Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyb vaskulær billeddannelse i øjet med flow-forbedret ultralyd

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62986
Automatic Translation
1,2, 3
1Aarhus Institute of Advanced Studies, Aarhus University, 2Zoophysiology, Department of Biology, Aarhus University, 3Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Vi præsenterer en ikke-invasiv ultralydsteknik til generering af tredimensionelle angiografer i øjet uden brug af kontrastmidler.

Abstract

Nethinden i øjet er et af de mest energikrævende væv i kroppen og kræver derfor en høj ilttilførsel fra en rig blodforsyning. Choroidens kapillære lamina linjer den ydre overflade af nethinden og er den dominerende iltkilde i de fleste hvirveldyrs nethinden. Denne vaskulære seng er imidlertid udfordrende at afbilde med traditionelle optiske teknikker på grund af sin position bag den meget lysabsorberende nethinde. Her beskriver vi en højfrekvent ultralydsteknik med efterfølgende flowforbedring til billede af dybe vaskulære senge (0,5-3 cm) af øjet med en høj spatiotemporal opløsning. Denne ikke-invasive metode fungerer godt i arter med nukleerede røde blodlegemer (ikke-pattedyr og føtale dyremodeller). Det giver mulighed for generering af ikke-invasive tredimensionelle angiografer uden brug af kontrastmidler, og det er uafhængigt af blodgennemstrømningsvinkler med en højere følsomhed end Doppler-baserede ultralydsbilleddannelsesteknikker.

Introduction

Det høje stofskifte på hvirveldyrets nethinde pålægger en iboende afvejning mellem to kontrasterende behov; høje blodgennemstrømningshastigheder og en let vej uden blodkar. For at undgå synsforstyrrelser af perfuserende røde blodlegemer modtager nethinden hos alle hvirveldyr ilt og næringsstoffer via et ark kapillærer bag fotoreceptorerne, choriocapillaris1,2,3. Denne ene kilde til næringsstoffer og ilt pålægger imidlertid en diffusionsbegrænsning for tykkelsen af nethinden4,5, så mange visuelt aktive arter besidder en række udførlige vaskulære netværk for at give yderligere blodforsyning til dette metabolisk aktive organ6. Disse vaskulære senge omfatter blodkar, der perfuserer de indre retinale lag hos pattedyr og nogle fisk4,7,8,9,10, blodkar på den indre (lysvendte) side af nethinden, der findes i mange fisk, krybdyr og fugle4,11,12,13, og modstrømsvaskulære arrangementer af fiskekoroidet, choroid rete mirabile, der giver mulighed for generering af superatmosfæriske iltpartialtryk14,15,16,17,18,19,20. På trods af at disse yderligere ikke-choroidale veje til retinal næringsstofforsyning spiller en væsentlig rolle i brændstof til de metaboliske krav til overlegen vision4, er den tredimensionelle anatomi af disse vaskulære strukturer dårligt forstået, hvilket begrænser vores forståelse af den morfologiske udvikling af hvirveldyrøjet.

Traditionelt er retinal blodforsyning blevet undersøgt ved hjælp af optiske teknikker, såsom fundus oftalmoscopy. Denne kategori af teknikker giver ikke-destruktiv information med høj gennemstrømning om ikke-choroidal blodkaranatomi i høj opløsning21 og anvendes derfor let til klinisk diagnose af abnormiteter i retinal karstruktur22. Imidlertid absorberer retinalpigmentepitelet det transmitterede lys og begrænser synsdybden i disse optiske teknikker, hvilket giver reduceret information om choroidal struktur og funktion uden brug af kontrastmiddel21. Lignende dybdebegrænsninger opleves i optisk kohærenstomografi (OCT). Denne teknik kan generere fundusangiografier i høj opløsning ved hjælp af lysbølger på den tekniske bekostning af dybdeindtrængning23, mens den forbedrede dybdebilleddannelse OCT kan visualisere choroid på bekostning af retinal billeddannelseskvalitet24. Magnetisk resonansbilleddannelse overvinder de optiske begrænsninger ved oftalmoskopi og OCT og kan kortlægge vaskulære lag i nethinden, omend i en lav opløsning25. Histologi og mikrocomputertomografi (μCT) opretholder de optiske teknikkers høje opløsning og giver information om vaskulær morfologi med hele øjne4, men begge teknikker kræver okulær prøveudtagning og er derfor ikke mulige i klinikken eller sjældne eller truede arter. For at overvinde nogle af begrænsningerne ved disse etablerede retinale billeddannelsesteknikker præsenterer undersøgelsen her en ultralydsprotokol på bedøvede dyr, hvor blodbevægelse kortlægges i silico på en række lige store todimensionelle ultralydsscanninger, der spænder over et helt øje ved at anvende en sammenlignelig teknik som beskrevet tidligere til embryonal og kardiovaskulær billeddannelse26,27, 28 og i OLT-angiografi29. Denne tilgang giver mulighed for generering af ikke-invasive tredimensionelle dybe okulære angiografer uden brug af et kontrastmiddel og åbner nye muligheder for kortlægning af blodgennemstrømningsfordelingen i øjet på tværs af arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nedenstående protokol er udført med tilladelse fra Styrelsen for Dyreforsøg under Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri, Fødevarestyrelsen (Tilladelsesnummer 2016-15-0201-00835).

