Summary
Aquí, describimos un protocolo optimizado para la oclusión de la vena retiniana utilizando rosa de bengala y un sistema de microscopio de imágenes de retina guiado por láser con recomendaciones para maximizar su reproducibilidad en cepas modificadas genéticamente.
Abstract
Los modelos de ratón de oclusión de la vena retiniana (OVR) se utilizan a menudo en oftalmología para estudiar la lesión hipóxico-isquémica en la retina neural. En este informe, se proporciona un método detallado que señala los pasos críticos con recomendaciones de optimización para lograr tasas de oclusión consistentemente exitosas en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente. El modelo de ratón RVO consiste principalmente en la administración intravenosa de un colorante fotosensibilizador seguido de fotocoagulación con láser utilizando un microscopio de imágenes de retina conectado a un láser guiado oftálmico. Se identificaron tres variables como determinantes de la consistencia de la oclusión. Al ajustar el tiempo de espera después de la administración de rosa de bengala y equilibrar la línea de base y la salida experimental del láser, la variabilidad entre los experimentos puede ser limitada y se puede lograr una mayor tasa de éxito de oclusiones. Este método se puede utilizar para estudiar enfermedades de la retina que se caracterizan por edema retiniano y lesión hipóxico-isquémica. Además, como este modelo induce lesión vascular, también se puede aplicar para estudiar la neurovasculatura, la muerte neuronal y la inflamación.
Introduction
La oclusión de la vena retiniana (OVR) es una enfermedad vascular retiniana común que afectó a aproximadamente 28 millones de personas en todo el mundo en 20151. La OVR conduce a la disminución y pérdida de la visión en adultos en edad laboral y ancianos, lo que representa una enfermedad continua que amenaza la vista y que se estima que aumentará durante la próxima década. Algunas de las distintas patologías de la OVR incluyen lesión hipóxico-isquémica, edema retiniano, inflamación y pérdida neuronal2. Actualmente, la primera línea de tratamiento para este trastorno es a través de la administración de inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Si bien el tratamiento anti-VEGF ha ayudado a mejorar el edema retiniano, muchos pacientes aún enfrentan una disminución de la visión3. Para comprender mejor la fisiopatología de esta enfermedad y probar posibles nuevas líneas de tratamiento, es necesario constituir un protocolo funcional y detallado de modelo de ratón RVO para diferentes cepas de ratones.
Se han desarrollado modelos de ratón implementando el mismo dispositivo láser utilizado en pacientes humanos, junto con un sistema de imágenes escalado al tamaño correcto para un ratón. Este modelo de ratón de RVO fue reportado por primera vez en 20074 y establecido por Ebneter y otros 4,5. Finalmente, el modelo fue optimizado por Fuma et al. para replicar manifestaciones clínicas clave de la OVR, como el edema retiniano6. Desde que se informó por primera vez del modelo, muchos estudios lo han empleado utilizando la administración de un tinte fotosensibilizador seguido de fotocoagulación de las principales venas de la retina con un láser. Sin embargo, la cantidad y el tipo de tinte que se administra, la potencia del láser y el tiempo de exposición varían significativamente entre los estudios que han utilizado este método. Estas diferencias a menudo pueden conducir a una mayor variabilidad en el modelo, lo que dificulta su replicación. Hasta la fecha, no hay estudios publicados con detalles específicos sobre posibles vías para su optimización.
Este informe presenta una metodología detallada del modelo de ratón RVO en la cepa C57BL / 6J y una cepa knockout endotelial 9 inducible por tamoxifeno (iEC Casp9KO) con un fondo C57BL / 6J y de relevancia para la patología RVO como cepa de referencia para un ratón modificado genéticamente. Un estudio previo había demostrado que la activación no apoptótica de la caspasa-9 endotelial instiga el edema retiniano y promueve la muerte neuronal8. La experiencia con esta cepa ayudó a determinar y proporcionar información sobre posibles modificaciones para adaptar el modelo de ratón RVO, que puede ser aplicable a otras cepas modificadas genéticamente.
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Protocol
Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.
NOTA: Todos los experimentos utilizaron ratones machos de dos meses de edad que pesaban aproximadamente 20 g.
1. Preparación y administración de tamoxifeno para la ablación genética inducible de genes floxed
NOTA: El diámetro de los vasos retinianos puede verse afectado por el peso del animal. Asegúrese de que todos los animales utilizados para un experimento tengan pesos similares.
- Diluir tamoxifeno en aceite de maíz a una concentración de 20 mg / ml.
