Summary
我们提出了一种非侵入性超声技术，用于在不使用造影剂的情况下在眼睛中生成三维血管造影。
Abstract
眼睛内的视网膜是体内对能量要求最高的组织之一，因此需要从丰富的血液供应中输送高速率的氧气。脉络膜的毛细血管层排列在视网膜的外表面，是大多数脊椎动物视网膜中氧气的主要来源。然而，这种血管床由于其位于高度吸光的视网膜后面，因此使用传统光学技术进行成像具有挑战性。在这里，我们描述了一种高频超声技术，随后的流动增强，以高时空分辨率对眼睛的深血管床（0.5-3厘米）进行成像。这种非侵入性方法在有核红细胞的物种（非哺乳动物和胎儿动物模型）中效果很好。它允许在不使用造影剂的情况下生成非侵入性三维血管造影，并且它独立于血流角，具有比基于多普勒的超声成像技术更高的灵敏度。
Introduction
脊椎动物视网膜上的高新陈代谢在两种截然不同的需求之间进行了内在的权衡;高血流速和没有血管的光路。为了避免注注红细胞的视觉障碍，所有脊椎动物的视网膜通过光感受器后面的一片毛细血管（脉络膜毛细血管）接收氧气和营养物质1，2，3。然而，这种营养和氧气的单一来源对视网膜的厚度施加了扩散限制4，5，因此许多视觉活性物种拥有各种精心设计的血管网络，为这种代谢活跃的器官提供额外的血液供应6。这些血管床包括哺乳动物和一些鱼类视网膜内部层的血管4，7，8，9，10，许多鱼类，爬行动物和鸟类中发现的视网膜内侧（面向光线）的血管4，11，12，13，以及鱼类脉络膜，脉络膜爬行动物的反流血管排列奇迹，允许产生超大气氧分压14，15，16，17，18，19，20。尽管这些额外的非脉络膜视网膜营养供应途径在促进优越视力4的代谢需求方面起着至关重要的作用，但这些血管结构的三维解剖结构知之甚少，限制了我们对脊椎动物眼睛形态进化的理解。
传统上，视网膜血液供应是使用光学技术（例如眼底镜检查）进行研究的。这类技术以高分辨率21 提供有关非脉络膜血管解剖学的高通量非破坏性信息，因此很容易用于视网膜血管结构异常的临床诊断22。然而，在这些光学技术中，视网膜色素上皮吸收透射光并限制视深，从而在不使用造影剂的情况下减少有关脉络膜结构和功能的信息21。在光学相干断层扫描（OCT）中也遇到了类似的深度限制。该技术可以使用光波生成高分辨率的眼底血管造影，但以深度穿透为代价23，而增强的深度成像OCT可以以视网膜成像质量为代价可视化脉络膜24。磁共振成像克服了眼底镜检查和OCT的光学局限性，可以绘制视网膜中的血管层，尽管分辨率较低25。组织学和微量计算断层扫描（μCT）保持了光学技术的高分辨率，并提供了有关全眼血管形态的信息4，但这两种技术都需要眼部采样，因此在临床或稀有或濒危物种中是不可能的。为了克服这些已建立的视网膜成像技术的一些局限性，这里的研究提出了一种关于麻醉动物的超声方案，其中通过应用一种可比较的技术，在一系列间隔相等的二维超声扫描 上以计算机 形式绘制血液运动，这些扫描跨越整个眼睛，如前所述用于胚胎和心血管成像26，27，28 和OCT血管造影29。这种方法允许在不使用造影剂的情况下生成非侵入性的三维深眼血管造影，并为绘制不同物种的眼睛内血流分布开辟了新的途径。
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Protocol
以下协议是在丹麦食品，农业和渔业部，丹麦兽医和食品管理局的丹麦动物实验检查局的许可下执行的（许可证号为2016-15-0201-00835）。
1. 麻醉和超声介质
- 麻醉研究动物。
注意：适当麻醉的类型和剂量高度依赖于物种。一般来说，浸渍式麻醉剂，如MS-222（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸）、苯佐卡因（4-氨基苯甲酸乙酯）和丙泊酚（2，6-二异丙基苯酚）在鱼类和两栖动物中是有用的，它们很容易在鳃或皮肤上吸收麻醉剂（例如，0.05mg·虹鳟鱼中的L-1 苯佐卡因）。一系列可静脉内、肌内、腹腔给药的溶解化合物可用于羊膜，气体麻醉剂也是如此。肌内注射阿法沙龙对爬行动物有用（例如，在蜥蜴中为30 mg·kg-1 ），而作为气体施用的异氟醚对鸟类有用（例如，2%在空气中用于鸽子）。请参阅已发表的文献30，31，32 ，以全面概述跨物种可用的麻醉剂。 - 测试动物的反应，以确认最佳的麻醉水平。确保动物在手术过程中完全静止不动，因为流量增强的超声手术对运动噪音敏感。
- 太深的麻醉会改变血流模式，因此在实验的启动阶段进行剂量滴定。
- 分步增加麻醉剂量，并在简单亮度模式（B模式）超声的帮助下观察眼睛的血流量。
注意：当动物一动不动（呼吸除外）且可见眼血流时，可获得最佳麻醉水平。
- 如果麻醉剂的类型/剂量不允许呼吸运动，则确保动物充分通风，例如，使用空气泵为水生物种的水充氧，或为呼吸空气的物种使用呼吸呼吸的呼吸机。
- 将动物摆成允许从上方直接进入眼睛的姿势。
注意：根据物种的不同，这可以处于仰卧位或侧位。使用一小块非反应性金属（例如，不锈钢）和松散的橡皮筋来构建一个简单的保持装置是有用的（见 图1）。 - 将适当的超声培养基放在动物的眼睛上。如果鳞片眼睑（超声波不透水）覆盖眼睛，然后用棉签轻轻移开。
注意：对于水生物种，最好的超声介质是动物通常生活的清洁水箱水。对于陆地物种，大量的超声凝胶可确保超声换能器（即线性阵列探头）在整个眼睛表面的自由移动和成像。陆地物种需要对侧眼睛上的兽医软膏。
2. 2D和3D眼部超声图像采集
- 根据所需的图像方向，将超声换能器内侧定位为背侧/腹侧或喙/尾方向。
- 在B模式下，以最大景深对眼睛的内侧和最深处进行成像，并确保所有感兴趣的结构在图像场中都可见。
注意：在某些物种中，晶状体占玻璃体房的相对较大比例，其可能吸收超声波，特别是在较高频率下。 - 在检查实时图像时，将换能器缓慢地平移到每一侧。确保所有感兴趣的结构在图像场中都是可见的;如果没有，请切换到频率较低、景深较大的传感器。
注：以下中心频率允许以下最大景深：21 MHz：3厘米，40 MHz：1.5厘米，50 MHz：1厘米（见 表1）。然而，如果眼睛含有钙化或其他超声不透水结构，这些最大景深值可能会明显降低。 - 调整图像深度、深度偏移（从图像顶部到感兴趣结构的距离）、图像宽度以及焦点区域的数量和位置，以覆盖所有三个空间维度（例如，1 cm 图像深度、 2 mm 深度偏移、1 cm 图像宽度、一个焦点区域）中的所需感兴趣区域。
注意：尽管调整这些参数的按钮的特定命名可能因超声系统而异，但大多数系统都具有用于这些调整的逻辑名称的按钮。这些图像参数设置通常会影响超声采集的可能时间分辨率范围。 - 设置帧速率在50-120帧·s-1的范围内。
注意：时间分辨率（即连续B扫描之间的时间间隔）必须足以显示成像血管中的大像素强度变异性，即时间分辨率不得太高。另一方面，为了在合理的时间内完成眼睛的完整3D记录，时间分辨率不能太低。50-120帧·s-1 的时间分辨率通常足以满足大多数物种的流动增强程序。在某些超声系统上，可以通过在“一般成像”（高空间/低时间分辨率）和“心脏病学”（低空间/高时间分辨率）模式之间切换来获得所需的时间分辨率。 - 将2D增益调整到一个水平（~5 dB），因此解剖结构仅在B模式采集中可见，以增加随后的流量增强重建中的信噪比。
- 要在单个切片位置获取2D流动增强图像，请将探头平移到该位置并继续执行步骤3.1。
- 要获得整个感兴趣区域（例如视网膜）的3D记录，请将换能器转换为感兴趣区域的一个极端。
- 要确定感兴趣区域极端的确切位置，请短暂增加 2D 增益。
- 在正确的探头放置完成后，在录制前降低2D增益，以确保在随后的流量增强重建中具有最大的信噪比。
- 对于 3D 录制中的每个步骤（切片），获取≥100 帧（最佳≥ 1000 帧）。
- 使用显微操作器或内置传感器电机，以25 μm或50 μm的步长在整个感兴趣区域平移传感器，并为每个步骤重复≥100帧采集。
- 根据该机构的动物护理指南对研究动物实施安乐死。
3. 流量增强图像重建
- 将记录导出为医学数字成像和通信 （DICOM） 文件格式（小端）。
- 要根据≥100帧（T）电影记录生成单个流量增强图像，请使用以下公式计算像素水平（STD（x，y））的标准偏差：
其中 It（x，y） 是像素在时间 t 时 （x，y） 像素坐标处的强度，Īt（x，y） 是 I 随时间变化的算术平均值。 - 对 3D 录制中的每个切片重复步骤 3.2。
- 要自动执行 3D 记录中多个切片的 STD 计算和图像重建过程，请使用 ImageJ 和补充宏脚本（补充文件 1）以批处理模式执行此操作。
- 将所有重建的切片合并到一个图像堆栈中（ImageJ 中的“图像到堆栈 ”命令）。
- 根据采集期间使用的步长指定切片厚度（ImageJ 中的“属性” 命令）。
- 将图像堆栈另存为 3D TIF 文件。
注意：眼部血管的流动加权三维记录随后可用于创建体积渲染并构建眼睛血管结构的数字和物理解剖模型。这些图像处理选项超出了本协议的范围。有关更多详细信息，请参阅以前发表的文章33，34，35。
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Representative Results
用于成像眼睛血管床的流量增强超声技术可以应用于一系列物种，目前已用于46种不同的脊椎动物物种（图1， 表1）。非成体哺乳动物脊椎动物中有核红细胞的存在与电影记录中的静态组织相比，流动血液提供了积极的对比（补充文件2）。然而，当逐帧分析时，血液和周围组织之间的明显区别不太明显（图2A）。该协议中描述的血流增强程序基本上将2D空间中的多时间点记录（由 T 帧组成的切片）编译成单个图像，其中位于流动血液中的像素的固有信号值波动比周围静态组织得分更高的标准偏差，从而产生正对比度（图2B）。为了可感知地增强血管对比度，可以使用查找表来生成伪彩色图像（图2C）。在3D采集中，具有已知间距的多个平行切片可以组合成3D图像数据（补充文件3 和 补充文件4），可用于三维体积渲染（图2D）和解剖建模（图2E 和 补充文件5）。基于多普勒的超声成像也提供了专门成像血流的选项，但是灵敏度低于所描述的方法（将 图2G 与 图2H 和 图2I进行比较），重要的是，如果血流方向直接或接近垂直于声波的方向，则不是这样。该协议中描述的血流增强程序与平面内和面外血流的方向无关。
流量增强超声程序允许对一系列有核红细胞的物种进行血流成像（图3A-D）。如果存在于该物种中，则可以对某些鱼类中的脉络膜奇异物等深层眼血管床进行成像（图2中的黄色箭头，图3B，图4）。该方法受到成年哺乳动物中无核红细胞的限制，其中流量增强程序产生一定程度的血流对比度，但不像具有有核红细胞的物种那样明显（图3E，F）。
流量增强超声对运动噪声敏感，例如，呼吸运动可导致图像模糊和伪影，例如组织边界增强（图4A-C，补充文件6）。前瞻性或回顾性门控可用于调整运动噪声（图4D，E）。
图1：适合于眼部脉管系统流量增强超声成像的各种物种的例子。（B）西伯利亚鲟鱼（Acipenser baerii）。（C） 欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）。（D）小丑羽毛背（Chitala ornata）。（E）鲫鱼（Carassius carassius）。（F）胚胎家鸡（Gallus gallus domesticus）。使用非反应性金属砝码和松散的橡皮筋（A，C，D）构建简单的夹持装置是有用的。大型、不动的实验室超声成像系统既可用于手术（A-D，F），也可用于小型现场手术系统（E）。当成像像胚胎鸟一样无法在温控水浴中保留的小型和高度温度敏感的物种时，可以在样品在培养箱内（F）时进行成像。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：流量增强对眼部超声扫描的影响（A）1000帧电影记录中金鱼眼睛的原始B模超声图像示例。虽然可以在电影记录中观察到血流（补充文件2），但在静态帧中很难看到。（B） 流动增强灰度图像（与 A 中的切片相同）。视网膜和视网膜后血管床均得到增强。（C）B中带有ImageJ Fire Look Up Table的图像的伪彩色版本。（D）基于3D采集，以体积渲染显示与A-C相同的金鱼眼中的血流。（E）A-D中眼睛的两段（视网膜和视网膜后血管）解剖模型（交互式模型见补充材料5）。（F-I）另一条金鱼眼睛的原始B模超声图像（F）将基于彩色多普勒的流动成像（G）与该协议中描述的流动增强方法（H-I，注I是H在F上的叠加）进行比较。绿色箭头表示视网膜血管，黄色箭头表示脉络膜视网膜奇幻视网膜。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：各种脊椎动物物种中流动增强的眼部超声图像的代表性示例。 （A） 塞内加尔双翅目（（B）红腹食人鱼（Pygocentrus nattereri）。（C）绿鬣蜥（鬣蜥）。（D）胚胎（第18天）家鸡（Gallus gallus domesticus）。（E）家鼠（肌肉）。（F）褐鼠（Rattus norvegicus）。在具有有核红细胞的物种中，流量增强程序产生有用的眼部血流图像（A-D），而在成年哺乳动物（去核红细胞）中，它仅在流动血液和周围组织（E-F）之间产生有限的对比度。绿色箭头表示视网膜血管;蓝色箭头表示视网膜后血管，如脉络膜毛细血管;黄色箭头表示脉络膜奇幻视。在胚胎晚期的家鸡中，可以观察到果胶眼中的血流（F中的下绿色箭头）。请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：呼吸运动会引起运动噪声，可通过回顾性门控来缓解。 （A-B）欧洲人眼中的呼吸运动示例（胸膜板）。红点在A（切片54/410）和B（切片92/410）中处于相同的图像坐标，但可以观察到眼睛的位置已经移动（另见补充材料6中的电影记录）。（C） 由于运动噪声，尝试对完整的410帧录制执行流量增强操作失败。由于运动，组织边界被人为地增强。（D）基于A-B红点处归一化信号强度（SI）的回顾性门控操作。只有归一化SI>50（共38帧）的帧，即表明眼睛与B中的相同位置，才包括在流量增强程序中。（E）追溯门控流量增强程序的结果图像。与 C 进行比较。在门控图像中，避免了人工边界增强，并且可以观察到脉络膜奇迹（黄色箭头）中的血流。请点击此处查看此图的放大版本。
表1：使用流量增强超声技术对眼部血流进行成像的物种列表。 该方法的适用性基于与静态背景相比产生血管床对比度丰富的表示的能力。请点击此处下载此表格。
补充文件 1：用于自动执行流量增强计算的宏脚本。 该脚本是用IJ1宏语言编写的，可以使用ImageJ宏功能（用于单切片录制）或ImageJ批处理（用于多切片3D录制）执行。 请点击此处下载此文件。
补充文件2：金鱼（Carassius auratus）眼睛上的原始B模式电影记录。在视频播放时可以观察到血流，但不能像 图2A那样在单个帧上观察到血流。 请点击此处下载此文件。
补充文件3：通过金鱼（Carassius auratus）的眼睛切片视频的血流增强部分。请点击此处下载此文件。
补充文件4：金鱼（Carassius auratus） 流动增强眼的三维TIF文件。图像已按 3 x 3 x 3 装箱，以最大程度地减小文件大小（空间分辨率和文件大小减少 27 倍）。请点击此处下载此文件。
补充文件5：金鱼（Carassius auratus） 眼中视网膜前和视网膜后血管的交互式3D模型。请点击此处下载此文件。
补充文件6：欧洲普莱斯（Pleuronectes platessa） 眼中的原始B模式电影记录。注意呼吸运动。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
使用流量增强超声的血管成像为眼睛脉管系统的非侵入性成像提供了一种新方法，与现有技术相比具有多项优势，但具有其内在局限性。流量增强超声的主要优点是能够生成景深超过视网膜色素上皮的眼部血管造影，这限制了光学技术的景深。在超声成像中，空间分辨率和景深最终由超声换能器频率决定，其中较高的频率会增加空间分辨率，但代价是景深较浅，因此换能器频率的选择引入了图像深度和空间分辨率之间的权衡。根据我们的经验，在图像深度为<1厘米的小眼睛中使用高频超声换能器（≥50 MHz）和在图像深度为1.5-3.0厘米的大眼睛中使用低频换能器（20-40 MHz）可实现最佳的视网膜超声成像。对于 3D 超声扫描，附加切片尺寸的分辨率由 2D 超声扫描堆栈中扫描之间的步长大小设置。根据我们的经验，很难进行步长小于20μm的3D扫描。
流量增强型 2D 超声具有较高的时间分辨率。理想情况下，每张图像需要≥1000帧才能进行流动增强血管成像，因此每张图像扫描至少需要8秒。在执行3D流量增强超声时，时间分辨率显着降低，其中扫描时间随着3D扫描堆栈中的图像数量而增加。鉴于高时间分辨率，流量增强型2D超声工作流程显示出作为识别实验操作期间相对血流速度和血流分布的时间变化的方法的巨大潜力。因此，未来的研究可以使用工作流程来确定改变的环境条件（例如，温度，pO2，pCO2）或药理学给药如何影响眼睛和其他器官的血流。
超声工作流程依赖于来自大多数非哺乳动物脊椎动物的有核红细胞的正对比。因此，成年哺乳动物和一些蝾螈物种的去核红细胞37 提供的对比度太小，无法使用目前的工作流程有效增强血流量（图3E，F）。在传统的超声工作流程中，微气泡的血管注射可提供足够高的对比度来识别哺乳动物的脉管系统38，这已被用于生成大鼠眼内球后血管的血管血管造影39。然而，微气泡在几分钟内爆裂，因此3D血管造影的生成需要连续的微气泡注射。
流量增强超声依赖于眼睛相同位置的顺序记录，因此该技术在清醒的动物中是不可能的，其中微小的随机运动可能会抵消图像并破坏流量增强计算。因此，本方法必须在适当的麻醉下进行固定，以通过减少随机运动来提高图像质量。然而，在有规律的呼吸运动期间发生的有规律的眼睛运动可以通过前瞻性或回顾性地门控动物的通气模式来抵消，因此在数据分析中仅使用通气周期内相同时间间隔的扫描记录。虽然用于偏移图像通气运动的回顾性门控方法显着提高了图像稳定性，但它显着减少了计算信号强度标准偏差时所包含的帧数，从而导致信噪比降低（将 图4E 与 图2C 和 图2I进行比较）).使用超声扫描仪的前瞻性门控可以减轻这种影响，其中仅在动物处于所需的呼吸阶段时才获取图像数据。但是，如果必须采集所需的帧数≥1000，这会导致采集时间显著增加。
我们在动物学和兽医研究中看到了多种应用，用于流量增强的超声工作流程，以绘制眼睛脉管系统的生理学和解剖结构。鳍鱼、哺乳动物和鸟类的脉管系统描述得比较清楚1，3，4，8，9，12，15，40，但对于非硬骨鱼（无颚脊椎动物和软骨动物），两栖动物和爬行动物来说并非如此，它们代表了各自早期分化的姐妹群体。对这些知之甚少的动物群体实施流量增强超声检查，并将这些数据与研究程度更高的群体的知识相结合，将为脊椎动物眼脉管系统的进化提供基本的见解。由于密切相关的物种4中眼睛的脉管系统相似，因此有关广泛物种中眼部脉管系统的此类详细信息将为兽医识别由于发育缺陷，疾病或身体损伤而导致的眼睛脉管系统畸形提供参考点。此外，以高时空分辨率获取2D血流信息的能力为量化深血管床中血流分布的药代动力学效应提供了手段，在药物开发和测试中具有广泛的应用。对该技术的未来研究应侧重于确定可注射的化合物，这些化合物可增强物种中血液与去核红细胞的对比度，这将扩大该技术对哺乳动物的适用性，在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用眼部和其他深层血管床的血管功能障碍。
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Disclosures
作者声明不存在完整的利益。
Acknowledgments
这项工作已获得嘉士伯基金会（CF17-0778;CF18-0658），伦德贝克基金会（R324-2019-1470;R346-2020-1210），Velux基金会（00022458），A.P. Møller医学科学促进基金会，Marie Skłodowska-Curie资助协议（第754513号）下的欧盟地平线2020研究和创新计划以及奥胡斯大学研究基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-222 | Sigma | E10521-50G | |
| Benzocaine | Sigma | E-1501 | |
| Propofol | B Braun | 12260470_0320 |
|
| Alfaxalon | Jurox | NA | |
| Isoflurane | Zoetis | 50019100 | |
| Ultrasound scanner | VisualSonics | Vevo 2100 |
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