Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה וסקולרית עמוקה בעין עם אולטרסאונד משופר בזרימה

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62986
Automatic Translation
1,2, 3
1Aarhus Institute of Advanced Studies, Aarhus University, 2Zoophysiology, Department of Biology, Aarhus University, 3Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

אנו מציגים טכניקת אולטרסאונד לא פולשנית ליצירת אנגיוגרפיות תלת מימדיות בעין ללא שימוש בחומרי ניגודיות.

Abstract

הרשתית בתוך העין היא אחת הרקמות התובעניות ביותר בגוף ולכן דורשת שיעורים גבוהים של אספקת חמצן מאספקת דם עשירה. הלמינה הנימית של הכורואיד קוים את פני השטח החיצוניים של הרשתית והוא המקור השולט של חמצן ברוב הרשתיות החוליות. עם זאת, מיטת כלי דם זו מאתגרת לתמונה עם טכניקות אופטיות מסורתיות בשל מיקומה מאחורי הרשתית סופגת האור. כאן אנו מתארים טכניקת אולטרסאונד בתדר גבוה עם שיפור זרימה עוקב למיטות כלי דם עמוקות תמונה (0.5-3 ס"מ) של העין עם רזולוציה מרחבית גבוהה. שיטה לא פולשנית זו פועלת היטב במינים עם תאי דם אדומים מגורענים (מודלים שאינם יונקים ובעלי חיים עובריים). זה מאפשר דור של אנגיוגרפיות תלת מימדיות לא פולשניות ללא שימוש בחומרי ניגודיות, והוא אינו תלוי בזוויות זרימת הדם עם רגישות גבוהה יותר מאשר טכניקות הדמיית אולטרסאונד מבוססות דופלר.

Introduction

חילוף החומרים הגבוה ברשתית החוליות מטיל טרייד-אוף מהותי בין שני צרכים מנוגדים; קצבי זרימת דם גבוהים ונתיב אור נטול כלי דם. כדי למנוע הפרעה חזותית של זלוף תאי דם אדומים, הרשתית של כל בעלי החוליות מקבלת חמצן וחומרים מזינים באמצעות גיליון של נימים מאחורי קולטני האור, choriocapillaris1,2,3. עם זאת, מקור יחיד זה של חומרים מזינים וחמצן מטיל מגבלה דיפוזיה לעובי של הרשתית 4,5, כל כך הרבה מינים פעילים חזותית יש מגוון רחב של רשתות כלי דם משוכללים כדי לספק אספקת דם נוספת זה איבר פעיל מטבולית6. מיטות כלי דם אלה כוללות כלי דם המזיפים את שכבות הרשתית הפנימית ביונקים וכמה דגים4,7,8,9,10, כלי דם בצד הפנימי (הפונה לאור) של הרשתית הנמצאים בדגים רבים, זוחלים וציפורים4,11,12,13, וסידורי כלי דם נגד של כורואיד הדגים, רט הכורואידית mirabile, המאפשרת ייצור של לחצים חלקיים חמצן סופר אטמוספרי14,15,16,16,17,18,19,20. למרות זאת, נתיבים לא-כרוידליים נוספים אלה לאספקת חומרים מזינים ברשתית ממלאים תפקיד חיוני בתדלוק הדרישות המטבוליות של ראייה מעולה4, האנטומיה התלת-ממדית של מבני כלי דם אלה מובנת היטב, ומגבילה את הבנתנו את האבולוציה המורפולוגית של העין החוליתנית.

באופן מסורתי, אספקת הדם ברשתית נחקרה באמצעות טכניקות אופטיות, כגון פונדוס עיניים. קטגוריה זו של טכניקות מספקת מידע לא הרסני בעל תפוקה גבוהה על אנטומיה של כלי דם שאינם כרוידיאליים ברזולוציה גבוהה21 ולכן משמשת בקלות לאבחון קליני של חריגות במבנה כלי הרשתית22. עם זאת, אפיתל הפיגמנט הרשתית סופג את האור המועבר ומגביל את עומק הראייה בטכניקות אופטיות אלה, ומספק מידע מופחת על מבנה ותפקוד choroidal ללא שימוש בחומר ניגודיות21. מגבלות עומק דומות מנוסות בטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT). טכניקה זו יכולה ליצור אנגיוגרפיות fundus ברזולוציה גבוהה באמצעות גלי אור על חשבון טכני של חדירת עומק23, בעוד הדמיית עומק משופרת OCT יכול לדמיין את הכורואיד על חשבון איכות הדמיה ברשתית24. הדמיית תהודה מגנטית מתגברת על המגבלות האופטיות של עיניים ו- OCT ויכולה למפות שכבות כלי דם ברשתית, אם כי ברזולוציה נמוכה25. היסטולוגיה וטומוגרפיה מיקרו-מחשבתית (μCT) שומרות על הרזולוציה הגבוהה של הטכניקות האופטיות ומספקות מידע על מורפולוגיה של כלי דם שלם-עין4, אך שתי הטכניקות דורשות דגימת עיניים ולכן אינן אפשריות במרפאה או במינים נדירים או בסכנת הכחדה. כדי להתגבר על חלק מהמגבלות של טכניקות הדמיית רשתית מבוססות אלה, המחקר כאן מציג פרוטוקול אולטרסאונד על בעלי חיים מרדימים, שבו תנועת הדם ממופה בסיליקו על סדרה של סריקות אולטרסאונד דו מימדיות מרווחות באותה מידה המשתרעות על פני עין שלמה על ידי יישום טכניקה דומה כפי שתואר בעבר להדמיה עוברית ולב וכלי דם26,27, 28 ובאנגיוגרפיה OCT29. גישה זו מאפשרת יצירת אנגיוגרפיות עיניים עמוקות תלת-ממדיות לא פולשניות ללא שימוש בחומר ניגודיות ופותחת אפיקים חדשים למיפוי התפלגות זרימת הדם בעין על פני מינים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול שלהלן בוצע באישור הפיקוח הדני לניסויים בבעלי חיים בתוך משרד המזון, החקלאות והדיג הדני, מינהל הווטרינריה והמזון הדני (היתר מספר 2016-15-0201-00835).