1. Anæstesi og ultralydsmedium

  1. Anæstesi forskningsdyret.
    BEMÆRK: Type og dosis af passende anæstesi er meget artsafhængige. Generelt er nedsænkningsbaserede anæstetika såsom MS-222 (ethyl 3-aminobenzoatmethansulfonsyre), benzocain (ethyl 4-aminobenzoat) og propofol (2,6-diisopropylphenol) nyttige i fisk og padder, som let absorberer bedøvelsesstoffet over gæller eller hud (f.eks. 0,05 mg· L-1 benzocain i regnbueørred). En række opløste forbindelser, der kan administreres intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, er tilgængeligt for amnioter, ligesom gasbaserede anæstetika. Alfaxalon administreret intramuskulært er nyttigt i krybdyr (f.eks. 30 mg · kg-1 i firben), og isofluran administreret som gas er nyttigt hos fugle (f.eks. 2% i luft til duer). Se den offentliggjorte litteratur30,31,32 for et fuldt overblik over tilgængelige anæstetika på tværs af arter.
  2. Test reflekser i dyret for at bekræfte et optimalt niveau af anæstesi. Sørg for, at dyret er helt ubevægeligt under proceduren, da den flowforstærkede ultralydsprocedure er følsom over for bevægelsesstøj.
    1. For dyb anæstesi kan ændre blodgennemstrømningsmønstre, så udfør en dosistitrering i opstartsfasen af et eksperiment.
    2. Forøg anæstesidoseringen i trin og observer blodgennemstrømningen i øjet hjulpet af simpel lysstyrketilstand (B-tilstand) ultralyd.
      BEMÆRK: Et optimalt niveau af anæstesi opnås, når dyret er ubevægeligt (undtagen åndedræt) med synlig okulær blodgennemstrømning.
  3. Hvis typen/dosis af bedøvelsesmiddel ikke er tilladelig for åndedrætsbevægelser, skal du sørge for tilstrækkelig ventilation af dyret, f.eks. ved hjælp af en luftpumpe til at ilte vandet til akvatiske arter eller en ventilator til luftåndingsarter.
  4. Placer dyret i en kropsholdning, der giver direkte adgang ovenfra til øjet.
    BEMÆRK: Afhængigt af art kan dette være i enten liggende eller lateral position. Det kan være nyttigt at konstruere en simpel holdeanordning ved hjælp af et lille stykke ikke-reaktivt metal (f.eks. Rustfrit stål) og løse gummibånd (se figur 1).
  5. Placer passende ultralydsmedium på dyrets øje. Hvis skalerede øjenlåg (ultralyd uigennemtrængelig) dækker øjet, skal du placere disse forsigtigt med en vatpind.
    BEMÆRK: For akvatiske arter er det bedste ultralydsmedium rent tankvand, hvor dyret normalt lever. For jordbaserede arter sikrer en generøs mængde ultralydsgel frie bevægelser og billeddannelse af ultralydstransduceren (dvs. lineær array-sonde) over hele øjets overflade. Vet salve på det kontralaterale øje er påkrævet for jordbaserede arter.

