小限に抑え、単一分子レベルでシグナルを検出できます。したがって、DNAカーテンは、DNAモチーフ上の転写凝縮物形成のダイナミクスを調査するための有望な方法である可能性があります。本論文では、染色体転座によって生成されたFUS/EWS/TAF15(FET)ファミリー融合癌タンパク質EWS-FLI1の例について説明します。EWS-FLI1分子がDNA上でLLPを受ける様子を観察するためのDNAカーテン実験では×EWS-FLI1分子が27-の結合配列である25GGAAを含むラムダDNAをDNA基質として使用しました。本稿では、実験プロトコルとデータ解析手法について詳細に論じている。
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Protocol
1.脂質二重層マスターミックスの調製
- ガラスバイアルを二重蒸留水(ddH2O)と99%エタノールですすぎ、60°Cの乾燥オーブンで乾燥させます。
- 1 gの1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、100 mgのポリエチレングリコール反応(PEG化)脂質(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)(PEG2000 DOPE)および25 mgのビオチン化脂質(18:1の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)(ビオチニルキャップドープ))を10 mLのクロロホルムに溶解して、脂質マスターミックスを作ります。
- バイアルあたり1 mLの脂質マスターミックスを調製し、清潔なガラスバイアルに-20°Cで保存します。
注:溶解した脂質をガラスバイアルに保管し、保管中はバイアルキャップをパラフィルムで覆います。
2.リポソーム溶液の調製
- 2 mLのガラスバイアルをddH2Oおよび99%エタノールですすぎ、60°Cの乾燥オーブンで完全に乾燥させます。
- 250 μLのガラスシリンジをクロロホルムですすぎ、200 μLの脂質マスターミックスを乾いたガラスバイアルに移します。
- 窒素スプレーガンを使用して、バイアルを一方向に連続的に回転させながらN2 を穏やかに流します。
注:N2 はクロロホルムの蒸発を助け、残留脂質はガラスバイアルの壁に薄膜を形成します。最初は非常に穏やかになるように窒素の流れを調整し、バイアルに白いフィルムが現れたら流れを増やします。この蒸発プロセスを5分以内に完了します。 - ガラスバイアルを室温(RT)の真空乾燥オーブンに16〜24時間移し、脂質からクロロホルムを完全に除去します。
- 2 mLの新鮮な脂質バッファー(10 mM Tris-HCl(pH 7.5)および100 mM NaCl)をガラスバイアルに加え、脂質をRTで2時間溶解します。溶液を数回ボルテックスし、5 mLのポリプロピレン製培養チューブに移します。
- 次の設定を使用して、小さな単層小胞を形成するために、マイクロチップ超音波処理器で氷上の脂質溶液を超音波処理します:6サイクルの6秒オン-12秒オフ(20%振幅)、次に6秒オン-6秒オフ(30%振幅)3サイクル、最後に10秒オン(40%振幅)。
注:超音波処理中の温度上昇は、泡の破裂をもたらし、リポソームを破壊する可能性があります。そのため、泡の状態や温度を確認し、こまめに氷を補給しましょう。 - リポソームを0.22 μmのナイロンシリンジフィルターでろ過し、アリコートして4°Cで保存します。
注:長期間の保管により移動性が低下するため、リポソームは2〜3か月で使用するか、使用前に新たに調製する必要があります。
3. ラムダDNAの配列クローニングとビオチン化
- ラムダDNAへの結合モチーフの挿入
- 結合モチーフおよびラムダDNAを含む標的断片をNheIおよびXhoIで消化する。T4リガーゼを使用して、RTで一晩ターゲットフラグメントをラムダDNAでリゲーションします。
- 大腸菌VCS257細胞を抗生物質フリーLB培地中でOD600が0.6に達するまで培養する。後で使用するために、細菌を4°Cで保管してください。
- ライゲーション溶液を65°Cで20分間加熱し、T4リガーゼを変性させます。
- ラムダファージ抽出物を解凍し、鈍い先端でピペッティングしてライゲーション製品と穏やかに混合し、RTで2時間インキュベートします。
- 500 μLのSMバッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、100 mM NaCl、および8 mM MgCl2、0.22 μmフィルターでろ過)と20 μLのクロロホルムをステップ3.1.4のパッケージング混合物に加え、よく混合し、溶液を遠心分離します。
注:包装抽出物の活性は、長期間4°Cで維持できます。 - パッケージング抽出物10 μLをSMバッファー90 μLおよびVCS257細胞100 μL(ステップ3.1.2から)と混合して反応混合物を調製し、混合物を37°Cで15分間インキュベートします。
注:包装溶液の濃度は、翌日のファージプラークの密度に依存します。必要に応じて希釈または添加することができる。 - ~5 mL の溶かした上寒天培地(22 g/L NZCYMブロスと15 g/L寒天)を15 mLチューブに入れます。上部寒天が~42°Cに冷えたらすぐに、平滑末端ピペットを使用して反応混合物(ステップ3.1.6から)をゆっくりと加え、抗生物質を含まないLB寒天プレートに液体を注ぎます。プレートを37°Cのインキュベーターに一晩保管します。
- PCRにより上寒天プレート上の透明ファージプラークのうち陽性プラークを確認した。陽性プラークをピペットで新しい上部寒天プレートに移し、プレートを37°Cのインキュベーターに一晩保管します。
- 10 mM MgCl2 および10 mM CaCl2を含む400 μLのバッファーに400 μLのVCS257細胞を加え、この細胞混合物に1つのプラークを接種し、37°Cの振とう機で250 rpmで15分間インキュベートします。
- ファージプラークを含むこの懸濁液を2 Lフラスコ内の200 mLのNZCYMブロスに800 μL加え、37°Cの振とう機で125 rpmでインキュベートします。
- ~4時間の培養後の細菌懸濁液のOD600 を測定します。OD600 値は最初に上昇し、次に ~0.2 で谷に低下することに注意してください。OD 600値が再び上昇しそうになったらインキュベーションを停止し、500 μLのクロロホルムを加え、80 rpmでさらに5分間振とうします。
注意: トラフ後のOD600 の増加はすぐに発生します。したがって、OD600 値が0.3に減少した場合は、培養中のVCS257細胞の過剰な増殖を避けるために、より頻繁に測定する必要があります。 - ファージ培養液を500 mLボトルに移し、11.7 gのNaClを加えてボトルを振とうします。ボトルを氷上で10分間インキュベートします。
- 懸濁液を4本の50 mLチューブに均等に移します。チューブを12,000 x g で10分間遠心分離します。
注:セクション3.1のこれらの遠心分離手順はすべて、4°Cで実行する必要があります。 - 上清を4本の新しい50 mLチューブに移し、同じ速度で5分間遠心分離します。
- 上清を集め、10%(w / v)PEG8000粉末を加え、4°Cで回転させて30分間インキュベートします。
- ステップ3.1.15の懸濁液を12,000 x g で15分間遠心分離し、ファージペレットを得る。
- ペレットを1 mLのファージ希釈バッファー(10 mM Tris-HCl(pH 7.5)、100 mM NaCl、および10 mM MgCl2)に4 mLチューブに再懸濁し、これらの混合物4 mLすべてを50 mLチューブに注ぎます。
- RNase A(10 mg/mL)およびDNase I(4 mg/mL)を20 μg/mLおよび5 μg/mLの最終濃度に加え、37°Cで30分間インキュベートして、過剰な核酸を分解します。
- 4.5 mLの300 mM Tris-HCl(pH 7.5)、2.76 mLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1.67 mLの10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および75 μLのプロテイナーゼK(10 mg/mL)をチューブに加え、65°Cで10分間インキュベートします。
- 4.5 mLの予冷した3 M酢酸カリウムを加え、氷上で10分間インキュベートします。
- 8,000 x gで10分間遠心分離し、上清を10,000 x gでさらに5分間回転させます。
- 十分に混合しながら(ステップ3.1.21から)収集した上清に70%量のイソプロパノールを加え、RTで2分間インキュベートした後、8,000 x g で10分間遠心分離します。イソプロパノールを捨て、5分間再び回転させます。
注:DNAペレットは、最初の10分間の遠心分離の前に塗抹されます。ペレットは、2回目の5分間の遠心分離後にチューブの底部で濃縮されます。 - 沈殿したDNAを2〜3 mLの70%エタノールで洗浄し、1分間再度スピンダウンします。ペレットを4°Cで2時間乾燥させた後、500 μLのTEバッファー(10 mM Tris-HCl(pH 8.0)および1 mM EDTA)にDNAをRTで一晩再懸濁します。
- DNAを1.5 mLチューブに移し、18,000 x g で3分間回転させます。DNAを新しい1.5 mLチューブに移します。精製したラムダDNAを分注し、-20°Cで保存します。
- ビオチン-ラムダDNA調製
- クローニングしたモチーフを持つ精製ラムダDNA50 μLを65°Cで10分間溶解します。
注:ラムダDNAの長さは~48 kbpであるため、DNAの切断を避けるためにピペッティングの前に加熱する必要があります。 - 50 μLのラムダDNA、1 μLのビオチンプライマー(5'-(フォス)-AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3')(100 μM)および54 μLのddH2Oを一緒に混合します。混合物を65°Cで5分間共インキュベートし、ベンチに置いてRTまで冷却します。
- 12 μLの10x T4リガーゼバッファーと3 μLのT4リガーゼを加え、RTで数時間または一晩インキュベートします。
- 等量のフェノール-クロロホルム(1:1)混合物をライゲーション製品に加え、すぐによく混合し、RTで2分間12,000 x g で遠心分離します。
- DNAを含む上部水相を新しいチューブに注意深く移し、等量のクロロホルムを加えてよく混合し、12,000 x g で2分間遠心分離します。
- 上部水相を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールと3 M酢酸ナトリウムの10%を加え、RTで2分間インキュベートします。混合物を12,000 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、ペレットを75%エタノールで洗浄し、12,000 x g で5分間遠心分離します。
- 75% エタノールを除去し、RT で 10 分間 DNA を風乾し、120 μL の TE バッファーを使用して DNA を溶解します。
- ステップ3.2.8の溶液120 μLに60 μLのバッファーA(30%(w/v)PEG8000および30 mM MgCl2)を加え、4°Cで20〜24時間回転させます。
- 混合物を18,000gで5分間遠心分離し、上清を除去します。
- 180 μLの予冷75%エタノールを使用してペレットを洗浄し、ステップ3.2.10を繰り返します。
- ペレットをRTで乾燥させ、100 μLのTE150バッファーを使用してDNAを溶解します。
- クローニングしたモチーフを持つ精製ラムダDNA50 μLを65°Cで10分間溶解します。
4.ナノ加工ジグザグバリア
- 超音波処理によって20分間アセトンでスライドをきれいにし、さらに20分間超音波処理のために1M NaOHを有する新しいガラス容器にそれらを移す。90mLのH 2 SO4を30mLのH 2 O2と混合し、この混合物にスライドを30分間浸す。スライドをアセトンとイソプロパノールですすぎ、スライドをN2で乾燥させます。
注:H 2 SO4とH 2 O2の混合は発熱プロセスです。操作中は適切な安全対策を講じてください。 - 洗浄したスライドをポリメチルメタクリレート(PMMA)25 kDa、PMMA 49.5 kDa、および導電性保護コーティングの最上層で連続してコーティングします。電子ビームリソグラフィを使用してジグザグバリアを記述します(図1A)。
- スライドをddH 2 Oで洗浄して導電性保護コーティングを取り除き、スライドをN2で乾燥させます。
- マグネトロンスパッタリングマシンを使用してクロム(Cr)の30 nm層を堆積させ、残りのPMMA層をアセトンで除去します。
注:1つのフローセルは、20を超えるDNAカーテン実験に再利用できます。フローセルを再利用するには、エタノール、洗剤、NaOHで洗浄します。
5. EWS-FLI1タンパク質の精製
注:25×GGAAモチーフを持つラムダDNA上の500 nM EWS-FLI1の観察は、凝縮物形成へのDNAカーテンの適用の良い例として役立ちます。EWS-FLI1は、EWSR1のN末端(1-265)とFLI1のC末端(220-453)を組み合わせた融合タンパク質です。mCherryタグをEWS-FLI1融合タンパク質のN末端に融合させて可視化しました。
- EWS-FLI1遺伝子を再構成されたpRSFベクターまたは他の任意の適切な原核生物発現ベクターにクローニングします。
- 7x His-mCherry-EWSFLI1をコードするプラスミドを 大腸菌 BL21(DE3)株に形質転換する。5 mLのLB培地中で37°Cで一晩、単一コロニーを増殖させます。2 LのLB培地に移した後、OD600 値が0.6〜0.8に達したら、0.5 mM IPTGを添加し、細胞培養液を18°Cで16〜18時間振とうします。
- 培養液を遠心分離して上清を除去し、溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 M KCl、1 M 尿素、10 mMイミダゾール、1.5 mM β-メルカプトエタノール(β-ME)、および5%グリセロール)で細胞を再懸濁します。
- ~30分間の18000 × g での超音波処理および遠心分離の後、5倍容量の溶解バッファーで平衡化されたNi-NTA樹脂上に上清をロードし、次いで10倍容量の洗浄バッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 M KCl、1 M 尿素、40 mMイミダゾール、1.5 mM β-ME、および5%グリセロール)で樹脂を洗浄します。
- 結合したタンパク質を15 mLの溶出バッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 M KCl、1 M 尿素、500 mM イミダゾール、1.5 mM β-ME、および5%グリセロール)で溶出し、溶出液を~500 μLまで濃縮します。
- 濃縮タンパク質溶液をゲルろ過カラムにロードし、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で生成物を分析します。精製したタンパク質を液体窒素中で素早く凍結し、-80°Cで保存します。
6. DNAカーテンフローセルの作製
- DNAカーテン実験用のジグザグナノ加工バリアを備えたフローセルを準備し、流れの方向を決定します。これを行うには、入力チューブと出力チューブを正しい方向に接続します。
- 2つの3 mLシリンジを使用して、2.5 mLの脂質バッファーでフローセルを洗浄します。フローセルに気泡がないことを確認します。
- 出力からシリンジを取り外し、1 mLのリポソーム溶液(セクション2からのリポソームストック40 μLと脂質バッファー960 μL)を3回注入し、各注射後に5分間インキュベートします。
- 治癒ステップでは、フローセルを2.5 mLの脂質バッファーでゆっくりと洗浄し、RTで30分間インキュベートします。
注意: 必要に応じて、治癒時間を長くすることができます。気泡が現れた場合は、手順5.3と5.4を繰り返して二重修復を実行し、気泡を取り除きます。 - 30 mLのウシ血清アルブミン(BSA)バッファー(40 mM Tris-HCl(pH 7.5)、2 mM MgCl2、1 mMジチオスレイトール、および表面パッシベーション用の0.5 mg/mL BSA)を調製します。30分間の治癒後、フローセルを出力側から2.5 mLのBSAバッファーで洗浄します。
注:BSAストックは4°Cで保存された20 mg / mL溶液であり、1〜2週間以内に使用する必要があります。バッファー中のBSA濃度は、表面状態に応じて調整できます。 - 800 μLのストレプトアビジンバッファー(1 mg/mLストレプトアビジンストック10 μL、BSAバッファー790 μL)を入力側からフローセルに2ステップで注入し、各ステップの後に10分間インキュベートします。
注:ストレプトアビジンは、ビオチン化脂質とビオチン化DNAの間を架橋することにより、その多価性によりDNAを脂質に固定します。 - フローセルを2.5 mLのBSAバッファーで洗浄し、遊離ストレプトアビジン分子をすべて除去します。
- BSAバッファー(2.5 μLのDNAおよび998 μLのBSAバッファー)を使用して、セクション3のクローニングモチーフでビオチンラムダDNAを希釈します。ラムダDNAを5分間隔で4回ゆっくりと注入します。
- 注入中に顕微鏡と科学的な相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)システムの電源を入れます。チューブを10 mLのddH 2 Oで洗浄します。 プリズムとチューブコネクタを水、2%液体キュベットクリーナー、および99%エタノールですすいでください。KClおよび二本鎖DNA色素をBSAバッファーに添加してイメージングバッファーを調製し、それぞれ150 mMおよび0.5 nMの最終濃度を取得し、少なくとも20 mLのイメージングバッファーを30 mLシリンジに取ります。
- 顕微鏡ステージにフローセルを設置し、マイクロ流体システムに接続します。
- 0.03 mL/minの流速を使用して、DNA分子をバリアに10分間フラッシュし、フローを停止した状態で30分間インキュベートした後、スイッチをオフにしてDNAを横方向に拡散させます。
注:この30分間のインキュベーションの目的は、DNA分子がフラッシュされる入力に対して閉じられたバリアの側に蓄積する傾向があるため、単純な拡散によってDNA分子をバリアの前でより均等に分布させることです。インキュベーション時間は必要に応じて調整できます。
7. DNAカーテン上でのEWS-FLI1凝縮形成のイメージング
- イメージングソフトウェアを開き、明視野下で3×3のジグザグパターンの位置を見つけてマークします。
- 0.2 mL/minでフローをオンにして、二本鎖DNA色素でDNAを10分間染色します。
- mCherry-EWS-FLI1をイメージングバッファーでチューブ内の100 μL中100 nMの濃度に希釈します。
- タンパク質サンプルを100 μLのガラスシリンジでバルブに通し、流量を0.4 mL/minに変更します。
- 488 nmレーザーをオンにし、各領域を事前にスキャンして、DNA分布状態を確認します。DNA分子が均等に分布する領域を選択します。レーザー出力を 488 nm レーザーの場合は 10%、561 nm レーザーの場合は 20% に設定します。パワーメーターを使用して、プリズムの近くで実際のレーザーパワーを測定します:488nmレーザーの場合は4.5 mW、561 nmレーザーの場合は16.0 mW。
- 画像取得
- 488nmと561nmの両方のレーザーで2秒間隔で画像の取得を開始します。
- バルブを手動モードから注入モードに変更して、イメージングバッファーが60秒後にタンパク質サンプルをフローセルにフラッシュできるようにします。
注:このプロセスには~30秒かかり、EWS-FLI1タンパク質がフローセルに到達するとすぐに視野がmCherryシグナルで覆われます。 - 遊離したEWS-FLI1を除去するには、561 nmレーザーのみをオンにして、フローセルをイメージングバッファーで5分間洗浄し続けます。フローを停止し、37°Cで10分間インキュベートします。
- 0.4 mL/minでフローをオンにしてDNAを伸長させ、異なるフレーム間で2秒間隔で画像を取得して、EWS-FLI1凝縮液形成のハイスループットデータを取得します。
8. mCherry-EWS-FLI1の強度解析
- データを画像シーケンスとしてImageJソフトウェアにインポートし、8×8ピクセルの正方形で25×GGAAサイトのパンクタを選択し、画像を.tif形式で保存します。
- パンクタ全体を含む8×8ピクセル正方形の強度の合計として強度を計算し、8 x 8ピクセル正方形に近い同じサイズの領域の背景の強度を差し引いて背景を削除します。
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Representative Results
DNAカーテンの概略図を図1A、図1B、および図1Dに示します。GGAAの25の途切れのないリピートを含むクローニングされた標的配列は、ユーイング肉腫のNORB1プロモーターに見られます。この標的配列は、EWS-FLI1の募集にとって非常に重要です28。EWS-FLI1分子は、561 nmレーザーで得られたmCherry標識EWS-FLI1シグナルを検出することによって視覚化されました(図1Cおよび図1E)。DNAカーテン実験をセットアップした後、DNA基質の25×GGAAサイトでのEWS-FLI1の生体分子凝縮物のin vitro形成を直接視覚化することができました(図1B-E)。DNAカーテンに用いたmCherry-EWS-FLI1の特異性は、25×GGAAを含むDNAテンプレートとGGAAを含まないDNAテンプレートを用いた電気泳動移動度シフトアッセイによって確認されました(図2A)。さらに、EWS-FLI1の濃度を20 nMから500 nMまで滴定し、25× GGAA部位の点状突起の強度を測定しました。mCherry-FLI1DBDの強度と比較して、EWS-FLI1の強度は劇的に増加しましたが、タンパク質が25×GGAA部位をカバーするように飽和した場合、FLI1DBDの強度の変化はごくわずかでした。したがって、これらの結果は、EWS-FLI1がDNA上に凝縮物を形成したことを強く示唆しています(図2B-E)。
図1:25×GGAAモチーフを含むラムダDNA上でのEWS-FLI1凝縮物形成。 (A)DNAカーテンの概略図。(B および D)ラムダDNA上に集合するEWS-FLI1凝縮物(500 nM)を検出するための2つの戦略:(B)10分間洗浄を続ける;(D)10分間インキュベートする。 (CおよびE)DNAカーテンの代表的な広視野全反射蛍光顕微鏡画像:(C)Bでの検出戦略;(E) Dにおける検出戦略 C(ii)およびE(ii)DNAを拡大して、単一のDNA基質上に形成された明確な点状突起を示す。DNA基質は、25×GGAAモチーフを有するラムダDNAである。数字「1、2、3、4」は1つのラムダDNA上のプンクタの異なる位置を表し、「3」は25×GGAAマイクロサテライト配列がクローニングされた場所です。スケールバー = 4.9 μm (C, E (i)) および 0.7 μm (C, E (ii))。この数値は24から変更されました。略称:dsDNA = 二本鎖DNA。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:25×GGAAが繰り返すmCherry-EWS-FLI1の分離ドメインの結合イベント。 (A) (i) mCherry-EWS-FLI1.(ii)mCherry-EWS-FLI1の電気泳動移動度シフトアッセイ:5'クエーサー670で標識した306-bp dsDNAを、40 mM Tris-HCl(pH 7.5)、150 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM DTT、および0.2 mg/mLウシ血清アルブミンを含む反応バッファー中で、室温下で30分間異なる濃度でmCherry-EWS-FLI1とともにインキュベートしました。サンプルをロードし、1.3%アガロースゲル上で25分間、120 Vで実行しました。 (B-D) 500 nM mCherry(B)、500 nM mCherry-EWSLCD(C)、または500 nM mCherry-FLI1DBD(D)とのインキュベーション後のDNAカーテンを使用した25×GGAAの広視野全反射蛍光顕微鏡画像。(E)標的部位(25×GGAA)領域におけるEWSFLI1(シアン)およびFLI1DBD(黒)シグナルの強度分布とタンパク質濃度。この数値は24から変更されました。略語: LCD = 低複雑度ドメイン;DBD = DNA結合ドメイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
単一分子アプローチは反応系の内容に非常に敏感であるため、DNAカーテン実験中のすべての材料と溶液、特にセクション1と2で調製された脂質とセクション5で使用されるバッファーの品質を確保するために特別な努力を払う必要があります。バッファーの調製には高純度の試薬を使用し、単一分子アッセイ用にバッファーは新たに調製する必要があります。
500 nM mCherry標識EWS-FLI1をチャンバーに流すと、25× GGAA配列を含むラムダDNAにいくつかのマゼンタプンクタが現れました。ブランクバッファーで10分間洗浄した後でも、DNA全体にマゼンタシグナルの連続した非特異的分布があったことに注意してください(図1B、C)。興味深いことに、EWS-FLI1分子は、バッファーフローなしで10分間のインキュベーション中にDNA上で再配列され、いくつかの点状突起に集められました(図1D、E)。これらの点状突起の1つはクローン化された25×GGAA部位で形成され、他のすべては高密度の連続したGGAAモチーフを含む領域で形成されました。この現象は、フローなしのインキュベーション手順により、EWS-FLI1分子が遺伝子座を検索し、DNA上により速く集合できることを強く示唆しています。
これらの凝縮物がDNAカーテン上でどのように形成されたかを明らかにするために、いくつかの対照実験を実行する必要があります。mCherry、mCherry-EWSLCD、およびmCherry-FLI1DBDを精製し、同じ手順に従ってこれらのタンパク質をチャンバーに注入しました。mCherry(図2B)もmCherry-EWSLCD(図2C)もDNA上にシグナルを残さず、EWS-FLI1のFLI1DBDがDNAとの相互作用に必要であることを示しています。このような低タンパク質濃度のDNAカーテンで相分離が起こることを確認するために、mCherry-EWS-FLI1の濃度を25 nMから500 nMまで滴定し、クローン部位で1つのDNA分子上の各パンクタの強度を測定しました(図2E)。mCherryで標識した融合TF FLI1DBDの強度と比較すると、EWS-FLI1とFLI1-DBDのパンクタ強度は低タンパク質濃度で類似していたが、EWS-FLI1の強度は劇的に増加し、FLI1DBDの強度は500nMに達しても低いままであることが明らかになった。これらの結果は、EWS-FLI1分子が25×GGAA配列に結合し、LCD相互作用を介してその上に凝縮物に集合することを示唆しています。単一のFLI1DBDは2x GGAAモチーフに結合でき、高次オリゴマーは反復性の高い低親和性配列に結合します27。25× GGAA配列上のmCherry-FLI1DBDシグナルは、個々のタンパク質分子ではなくタンパク質クラスターからのものでした。mCherry-FLI1DBDは25×GGAA部位に結合できましたが、DNA上に凝縮液として組み立てることができず、LCDとLCDの相互作用が相分離に必要であることが確認されました(図2D、E)。
単一分子法により、研究者は転写因子凝縮物内の動態を研究することができます。DNAカーテン法は、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)29、超解像イメージング30、および光ピンセット31,32などの他の単一分子法と比較していくつかの利点を有する。まず、DNA Curtains法は、長いゲノムDNA上の転写機構をin vitroで再構成し、ハイスループットデータ取得による転写凝縮物形成のリアルタイム観察を可能にします。第二に、整列したDNA分子は、各DNA鎖上の凝縮物の位置のマッピングを可能にする。したがって、点状突起形成に好ましいDNA配列を容易に決定することができる。
さらに、DNAカーテンで長期的な取得が可能で、1つのパンクタムのオンレート(kオン)とオフレート(kオフ)の測定が可能です。それにもかかわらず、DNAカーテンにはいくつかの固有の技術的欠陥があり、さまざまな方法からの証拠をまとめて調査する必要があります。一方で、DNAカーテンの分解能は、長いラムダDNAテンプレートには回折限界に関して制限があり、隣接する2つの蛍光シグナルの識別を妨げる可能性があるため、0.18 μmまたは~1,000-bpにしか達できません。一方、フローは二本鎖DNA(dsDNA)を伸長させるために使用され、生体分子にかかる力はDNAに結合するタンパク質の拡散特性に影響を与える可能性があります。ダブルテザーDNAカーテンは、dsDNAの両端を固定し、流れのないタンパク質の動きを記録することができ、これは注目すべき解決策です33。要約すると、DNA上の生体分子凝縮物の動的集合をリアルタイムで理解することを深めることは、LLPSの生物物理学的メカニズムだけでなく、遺伝子転写制御24などのLLPS関連の細胞プロセスの基礎生物学にも光を当てます。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この作業は、NSFC助成金第31670762号(Z.Q.)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
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