1. אמצעי הרדמה ואולטרסאונד

  1. להרדים את חיית המחקר.
    הערה: סוג ומינון של הרדמה מתאימה תלויים מאוד במינים. באופן כללי, הרדמה מבוססת טבילה כגון MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate מתנסולפוניק חומצה), בנזוקאין (אתיל 4-aminobenzoate), ו propofol (2,6-diisopropyl פנול) שימושיים דגים ודו-חיים אשר סופג בקלות את ההרדמה על זימים או עור (למשל, 0.05 מ"ג· L-1 בנזוקאין פורל קשת בענן). מגוון של תרכובות מומסות שניתן לנהל דרך הווריד, תוך שרירית, תוך שרירית, תוך-אפריטוני זמין עבור מי שפיר, כמו גם הרדמה על בסיס גז. אלפקסלון מנוהל תוך שרירית שימושי בזוחלים (למשל, 30 מ"ג-ק"ג-1 בלטאות), ואיזופלוראן המנוהל כגז שימושי בציפורים (למשל, 2% באוויר ליונים). עיין בספרות שפורסמה30,31,32 לקבלת סקירה מלאה של הרדמה זמינה בין מינים.
  2. בדוק רפלקסים בבעלי החיים כדי לאשר רמה אופטימלית של הרדמה. ודא כי החיה היא ללא תנועה לחלוטין במהלך ההליך כמו הליך אולטרסאונד משופרת זרימה רגישה רעש תנועה.
    1. הרדמה עמוקה מדי יכולה לשנות את דפוסי זרימת הדם, אז לנהל טיטרציה מינון בשלב ההפעלה של ניסוי.
    2. הגדל את מינון ההרדמה בשלבים ולבחון את זרימת הדם בעין בסיוע מצב בהירות פשוט (B-mode) אולטרסאונד.
      הערה: רמה אופטימלית של הרדמה מתקבלת כאשר החיה היא ללא תנועה (למעט נשימה) עם זרימת דם עינית גלויה.
  3. אם סוג /מינון של הרדמה אינו מתירני לתנועות נשימה, אז להבטיח אוורור נאות של החיה, למשל, באמצעות משאבת אוויר כדי לחמצן את המים עבור מינים מימיים או מכונת הנשמה עבור מינים נושמי אוויר.
  4. מקם את החיה בתנוחה המאפשרת גישה ישירה מלמעלה לעין.
    הערה: בהתאם למינים, זה יכול להיות במצב סופי או לרוחב. זה יכול להיות שימושי כדי לבנות התקן החזקה פשוט באמצעות חתיכה קטנה של מתכת לא תגובתית (למשל, נירוסטה) וגומיות רופפות (ראה איור 1).
  5. מניחים מדיום אולטרסאונד מתאים על העין של החיה. אם העפעפיים קנה המידה (אולטרסאונד אטום) לכסות את העין, ואז להזיז אותם בעדינות עם צמר גפן ספוגית.
    הערה: עבור מינים ימיים, אמצעי האולטרסאונד הטוב ביותר הוא מי טנק נקיים שבהם החיה בדרך כלל חיה. עבור מינים יבשתיים, כמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד מבטיח תנועות חופשיות והדמיה של מתמר אולטרסאונד (כלומר, בדיקה מערך ליניארי) על פני השטח כולו של העין. משחה וטרינרית על העין הנגדית נדרשת עבור מינים יבשתיים.