NOTA: El tamoxifeno es un tóxico y es sensible a la luz. Protéjase de la luz, por ejemplo, con papel de aluminio. - Vórtice la solución durante un par de segundos.
- Dejar en el horno a 55 °C durante 15 min.
NOTA: Asegúrese de que el tamoxifeno se haya disuelto completamente. Puede ser necesario un vórtice adicional. - Conservar la solución a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
- Use una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 g para la inyección de tamoxifeno. Limpie el área de inyección con etanol al 70%. Administrar 2 mg de tamoxifeno (100 μL de 20 mg/ml) por vía intraperitoneal (IP) una vez al día durante el tiempo establecido según la línea Cre inducible específica.
- Permita dos días de descanso para los animales antes de comenzar los experimentos.
2. Preparación de reactivos para fotocoagulación láser
- Rosa de bengala
NOTA: La rosa de bengala es sensible a la luz. Almacenar en la oscuridad hasta su uso y preparar fresco para obtener mejores resultados.- Prepare la rosa de bengala diluyéndola a 5 mg/ml en solución salina estéril y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
- Prepare una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 G con rosa de bengala.
- Ketamina/xilazina
- Diluir ketamina y xilazina en solución salina estéril en consecuencia para las siguientes concentraciones: ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg).
- Carprofeno
- Diluir el carprofeno a 1 mg/ml en solución salina estéril.
- Prepare una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 G con carprofeno.
- Solución salina estéril
- Prepare una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 26 g con solución salina estéril.
3. Configuración del láser
- Manipule suavemente el cable de fibra óptica y conéctelo a la caja de control láser y al adaptador láser del microscopio de imágenes de retina.
- Encienda la caja de la lámpara del microscopio de imágenes de retina.
- Encienda el equipo y abra el programa de imágenes.
- Ajuste el balance de blancos utilizando un trozo de papel blanco y colocándolo delante del ocular del ratón y haciendo clic en Ajustar en el programa de imágenes.
- Encienda la caja de control láser girando la llave y siguiendo las instrucciones en la pantalla de la caja de control láser.
NOTA: El láser utilizado en este experimento es de clase 3B y puede causar daño ocular. Use gafas protectoras cuando opere el láser. - Verifique la potencia láser de referencia.
- Utilice un medidor de potencia láser.
- Ajuste la pantalla de la caja de control láser a los siguientes parámetros: 50 mW y 2.000 ms.
- Encienda el láser y coloque el medidor de potencia delante del ocular.
NOTA: Asegúrese de que la luz del microscopio esté apagada mientras prueba la potencia láser de referencia. - Presione el pedal del pedal para activar el láser.
- Apunte a que la lectura de potencia del láser sea de 13-15 mW.
NOTA: La lectura de potencia del láser determinará la tasa de éxito de las oclusiones de las venas retinianas. Si la lectura de potencia del láser es demasiado baja, se pueden realizar ajustes en la potencia y el tiempo de exposición al láser. Véanse las recomendaciones en el cuadro 1 .
- Ajuste la potencia del láser experimental configurando la pantalla de la caja de control láser para los siguientes parámetros: 100 mW, 1.000 ms.
- Apague el láser.
NOTA: Por seguridad y para evitar el sobrecalentamiento, es mejor mantener el láser apagado entre ratones.
4. Inyección de rosa bengala en la vena de la cola del ratón
- Vierta 300 ml de agua en un vaso de precipitados de 500 ml.
- Caliente el vaso de precipitados en un horno de microondas durante 1 min.
- Ponga una gasa en el agua tibia en el vaso de precipitados.
- Coloque el ratón en un retenedor.
- Presione la gasa en la cola del ratón suavemente y busque las venas dilatadas. Desinfecte el lugar de la inyección con una toallita con alcohol después de la dilatación con agua tibia.
- Inserte la aguja en el lugar de la inyección y tire de la jeringa para asegurarse de que está en la vena. Luego, inyecte la vena de la cola del ratón, administrando la cantidad correcta de acuerdo con el peso del animal (37.5 mg / kg). Aplique presión en el lugar de la inyección para evitar hematomas o sangrado. Limpie el sitio.
- Suelte el ratón del sistema de sujeción y devuélvalo a la jaula.
- Deje que circulen 8 minutos para que la rosa de bengala circule antes de la inyección de anestésicos.
NOTA: Esto proporcionará un total de 10 minutos entre la inyección de rosa de bengala y la irradiación láser.
5. Oclusión de las venas principales
- Encienda la plataforma del ratón con calefacción.
- Agregue una gota de fenilefrina y tropicamida en cada ojo.
- Inyectar 150 μL de los anestésicos, ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg) IP.
NOTA: Durante este procedimiento, el ratón recibió dos inyecciones IP. Por lo tanto, los lados se alternaron. La inyección IP para la anestesia se administró en el cuadrante abdominal inferior derecho, y la solución salina se inyectó en el cuadrante abdominal inferior izquierdo. Se recomienda tirar de la jeringa antes de inyectarla para asegurarse de que la aguja esté en el abdomen y no en ningún órgano. - Pellizque el dedo del pie al animal para determinar la profundidad de la anestesia y espere hasta que no responda.
- Agregue una gota de clorhidrato de proparacaína por ojo (analgésico).
- Agregue ungüento de gel a ambos ojos.
- Inyecte 150 μL de carprofeno por vía subcutánea entre las orejas.
- Coloque el ratón en la plataforma.
- Ajuste la plataforma hasta que la vista del fondo de la retina sea clara y enfocada.
- Cuente las venas de la retina y tome una imagen del fondo de ojo.
NOTA: Las venas retinianas son más oscuras y anchas que las arterias. Las venas y las arterias se alternan; Sin embargo, a veces puede haber una arteria ramificada cerca del nervio óptico y, por lo tanto, dos arterias adyacentes. - Encienda el láser y apunte hacia una vena retiniana a aproximadamente 375 μm del disco óptico.
- Irradiar el recipiente presionando el interruptor de pedal y moviendo ligeramente el rayo láser hasta 100 μm. Repita este paso tres veces y mueva el rayo láser después de cada pulso para que la irradiación no se enfoque en un punto.
- Repita la irradiación en otros vasos principales para lograr 2-3 oclusiones.
6. Establecer el número de venas ocluidas en el día 0
- Apague la lámpara después de irradiar los recipientes y espere 10 minutos.
NOTA: La exposición a la luz puede causar daño e inflamación en la retina; Apague la lámpara durante el tiempo de espera para minimizar la exposición7. - Vuelva a encender la lámpara y cuente el número de venas ocluidas.
- Tome una imagen del fondo de ojo.
7. Cuidados posteriores
- Inyecte 1 ml de solución salina IP estéril.
NOTA: Consulte los detalles de la inyección IP en la sección 5, paso 3. - Agregue gotas oftálmicas lubricantes en ambos ojos.
- Agregue ungüento de gel a ambos ojos.
- Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia y no lo devuelva a la jaula con los otros animales hasta que esté completamente recuperado. El carprofeno (5 mg/kg) se puede administrar diariamente hasta 2 días después del procedimiento. Si se aplica a los seres humanos, el dolor no es un síntoma de RVO.
NOTA: No deje a los animales desatendidos hasta que se recuperen completamente de la anestesia.
8. Evaluación del edema retiniano mediante tomografía de coherencia óptica (OCT)
NOTA: Este paso se puede realizar en el momento de interés del investigador. El pico de edema retiniano para un ratón C57BL / 6J es 1 día después del procedimiento RVO. Este punto de tiempo puede variar dependiendo del fondo del mouse.
- Encienda la caja de luz del microscopio de imágenes de retina, la máquina OCT y la plataforma de ratón calentado.
- El día después de la oclusión, siga los pasos 5.2 a 5.7 para preparar al animal.
- Abra los programas de software de creación de imágenes y OCT.
- En el programa OCT, ajuste el empujón a 5.
- Tome OCT a 75 μm distal de la quemadura o 4 clics.
- Tome imágenes de OCT en cuatro cuadrantes de la retina.
- Analice las imágenes de OCT con el software de rastreo.
- Compare el grosor retiniano de las medidas preirradiadas con 1 día después de la OVR o en el momento de interés.
NOTA: Al analizar los datos, tenga en cuenta el número de venas irradiadas, ya que esto puede influir en el desarrollo de edema retiniano. Luego, los animales son sacrificados mediante la administración de anestesia seguida de cirugía de no supervivencia por perfusión.
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Representative Results
El modelo de ratón RVO tiene como objetivo lograr con éxito oclusiones en las venas retinianas, lo que lleva a la lesión hipóxico-isquémica, ruptura de la barrera retiniana sanguínea, muerte neuronal y edema retiniano8. La Figura 1 muestra una línea de tiempo de pasos para garantizar la reproducibilidad, un esquema del diseño experimental y describe los pasos que se pueden optimizar aún más dependiendo de las preguntas experimentales. Los tres pasos principales que se pueden modificar son el tiempo de espera después de la administración de rosa de bengala, la potencia láser de referencia y la salida de láser experimental. En este informe, se utilizaron ratones C57BL / 6J, así como compañeros de camada WT y KO de una línea de ratón knockout caspasa-9 de células endoteliales inducibles (iEC Casp9), para determinar los ajustes óptimos en diferentes cepas.
El tiempo de espera desde la inyección de rosa de bengala hasta la irradiación láser puede alterar el éxito de la fotocoagulación en las venas. Un tiempo de espera demasiado corto puede resultar en una baja concentración de rosa de bengala dentro de las venas, mientras que un tiempo de espera demasiado largo puede hacer que la rosa de bengala se elimine de la circulación retiniana. Ambas situaciones pueden conducir a una fotocoagulación deficiente y oclusiones infructuosas. Al probar el número de oclusiones obtenidas inmediatamente después de la irradiación láser, la comparación de animales que fueron sometidos con láser 10 y 20 minutos después de la administración de rosa de bengala reveló que no hubo diferencias en el número de oclusiones logradas (Figura 2B). Sin embargo, el número de oclusiones sostenidas hasta 1 día después de la OVR disminuyó significativamente en animales que fueron sometidos con láser 20 minutos después de la administración de rosa de bengala, independientemente del genotipo. Este resultado sugiere que cuando se estudia la lesión aguda inducida por RVO, el tiempo de espera después de la administración de rosa de bengala puede afectar la estabilidad de la oclusión. La reperfusión temprana de las venas (antes de 24 h después de la lesión) podría afectar el desarrollo de edema retiniano y, por lo tanto, debe controlarse determinando el tiempo de espera correcto desde la administración de rosa de bengala hasta la irradiación con láser.
En principio, la fotocoagulación exitosa que conduce a la oclusión es impulsada por la potencia del láser. Aunque esta es una parte tan importante del proceso, también es una de las mayores fuentes de variabilidad en el modelo y debe optimizarse para la coherencia. Para lograr esto, se recomienda medir la salida del láser durante la configuración antes de que los ratones sean inyectados con rosa de bengala. La salida recomendada para la potencia láser de referencia está entre 13,0 y 15,0 mW. La baja potencia inicial del láser, como 11,5 mW, sin modificar la potencia experimental (100 mW), no dio lugar a oclusiones, como se muestra en la Figura 3. En contraste, una salida láser de referencia de 13.5 mW con una potencia experimental de 100 mW resultó en oclusiones exitosas. En los casos en que la salida del láser estaba por debajo de 13,0 mW, la potencia experimental se incrementó a 110 mW para lograr las mismas oclusiones exitosas que con una salida láser de referencia más alta. Típicamente, 100 mW es la potencia experimental estándar; sin embargo, si la salida del láser es inferior a 13,0 mW, se puede compensar modificando la potencia experimental con los rangos recomendados en la Tabla 1.
Se han observado cuatro tipos principales de oclusiones después de la fotocoagulación con láser de las venas. Estos tipos de oclusiones se resumen en la Figura 4A y se han clasificado según la cantidad de flujo sanguíneo; vasos completamente ocluidos (sin flujo sanguíneo), vasos parcialmente ocluidos (en su mayoría bloqueados con flujo ocasional), parcialmente reperfundidos (flujo sanguíneo constante ininterrumpido con obstáculos) y vasos completamente reperfundidos (sin obstrucción obvia alguna). Para investigar si los tipos de oclusiones cambian según el genotipo y determinar el tiempo empleado por estado de oclusión, se evaluaron videos de 10 minutos después de la irradiación láser. Esta evaluación ayudó a determinar que la vasculatura irradiada de los ratones iEC Casp9 pasa más tiempo en estados parcialmente reperfundidos y parcialmente ocluidos que C57BL6 / J, que pasan más tiempo en estados completamente ocluidos (Figura 4B).
La Figura 5 muestra cómo el estado de oclusión de los vasos cambia rápidamente dentro de los primeros 10 minutos después de la fotocoagulación con láser. Una vez transcurridos estos 10 min iniciales, las oclusiones se estabilizan y se mantienen hasta un punto de tiempo de 24 h. Por lo tanto, para evaluar el número inicial exacto de oclusiones por ojo, se recomienda esperar 10 minutos después de la irradiación. Una evaluación previa de este modelo determinó que la mayoría de las oclusiones se reperfunden 8 días después de la irradiación8; Sin embargo, la tasa de oclusiones que reperfunden por día puede variar según la tensión y debe determinarse en cada modelo experimental. El modelo presentado aquí es de lesión aguda y está destinado a ser utilizado para comprender las vías que conducen al edema, que se desarrolla dentro de las 24 h después de las oclusiones. Otra característica de la RVO son las hemorragias en forma de llama, que se pueden observar a las 24 h después de la lesión, como se muestra en la Figura 5.
El seguimiento a las 24 h después de la OVR puede revelar otras patologías oftálmicas que pueden ocurrir como resultado del método de OVR. Algunos incluyen, entre otros, hemorragia subretiniana (caracterizada por parche sanguíneo continuo), desprendimiento de retina, retina completamente isquémica (sin flujo sanguíneo en venas y arterias) y cataratas. La Figura 6 muestra imágenes de fondo de ojo con la OCT correspondiente como ejemplos de estos, excepto en ojos donde se forman cataratas (Figura 6F), ya que la OCT no se puede realizar en presencia de una catarata. La figura 6A muestra ejemplos de cómo se ven una imagen de fondo de ojo y OCT de un ojo no lesionado como referencia.
La principal patología morfológica de la OVR en este modelo es el edema retiniano. Para evaluar el nivel de edema retiniano, se recomienda tomar imágenes de OCT antes del día del procedimiento de RVO para una lectura basal y en el punto de tiempo de interés. La figura 7 muestra la cuantificación de OCT del edema retiniano en ojos lesionados. Otra medida utilizada para determinar el estado de las capas neuronales es evaluar la desorganización de las capas internas de la retina (DRIL). Esta es una medida utilizada en el ámbito clínico que representa la no perfusión capilar, otro sello distintivo de la RVO 5,9,10. Un ejemplo de esta evaluación se puede encontrar en la Figura 7B. La Figura 7C muestra un ejemplo de una imagen OCT con las etiquetas correspondientes para cada capa retiniana.
Figura 1: Línea de tiempo y esquema del modelo de ratón RVO . (A) Cronología de eventos desde la administración de rosa de bengala hasta la obtención de imágenes de venas ocluidas. (B) Representación resumida del método para lograr una fotocoagulación exitosa de la vena retiniana. Los cuadros rojos representan pasos importantes en el proceso que son muy variables y que se pueden optimizar por modelo de ratón y cuestión de interés. (C) Las venas principales de la retina (V) son más anchas y oscuras en comparación con las arterias (A). Cada vena principal será irradiada con un láser guiado de 532 nm, tamaño de punto 50 μm, potencia 100 mW, duración 1 s, energía total 0.3 J y exposición radiante 15278.87 J / cm2, a una distancia promedio de 375 μm del nervio óptico. (D) La aplicación del láser provoca una burbuja de vaporización visible en las imágenes del fondo de ojo de aproximadamente 150 μm y cubre el <4% del área total de la retina. Los números representan la ubicación sugerida y la dirección del movimiento (flechas) del rayo láser al irradiar recipientes. Abreviaturas: A = arteria; V = vena; ON = nervio óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El tiempo de foto-oclusión en relación con la administración de rosa de bengala es crítico para una fotocoagulación exitosa . (A) Imágenes retinianas del fondo de ojo de iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO fotoocluidas 10 y 20 min después de la administración de rosa de bengala. Los círculos blancos representan venas que tuvieron oclusiones exitosas. (B) Número de oclusiones inmediatamente después de la irradiación (0 h) y 1 día después de la irradiación durante 10 min y 20 min después de la inyección de genotipos combinados de rosa de bengala. Prueba t de Welch, las barras de error indican SEM. (C) Número de oclusiones separadas por genotipo. ANOVA bidireccional y prueba de LSD de Fisher; las barras de error indican SEM. Abreviaturas: WT = tipo comodín; KO = nocaut; SEM = error estándar de la media; ANOVA = análisis de varianza; LSD = diferencia menos significativa; ns = no significativo; P-RVO = oclusión venosa retiniana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La medición de la línea de base y la salida experimental del láser son pasos críticos para una fotocoagulación exitosa. Imágenes retinianas del fondo de ojo de iEC Casp9 WT y iEC Casp9 KO 10 min después de la fotocoagulación; foto-ocluido con diferentes niveles de salida láser basales y experimentales. La baja salida láser de referencia se puede compensar con una salida láser experimental (12,8 mW, 110 mW). Los círculos blancos representan venas que tuvieron oclusiones exitosas. Abreviaturas: WT = tipo salvaje; KO = nocaut. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El método RVO da como resultado diferentes tipos de oclusiones. (A) Imágenes retinianas del fondo de ojo de C57BL/6J, iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 10 min después de la fotocoagulación con diferentes tipos de oclusiones: completamente ocluidas, parcialmente ocluidas, parcialmente reperfundidas y completamente reperfundidas. Los recuadros muestran una vista enfocada de una vena que resultó en un tipo específico de oclusión después de la fotocoagulación. (B) Cuantificación del porcentaje de venas ocluidas en los diferentes estados de oclusión para cada genotipo durante los primeros 10 min post irradiación. Los videos de diez minutos fueron evaluados por dos investigadores, cegados a los genotipos, que asignaron números a los diferentes estados de oclusión (completamente ocluido (-2), parcialmente ocluido (-1), completamente reperfundido (2) y parcialmente reperfundido (1)) por duración. Abreviaturas: RVO = oclusión de la vena retiniana; WT = tipo salvaje; KO = nocaut. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cronología de las oclusiones después de la OVR. Imágenes retinianas del fondo de ojo de C57BL/6J, iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min y 24 h después de la irradiación láser. Los primeros 10 minutos son críticos para el estado de las oclusiones y pueden cambiar rápidamente. Después de los primeros 10 minutos, las oclusiones son estables hasta al menos 24 h. Los círculos blancos representan venas que tuvieron oclusiones exitosas, y las puntas de flecha amarillas representan hemorragias en forma de llama. Abreviaturas: RVO = oclusión de la vena retiniana; WT = tipo salvaje; KO = nocaut. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Diferentes patologías oftálmicas pueden ocurrir después de la OVR. (A-E) muestran imágenes del fondo de ojo de la retina y la OCT correspondiente. (A) Un ejemplo de un ojo no lesionado que no se sometió al proceso de RVO. (B) Hemorragia subretiniana que muestra sangre que se escapa de los vasos en la imagen del fondo de ojo. (C) Desprendimiento de retina visto por el pliegue borroso en el fondo de ojo y el levantamiento de la retina en la OCT. (D) Edema excesivo mostrado por una gran cantidad de hinchazón en el OCT. (E) Un ojo completamente isquémico con un flujo sanguíneo completamente deteriorado que resulta en una retina blanca. (F) Dos ejemplos diferentes de un ojo catarido en los que no se pudo obtener una imagen clara del fondo de ojo y la OCT. Barras de escala OCT: 100 μm. Abreviaturas: RVO = oclusión de la vena retiniana; OCT = tomografía de coherencia óptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Cuantificación de imágenes de OCT. (A) Examinar el grosor de la capa y el DRIL en ojos de control sin láser y ojos que pasaron por el procedimiento de RVO. Mediciones GCL, IPL, INL, OPL, ONL, segmento externo y retina completa. Estadística, valores p de la prueba de Mann-Whitney: GCL: 0.0070, IPL: 0.0205, INL: <0.0001, OPL: 0.0014, ONL: 0.5582, segmento externo: 0.44852, retina completa: 0.0019. Las barras de error muestran SEM. (B) Cuantificación de DRIL medida a partir de las imágenes OCT de controles no láser y ratones RVO WT y KO iEC Casp9, así como ratones c57 / BL6J que tenían RVO. Las barras de error muestran SEM. (C) OCT de ejemplo con las etiquetas de cada capa retiniana. Abreviaturas: DRIL = Desorganización de las capas internas de la retina; OVR = oclusión de la vena retiniana; WT = tipo salvaje; KO = nocaut; GCL = capa de células ganglionares; IPL = capa plexiforme interna; INL = capa nuclear interna; OPL = capa plexiforme externa; ONL = capa nuclear externa; SEM = error estándar de la media; OCT = tomografía de coherencia óptica; ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Salida láser de referencia (mW) | Salida láser experimental recomendada (mW) | Tiempo de exposición recomendado (ms) |
| <11.0 o >15.0 | Apague el láser y ajuste la fibra en el extremo que está conectado a la caja de control del láser. Desenrosque y muévalo ligeramente hacia la derecha o hacia la izquierda. Mide el resultado de nuevo, hasta que alcance un valor mayor o menor. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tabla 1: La baja salida láser de referencia se puede compensar con una mayor salida de láser experimental. Variaciones en la salida láser de referencia y la salida láser experimental recomendada y el tiempo de exposición.
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Discussion
El modelo RVO de ratón proporciona una vía para comprender mejor la patología de RVO y probar posibles terapias. Si bien el modelo RVO del ratón se usa ampliamente en el campo, existe la necesidad de un protocolo detallado actual del modelo que aborde su variabilidad y describa la optimización del modelo. Aquí, proporcionamos una guía con ejemplos de la experiencia sobre lo que se puede alterar para obtener los resultados más consistentes en una cohorte de animales experimentales y proporcionar datos confiables.
Los dos elementos más esenciales del modelo de ratón RVO son la salida del láser y la inyección intravenosa exitosa del tinte fotosensibilizador. Para producir la potencia necesaria para inducir la coagulación cuando el láser se dirige a una vena en particular, la salida del láser debe ajustarse adecuadamente. Si bien esto se puede lograr utilizando las técnicas sugeridas en el método, es importante considerar las diferencias en la configuración del sistema de cada laboratorio. Las variaciones del cable de fibra óptica y cómo se acomoda en relación con el equipo y la temperatura ambiente son algunas de las variables que pueden explicar la baja salida del láser. Se recomiendan ajustes independientes a la configuración del sistema para aumentar la salida láser.
Sin embargo, este esfuerzo es inoperable sin una técnica de vena de cola adecuada para administrar el tinte fotosensibilizador. Las inyecciones en la vena de la cola pueden ser difíciles de lograr, y es una habilidad que lleva tiempo desarrollar. Las inyecciones deficientes pueden resultar en ninguna oclusión; en este caso, la rosa de bengala se puede administrar a través de IP. La administración de Rosa de Bengala vía IP se ha utilizado para modelar la OVR, pero con un tiempo de irradiación láser más largo (3 s) y una mayor concentración de Rosa de Bengala (40 mg/ml)11. Para limitar la irradiación láser prolongada y dirigirse específicamente a la vasculatura, la veteado de la cola es el modo preferido de administración.
Este modelo también podría lograrse utilizando otros colorantes fotoactivables como la eosina Y y la fluoresceína sódica12,13,14, aunque la rosa bengala es el colorante fotoactivable más utilizado 4,5,6,8. Se ha demostrado que todos los colorantes producen características tempranas de enfermedad clínica, como hemorragia retiniana y edema retiniano15. Se ha demostrado que los colorantes fotoactivables no tienen efectos adversos en los animales, mostrando así una toxicidad insignificante en el sistema15,16. También debe tenerse en cuenta que el tinte elegido debe tener una absorción máxima compatible con la longitud de onda del láser que se está utilizando. Rosa de Bengala tiene una excitación a 525 nm17, fluoresceína de sodio a 475-490 nm 18, y eosina Y a 490 nm19.
Las principales fuentes de variabilidad en este modelo son el tiempo de fotooclusión en relación con la administración de rosa de bengala y la salida de láser basal y experimental. Mientras que la Figura 2 muestra puntos de tiempo de 10 y 20 minutos para la fotooclusión, también se realizó un pequeño número de experimentos de 5 y 15 minutos (datos no mostrados), produciendo oclusiones que no fueron tan consistentes como el punto de tiempo de 10 minutos. Por lo tanto, se eligió 10 min para ser el tiempo de espera óptimo entre la administración de rosa de bengala y la fotooclusión para este método. Sin embargo, los estudios han informado que la OVR también puede ser inducida tan pronto como 3 minutos después de la administración de rosa de bengala5. Otra forma de determinar el tiempo de espera óptimo específico de la cepa de ratón desde la rosa de bengala hasta la fotooclusión es monitorear la concentración relativa de rosa bengala utilizando el modo de imagen de fluorescencia con un filtro de tetrametilrodamina (TRITC). Sin embargo, el protocolo descrito aquí se puede realizar utilizando microscopios de imágenes de retina que no tienen un filtro TRITC.
La otra fuente de alta variabilidad en este modelo es la salida láser de referencia. Como los niveles diarios de salida de láser de referencia pueden ser muy diferentes, es importante evaluar los niveles antes de cada experimento. La estandarización de la salida láser de referencia en todos los estudios puede ayudar a potenciar y ampliar el uso del modelo de ratón RVO. Reajustar el cable de fibra puede ser suficiente para modificar los niveles de referencia; sin embargo, si no se puede alcanzar una medición de 13,0 mW, la Tabla 1 proporciona una guía para la compensación utilizando la potencia experimental. Es importante tener en cuenta que debido a que la retina es un sistema cerrado, determinar la fracción de venas ocluidas (el número de venas ocluidas dividido por el número de venas irradiadas) es esencial para comprender, controlar y predecir la gravedad del daño en el modelo RVO. El análisis previo de lecturas dañadas (DRIL y grosor de la retina) se correlacionó con la fracción de venas ocluidas y predijo la atrofia retiniana a los 8 días después de la OVR8. Por lo tanto, la fracción de venas ocluidas debe ser considerada y evaluada. Todavía no está claro cómo otros estados de oclusión intermedia, como parcialmente reperfundido, parcialmente ocluido o venas que alguna vez fueron ocluidas y reperfundidas por 10 minutos, contribuyen al desarrollo de edema y atrofia retiniana.
Los estudios adicionales de los ojos con estos tipos de oclusiones pueden ayudar a investigar si una oclusión sostenida es necesaria para un daño sustancial o si incluso las oclusiones transitorias son importantes en este modelo. Dependiendo de la pregunta experimental que se haga, las diferentes tasas de oclusión serán óptimas. Una tasa de oclusión del 40-50% es ideal en la mayoría de los casos, lo que significa dos o tres oclusiones en un ojo con seis venas. Esto asegura una lesión sustancial, pero la retina está intacta y puede ser diseccionada para análisis inmunohistoquímicos y bioquímicos.
Para determinar esto, es relevante distinguir la visión patológica de una oclusión exitosa y representativa de la firma RVO. La oclusión natural presentada por RVO incluye hemorragias en forma de llama 20 (no confundir con hemorragia subretiniana), que se pueden observar en este modelo24 h después de la lesión. El modelo RVO también puede conducir a lesiones retinianas no deseadas (no distintivas de la patología RVO) como las que se muestran en la Figura 6B-F, si sus parámetros no se controlan con cautela. Un enfoque que se puede tomar para evitar estos, además de regular la concentración de rosa de bengala y la potencia láser experimental, es dejar de irradiar los vasos que tienen una clara formación de un trombo después de la primera o segunda irradiación.
Otros factores a considerar al emplear este modelo y decidir qué venas ocluir son la cepa del ratón y el diámetro del vaso. Algunas cepas de ratón, como BALB/c, más comúnmente conocida como albina, son susceptibles al daño leve21. Además, tienen déficits de desarrollo retiniano que conducen a defectos en la decusación en el quiasma óptico y agudeza visual22,23. Se recomienda evaluar completamente la integridad retiniana y vascular basal de los controles no lesionados para la cepa de ratón elegida para los estudios de RVO. Estudios han demostrado que el ancho de la vena puede interferir con el desarrollo de edema retiniano y patología de la enfermedad24. Por lo tanto, deben utilizarse animales de peso similar para evitar una mayor variabilidad. Los factores de exclusión de qué ojos usar en un estudio también dependerán de la pregunta experimental. Puede ser prudente incluir cualquier ojo que alguna vez fue ocluido, incluso si se vuelve a perfundir en el punto de tiempo de seguimiento para la señalización. Sin embargo, si se desean oclusiones estables, estos ojos serían excluidos. La Figura 6 muestra ejemplos de posibles criterios de exclusión u ojos que podrían ser utilizados para el análisis patológico.
Para demostrar que estos ajustes del láser no estaban causando daño y los efectos observados fueron realmente impulsados por las propias oclusiones, se realizaron controles simulados en estudios previos8. Los ratones simulados todavía recibieron una inyección de rosa de bengala en la vena de la cola, pero fueron irradiados en el espacio parenquimatoso entre los vasos principales en lugar de ser irradiados en la vena. Este fue un paso importante para garantizar que el modelo replicara las lesiones de RVO observadas en pacientes en lugar de simplemente dañar el tejido con un láser. Estos simulacros no muestran activación de caspasa-9 o -7 o cualquiera de los edemas observados en los ratones que recibieron irradiación láser normal a los vasos, lo que indica que el láser no tuvo ningún efecto adverso. Tener estos controles es esencial, especialmente si se utilizarán configuraciones láser más altas para garantizar que la lesión que se está modelando sea una representación precisa del daño deseado8.
El modelo de ratón RVO se puede aplicar para estudiar otras enfermedades que resultan de lesiones hipóxico-isquémicas en la retina y el cerebro, como la retinopatía diabética, la retinopatía del prematuro y el accidente cerebrovascular. Además, puede servir como modelo para estudiar las vías de señalización relevantes para el desarrollo de lesiones vasculares y probar posibles tratamientos que mejoren la neurodegeneración en el sistema nervioso central. La optimización adaptada en este informe puede limitar la variabilidad en el modelo de RVO de ratón y arrojar luz sobre la fisiopatología de RVO.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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