2. 2D og 3D okulær ultralyd billedoptagelse

  1. Placer ultralydstransduceren medial til øjet i enten en dorsal / ventral eller rostral / kaudal orientering afhængigt af ønsket billedorientering.
  2. I B-tilstand, med en maksimal dybdeskarphed, skal du afbilde den mediale og dybeste del af øjet og sørge for, at alle strukturer af interesse er synlige i billedfeltet.
    BEMÆRK: I nogle arter optager den krystallinske linse en forholdsvis stor del af den glasagtige humor, som kan absorbere ultralydet, især ved højere frekvenser.
  3. Oversæt langsomt transduceren til hver side, mens du inspicerer billederne i realtid. Sørg for, at alle strukturer af interesse er synlige i billedfeltet; Hvis ikke, skal du skifte til en transducer med en lavere frekvens og større dybdeskarphed.
    BEMÆRK: Følgende centerfrekvenser giver mulighed for følgende maksimale dybdeskarphed: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (se tabel 1). Disse maksimale dybdeskarphedsværdier kan dog være markant lavere, hvis øjet indeholder forkalkede eller andre ultralydsuigennemtrængelige strukturer.
  4. Juster billeddybde, dybdeforskydning (afstand fra toppen af billedet til den interessante struktur), billedbredde samt antal og placering af brændvidder for at dække det ønskede område af interesse i alle tre rumlige dimensioner (f.eks. 1 cm billeddybde, 2 mm dybdeforskydning, 1 cm billedbredde, en brændvidde).
    BEMÆRK: Selvom specifik navngivning af knapper, der justerer disse parametre, kan variere mellem ultralydssystemer, vil de fleste systemer have knapper med logiske navne til disse justeringer. Disse billedparameterindstillinger påvirker normalt rækkevidden af mulige tidsmæssige opløsninger af ultralydsanskaffelsen.
  5. Indstil billedhastigheden i området 50-120 billeder·s-1.
    BEMÆRK: Den tidsmæssige opløsning (dvs. tidsintervallet mellem successive B-scanninger) skal være tilstrækkelig til at vise stor pixelintensitetsvariation i afbildede blodkar, dvs. den tidsmæssige opløsning må ikke være for høj. På den anden side, for at fuldføre en fuld 3D-optagelse af øjet inden for en rimelig tid, kan tidsmæssig opløsning ikke være for lav. En tidsmæssig opløsning fra 50-120 rammer·s-1 er normalt tilstrækkelig til den flowforstærkede procedure i de fleste arter. På nogle ultralydssystemer kan denne ønskede tidsmæssige opløsning opnås ved at skifte mellem tilstandene "generel billeddannelse" (høj rumlig / lav tidsmæssig opløsning) og "kardiologi" (lav rumlig / høj tidsmæssig opløsning).
  6. Juster 2D-forstærkningen til et niveau (~ 5 dB), så anatomiske strukturer kun lige er synlige i B-mode-erhvervelsen for at øge signal-støj-forholdet i den efterfølgende flow-forbedrede rekonstruktion.
  7. Hvis du vil hente et 2D-flowforbedret billede i en enkelt udsnitsposition, skal du oversætte transduceren til denne position og fortsætte i trin 3.1.
  8. For at erhverve en 3D-optagelse af en hel region af interesse, f.eks. nethinden, skal du oversætte transduceren til en ekstrem af interesseområdet.
    1. For at bestemme den nøjagtige position af den ekstreme ende af interesseområdet skal du øge 2D-gevinsten kort.
    2. Når den korrekte transducerplacering er fuldført, skal du sænke 2D-forstærkningen før optagelse for at sikre maksimalt signal-støj-forhold i den efterfølgende flow-forbedrede rekonstruktion.
  9. For hvert trin (udsnit) i 3D-optagelsen skal du hente ≥100 billeder (optimalt ≥1000 billeder).
  10. Brug en mikromanipulator eller indbygget transducermotor til at oversætte transduceren over hele det område, der er af interesse, i trin på f.eks. 25 μm eller 50 μm (husk at notere trinstørrelsen) og gentag ≥100 frames-anskaffelsen for hvert trin.
  11. Aflive forskningsdyret i henhold til institutionens retningslinjer for dyrepleje.

3. Flow-forbedret billedrekonstruktion

  1. Eksporter optagelserne til digitalt billedbehandlings- og kommunikationsformat i medicin (DICOM) (little-endian).
  2. Hvis du vil producere et enkelt flowforbedret billede baseret på en ≥100 frames (T)-optagelse, skal du beregne standardafvigelsen på pixelniveau (STD(x,y)) ved hjælp af formlen:
    Equation 1
    Hvor It(x,y) er intensiteten af pixlen ved (x,y) pixelkoordinaten på tidspunktet t, og Īt(x,y) er den aritmetiske middelværdi af I over tid.
  3. Gentag trin 3.2 for hvert udsnit i 3D-optagelsen.
  4. Hvis du vil automatisere STD-beregningen og billedgenopbygningsprocessen for flere udsnit i en 3D-optagelse, skal du udføre denne handling i batchtilstand ved hjælp af f.eks. ImageJ og det supplerende makroscript (Supplerende fil 1).
  5. Kombiner alle rekonstruerede udsnit i én billedstak (kommandoen Billeder, der skal stables i ImageJ).
  6. Angiv udsnitstykkelsen ud fra den trinstørrelse, der blev brugt under anskaffelsen (kommandoen Egenskaber i ImageJ).
  7. Gem billedstakken som en 3D TIF-fil.
    BEMÆRK: Flowvægtede tredimensionelle optagelser af okulære blodkar kan efterfølgende bruges til at skabe volumengengivelser og opbygge digitale og fysiske anatomiske modeller af vaskulære strukturer i øjet. Disse billedbehandlingsmuligheder ligger uden for denne protokols anvendelsesområde; Se de tidligere offentliggjorte artikler for flere detaljer33,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den flowforstærkede ultralydsteknik til at afbilde vaskulære senge i øjet kan anvendes i en række arter og er i øjeblikket blevet anvendt i 46 forskellige hvirveldyrarter (figur 1, tabel 1). Tilstedeværelsen af nukleerede røde blodlegemer hos ikke-voksne pattedyrs hvirveldyr giver positiv kontrast af flydende blod sammenlignet med statisk væv i cineoptagelser (Supplerende fil 2). Men når den analyseres ramme for ramme, er den klare skelnen mellem blod og omgivende væv mindre indlysende (figur 2A). Blodgennemstrømningsforbedringsproceduren beskrevet i denne protokol kompilerer i det væsentlige en flertidspunktoptagelse i 2D-rum (et udsnit lavet af T-rammer ) i et enkelt billede, hvor de iboende signalværdiudsving i pixels placeret i flydende blod scorer en højere standardafvigelse end omgivende statisk væv og dermed producerer positiv kontrast (figur 2B). For at opfatte blodkarkontrasten kan Look Up Tables bruges til at producere pseudofarvebilleder (figur 2C). I 3D-erhvervelser kan flere parallelle udsnit med kendt afstand kombineres til 3D-billeddata (supplerende fil 3 og supplerende fil 4), der kan bruges til tredimensionel volumengengivelse (figur 2D) og anatomisk modellering (figur 2E og supplerende fil 5). Doppler-baseret ultralydsbilleddannelse giver også mulighed for specifikt at afbilde blodgennemstrømningen, dog med mindre følsomhed end den beskrevne metode (sammenlign figur 2G med figur 2H og figur 2I), og vigtigst af alt ikke, hvis blodgennemstrømningsorienteringen er direkte eller tæt på vinkelret på lydbølgens retning. Den flowforstærkede procedure, der er beskrevet i denne protokol, er uafhængig af orienteringen af blodgennemstrømningen både i og uden for planet.

Den flow-forbedrede ultralydsprocedure giver mulighed for billeddannelse af blodgennemstrømning i en række arter med nukleerede røde blodlegemer (figur 3A-D). Dybe okulære vaskulære senge som choroid rete mirabile i nogle fisk kan afbildes, hvis de er til stede i arten (gul pilespids i figur 2, figur 3B, figur 4). Metoden er begrænset af fraværet af nukleerede røde blodlegemer hos voksne pattedyr, hvor flowforbedringsproceduren producerer en vis grad af blodgennemstrømningskontrast, men ikke er så tydelig som i arter med nukleerede røde blodlegemer (figur 3E,F).

Flow-forbedret ultralyd er følsom over for bevægelsesstøj, og f.eks. Kan åndedrætsbevægelser forårsage billedsløring og artefakter såsom vævsgrænseforbedring (figur 4A-C, supplerende fil 6). Prospektiv eller retrospektiv gating kan bruges til at justere for bevægelsesstøj (figur 4D,E).

Figure 1
Figur 1: Eksempler på de mange forskellige arter, der er egnede til flow-forbedret ultralydsbilleddannelse af okulær vaskulatur. (A) Guldfisk (Carassius auratus). B) Sibirisk stør (Acipenser baerii). C) Europæisk havbars (Dicentrarchus labrax). (D) Klovnefjerryg (Chitala ornata). (E) Crucian karpe (Carassius carassius). F) Embryonal tamkylling (Gallus gallus domesticus). Det kan være nyttigt at konstruere en simpel holdeanordning ved hjælp af en ikke-reaktiv metalvægt og løse gummibånd (A, C, D). Både store, immobile laboratoriebaserede ultralydsbilleddannelsessystemer kan bruges til proceduren (A-D, F) såvel som små feltoperative systemer (E). Ved billeddannelse af små og meget temperaturfølsomme arter, der ikke kan bevares i et temperaturkontrolleret vandbad som embryonale fugle, kan billeddannelse udføres, mens prøven er inde i inkubatoren (F). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Effekt af flowforbedring på okulære ultralydsscanninger. (A) Eksempler på rå B-mode ultralydsbilleder af øjet på en guldfisk i en 1000 frame cine optagelse. Mens blodgennemstrømningen kan observeres i cineoptagelsen (supplerende fil 2), er det svært at se i statiske rammer. (B) Flowforstærket gråtonebillede (samme udsnit som i A). Både retinale og post-retinale vaskulære senge forbedres. (C) Pseudofarvet version af billedet i B med ImageJ Fire Look Up Table. (D) Volumen-gengivet visning af blodgennemstrømning i øjet på den samme guldfisk som i A-C, baseret på 3D-erhvervelse. (E) To-segment (retinale og post-retinale kar) anatomisk model af øjet i A-D (for interaktiv model se supplerende materiale 5). (F-I) Rå B-mode ultralydsbillede af øjet på en anden guldfisk (F), der sammenligner farve Doppler-baseret flowbilleddannelse (G) med de flowforstærkede metoder, der er beskrevet i denne protokol (H-I, note I er et overlay af H på F). Grønne pile angiver retinale kar, gule pilespidser angiver choroid rete mirabile. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative eksempler på flowforstærkede okulære ultralydsbilleder i en række hvirveldyrarter. (A) Senegal bichir (Polypterus senegalus). (B) Rødbuget piratfisk (Pygocentrus nattereri). C) Grøn leguan (leguan leguan). (D) Embryonal (dag 18) tamkylling (Gallus gallus domesticus). (E) Husmus (Mus musculus). F) Brun rotte (Rattus norvegicus). I arter med nukleerede røde blodlegemer giver flowforbedringsproceduren nyttige billeder af okulær blodgennemstrømning (AD), mens den hos voksne pattedyr (enukleerede røde blodlegemer) kun producerer begrænset kontrast mellem flydende blod og omgivende væv (E-F). Grønne pile angiver retinale kar; blå pilespidser angiver post-retinale kar såsom choriocapillaris; gule pilespidser angiver choroid rete mirabile. I den sene embryonale hjemmekylling kan blodgennemstrømningen i pecten oculi observeres (nedre grøn pil i F). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Åndedrætsbevægelser inducerer bevægelsesstøj, der kan lindres ved retrospektiv gating. (A-B) Eksempel på åndedrætsbevægelser i øjet på en europæisk rødspætte (Pleuronectes platessa). Den røde pisk er på samme billedkoordinat i A (skive 54/410) og B (skive 92/410), men det kan observeres, at øjet har forskudt position (se også cineoptagelse i supplerende materiale 6). (C) Forsøg på at udføre flowforbedringshandlingen på hele 410 billeder, der optager mislykkes på grund af bevægelsesstøj. Vævsgrænser forbedres kunstigt på grund af bevægelser. D) retrospektiv gating-drift baseret på normaliseret signalintensitet (SI) ved den røde prikke i A-B. Kun rammer med normaliseret SI-> 50 (i alt 38 rammer), dvs. angiver, at øjet er i samme position som i B, er inkluderet i flowforbedringsproceduren. (E) Resulterende billede af retrospektivt gated flowforbedringsprocedure. Sammenlign med C. I det lukkede billede undgås kunstig grænseforbedring, og blodgennemstrømning i choroid rete mirabile (gul pilespids) kan observeres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over arter, hvor den flowforstærkede ultralydsteknik til at afbilde okulær blodgennemstrømning er blevet anvendt. Metodens anvendelighed er baseret på evnen til at producere en kontrastrig repræsentation af vaskulære senge sammenlignet med den statiske baggrund. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Makroscript til automatisering af beregninger af flowforbedring. Scriptet er skrevet på IJ1-makrosprog og kan udføres både ved hjælp af ImageJ-makrofunktionen (til optagelse af et enkelt udsnit) eller ImageJ Batch-processen (til 3D-optagelse i flere udsnit). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Rå B-mode cine optagelse på øjet af en guldfisk (Carassius auratus). Blodgennemstrømningen kan observeres, når videoen afspilles, men ikke på en enkelt ramme som i figur 2A. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Skær video gennem øjet på en guldfisk (Carassius auratus) af blodgennemstrømningsforbedrede sektioner. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Tredimensionel TIF-fil af guldfiskens flowforstærkede øje (Carassius auratus). Billeder er blevet kasseret med 3 x 3 x 3 for at minimere filstørrelsen (27 gange reduktion i rumlig opløsning og filstørrelse). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: Interaktiv 3D-model af præ- og post-retinale fartøjer i øjet på en guldfisk (Carassius auratus). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: Rå B-mode cine optagelse på øjet af en europæisk rødspætte (Pleuronectes platessa). Bemærk åndedrætsbevægelser. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vaskulær billeddannelse ved hjælp af flow-forbedret ultralyd giver en ny metode til ikke-invasiv billeddannelse af øjets vaskulatur, der giver flere fordele i forhold til nuværende teknikker, men har sine iboende begrænsninger. Den primære fordel ved flow-forbedret ultralyd er evnen til at generere okulære angiografer med en dybdeskarphed, der overstiger retinal pigmentepitelet, hvilket begrænser dybdeskadsen i optiske teknikker. I ultralydsbilleddannelse bestemmes rumlig opløsning og dybdeskarphed i sidste ende af ultralydstransducerfrekvensen, hvor højere frekvenser øger den rumlige opløsning, men på bekostning af en lavere dybdeskarphed, således at valget af transducerfrekvens introducerer en afvejning mellem billeddybde og rumlig opløsning. Efter vores erfaring opnås optimal retinal ultralydsbilleddannelse ved hjælp af højfrekvente ultralydstransducere (≥50 MHz) i små øjne med billeddybder på <1 cm og lavfrekvente transducere (20-40 MHz) i større øjne med billeddybder på 1,5-3,0 cm. For en 3D-ultralydsscanning indstilles opløsningen af den ekstra skivedimension af trinstørrelsen mellem scanninger i stakken af 2D-ultralydsscanninger. Efter vores erfaring er det vanskeligt at gennemføre en 3D-scanning med en trinstørrelse mindre end 20 μm.

Flow-forbedret 2D ultralyd har en høj tidsmæssig opløsning. Ideelt set kræves der ≥ 1000 billeder pr. billede til flowforstærket vaskulær billeddannelse, så der kræves mindst 8 s pr. Billedscanning. Den tidsmæssige opløsning reduceres betydeligt, når der udføres 3D-flow-forbedrede ultralyd, hvor scanningstiden stiger med antallet af billeder i 3D-stakken af scanninger. I betragtning af den høje tidsmæssige opløsning viser den flowforstærkede 2D-ultralydsarbejdsgang et stærkt potentiale som en metode til at identificere tidsmæssige ændringer i relative blodgennemstrømningshastigheder og blodgennemstrømningsfordeling under eksperimentel manipulation. Således kan fremtidige undersøgelser bruge arbejdsgangen til at identificere, hvordan ændrede miljøforhold (f.eks. Temperatur, pO2, pCO2) eller farmakologisk administration påvirker blodgennemstrømningen i øjet og andre organer.

Ultralydsarbejdsgangen er afhængig af den positive kontrast af nukleerede røde blodlegemer fra de fleste ikke-pattedyrs hvirveldyr. Således giver de enukleerede røde blodlegemer hos voksne pattedyr og nogle salamanderarter37 for lidt kontrast til effektivt at forbedre blodgennemstrømningen ved hjælp af den nuværende arbejdsgang (figur 3E,F). I traditionelle ultralydsarbejdsgange giver vaskulær injektion af mikrobobler høj nok kontrast til at identificere vaskulaturen hos pattedyr38, som er blevet brugt til at generere vaskulære angiografer af retrobulbarkarrene i rotteøjet39. Mikroboblerne brister imidlertid inden for få minutter, så genereringen af 3D-angiografer kræver successive mikrobobleinjektioner.

Flowforstærket ultralyd afhænger af sekventielle optagelser i samme position af øjet, så teknikken er ikke mulig hos vågne dyr, hvor mindre tilfældige bevægelser kan opveje billedet og underminere flowforbedringsberegninger. Således skal den nuværende metode udføres under korrekt anæstesi til immobilisering for at forbedre billedkvaliteten ved at reducere tilfældige bevægelser. Regelmæssige bevægelser af øjet, der opstår under regelmæssige åndedrætsbevægelser, kan dog opvejes af prospektivt eller retrospektivt gating til dyrets ventilationsmønster, så kun scanningsoptagelse fra det samme tidsinterval inden for ventilationscyklussen anvendes i dataanalysen. Mens den retrospektive gating-tilgang til at udligne ventilatoriske bevægelser af billedet forbedrer billedstabiliteten betydeligt, reducerer den markant antallet af billeder, der er inkluderet i beregningen af standardafvigelsen for signalintensitet, hvilket fører til et fald i signal-støj-forholdet (sammenlign figur 4E med figur 2C og figur 2I ). Denne effekt lindres ved hjælp af prospektiv gating ved ultralydsscanneren, hvor billeddata kun erhverves, når dyret er i den ønskede respirationsfase. Dette medfører dog en markant stigning i anskaffelsestiden, hvis det ønskede antal rammer ≥ 1000 skal erhverves.

Vi ser flere anvendelser inden for zoologisk og veterinær forskning til den flow-forbedrede ultralydsarbejdsgang for at kortlægge fysiologien og anatomien af øjets vaskulatur. Vaskulaturen hos ray-finned fisk, pattedyr og fugle er relativt velbeskrevet1,3,4,8,9,12,15,40, men dette er ikke tilfældet for ikke-benede fisk (kæbeløse hvirveldyr og chondrichthyans), padder og krybdyr, der repræsenterer deres respektive tidligere divergerende søstergrupper. Implementering af flowforstærket ultralyd på disse dårligt forståede dyregrupper og integrering af disse data med viden om de mere velstudiegrupper vil give grundlæggende indsigt i udviklingen af hvirveldyrøjets vaskulatur. Fordi øjets vaskulatur er ens i nært beslægtede arter4, vil sådanne detaljerede oplysninger om okulær vaskulatur i en bred vifte af arter give dyrlæger et referencepunkt til at identificere misdannelser i øjets vaskulatur på grund af udviklingsfejl, sygdomme eller fysiske skader. Desuden giver evnen til at erhverve 2D-blodgennemstrømningsinformation med en høj spatiotemporal opløsning midlerne til at kvantificere farmakokinetiske virkninger på blodgennemstrømningsfordelingen i dybe vaskulære senge med store anvendelser inden for lægemiddeludvikling og testning. Fremtidige undersøgelser af denne teknik bør fokusere på at identificere injicerbare forbindelser, der forbedrer blodets kontrast i arter med enukleerede røde blodlegemer, hvilket vil udvide anvendeligheden af denne teknik til pattedyr med store anvendelser inden for biomedicinsk forskning og klinisk diagnostik af vaskulær dysfunktion i øjet og andre dybe vaskulære senge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke findes nogen fuldstændige interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde har modtaget støtte fra Carlsbergfondet (CF17-0778; CF18-0658), Lundbeckfonden (R324-2019-1470; R346-2020-1210), Velux Fondene (00022458), A.P. Møller Fonden til Fremme af Lægevidenskaben, EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-bevillingsaftalen (nr. 754513) og Aarhus Universitets Forskningsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-222 Sigma E10521-50G
Benzocaine Sigma E-1501
Propofol B Braun
12260470_0320
Alfaxalon Jurox NA
Isoflurane Zoetis 50019100
Ultrasound scanner VisualSonics Vevo 2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary. Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).
  2. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 175-208 (2001).
  3. Country, M. W. Retinal metabolism: A comparative look at energetics in the retina. Brain Research. 1672, 50-57 (2017).
  4. Damsgaard, C., et al. Retinal oxygen supply shaped the functional evolution of the vertebrate eye. Elife. , 8 (2019).
  5. Buttery, R. G., Hinrichsen, C. F. L., Weller, W. L., Haight, J. R. How thick should a retina be? A comparative study of mammalian species with and without intraretinal vasculature. Vision Research. 31 (2), 169-187 (1991).
  6. Ames, A., Li, Y., Heher, E., Kimble, C. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
  7. Chase, J. The Evolution of retinal vascularization in mammals: A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  8. Johnson, G. L. Ophthalmoscopic studies on the eyes of mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 254 (794), 207-220 (1968).
  9. Johnson, G. L. I. Contributions to the comparative anatomy of the mammalian eye, chiefly based on ophthalmoscopic examination. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 194 (194-206), 1-82 (1901).
  10. Rodriguez-Ramos Fernandez, J., Dubielzig, R. R. Ocular comparative anatomy of the family Rodentia. Veterinary Ophthalmology. 16, 94-99 (2013).
  11. Copeland, D. E. Functional vascularization of the teleost eye. Current Topics in Eye Research. 3, 219-280 (1980).
  12. Meyer, D. B. The Visual System in Vertebrates. Handbook of Sensory Physiology. Crescitelli, F. 7, Springer. Berlin, Heidelberg. (1977).
  13. Potier, S., Mitkus, M., Kelber, A. Visual adaptations of diurnal and nocturnal raptors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 106, 116-126 (2020).
  14. Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. Active secretion of oxygen into the eye of fish. Nature. 194, 106-107 (1962).
  15. Damsgaard, C. Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye. Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840 (2021).
  16. Damsgaard, C., et al. A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina. Elife. 9, (2020).
  17. Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).
  18. Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).
  19. Berenbrink, M. Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes. Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).
  20. Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system. Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).
  21. Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: State of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
  22. Yung, M., Klufas, M. A., Sarraf, D. Clinical applications of fundus autofluorescence in retinal disease. International Journal of Retina and Vitreous. 2 (1), 12 (2016).
  23. Ang, M., et al. Optical coherence tomography angiography: a review of current and future clinical applications. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (2), 237-245 (2018).
  24. Spaide, R. F., Koizumi, H., Pozonni, M. C. Enhanced depth imaging spectral-domain optical coherence tomography. American Journal of Ophthalmology. 146 (4), 496-500 (2008).
  25. Shen, Q., et al. Magnetic resonance imaging of tissue and vascular layers in the cat retina. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 23 (4), 465-472 (2006).
  26. Tan, G. X., Jamil, M., Tee, N. G., Zhong, L., Yap, C. H. 3D reconstruction of chick embryo vascular geometries using non-invasive high-frequency ultrasound for computational fluid dynamics studies. Annals of Biomedical Engineering. 43 (11), 2780-2793 (2015).
  27. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ dynamics and fluid dynamics of the HH25 chick embryonic cardiac ventricle as revealed by a novel 4D high-frequency ultrasound imaging technique and computational flow simulations. Annals of Biomedical Engineering. 45 (10), 2309-2323 (2017).
  28. Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e57089 (2018).
  29. Jia, Y., et al. Split-spectrum amplitude-decorrelation angiography with optical coherence tomography. Optics Express. 20 (4), 4710-4725 (2012).
  30. Clarke, K. W., Trim, C. M., Trim, C. M. Veterinary Anaesthesia E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2013).
  31. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. , Elsevier Science & Technology. (2015).
  32. West, G., Heard, D., Caulkett, N. Zoo Animal and Wildlife Immobilization and Anesthesia. , John Wiley & Sons, Inc. (2014).
  33. Lauridsen, H., Hansen, K., Nørgård, M. Ø, Wang, T., Pedersen, M. From tissue to silicon to plastic: three-dimensional printing in comparative anatomy and physiology. Royal Society Open Science. 3 (3), 150643 (2016).
  34. Lauridsen, H., et al. Inside out: Modern imaging techniques to reveal animal anatomy. PLoS One. 6 (3), 17879 (2011).
  35. Ruthensteiner, B., Heß, M. Embedding 3D models of biological specimens in PDF publications. Microscopy Research and Technique. 71 (11), 778-786 (2008).
  36. Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep vascular imaging in the eye with flow-enhanced ultrasound. bioRxiv. , 447055 (2021).
  37. Mueller, R. L., Ryan Gregory, T., Gregory, S. M., Hsieh, A., Boore, J. L. Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders. Zoology. 111 (3), 218-230 (2008).
  38. Greis, C. Quantitative evaluation of microvascular blood flow by contrast-enhanced ultrasound (CEUS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 49, 137-149 (2011).
  39. Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye. Experimental Eye Research. 193, 107986 (2020).
  40. Walls, G. L. The vertebrate eye and its adaptive radiation. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).

Tags

Biologi udgave 176
Dyb vaskulær billeddannelse i øjet med flow-forbedret ultralyd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep… More

Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound. J. Vis. Exp. (176), e62986, doi:10.3791/62986 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter