Summary
Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.
Abstract
I modelli murini di occlusione venosa retinica (RVO) sono spesso utilizzati in oftalmologia per studiare il danno ipossico-ischemico nella retina neurale. In questo rapporto, viene fornito un metodo dettagliato che evidenzia i passaggi critici con raccomandazioni per l'ottimizzazione per ottenere tassi di occlusione costantemente efficaci in diversi ceppi di topi geneticamente modificati. Il modello murino RVO consiste principalmente nella somministrazione endovenosa di un colorante fotosensibilizzante seguito da fotocoagulazione laser utilizzando un microscopio di imaging retinico collegato a un laser a guida oftalmica. Tre variabili sono state identificate come determinanti della coerenza dell'occlusione. Regolando il tempo di attesa dopo la somministrazione del bengala rosa e bilanciando la linea di base e l'uscita laser sperimentale, la variabilità tra gli esperimenti può essere limitata e un tasso di successo più elevato di occlusioni raggiunto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le malattie della retina caratterizzate da edema retinico e lesioni ipossico-ischemiche. Inoltre, poiché questo modello induce lesioni vascolari, può anche essere applicato per studiare la neurovascolarizzazione, la morte neuronale e l'infiammazione.
Introduction
L'occlusione venosa retinica (RVO) è una malattia vascolare retinica comune che ha colpito circa 28 milioni di persone in tutto il mondo nel 20151. La RVO porta al declino della vista e alla perdita negli adulti e negli anziani in età lavorativa, rappresentando una malattia pericolosa per la vista in corso che si stima aumenterà nel prossimo decennio. Alcune delle patologie distinte della RVO includono lesioni ipossico-ischemiche, edema retinico, infiammazione e perdita neuronale2. Attualmente, la prima linea di trattamento per questo disturbo è attraverso la somministrazione di inibitori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Mentre il trattamento anti-VEGF ha contribuito a migliorare l'edema retinico, molti pazienti affrontano ancora un declino della vista3. Per comprendere ulteriormente la fisiopatologia di questa malattia e per testare potenziali nuove linee di trattamento, è necessario costituire un protocollo modello murino RVO funzionale e dettagliato per diversi ceppi murini.
I modelli murini sono stati sviluppati implementando lo stesso dispositivo laser utilizzato nei pazienti umani, abbinato a un sistema di imaging scalato alla dimensione corretta per un topo. Questo modello murino di RVO è stato segnalato per la prima volta nel 2007 4 e ulteriormente stabilito da Ebneter e altri 4,5. Alla fine, il modello è stato ottimizzato da Fuma et al. per replicare le manifestazioni cliniche chiave della RVO come l'edema retinico6. Da quando il modello è stato segnalato per la prima volta, molti studi lo hanno impiegato utilizzando la somministrazione di un colorante fotosensibilizzante seguito dalla fotocoagulazione delle principali vene retiniche con un laser. Tuttavia, la quantità e il tipo di colorante che viene somministrato, la potenza del laser e il tempo di esposizione variano significativamente tra gli studi che hanno utilizzato questo metodo. Queste differenze possono spesso portare a una maggiore variabilità nel modello, rendendolo difficile da replicare. Ad oggi, non ci sono studi pubblicati con dettagli specifici sulle potenziali strade per la sua ottimizzazione.
Questo rapporto presenta una metodologia dettagliata del modello murino RVO nel ceppo C57BL/6J e un ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 knockout (iEC Casp9KO) con un background C57BL/6J e di rilevanza per la patologia RVO come ceppo di riferimento per un topo geneticamente modificato. Uno studio precedente aveva dimostrato che l'attivazione non apoptotica della caspasi-9 endoteliale istiga l'edema retinico e promuove la morte neuronale8. L'esperienza nell'uso di questo ceppo ha aiutato a determinare e fornire informazioni su potenziali modifiche per personalizzare il modello murino RVO, che può essere applicabile ad altri ceppi geneticamente modificati.
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Protocol
Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.
NOTA: Tutti gli esperimenti hanno utilizzato topi maschi di due mesi che pesavano circa 20 g.
1. Preparazione e somministrazione di tamoxifene per l'ablazione genetica inducibile di geni floxati
NOTA: Il diametro dei vasi retinici può essere influenzato dal peso dell'animale. Assicurati che tutti gli animali utilizzati per un esperimento abbiano pesi simili.
- Diluire il tamoxifene in olio di mais ad una concentrazione di 20 mg/ml.
NOTA: Il tamoxifene è un tossico ed è sensibile alla luce. Proteggere dalla luce, ad esempio, con un foglio di alluminio. - Vortice la soluzione per un paio di secondi.
- Lasciare in forno a 55 °C per 15 min.
NOTA: Assicurarsi che il tamoxifene si sia sciolto completamente. Potrebbe essere necessario un ulteriore vortice. - Conservare la soluzione a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
- Utilizzare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G per l'iniezione di tamoxifene. Pulire l'area di iniezione con etanolo al 70%. Somministrare 2 mg di tamoxifene (100 μL da 20 mg/ml) per via intraperitoneale (IP) una volta al giorno per il tempo stabilito secondo la specifica linea Cre inducibile.
- Concedere due giorni di riposo per gli animali prima di iniziare gli esperimenti.
2. Preparazione di reagenti per fotocoagulazione laser
- Rosa bengala
NOTA: Il bengala rosa è sensibile alla luce. Conservare al buio fino all'uso e preparare fresco per ottenere i migliori risultati.- Preparare il bengala rosa diluendolo a 5 mg/ml in soluzione salina sterile e filtrarlo attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm.
- Preparare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G con rosa bengala.
- Ketamina/xilazina
- Diluire ketamina e xilazina in soluzione salina sterile di conseguenza per le seguenti concentrazioni: ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).
- Carprofen
- Diluire il carprofen a 1 mg/ml in soluzione salina sterile.
- Preparare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G con carprofene.
- Soluzione salina sterile
- Preparare una siringa da 5 mL dotata di un ago da 26 G con soluzione salina sterile.
3. Configurazione laser
- Maneggiare delicatamente il cavo in fibra ottica e collegarlo alla scatola di controllo laser e all'adattatore laser del microscopio di imaging retinico.
- Accendere la scatola della lampada del microscopio per imaging retinico.
- Accendere il computer e aprire il programma di imaging.
- Regolare il bilanciamento del bianco utilizzando un foglio di carta bianca e mettendolo davanti all'occhio del mouse e facendo clic su Regola nel programma di imaging.
- Accendere la scatola di controllo laser ruotando la chiave e seguendo le istruzioni sullo schermo della scatola di controllo laser.
NOTA: Il laser utilizzato in questo esperimento è di classe 3B e può causare danni agli occhi. Indossare occhiali protettivi durante l'utilizzo del laser. - Verificare la potenza laser di base.
- Utilizzare un misuratore di potenza laser.
- Regolare lo schermo della scatola di controllo laser sui seguenti parametri: 50 mW e 2.000 ms.
- Accendere il laser e posizionare il misuratore di potenza davanti all'oculare.
NOTA: assicurarsi che la luce del microscopio sia spenta durante il test della potenza laser di base. - Premere il pedale dell'interruttore a pedale per attivare il laser.
- Puntare alla lettura della potenza del laser di 13-15 mW.
NOTA: La lettura della potenza laser determinerà la percentuale di successo per le occlusioni venose retiniche. Se la lettura della potenza del laser è troppo bassa, è possibile regolare la potenza e il tempo di esposizione del laser. Si veda la tabella 1 per le raccomandazioni.
- Regolare la potenza del laser sperimentale impostando lo schermo della scatola di controllo laser per i seguenti parametri: 100 mW, 1.000 ms.
- Spegnere il laser.
NOTA: per sicurezza e per evitare il surriscaldamento, è meglio tenere il laser spento tra i mouse.
4. Iniezione della vena della coda di topo di rosa bengala
- Versare 300 ml di acqua in un becher da 500 ml.
- Riscaldare il becher in un forno a microonde per 1 minuto.
- Metti una garza nell'acqua calda nel becher.
- Metti il mouse in un sistema di ritenuta.
- Premere delicatamente la garza nella coda del topo e cercare le vene dilatate. Disinfettare il sito di iniezione usando una salvietta imbevuta di alcool dopo la dilatazione dell'acqua calda.
- Inserisca l'ago nel sito di iniezione e tiri la siringa per assicurarsi di essere nella vena. Quindi, iniettare la vena della coda del topo, somministrando la quantità corretta in base al peso dell'animale (37,5 mg / kg). Applicare pressione sul sito di iniezione per evitare ematoma o sanguinamento. Cancella il sito.
- Rilasciare il mouse dal sistema di ritenuta e riportarlo nella gabbia.
- Lasciare circolare 8 minuti affinché il bengala rosa circoli prima dell'iniezione di anestetici.
NOTA: Questo fornirà un totale di 10 minuti tra l'iniezione di rose bengala e l'irradiazione laser.
5. Occlusione delle vene principali
- Accendere la piattaforma del mouse riscaldata.
- Aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide in ciascun occhio.
- Iniettare 150 μL di anestetici, ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) IP.
NOTA: durante questa procedura, al mouse sono state somministrate due iniezioni IP. Quindi, i lati erano alternati. L'iniezione IP per l'anestesia è stata somministrata nel quadrante addominale inferiore destro e la soluzione salina è stata iniettata nel quadrante addominale inferiore sinistro. Si raccomanda di tirare la siringa prima dell'iniezione per assicurarsi che l'ago sia nell'addome e non negli organi. - Pizzicare l'animale per determinare la profondità dell'anestesia e attendere fino a quando non risponde.
- Aggiungere una goccia di proparacaina cloridrato per occhio (analgesico).
- Aggiungi un unguento gel a entrambi gli occhi.
- Iniettare 150 μL di carprofen per via sottocutanea tra le orecchie.
- Posizionare il mouse sulla piattaforma.
- Regolare la piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata.
- Conta le vene retiniche e scatta un'immagine del fondo.
NOTA: Le vene retiniche sono più scure e più larghe delle arterie. Vene e arterie si alternano; Tuttavia, a volte può esserci un'arteria ramificata vicino al nervo ottico e, quindi, due arterie adiacenti. - Accendere il laser e puntare verso una vena retinica a circa 375 μm dal disco ottico.
- Irradiare il recipiente premendo l'interruttore a pedale e spostando leggermente il raggio laser fino a 100 μm. Ripetere questo passaggio tre volte e spostare il raggio laser dopo ogni impulso in modo che l'irradiazione non sia focalizzata in un punto.
- Ripetere l'irradiazione su altri vasi principali per ottenere 2-3 occlusioni.
6. Stabilire il numero di vene occluse al giorno 0
- Spegnere la lampada dopo aver irradiato i recipienti e attendere 10 minuti.
NOTA: L'esposizione alla luce può causare danni alla retina e infiammazione; Spegnere la lampada durante il tempo di attesa per ridurre al minimo l'esposizione7. - Riaccendere la lampada e contare il numero di vene occluse.
- Prendi un'immagine del fondo.
7. Assistenza post-vendita
- Iniettare 1 mL di IP salino sterile.
NOTA: vedere i dettagli dell'iniezione IP nel paragrafo 5, punto 3. - Aggiungere colliri lubrificanti su entrambi gli occhi.
- Aggiungi un unguento gel a entrambi gli occhi.
- Guarda il topo mentre si riprende dall'anestesia e non restituirlo alla gabbia con gli altri animali fino a quando non si è completamente ristabilito. Carprofen (5 mg/kg) può essere somministrato giornalmente fino a 2 giorni dopo la procedura. Se applicato agli esseri umani, il dolore non è un sintomo di RVO.
NOTA: Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non si riprendono completamente dall'anestesia.
8. Valutazione dell'edema retinico mediante tomografia a coerenza ottica (OCT)
NOTA: questo passaggio può essere eseguito nel punto di interesse dello sperimentatore. Il picco di edema retinico per un topo C57BL / 6J è 1 giorno dopo la procedura RVO. Questo punto temporale può variare a seconda dello sfondo del mouse.
- Accendere la scatola luminosa del microscopio per imaging retinico, la macchina OCT e la piattaforma del mouse riscaldata.
- Il giorno dopo l'occlusione, seguire i passaggi da 5.2 a 5.7 per preparare l'animale.
- Aprire i programmi software di imaging e dello Strumento di personalizzazione di Office.
- Nel programma dello Strumento di personalizzazione di Office regolare la spinta su 5.
- Prendi OCT a 75 μm distali dalla bruciatura o 4 clic.
- Prendere immagini OCT in quattro quadranti della retina.
- Analizzare le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office utilizzando il software di tracciamento.
- Confrontare lo spessore retinico delle misure pre-irradiate con 1 giorno dopo RVO o nel punto di interesse temporale.
NOTA: Quando si analizzano i dati, prendere in considerazione il numero di vene irradiate in quanto ciò può influenzare lo sviluppo di edema retinico. Gli animali vengono quindi eutanizzati somministrando anestetico seguito da un intervento chirurgico di perfusione non di sopravvivenza.
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Representative Results
Il modello murino RVO mira a raggiungere con successo occlusioni nelle vene retiniche, portando a lesioni ipossico-ischemiche, rottura della barriera retinica del sangue, morte neuronale ed edema retinico8. La Figura 1 mostra una sequenza temporale dei passaggi per garantire la riproducibilità, uno schema del progetto sperimentale e delinea i passaggi che possono essere ulteriormente ottimizzati a seconda delle domande sperimentali. I tre passaggi principali che possono essere modificati sono il tempo di attesa dopo la somministrazione del bengala rosa, la potenza laser di base e l'uscita laser sperimentale. In questo rapporto, i topi C57BL / 6J, così come i compagni di cucciolata WT e KO di una linea murina knockout inducibile di cellule endoteliali caspasi-9 (iEC Casp9), sono stati utilizzati per determinare le impostazioni ottimali su diversi ceppi.
Il tempo di attesa dall'iniezione di rose bengala all'irradiazione laser può alterare il successo della fotocoagulazione nelle vene. Un tempo di attesa troppo breve può comportare una bassa concentrazione di rosa bengala all'interno delle vene, mentre un tempo di attesa troppo lungo può portare alla rimozione del bengala rosa dalla circolazione retinica. Entrambe le situazioni possono portare a scarsa fotocoagulazione e occlusioni infruttuose. Durante il test del numero di occlusioni ottenute immediatamente dopo l'irradiazione laser, il confronto tra gli animali che sono stati laserati 10 e 20 minuti dopo la somministrazione di rose bengala ha rivelato che non vi erano differenze nel numero di occlusioni raggiunte (Figura 2B). Tuttavia, il numero di occlusioni sostenute fino a 1 giorno dopo RVO è diminuito significativamente negli animali che sono stati laserati 20 minuti dopo la somministrazione di rosa bengala indipendentemente dal genotipo. Questo risultato suggerisce che quando si studia la lesione acuta indotta da RVO, il tempo di attesa dopo la somministrazione di rose bengala può influire sulla stabilità dell'occlusione. La riperfusione precoce delle vene (prima di 24 ore dopo l'infortunio) potrebbe influire sullo sviluppo dell'edema retinico e, pertanto, dovrebbe essere controllata determinando il corretto tempo di attesa dalla somministrazione del bengala rosa all'irradiazione laser.
In linea di principio, la fotocoagulazione di successo che porta all'occlusione è guidata dalla potenza del laser. Sebbene questa sia una parte così importante del processo, è anche una delle maggiori fonti di variabilità nel modello e dovrebbe essere ottimizzata per la coerenza. Per fare ciò, si consiglia di misurare l'uscita laser durante la configurazione prima che i topi vengano iniettati con il bengala rosa. L'uscita consigliata per la potenza laser di base è compresa tra 13,0 e 15,0 mW. Una bassa potenza laser di base, come 11,5 mW, senza modificare la potenza sperimentale (100 mW), non ha prodotto occlusioni, come mostrato nella Figura 3. Al contrario, un'uscita laser di base di 13,5 mW con una potenza sperimentale di 100 mW ha portato a occlusioni di successo. Nei casi in cui l'uscita laser era inferiore a 13,0 mW, la potenza sperimentale è stata aumentata a 110 mW per ottenere le stesse occlusioni di successo come con un'uscita laser di base più elevata. Tipicamente, 100 mW è la potenza sperimentale standard; tuttavia, se l'uscita laser è inferiore a 13,0 mW, può essere compensata modificando la potenza sperimentale con gli intervalli raccomandati nella Tabella 1.
Quattro tipi principali di occlusioni sono stati notati per verificarsi dopo la fotocoagulazione laser delle vene. Questi tipi di occlusioni sono riassunti in Figura 4A e sono stati classificati in base alla quantità di flusso sanguigno; vasi completamente occlusi (nessun flusso sanguigno), vasi parzialmente occlusi (per lo più bloccati con flusso occasionale), parzialmente riperfusi (flusso sanguigno costante ininterrotto con ostacolo) e vasi completamente riperfusi (nessuna ostruzione evidente di sorta). Per indagare se i tipi di occlusioni cambiano in base al genotipo e determinare il tempo trascorso per stato di occlusione, sono stati valutati video di 10 minuti dopo l'irradiazione laser. Questa valutazione ha contribuito a determinare che la vascolarizzazione irradiata dei topi iEC Casp9 trascorre più tempo in stati parzialmente riperfusi e parzialmente occlusi rispetto a C57BL6/J, che trascorrono più tempo in stati completamente occlusi (Figura 4B).
La Figura 5 mostra come lo stato di occlusione dei vasi cambi rapidamente entro i primi 10 minuti dopo la fotocoagulazione laser. Una volta trascorsi questi 10 minuti iniziali, le occlusioni si stabilizzano e vengono mantenute fino a un punto temporale di 24 ore. Pertanto, per valutare il numero iniziale preciso di occlusioni per occhio, si consiglia di attendere 10 minuti dopo l'irradiazione. Una precedente valutazione di questo modello ha determinato che la maggior parte delle occlusioni si riperfonda entro 8 giorni dopo l'irradiazione8; Tuttavia, il tasso di occlusioni che si riperfondano al giorno può variare a seconda del ceppo e deve essere determinato in ciascun modello sperimentale. Il modello qui presentato è di lesione acuta e destinato ad essere utilizzato per comprendere i percorsi che portano all'edema, che si sviluppa entro 24 ore dopo le occlusioni. Un'altra caratteristica della RVO sono le emorragie a forma di fiamma, che possono essere osservate a 24 ore dopo l'infortunio, come illustrato nella Figura 5.
Il follow-up a 24 ore dopo RVO può rivelare altre patologie oftalmiche che possono verificarsi a seguito del metodo RVO. Alcuni includono ma non sono limitati a emorragia sottoretinica (caratterizzata da patch di sangue continuo), distacco di retina, retina completamente ischemica (nessun flusso sanguigno nelle vene e nelle arterie) e cataratta. La figura 6 mostra le immagini del fondo oculare con il corrispondente OCT come esempi di questi, tranne negli occhi in cui si formano la cataratta (Figura 6F), poiché l'OCT non può essere eseguito in presenza di una cataratta. La figura 6A mostra esempi di come appaiono come riferimento un'immagine del fondo oculare e un OCT di un occhio illeso.
La principale patologia morfologica di RVO in questo modello è l'edema retinico. Per valutare il livello di edema retinico, si raccomanda di prendere immagini OCT prima del giorno della procedura RVO per una lettura basale e nel punto di interesse temporale. La figura 7 mostra la quantificazione OCT dell'edema retinico negli occhi feriti. Un'altra misura utilizzata per determinare lo stato degli strati neuronali è valutare la disorganizzazione degli strati interni della retina (DRIL). Questa è una misura utilizzata in ambito clinico che rappresenta la non perfusione capillare, un altro segno distintivo di RVO 5,9,10. Un esempio di questa valutazione può essere trovato nella figura 7B. La figura 7C mostra un esempio di immagine OCT con le etichette corrispondenti per ogni strato retinico.
Figura 1: Sequenza temporale e schema del modello murino RVO . (A) Cronologia degli eventi dalla somministrazione del rosa bengala all'imaging delle vene occluse. (B) Rappresentazione riassuntiva del metodo per ottenere con successo la fotocoagulazione venosa retinica. Le caselle rosse rappresentano passaggi importanti nel processo che sono altamente variabili e che possono essere ottimizzati per modello di mouse e domanda di interesse. (C) Le vene principali della retina (V) sono più larghe e più scure rispetto alle arterie (A). Ogni vena principale sarà irradiata con un laser guidato di 532 nm, dimensione dello spot 50 μm, potenza 100 mW, durata 1 s, energia totale 0,3 J ed esposizione radiante 15278,87 J / cm2, ad una distanza media di 375 μm dal nervo ottico. (D) L'applicazione laser provoca una bolla di vaporizzazione visibile sull'imaging del fondo oculare di circa 150 μm e copre il <4% dell'area retinica totale. I numeri rappresentano la posizione e la direzione di movimento suggerite (frecce) del raggio laser durante l'irradiazione dei vasi. Abbreviazioni: A = arteria; V = vena; ON = nervo ottico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Il tempo di foto-occlusione relativo alla somministrazione del rosa bengala è fondamentale per il successo della fotocoagulazione . (A) Immagini retiniche del fondo oculare di iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO foto-occluse 10 e 20 minuti dopo la somministrazione di rose bengala. I cerchi bianchi rappresentano vene che hanno avuto occlusioni di successo. (B) Numero di occlusioni immediatamente dopo l'irradiazione (0 ore) e 1 giorno dopo l'irradiazione per 10 minuti e 20 minuti dopo l'iniezione di genotipi combinati nel Bengala rosa. Il test t di Welch, le barre di errore indicano SEM. (C) Numero di occlusioni separate per genotipo. ANOVA bidirezionale e test LSD di Fisher; le barre di errore indicano SEM. Abbreviazioni: WT = wild-type; KO = knockout; SEM = errore standard della media; ANOVA = analisi della varianza; LSD = differenza meno significativa; ns = non significativo; P-RVO = occlusione venosa post retinica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: La misurazione della linea di base e l'output laser sperimentale sono passaggi critici per una fotocoagulazione di successo. Immagini del fondo oculare retinico di iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 10 minuti dopo la fotocoagulazione; Foto-occluso con diversi livelli di uscita laser sperimentali e di base. L'uscita laser a bassa linea di base può essere compensata con un'uscita laser sperimentale (12,8 mW, 110 mW). I cerchi bianchi rappresentano vene che hanno avuto occlusioni di successo. Abbreviazioni: WT = wild-type; KO = knockout. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Il metodo RVO produce diversi tipi di occlusioni. (A) Immagini retiniche del fondo oculare di C57BL/6J, iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 10 minuti dopo la fotocoagulazione con diversi tipi di occlusioni: completamente occlude, parzialmente occluded, parzialmente riperfuse e completamente riperfuse. Gli inserti mostrano una visione focalizzata di una vena che ha provocato un tipo specifico di occlusione dopo la fotocoagulazione. (B) Quantificazione della percentuale di vene occluse nei diversi stati di occlusione per ciascun genotipo durante i primi 10 minuti dopo l'irradiazione. I video di dieci minuti sono stati valutati da due ricercatori, in cieco ai genotipi, che hanno assegnato numeri ai diversi stati di occlusione (completamente occlusi (-2), parzialmente occlusi (-1), completamente riperfusi (2) e parzialmente riperfusi (1)) per durata. Abbreviazioni: RVO = occlusione venosa retinica; WT = wild-type; KO = knockout. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Cronologia delle occlusioni dopo RVO. Immagini retiniche del fondo oculare di C57BL/6J, iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min e 24 h dopo irradiazione laser. I primi 10 minuti sono critici per lo stato delle occlusioni e possono cambiare rapidamente. Dopo i primi 10 minuti, le occlusioni sono stabili fino ad almeno 24 ore. I cerchi bianchi rappresentano le vene che hanno avuto occlusioni di successo e le punte di freccia gialle raffigurano emorragie a forma di fiamma. Abbreviazioni: RVO = occlusione venosa retinica; WT = wild-type; KO = knockout. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Diverse patologie oftalmiche possono verificarsi dopo RVO. (A-E) mostrano immagini retiniche del fondo oculare e OCT corrispondente. (A) Un esempio di un occhio illeso che non ha subito il processo RVO. (B) Emorragia sottoretinica che mostra fuoriuscita di sangue dai vasi nell'immagine del fondo oculare. (C) Distacco di retina visto dalla piega sfocata nel fondo oculare e dal sollevamento della retina nell'OCT. (D) Edema eccessivo mostrato da una grande quantità di gonfiore nell'OCT. (E) Un occhio completamente ischemico con flusso sanguigno completamente compromesso con conseguente retina bianca. (F) Due diversi esempi di cataratta oculare in cui non è stato possibile ottenere un'immagine chiara del fondo oculare e un PTOM. Barre scala OCT: 100 μm. Abbreviazioni: RVO = occlusione venosa retinica; OCT = tomografia a coerenza ottica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Quantificazione delle immagini OCT. (A) Esame dello spessore dello strato e del DRIL in occhi di controllo non laserati e occhi che hanno attraversato la procedura RVO. Misurazioni GCL, IPL, INL, OPL, ONL, segmento esterno e retina intera. Statistiche, test di Mann-Whitney p-valori: GCL: 0.0070, IPL: 0.0205, INL: <0.0001, OPL: 0.0014, ONL: 0.5582, Segmento esterno: 0.44852, Retina intera:0.0019. Le barre di errore mostrano SEM. (B) Quantificazione DRIL misurata dalle immagini OCT da controlli non laserati e topi RVO WT e KO iEC Casp9, nonché topi c57/BL6J con RVO. Le barre di errore mostrano SEM. (C) Esempio di OCT con le etichette di ogni strato retinico. Abbreviazioni: DRIL = Disorganizzazione degli strati retinici interni; RVO = occlusione venosa retinica; WT = wild-type; KO = knockout; GCL = strato cellulare ganglionario; IPL = strato plessiforme interno; INL = strato nucleare interno; OPL = strato plessiforme esterno; ONL = strato nucleare esterno; SEM = errore standard della media; OCT = tomografia a coerenza ottica; ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Uscita laser di base (mW) | Uscita laser sperimentale consigliata (mW) | Tempo di esposizione raccomandato (ms) |
| <11.0 o >15.0 | Spegnere il laser e regolare la fibra all'estremità collegata alla scatola di controllo laser. Svitarlo e spostarlo leggermente verso destra o sinistra. Misurare nuovamente il risultato, fino a raggiungere un valore più alto o più basso. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tabella 1: L'uscita laser a bassa linea di base può essere compensata con un'uscita laser sperimentale più elevata. Variazioni nell'output laser di base e nell'output laser sperimentale consigliato e nel tempo di esposizione.
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Discussion
Il modello RVO murino fornisce una strada per comprendere ulteriormente la patologia RVO e per testare potenziali terapie. Mentre il modello RVO del mouse è ampiamente utilizzato sul campo, vi è la necessità di un protocollo dettagliato corrente del modello che affronti la sua variabilità e descriva l'ottimizzazione del modello. Qui, forniamo una guida con esempi dall'esperienza su ciò che può essere modificato per ottenere i risultati più coerenti in una coorte di animali da esperimento e fornire dati affidabili.
I due elementi più essenziali del modello murino RVO sono l'uscita laser e l'iniezione endovenosa riuscita del colorante fotosensibilizzante. Per produrre la potenza necessaria per indurre la coagulazione quando il laser è puntato su una particolare vena, l'uscita laser deve essere regolata correttamente. Mentre questo può essere ottenuto utilizzando le tecniche suggerite nel metodo, è importante considerare le differenze nella configurazione del sistema di ciascun laboratorio. Le variazioni del cavo in fibra ottica e il modo in cui è sistemato in relazione all'apparecchiatura e alla temperatura ambiente sono alcune delle variabili che possono spiegare la bassa potenza laser. Si consigliano accordature indipendenti alla configurazione del sistema per aumentare l'uscita laser.
Tuttavia, questo sforzo è inutilizzabile senza una tecnica di vena caudale adatta per fornire il colorante fotosensibilizzante. Le iniezioni di vene della coda possono essere difficili da raggiungere ed è un'abilità che richiede tempo per svilupparsi. Le iniezioni scadenti possono causare nessuna occlusione; in questo caso, rose bengala può essere somministrato tramite IP. La somministrazione del rosa bengala tramite IP è stata utilizzata per modellare la RVO, ma con un tempo di irradiazione laser più lungo (3 s) e una maggiore concentrazione di bengala rosa (40 mg/ml)11. Per limitare l'irradiazione laser prolungata e colpire specificamente la vascolarizzazione, la venatura della coda è la modalità di somministrazione preferita.
Questo modello potrebbe anche essere realizzato utilizzando altri coloranti fotoattivabili come l'eosina Y e la fluoresceina di sodio12,13,14, sebbene il bengala rosa sia il colorante fotoattivabile 4,5,6,8 più utilizzato. Tutti i coloranti hanno dimostrato di produrre le prime caratteristiche della malattia clinica come l'emorragia retinica e l'edema retinico15. I coloranti fotoattivabili hanno dimostrato di non avere effetti avversi sugli animali, mostrando quindi una tossicità sistemica insignificante15,16. Va inoltre notato che il colorante scelto dovrebbe avere un assorbimento massimo compatibile con la lunghezza d'onda del laser utilizzato. Il rosa Bengala ha un'eccitazione a 525 nm17, fluoresceina di sodio a 475-490 nm 18 e Y eosin a 490 nm19.
Le principali fonti di variabilità in questo modello sono il tempo di foto-occlusione relativo alla somministrazione del bengala rosa e l'uscita laser basale e sperimentale. Mentre la Figura 2 mostra punti temporali di 10 e 20 minuti per la foto-occlusione, è stato eseguito anche un piccolo numero di esperimenti di 5 e 15 minuti (dati non mostrati), producendo occlusioni che non erano coerenti come il punto temporale di 10 minuti. Pertanto, 10 minuti sono stati scelti come tempo di attesa ottimale tra la somministrazione di rose bengala e la foto-occlusione per questo metodo. Tuttavia, gli studi hanno riportato che RVO può anche essere indotto già 3 minuti dopo la somministrazione di rose bengala5. Un altro modo per determinare il tempo di attesa ottimale specifico del ceppo del topo dal bengala rosa alla foto-occlusione è monitorare la concentrazione relativa di bengala rosa utilizzando la modalità di imaging a fluorescenza con un filtro tetrametilrodamina (TRITC). Tuttavia, il protocollo qui descritto può essere eseguito utilizzando microscopi di imaging retinico che non dispongono di un filtro TRITC.
L'altra fonte di elevata variabilità in questo modello è l'uscita laser di base. Poiché i livelli giornalieri di uscita laser di base possono essere molto diversi, è importante valutare i livelli prima di ogni esperimento. La standardizzazione dell'output laser di base tra gli studi può aiutare a potenziare ed espandere l'uso del modello murino RVO. La riregolazione del cavo in fibra può essere sufficiente per modificare i livelli della linea di base; tuttavia, se non è possibile raggiungere una misura di 13,0 mW, la Tabella 1 fornisce una guida per la compensazione utilizzando la potenza sperimentale. È importante notare che, poiché la retina è un sistema chiuso, determinare la frazione di vene occluse (il numero di vene occluse diviso per il numero di vene irradiate) è essenziale per comprendere, controllare e prevedere la gravità del danno nel modello RVO. L'analisi precedente delle letture danneggiate (DRIL e spessore della retina) era correlata alla frazione di vene occlusa e all'atrofia retinica prevista a 8 giorni dopo RVO8. Pertanto, la frazione di vene occluse dovrebbe essere considerata e valutata. Non è ancora chiaro come altri stati intermedi di occlusione, come parzialmente riperfusi, parzialmente occlusi o vene che una volta erano occluse e riperfuse di 10 minuti, contribuiscano allo sviluppo di edema retinico e atrofia.
Ulteriori studi sugli occhi con questi tipi di occlusioni possono aiutare a indagare se un'occlusione sostenuta è necessaria per danni sostanziali o se anche occlusioni transitorie sono importanti in questo modello. A seconda della domanda sperimentale posta, diversi tassi di occlusione saranno ottimali. Un tasso di occlusione del 40-50% è ideale nella maggior parte dei casi, il che significa due o tre occlusioni in un occhio con sei vene. Ciò garantisce lesioni sostanziali, ma la retina è intatta e può essere sezionata per analisi immunoistochimiche e biochimiche.
Per determinare ciò, è rilevante distinguere la visione patologica di un'occlusione riuscita e rappresentativa della firma RVO. L'occlusione naturale presentata da RVO include emorragie a forma di fiamma 20 (da non confondere con l'emorragia sottoretinica), che possono essere osservate in questo modello24 ore dopo l'infortunio. Il modello RVO può anche portare a lesioni retiniche indesiderate (non distintive della patologia RVO) come quelle mostrate in Figura 6B-F, se i suoi parametri non sono controllati con cautela. Un approccio che può essere adottato per evitarli, oltre a regolare la concentrazione di rose bengala e la potenza laser sperimentale, è quello di smettere di irradiare i vasi che hanno una chiara formazione di un trombo dopo la prima o la seconda irradiazione.
Altri fattori da considerare quando si utilizza questo modello e si decide quali vene occludere sono il ceppo del topo e il diametro del vaso. Alcuni ceppi murini, come BALB/c, più comunemente noti come albini, sono suscettibili di danni leggeri21. Inoltre, hanno deficit dello sviluppo retinico che portano a difetti nella decussazione al chiasma ottico e acuità visiva22,23. Si raccomanda di valutare completamente l'integrità basale retinica e vascolare dei controlli non danneggiati per il ceppo murino scelto per gli studi RVO. Gli studi hanno dimostrato che la larghezza della vena può interferire con lo sviluppo di edema retinico e patologia della malattia24. Pertanto, animali di peso simile dovrebbero essere utilizzati per evitare ulteriori variabilità. I fattori di esclusione di quali occhi usare in uno studio dipenderanno anche dalla domanda sperimentale. Potrebbe essere saggio includere qualsiasi occhio che una volta era occluso, anche se è riperfuso nel punto temporale di follow-up per la segnalazione. Tuttavia, se si desiderano occlusioni stabili, questi occhi sarebbero esclusi. La figura 6 mostra esempi di possibili criteri di esclusione o occhi che potrebbero essere utilizzati per l'analisi patologica.
Per dimostrare che queste impostazioni laser non stavano causando danni e gli effetti osservati erano veramente guidati dalle occlusioni stesse, sono stati effettuati controlli fittizi negli studi precedenti8. I topi fittizi ricevevano ancora un'iniezione nella vena caudale di bengala rosa, ma venivano irradiati nello spazio parenchimale tra i vasi principali invece di essere irradiati sulla vena. Questo è stato un passo importante per garantire che il modello replicasse le lesioni RVO osservate nei pazienti invece di ferire semplicemente il tessuto con un laser. Questi sham non mostrano alcuna attivazione di caspasi-9 o -7 o di qualsiasi edema osservato nei topi che hanno ricevuto una normale irradiazione laser ai vasi, indicando che il laser non ha avuto effetti avversi. Avere questi controlli è essenziale, soprattutto se verranno utilizzate impostazioni laser più elevate per garantire che la lesione modellata sia una rappresentazione accurata del danno desiderato8.
Il modello murino RVO può essere applicato per studiare altre malattie che derivano da lesioni ipossico-ischemiche nella retina e nel cervello come la retinopatia diabetica, la retinopatia della prematurità e l'ictus. Inoltre, può servire come modello in cui studiare le vie di segnalazione rilevanti per lo sviluppo di lesioni vascolari e testare potenziali trattamenti che migliorano la neurodegenerazione nel sistema nervoso centrale. L'ottimizzazione personalizzata in questo rapporto può limitare la variabilità nel modello RVO murino e far luce sulla fisiopatologia della RVO.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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