2. רכישת תמונה אולטרסאונד עינית 2D ו 3D

  1. מקם את המדיאלי מתמר אולטרסאונד לעין בכיוון הגב / הגחון או rostral / caudal בהתאם לכיוון התמונה הרצוי.
  2. במצב B, עם עומק שדה מרבי, דמיינו את החלק המדיאלי והעמוק ביותר של העין וודאו שכל מבני העניין גלויים בשדה התמונה.
    הערה: במינים מסוימים, העדשה הגבישית תופסת חלק גדול יחסית של הומור זגוגית, אשר עשוי לספוג את אולטרסאונד, במיוחד בתדרים גבוהים יותר.
  3. תרגם באיטיות את המתמר לכל צד בעת בדיקת התמונות בזמן אמת. ודא שכל מבני העניין גלויים בשדה התמונה; אם לא, עבור למתמר עם תדירות נמוכה יותר ועומק שדה גדול יותר.
    הערה: התדרים המרכזיים הבאים מאפשרים את עומק השדה המרבי הבא: 21 מגה-הרץ: 3 ס"מ, 40 מגה-הרץ: 1.5 ס"מ, 50 מגה-הרץ: 1 ס"מ (ראו טבלה 1). עם זאת, עומק מרבי זה של ערכי שדה יכול להיות נמוך משמעותית אם העין מכילה מסוידים או מבנים אטומים אולטרסאונד אחרים.
  4. התאם עומק תמונה, היסט עומק (מרחק מראש התמונה למבנה העניין), רוחב התמונה, כמו גם מספר ומיקום של אזורי מוקד כדי לכסות את אזור העניין הרצוי בכל שלושת הממדים המרחביים (לדוגמה, עומק תמונה של 1 ס"מ, היסט עומק 2 מ"מ, רוחב תמונה של 1 ס"מ, אזור מוקד אחד).
    הערה: למרות שמות ספציפיים של לחצנים המתאימים פרמטרים אלה עשוי להשתנות בין מערכות אולטרסאונד, רוב המערכות יהיו לחצנים עם שמות לוגיים עבור התאמות אלה. הגדרות פרמטר תמונה אלה משפיעות בדרך כלל על הטווח של רזולוציות זמניות אפשריות של רכישת אולטרסאונד.
  5. הגדר קצב פריימים בטווח של 50-120 מסגרות·s-1.
    הערה: הרזולוציה הזמנית (כלומר, מרווח הזמן בין סריקות B רצופות) חייבת להיות מספקת כדי להציג שונות גדולה בעוצמת הפיקסלים בכלי הדם המדומיים, כלומר, הרזולוציה הזמנית אינה יכולה להיות גבוהה מדי. מצד שני, כדי להשלים הקלטה תלת-ממדית מלאה של העין בזמן סביר, הרזולוציה הזמנית לא יכולה להיות נמוכה מדי. רזולוציה זמנית הנעה בין 50-120 מסגרות-1 מתאימה בדרך כלל להליך המשופר בזרימה ברוב המינים. על כמה מערכות אולטרסאונד, רזולוציה זמנית רצויה זו ניתן להשיג על ידי מעבר בין "הדמיה כללית" (רזולוציה מרחבית גבוהה / נמוכה זמנית) ו "קרדיולוגיה" (רזולוציה מרחבית נמוכה / רזולוציה זמנית גבוהה) מצבים.
  6. התאם רווח דו-ממדי לרמה (~ 5 dB), כך שמבנים אנטומיים נראים רק ברכישת מצב B רק כדי להגדיל את יחס האות לרעש בשחזור המשופר בזרימה הבאה.
  7. כדי להשיג תמונה דו-ממדית משופרת בזרימה במיקום פרוסה יחיד, תרגם את המתמר למיקום זה והמשיך בשלב 3.1.
  8. כדי לרכוש הקלטה תלת-ממדית של אזור מעניין שלם, למשל, הרשתית, תרגם את המתמר לקיצוניות אחת של אזור העניין.
    1. כדי לקבוע את המיקום המדויק של הקצה הקיצוני של אזור העניין, הגדל את הרווח הדו-ממדי בקצרה.
    2. לאחר השלמת מיקום המתמר הנכון, הפחת את הרווח הדו-ממדי לפני ההקלטה כדי להבטיח יחס אות לרעש מרבי בשחזור המשופר בזרימה לאחר מכן.
  9. עבור כל שלב (פרוסה) בהקלטה התלת-ממדית, רכשו ≥100 מסגרות (באופן מיטבי ≥1000 פריימים).
  10. באמצעות מיקרו-מניפולטור או מנוע מתמר מובנה, תרגם את המתמר על פני כל אזור העניין בשלבים של, למשל, 25 מיקרומטר או 50 מיקרומטר (זכור לציין את גודל הצעד) ולחזור על רכישת המסגרות ≥100 עבור כל שלב.
  11. המתת חסד של חיית המחקר על פי הנחיות הטיפול בבעלי חיים של המוסד.

3. שחזור תמונה משופר בזרימה

  1. יצא את ההקלטות להדמיה דיגיטלית ולתקשורת בפורמט קובץ של רפואה (DICOM) (מעט-אנדיאן).
  2. כדי להפיק תמונה אחת משופרת בזרימה המבוססת על ≥100 מסגרות (T) הקלטה של סינים, חשב את סטיית התקן ברמת הפיקסלים (STD(x,y)) באמצעות הנוסחה:
    Equation 1
    כאשר It(x,y) הוא עוצמת הפיקסל בקואורדינטת הפיקסלים (x,y) בזמן t, ו- Īt(x,y) הוא הערך הממוצע האריתמטי של I לאורך זמן.
  3. חזור על שלב 3.2 עבור כל פרוסה בהקלטה התלת-ממדית.
  4. כדי להפוך את תהליך חישוב STD ושחזור התמונה לאוטומטי עבור פרוסות מרובות בהקלטה תלת-ממדית, בצע פעולה זו במצב אצווה באמצעות, לדוגמה, ImageJ וקובץ המאקרו המשלים (קובץ משלים 1).
  5. שלבו את כל הפרוסות המשוחזרות למחסנית תמונה אחת (הפקודה 'תמונות לערימה ' ב-ImageJ).
  6. ציין עובי פרוסה מגודל השלב המשמש במהלך הרכישה (הפקודה מאפיינים ב- ImageJ).
  7. שמור את מחסנית התמונות כקובץ TIF תלת-ממדי.
    הערה: הקלטות תלת מימדיות משוקלל זרימה של כלי דם עיניים יכולות לשמש לאחר מכן ליצירת עיבודי נפח ולבניית מודלים אנטומיים דיגיטליים ופיזיים של מבני כלי דם של העין. אפשרויות עיבוד תמונה אלה חורגות מהטווח של פרוטוקול זה; עיין במאמרים שפורסמו בעבר לקבלת פרטים נוספים33,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טכניקת האולטרסאונד המשופרת בזרימה כדי לדמות מיטות וסקולריות של העין יכולה להיות מיושמת במגוון מינים וכיום נעשה בה שימוש ב-46 מינים שונים של בעלי חוליות (איור 1, טבלה 1). נוכחותם של תאי דם אדומים מגורענים בחולייתנים שאינם בוגרים-יונקים מספקת ניגודיות חיובית של דם זורם בהשוואה לרקמה סטטית בהקלטות סינים (קובץ משלים 2). עם זאת, כאשר מנתחים אותם על בסיס פריים אחר פריים, ההבחנה הברורה בין דם לרקמה הסובבת פחות ברורה (איור 2A). הליך שיפור זרימת הדם המתואר בפרוטוקול זה בעצם אוסף הקלטה רב-פעמית של נקודות במרחב דו-ממדי (פרוסה העשויה ממסגרות T) לתמונה אחת שבה ערך האות הטבוע בתנודות בפיקסלים הממוקמים בדם זורם מקבל ציון סטיית תקן גבוהה יותר מאשר הרקמה הסטטית שמסביב, ובכך מייצר ניגודיות חיובית (איור 2B). כדי לשפר באופן ניכר את הניגודיות של כלי הדם, ניתן להשתמש ב-Look Up Tables כדי להפיק תמונות פסאודוקולריות (איור 2C). ברכישות תלת-ממדיות, ניתן לשלב פרוסות מקביליות מרובות עם ריווח ידוע לנתוני תמונה תלת-ממדיים (קובץ משלים 3 וקובץ משלים 4) שניתן להשתמש בהם לעיבוד אמצעי אחסון תלת-ממדי (איור 2D) ולמידול אנטומי (איור 2E וקובץ משלים 5). הדמיית אולטרסאונד מבוססת דופלר מספקת גם את האפשרות לתמונת זרימת דם ספציפית, אולם עם פחות רגישות מהשיטה המתוארת (השוואת איור 2G לאיור 2H ואיור 2I), וחשוב לא אם כיוון זרימת הדם הוא ישירות או קרוב לאנך לכיוון גל הקול. ההליך המשופר בזרימה המתואר בפרוטוקול זה אינו תלוי באוריינטציה של זרימת הדם הן בתוך המטוס והן מחוץ למטוס.

הליך האולטרסאונד המשופר בזרימה מאפשר הדמיית זרימת דם במגוון מינים עם תאי דם אדומים מנוקבים (איור 3A-D). ניתן לצלם מיטות וסקולריות עמוקות בעיניים, כגון מירביל המקהלה בדגים מסוימים, אם הן קיימות במינים (ראש חץ צהוב באיור 2, איור 3B, איור 4). השיטה מוגבלת על ידי היעדר תאי דם אדומים מגורענים ביונקים בוגרים שבהם הליך שיפור הזרימה מייצר מידה מסוימת של ניגודיות לזרימת הדם, אך אינו נבדל כמו במינים עם תאי דם אדומים מנוקבים (איור 3E, F).

אולטרסאונד משופר בזרימה רגיש לרעשי תנועה, למשל, תנועות נשימה יכולות לגרום לטשטוש תמונה וחפצים כגון שיפור גבול הרקמה (איור 4A-C, קובץ משלים 6). ניתן להשתמש בגאינג פוטנציאלי או רטרוספקטיבי כדי להתאים לרעש תנועה (איור 4D,E).

Figure 1
איור 1: דוגמאות למגוון המינים המתאימים להדמיית אולטרסאונד משופרת בזרימה של כלי דם עיניים. (A) דג זהב (Carassius auratus). (ב) חידקן סיבירי (Acipenser baerii). (C) ים אירופאי (דיצנטריארכוס לברקס). (ד) ליצן נוצה (צ'יטלה אורנטה). (ה) קרפיון קרוסיאני (קרסיוס קרסיוס). (ו) עוף ביתי עוברי (גאלוס גאלוס באטוס מקומי). זה יכול להיות שימושי כדי לבנות מכשיר החזקה פשוט באמצעות משקל מתכת תגובתי וגומיות רופף (A,C,D). שתי מערכות הדמיית אולטרסאונד גדולות, מבוססות מעבדה ללא תנועה, יכולות לשמש להליך (A-D,F) כמו גם מערכות אופרטיביות שדה קטנות (E). כאשר מדמים מינים קטנים ורגישים מאוד לטמפרטורה שלא ניתן לשמור עליהם באמבט מים מבוקר טמפרטורה כמו ציפורים עובריות, ניתן לבצע הדמיה בזמן שהדגימה נמצאת בתוך האינקובטור (F). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השפעת שיפור הזרימה על סריקות אולטרסאונד עיניות. (A) דוגמאות לתמונות אולטרה-סאונד גולמיות מסוג B של עין של דג זהב בהקלטת סינים מסגרת 1000. בעוד זרימת הדם ניתן לראות בהקלטת cine (קובץ משלים 2) קשה לראות במסגרות סטטיות. (B) תמונת גווני אפור משופרת בזרימה (פרוסה זהה לזו של A). הן מיטות כלי הדם ברשתית והן במיטות כלי הדם שלאחר הרשתית משופרות. (ג) גרסה בצבע פסאודו של התמונה ב- B עם טבלת חיפוש אש של ImageJ. (D) תצוגה בתרגום נפח של זרימת הדם בעין של אותו דג זהב כמו ב- A-C, בהתבסס על רכישה תלת-ממדית. (ה) שני מקטעים (כלי רשתית ופוסט-רשתית) מודל אנטומי של עין ב- A-D (עבור מודל אינטראקטיבי ראה חומר משלים 5). (פ-י) תמונה אולטרה-סאונדית גולמית במצב B של העין של דג זהב אחר (F) המשווה הדמיית זרימה מבוססת דופלר צבע (G) לשיטות משופרות הזרימה המתוארות בפרוטוקול זה (H-I, הערה I היא שכבת-על של H ב- F). חצים ירוקים מצביעים על כלי רשתית, ראשי חץ צהובים מצביעים על ריט מירביל הכורואיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמאות מייצגות לתמונות אולטרסאונד עיניים משופרות בזרימה במגוון מינים בעלי חוליות. (A) ביצ'ר סנגל (פוליפטרוס סנגל סנגל). (B) פיראנה אדומת בטן (Pygocentrus nattereri). (C) איגואנה ירוקה (איגואנה איגואנה). (ד) עוברי (יום 18) עוף ביתי (גאלוס גאלוס גאלוס domesticus). (ה) עכבר בית (שרירים). (ו) חולדה חומה (ראטטוס נורוויגיקוס). במינים עם תאי דם אדומים מגורענים, הליך שיפור הזרימה מניב תמונות שימושיות של זרימת דם עינית (A-D), ואילו ביונקים בוגרים (תאי דם אדומים מוכללים), הוא מייצר ניגוד מוגבל בלבד בין דם זורם לבין הרקמה הסובבת (E-F). חצים ירוקים מצביעים על כלי רשתית; ראשי חץ כחולים מציינים כלי שיט פוסט-רשתיים כגון choriocapillaris; ראשי חץ צהובים מצביעים על צ'וריד רט מירביל. בעוף הביתי העוברי המאוחר, ניתן לראות את זרימת הדם באוקולי הפקטן (חץ ירוק תחתון ב- F). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תנועות נשימה גורמות לרעש תנועה שניתן להקל עליו באמצעות ג'ינגינג רטרוספקטיבי. (א-ב) דוגמה לתנועות נשימה בעין של פלייס אירופאי (Pleuronectes platesa). הנקודה האדומה נמצאת באותה קואורדינטת תמונה ב- A (פרוסה 54/410) ו- B (פרוסה 92/410), אך ניתן להבחין כי העין שינתה מיקום (ראה גם הקלטת סינים בחומר משלים 6). (ג) הניסיון לבצע את פעולת שיפור הזרימה בהקלטה המלאה של 410 המסגרות נכשל עקב רעשי תנועה. גבולות הרקמה משופרים באופן מלאכותי עקב תנועות. (D) פעולת הגיטינג רטרוספקטיבית המבוססת על עוצמת אות מנורמלת (SI) בנקודה האדומה ב- A-B. רק מסגרות עם SI מנורמל > 50 (בסך הכל 38 מסגרות), כלומר, המציין כי העין נמצאת באותו מיקום כמו ב- B, כלולים עבור הליך שיפור הזרימה. (ה) תמונה וכתוצאה מכך של הליך שיפור זרימה מגודר בדיעבד. השווה עם C. בתמונה המגודרת, שיפור גבול מלאכותי נמנע, ואת זרימת הדם ב choroid rete mirabile (ראש חץ צהוב) ניתן לראות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימה של מינים שבהם נעשה שימוש בטכניקת האולטרסאונד המשופרת בזרימה כדי לדמות את זרימת הדם בעיניים. תחולת השיטה מבוססת על היכולת לייצר ייצוג עשיר בניגודיות של מיטות כלי דם בהשוואה לרקע הסטטי. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: סקריפט מאקרו כדי להפוך חישובים לשיפור זרימה לאוטומטיים. קובץ ה- Script נכתב בשפת המאקרו IJ1 וניתן לבצעו הן באמצעות פונקציית המאקרו ImageJ (להקלטת פרוסה בודדת) והן באמצעות תהליך האצווה ImageJ (להקלטה תלת-ממדית מרובה פרוסות). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: גלם B-מצב cine הקלטה על העין של דג זהב (Carassius auratus). ניתן לצפות בזרימת הדם בזמן שהסרטון מופעל, אך לא במסגרת אחת כמו באיור 2A. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: פרוס וידאו דרך העין של דג זהב (Carassius auratus) של קטעים משופרים זרימת הדם. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: קובץ TIF תלת מימדי של העין המשופרת בזרימה של דגי זהב (Carassius auratus). התמונות נקטעו בפילוח של 3 x 3 x 3 כדי למזער את גודל הקובץ (הפחתה של פי 27 ברזולוציה המרחבית ובגודל הקובץ). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 5: דגם תלת-ממדי אינטראקטיבי של כלי שיט טרום-רשתית בעין של דג זהב (אאורטוס קרסיוס). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: גלם B-מצב cine הקלטה על העין של plaice האירופי (Pleuronectes platessa). שימו לב לתנועות נשימה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדמיה וסקולרית באמצעות אולטרסאונד משופר בזרימה מספקת שיטה חדשה להדמיה לא פולשנית של כלי הדם של העין המציעה מספר יתרונות על פני הטכניקות הנוכחיות אך יש לה מגבלות מהותיות. היתרון העיקרי של אולטרסאונד משופר זרימה הוא היכולת ליצור אנגיוגרפיות עינית עם עומק של שדה העולה על אפיתל הפיגמנט הרשתית, אשר מגביל את עומק השדה בטכניקות אופטיות. בהדמיית אולטרסאונד, רזולוציה מרחבית ועומק השדה נקבעים בסופו של דבר על ידי תדר מתמר אולטרסאונד, שבו תדרים גבוהים יותר להגדיל את הרזולוציה המרחבית, אבל על חשבון עומק רדוד יותר של שדה, ובכך הבחירה בתדר מתמר מציגה החלפה בין עומק התמונה לרזולוציה מרחבית. מניסיוננו, הדמיית אולטרסאונד רשתית אופטימלית מושגת באמצעות מתמרים אולטרסאונד בתדר גבוה (≥50 MHz) בעיניים קטנות עם עומקים תמונה של <1 ס"מ ומתמרים בתדר נמוך יותר (20-40 MHz) בעיניים גדולות יותר עם עומק תמונה של 1.5-3.0 ס"מ. עבור סריקת אולטרסאונד 3D, הרזולוציה של ממד פרוסה נוסף מוגדר על ידי גודל הצעד בין סריקות בערימה של סריקות אולטרסאונד 2D. מניסיוננו, קשה לבצע סריקה תלת-ממדית עם גודל צעד קטן מ-20 מיקרומטר.

אולטרסאונד 2D משופרת זרימה יש רזולוציה זמנית גבוהה. באופן אידיאלי, ≥1000 מסגרות לתמונה נדרשות להדמיית כלי דם משופרת בזרימה, כך שלפחות 8 s נדרשים לכל סריקת תמונה. הרזולוציה הזמנית מופחתת באופן משמעותי בעת ביצוע אולטרסאונד 3D זרימה משופרת, שבו זמן הסריקה גדל עם מספר התמונות בערימה 3D של סריקות. בהתחשב ברזולוציה הזמנית הגבוהה, זרימת העבודה של אולטרסאונד דו-ממדי משופרת בזרימה מראה פוטנציאל חזק כשיטה לזיהוי שינויים זמניים במהירויות זרימת הדם היחסיות ובהתפלגות זרימת הדם במהלך מניפולציה ניסיונית. לכן, מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בזרימת העבודה כדי לזהות כיצד תנאים סביבתיים משתנים (למשל, טמפרטורה, pO2, pCO2) או ניהול פרמקולוגי משפיעים על זרימת הדם בעין ובאיברים אחרים.

זרימת העבודה של אולטרסאונד מסתמכת על הניגוד החיובי של תאי דם אדומים מגורענים מרוב בעלי החוליות שאינם יונקים. לפיכך, תאי הדם האדומים של יונקים בוגרים וכמה מיני סלמנדרות37 מספקים ניגודיות מועטה מדי כדי לשפר ביעילות את זרימת הדם באמצעות זרימת העבודה הנוכחית (איור 3E,F). בתהליכי עבודה מסורתיים של אולטרסאונד, הזרקת כלי דם של microbubbles מספק ניגודיות גבוהה מספיק כדי לזהות את vasculature ביונקים38, אשר שימש כדי ליצור אנגיוגרפיות כלי דם של כלי retrobulbar בתוך העין החולדה39. עם זאת, microbubbles להתפוצץ בתוך דקות, כך הדור של אנגיוגרפיות 3D דורש זריקות microbubble רצופות.

אולטרסאונד משופר זרימה תלוי הקלטות רציפות באותה תנוחה של העין, ולכן הטכניקה אינה אפשרית בבעלי חיים ערים, שבו תנועות אקראיות קלות עשויות לקזז את התמונה ולערער חישובי שיפור זרימה. לכן, השיטה הנוכחית חייבת להתבצע תחת הרדמה נכונה עבור immobilization כדי לשפר את איכות התמונה על ידי הפחתת תנועות אקראיות. עם זאת, תנועות קבועות של העין המתרחשות במהלך תנועות נשימה רגילות ניתן לקזז על ידי פוטנציאל או בדיעבד gating לדפוס האוורור של החיה, ולכן רק סריקת הקלטה מאותו מרווח זמן בתוך מחזור האוורור משמש בניתוח הנתונים. בעוד שגישת ההתהוות הרטרוספקטיבית לקזז תנועות נשימה של התמונה משפרת באופן משמעותי את יציבות התמונה, היא מפחיתה באופן בולט את מספר המסגרות הכלולות בחישוב סטיית התקן של עוצמת האות המובילה לירידה ביחס האות לרעש ( השוואת איור 4E לאיור 2C ולאיור 2I ). אפקט זה הוא הקלה באמצעות gating פוטנציאלי בסורק אולטרסאונד, שבו נתוני תמונה נרכשים רק כאשר החיה נמצאת בשלב הרצוי של נשימה. עם זאת, הדבר גורם לעלייה ניכרת בזמן הרכישה אם יש לרכוש את מספר המסגרות הרצוי ≥1000.

אנו רואים יישומים מרובים במחקר זואולוגי ווטרינרי עבור זרימת העבודה אולטרסאונד משופרת זרימה כדי למפות את הפיזיולוגיה והאנטומיה של כלי הדם של העין. כלי הדם של דגים, יונקים וציפורים בעלי סנפירי קרניים מתוארים היטב יחסית 1,3,4,4,8,9,12,15,40, אך אין זה המקרה עבור דגים שאינם גרמיים (בעלי חוליות וכונדריכתיאנים נטולי לסתות), דו-חיים וזוחלים, המייצגים את קבוצות האחות המתפצלות המוקדמות שלהם. יישום אולטרסאונד משופר זרימה על קבוצות בעלי חיים אלה מובנים היטב ושילוב נתונים אלה עם ידע על קבוצות מחקרים טובים יותר יספק תובנה בסיסית על האבולוציה של כלי הדם של העין החולייתנית. מכיוון שכלי הדם של העין דומים במינים קרובים4, מידע מפורט כזה על כלי הדם של העין במגוון רחב של מינים יספק נקודת התייחסות לווטרינרים לזהות מומים בכלי הדם של העין עקב פגמים התפתחותיים, מחלות או פציעות פיזיות. יתר על כן, היכולת לרכוש מידע על זרימת דם דו-ממדית ברזולוציה מרחבית גבוהה מספקת את האמצעים לכימות השפעות פרמקוקינטיות על התפלגות זרימת הדם במיטות כלי דם עמוקות, עם יישומים עצומים בפיתוח ובדיקות של תרופות. מחקרים עתידיים על טכניקה זו צריכים להתמקד בזיהוי תרכובות להזרקה המשפרות את הניגודיות של דם במינים עם תאי דם אדומים enucleated, אשר ירחיב את תחולתה של טכניקה זו ליונקים עם יישומים עצומים במחקר ביו-רפואי ואבחון קליני של תפקוד לקוי של כלי הדם בעין ומיטות כלי דם עמוקות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי לא קיימים אינטרסים משלימים.

Acknowledgments

עבודה זו קיבלה מימון מקרן קרלסברג (CF17-0778; CF18-0658), קרן לונדבק (R324-2019-1470; R346-2020-1210), קרנות Velux (00022458), קרן A.P. Møller לקידום מדעי הרפואה, תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי סקודובסקה-קירי (מס ' 754513) וקרן המחקר של אוניברסיטת ארהוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-222 Sigma E10521-50G
Benzocaine Sigma E-1501
Propofol B Braun
12260470_0320
Alfaxalon Jurox NA
Isoflurane Zoetis 50019100
Ultrasound scanner VisualSonics Vevo 2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary. Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).
  2. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 175-208 (2001).
  3. Country, M. W. Retinal metabolism: A comparative look at energetics in the retina. Brain Research. 1672, 50-57 (2017).
  4. Damsgaard, C., et al. Retinal oxygen supply shaped the functional evolution of the vertebrate eye. Elife. , 8 (2019).
  5. Buttery, R. G., Hinrichsen, C. F. L., Weller, W. L., Haight, J. R. How thick should a retina be? A comparative study of mammalian species with and without intraretinal vasculature. Vision Research. 31 (2), 169-187 (1991).
  6. Ames, A., Li, Y., Heher, E., Kimble, C. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
  7. Chase, J. The Evolution of retinal vascularization in mammals: A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  8. Johnson, G. L. Ophthalmoscopic studies on the eyes of mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 254 (794), 207-220 (1968).
  9. Johnson, G. L. I. Contributions to the comparative anatomy of the mammalian eye, chiefly based on ophthalmoscopic examination. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 194 (194-206), 1-82 (1901).
  10. Rodriguez-Ramos Fernandez, J., Dubielzig, R. R. Ocular comparative anatomy of the family Rodentia. Veterinary Ophthalmology. 16, 94-99 (2013).
  11. Copeland, D. E. Functional vascularization of the teleost eye. Current Topics in Eye Research. 3, 219-280 (1980).
  12. Meyer, D. B. The Visual System in Vertebrates. Handbook of Sensory Physiology. Crescitelli, F. 7, Springer. Berlin, Heidelberg. (1977).
  13. Potier, S., Mitkus, M., Kelber, A. Visual adaptations of diurnal and nocturnal raptors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 106, 116-126 (2020).
  14. Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. Active secretion of oxygen into the eye of fish. Nature. 194, 106-107 (1962).
  15. Damsgaard, C. Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye. Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840 (2021).
  16. Damsgaard, C., et al. A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina. Elife. 9, (2020).
  17. Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).
  18. Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).
  19. Berenbrink, M. Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes. Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).
  20. Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system. Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).
  21. Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: State of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
  22. Yung, M., Klufas, M. A., Sarraf, D. Clinical applications of fundus autofluorescence in retinal disease. International Journal of Retina and Vitreous. 2 (1), 12 (2016).
  23. Ang, M., et al. Optical coherence tomography angiography: a review of current and future clinical applications. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (2), 237-245 (2018).
  24. Spaide, R. F., Koizumi, H., Pozonni, M. C. Enhanced depth imaging spectral-domain optical coherence tomography. American Journal of Ophthalmology. 146 (4), 496-500 (2008).
  25. Shen, Q., et al. Magnetic resonance imaging of tissue and vascular layers in the cat retina. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 23 (4), 465-472 (2006).
  26. Tan, G. X., Jamil, M., Tee, N. G., Zhong, L., Yap, C. H. 3D reconstruction of chick embryo vascular geometries using non-invasive high-frequency ultrasound for computational fluid dynamics studies. Annals of Biomedical Engineering. 43 (11), 2780-2793 (2015).
  27. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ dynamics and fluid dynamics of the HH25 chick embryonic cardiac ventricle as revealed by a novel 4D high-frequency ultrasound imaging technique and computational flow simulations. Annals of Biomedical Engineering. 45 (10), 2309-2323 (2017).
  28. Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e57089 (2018).
  29. Jia, Y., et al. Split-spectrum amplitude-decorrelation angiography with optical coherence tomography. Optics Express. 20 (4), 4710-4725 (2012).
  30. Clarke, K. W., Trim, C. M., Trim, C. M. Veterinary Anaesthesia E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2013).
  31. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. , Elsevier Science & Technology. (2015).
  32. West, G., Heard, D., Caulkett, N. Zoo Animal and Wildlife Immobilization and Anesthesia. , John Wiley & Sons, Inc. (2014).
  33. Lauridsen, H., Hansen, K., Nørgård, M. Ø, Wang, T., Pedersen, M. From tissue to silicon to plastic: three-dimensional printing in comparative anatomy and physiology. Royal Society Open Science. 3 (3), 150643 (2016).
  34. Lauridsen, H., et al. Inside out: Modern imaging techniques to reveal animal anatomy. PLoS One. 6 (3), 17879 (2011).
  35. Ruthensteiner, B., Heß, M. Embedding 3D models of biological specimens in PDF publications. Microscopy Research and Technique. 71 (11), 778-786 (2008).
  36. Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep vascular imaging in the eye with flow-enhanced ultrasound. bioRxiv. , 447055 (2021).
  37. Mueller, R. L., Ryan Gregory, T., Gregory, S. M., Hsieh, A., Boore, J. L. Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders. Zoology. 111 (3), 218-230 (2008).
  38. Greis, C. Quantitative evaluation of microvascular blood flow by contrast-enhanced ultrasound (CEUS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 49, 137-149 (2011).
  39. Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye. Experimental Eye Research. 193, 107986 (2020).
  40. Walls, G. L. The vertebrate eye and its adaptive radiation. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).

Tags

ביולוגיה גיליון 176
הדמיה וסקולרית עמוקה בעין עם אולטרסאונד משופר בזרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep… More

Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound. J. Vis. Exp. (176), e62986, doi:10.3791/62986 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter