Summary
We presenteren een niet-invasieve ultrasone techniek voor het genereren van driedimensionale angiografieën in het oog zonder het gebruik van contrastmiddelen.
Abstract
Het netvlies in het oog is een van de meest energie-eisende weefsels in het lichaam en vereist dus hoge snelheden van zuurstofafgifte van een rijke bloedtoevoer. De capillaire lamina van het vaatvlies bekleedt het buitenoppervlak van het netvlies en is de dominante bron van zuurstof in de meeste gewervelde netvliezen. Dit vaatbed is echter een uitdaging om in beeld te brengen met traditionele optische technieken vanwege de positie achter het zeer lichtabsorberende netvlies. Hier beschrijven we een hoogfrequente echografietechniek met daaropvolgende flow-enhancement om diepe vaatbedden (0,5-3 cm) van het oog met een hoge spatiotemporale resolutie in beeld te brengen. Deze niet-invasieve methode werkt goed bij soorten met nucleated rode bloedcellen (niet-zoogdier- en foetale diermodellen). Het maakt het genereren van niet-invasieve driedimensionale angiografieën mogelijk zonder het gebruik van contrastmiddelen, en het is onafhankelijk van bloedstroomhoeken met een hogere gevoeligheid dan op Doppler gebaseerde ultrasone beeldvormingstechnieken.
Introduction
Het hoge metabolisme op het netvlies van de gewervelde dieren legt een intrinsieke afweging op tussen twee contrasterende behoeften; hoge bloedstroomsnelheden en een licht pad zonder bloedvaten. Om visuele verstoring van het perfuseren van rode bloedcellen te voorkomen, ontvangt het netvlies van alle gewervelde dieren zuurstof en voedingsstoffen via een vel haarvaten achter de fotoreceptoren, de choriocapillaris1,2,3. Deze enkele bron van voedingsstoffen en zuurstof legt echter een diffusiebeperking op tot de dikte van het netvlies4,5, dus veel visueel actieve soorten bezitten een verscheidenheid aan uitgebreide vasculaire netwerken om extra bloedtoevoer naar dit metabolisch actieve orgaan te bieden6. Deze vaatbedden omvatten bloedvaten die de interne retinale lagen doordrenken bij zoogdieren en sommige vissen4,7,8,9,10, bloedvaten aan de binnenkant (licht gericht) van het netvlies die bij veel vissen, reptielen en vogels worden aangetroffen4,11,12,13, en tegenstroom vasculaire arrangementen van het vischoroïde, de vaatvliesrete mirabile, dat de vorming van superatmosfeer zuurstof partiële drukken14,15,16,17,18,19,20 mogelijk maakt. Ondanks het feit dat deze extra niet-choroïdale paden voor retinale nutriëntentoevoer een essentiële rol spelen bij het voeden van de metabolische vereisten van superieur zicht4, is de driedimensionale anatomie van deze vasculaire structuren slecht begrepen, waardoor ons begrip van de morfologische evolutie van het gewervelde oog wordt beperkt.
Traditioneel is retinale bloedtoevoer bestudeerd met behulp van optische technieken, zoals fundus oftalmoscopie. Deze categorie technieken biedt high-throughput niet-destructieve informatie over niet-choroïdale bloedvatanatomie in hoge resolutie21 en wordt daarom gemakkelijk gebruikt bij de klinische diagnose van afwijkingen in de retinale vaatstructuur22. Het retinale pigmentepitheel absorbeert echter het doorgelaten licht en beperkt de beelddiepte in deze optische technieken, waardoor minder informatie over de choroïdale structuur en functie wordt verkregen zonder het gebruik van contrastmiddel21. Vergelijkbare dieptebeperkingen worden ervaren in optische coherentietomografie (OCT). Deze techniek kan fundusangiografieën met hoge resolutie genereren met behulp van lichtgolven ten koste van dieptepenetratie23, terwijl de verbeterde dieptebeeldvorming OCT het vaatvlies kan visualiseren ten koste van de retinale beeldvormingskwaliteit24. Magnetische resonantie beeldvorming overwint de optische beperkingen van oftalmoscopie en OCT en kan vasculaire lagen in het netvlies in kaart brengen, zij het met een lage resolutie25. Histologie en microcomputed tomografie (μCT) handhaven de hoge resolutie van de optische technieken en geven informatie over vasculaire morfologie voor het hele oog4, maar beide technieken vereisen oculaire bemonstering en zijn daarom niet mogelijk in de kliniek of zeldzame of bedreigde soorten. Om enkele van de beperkingen van deze gevestigde retinale beeldvormingstechnieken te overwinnen, presenteert de studie hier een echografieprotocol op verdoofde dieren, waarbij de bloedbeweging in silico in kaart wordt gebracht op een reeks gelijk verdeelde tweedimensionale echografieën die een heel oog overspannen door een vergelijkbare techniek toe te passen zoals eerder beschreven voor embryonale en cardiovasculaire beeldvorming26,27, 28 en in OCT angiografie29. Deze aanpak maakt het mogelijk om niet-invasieve driedimensionale diepe oculaire angiografieën te genereren zonder een contrastmiddel te gebruiken en opent nieuwe wegen voor het in kaart brengen van de bloedstroomverdeling in het oog over soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderstaande protocol is uitgevoerd met toestemming van de Deense inspectie voor dierproeven binnen het Deense ministerie van Voedsel, Landbouw en Visserij, Deense veterinaire en voedseladministratie (vergunningsnummer 2016-15-0201-00835).
1. Anesthesie en echografie medium
- Verdoof het onderzoeksdier.
OPMERKING: Type en dosis van geschikte anesthesie zijn sterk soortafhankelijk. Over het algemeen zijn op onderdompeling gebaseerde anesthetica zoals MS-222 (ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonzuur), benzocaïne (ethyl 4-aminobenzoaat) en propofol (2,6-diisopropylfenol) nuttig bij vissen en amfibieën die gemakkelijk het anestheticum over kieuwen of huid absorberen (bijv. 0,05 mg · L-1 benzocaïne in regenboogforel). Een reeks opgeloste verbindingen die intraveneus, intramusculair, intraperitoneaal kunnen worden toegediend, is beschikbaar voor vruchtwater, net als op gas gebaseerde anesthetica. Alfaxalon intramusculair toegediend is nuttig bij reptielen (bijv. 30 mg·kg-1 bij hagedissen), en isofluraan toegediend als gas is nuttig bij vogels (bijv. 2% in lucht voor duiven). Raadpleeg de gepubliceerde literatuur30,31,32 voor een volledig overzicht van de beschikbare anesthetica voor verschillende soorten. - Test reflexen in het dier om een optimaal niveau van anesthesie te bevestigen. Zorg ervoor dat het dier volledig onbeweeglijk is tijdens de procedure, omdat de stroomverbeterde ultrasone procedure gevoelig is voor bewegingsgeluid.
- Te diepe anesthesie kan de bloedstroompatronen veranderen, dus voer een dosistitratie uit in de opstartfase van een experiment.
- Verhoog de anesthesiedosering in stappen en observeer de bloedstroom in het oog geholpen door eenvoudige helderheidsmodus (B-modus) echografie.
OPMERKING: Een optimaal niveau van anesthesie wordt verkregen wanneer het dier onbeweeglijk is (behalve ademhaling) met zichtbare oculaire bloedstroom.
- Als het type/de dosis verdovingsmiddel niet toelaatbaar is voor ademhalingsbewegingen, zorg dan voor voldoende ventilatie van het dier, bijvoorbeeld met behulp van een luchtpomp om het water voor aquatische soorten van zuurstof te voorzien of een ventilator voor luchtademende soorten.
- Plaats het dier in een houding die directe toegang van bovenaf tot het oog mogelijk maakt.
OPMERKING: Afhankelijk van de soort kan dit in rugligging of zijdelingse positie zijn. Het kan nuttig zijn om een eenvoudig houderapparaat te bouwen met behulp van een klein stukje niet-reactief metaal (bijv. Roestvrij staal) en losse elastiekjes (zie figuur 1). - Plaats het juiste ultrasone medium op het oog van het dier. Als geschubde oogleden (echografie ondoordringbaar) het oog bedekken, verplaats deze dan voorzichtig met een wattenstaafje.
OPMERKING: Voor aquatische soorten is het beste ultrasone medium schoon tankwater waarin het dier meestal leeft. Voor terrestrische soorten zorgt een royale hoeveelheid ultrasone gel voor vrije bewegingen en beeldvorming van de ultrasone transducer (d.w.z. lineaire array-sonde) over het hele oppervlak van het oog. Dierenartszalf op het contralaterale oog is vereist voor terrestrische soorten.
2. 2D en 3D oculaire echografie beeldverwerving
- Plaats de ultrasone transducer mediaal naar het oog in een dorsale / ventrale of rostrale / caudale oriëntatie, afhankelijk van de gewenste beeldoriëntatie.
- In B-modus, met een maximale scherptediepte, beeld je het mediale en diepste deel van het oog af en zorg je ervoor dat alle interessante structuren zichtbaar zijn in het beeldveld.
OPMERKING: Bij sommige soorten neemt de kristallijne lens een relatief groot deel van de glasvochthumor in beslag, die de echografie kan absorberen, vooral bij hogere frequenties. - Vertaal de transducer langzaam naar elke kant terwijl u de realtime beelden inspecteert. Zorg ervoor dat alle interessante structuren zichtbaar zijn in het afbeeldingsveld; zo niet, schakel dan over op een transducer met een lagere frequentie en grotere scherptediepte.
OPMERKING: De volgende middenfrequenties zorgen voor de volgende maximale scherptediepte: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (zie tabel 1). Deze maximale scherptedieptewaarden kunnen echter aanzienlijk lager zijn als het oog verkalkte of andere ultrasone ondoordringbare structuren bevat. - Pas de beelddiepte, diepteverschuiving (afstand van de bovenkant van de afbeelding tot de interessante structuur), beeldbreedte, evenals aantal en positie van brandpuntszones aan om het gewenste interessegebied in alle drie de ruimtelijke dimensies te bestrijken (bijvoorbeeld 1 cm beelddiepte, 2 mm diepteverschuiving, 1 cm beeldbreedte, één brandpuntszone).
OPMERKING: Hoewel de specifieke naamgeving van knoppen die deze parameters aanpassen kan variëren tussen echografiesystemen, hebben de meeste systemen knoppen met logische namen voor deze aanpassingen. Deze beeldparameterinstellingen hebben meestal invloed op het bereik van mogelijke temporele resoluties van de ultrasone acquisitie. - Stel de framesnelheid in het bereik van 50-120 frames·s-1 in.
OPMERKING: De temporele resolutie (d.w.z. het tijdsinterval tussen opeenvolgende B-scans) moet voldoende zijn om grote pixelintensiteitsvariabiliteit in afgebeelde bloedvaten weer te geven, d.w.z. de temporele resolutie mag niet te hoog zijn. Aan de andere kant, om een volledige 3D-opname van het oog binnen een redelijke tijd te voltooien, kan de temporele resolutie niet te laag zijn. Een temporele resolutie variërend van 50-120 frames·s-1 is meestal voldoende voor de flow-enhanced procedure bij de meeste soorten. Op sommige echografiesystemen kan deze gewenste temporele resolutie worden verkregen door te schakelen tussen de modi "algemene beeldvorming" (hoge ruimtelijke / lage temporele resolutie) en "cardiologie" (lage ruimtelijke / hoge temporele resolutie). - Pas de 2D-versterking aan op een niveau (~ 5 dB), zodat anatomische structuren slechts net zichtbaar zijn in de B-modus acquisitie om de signaal-ruisverhouding te verhogen in de daaropvolgende flow-verbeterde reconstructie.
- Als u een 2D-stroomverbeterd beeld wilt verkrijgen op een enkele segmentpositie, vertaalt u de transducer naar deze positie en gaat u verder met stap 3.1.
- Om een 3D-opname van een heel interessegebied te verkrijgen, bijvoorbeeld het netvlies, vertaalt u de transducer naar het ene uiterste van het interessegebied.
- Om de exacte positie van het uiterste uiteinde van het interessegebied te bepalen, verhoogt u de 2D-versterking kort.
- Nadat de juiste plaatsing van de transducer is voltooid, verlaagt u de 2D-versterking vóór de opname om een maximale signaal-ruisverhouding te garanderen in de daaropvolgende stroomverbeterde reconstructie.
- Verwerf voor elke stap (slice) in de 3D-opname ≥100 frames (optimaal ≥1000 frames).
- Vertaal met behulp van een micromanipulator of ingebouwde transducermotor de transducer over het hele interessegebied in stappen van bijvoorbeeld 25 μm of 50 μm (vergeet niet de stapgrootte te noteren) en herhaal de ≥100 frames acquisitie voor elke stap.
- Euthanaseer het onderzoeksdier volgens de richtlijnen voor dierverzorging van de instelling.
3. Flow-enhanced beeldreconstructie
- Exporteer de opnames naar digital imaging and communications in medicine (DICOM) bestandsformaat (little-endian).
- Als u één vloeiende afbeelding wilt maken op basis van een opname van ≥ 100 frames (T), berekent u de standaardafwijking op pixelniveau (STD(x,y)) met behulp van de formule:
Waarbij It(x,y) de intensiteit is van de pixel op de (x,y) pixelcoördinaat op tijdstip t, en Īt(x,y) de rekenkundige gemiddelde waarde van I in de tijd. - Herhaal stap 3.2 voor elk segment in de 3D-opname.
- Om het STD-berekenings- en beeldreconstructieproces voor meerdere segmenten in een 3D-opname te automatiseren, voert u deze bewerking uit in batchmodus met behulp van bijvoorbeeld ImageJ en het aanvullende macroscript (Aanvullend bestand 1).
- Combineer alle gereconstrueerde segmenten in één afbeeldingsstapel (opdracht Afbeeldingen naar stapel in AfbeeldingJ).
- Geef de segmentdikte op van de stapgrootte die tijdens de acquisitie wordt gebruikt (opdracht Eigenschappen in AfbeeldingJ).
- Sla de afbeeldingsstapel op als een 3D TIF-bestand.
OPMERKING: Flow-gewogen driedimensionale opnames van oculaire bloedvaten kunnen vervolgens worden gebruikt om volumeweergaven te maken en digitale en fysieke anatomische modellen van vasculaire structuren van het oog te bouwen. Deze beeldverwerkingsopties vallen buiten het bestek van dit protocol; zie de eerder gepubliceerde artikelen voor meer details33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De flow-enhanced ultrasone techniek om vaatbedden van het oog in beeld te brengen kan worden toegepast in een reeks soorten en is momenteel gebruikt bij 46 verschillende gewervelde soorten (figuur 1, tabel 1). De aanwezigheid van kernvormige rode bloedcellen in niet-volwassen gewervelde zoogdieren zorgt voor een positief contrast van stromend bloed in vergelijking met statisch weefsel in cine-opnames (aanvullend dossier 2). Wanneer het echter frame voor frame wordt geanalyseerd, is het duidelijke onderscheid tussen bloed en het omliggende weefsel minder duidelijk (figuur 2A). De in dit protocol beschreven bloedstroomverbeteringsprocedure compileert in wezen een multi-time point-opname in 2D-ruimte (een plak gemaakt van T-frames ) in een enkel beeld waarin de inherente signaalwaardefluctuaties in pixels in stromend bloed een hogere standaarddeviatie scoren dan omringend statisch weefsel, waardoor positief contrast wordt geproduceerd (figuur 2B). Om het bloedvatcontrast waarneembaar te verbeteren, kunnen Look Up Tables worden gebruikt om pseudocolor-afbeeldingen te produceren (figuur 2C). Bij 3D-acquisities kunnen meerdere parallelle segmenten met bekende spatiëring worden gecombineerd tot 3D-beeldgegevens (aanvullend bestand 3 en aanvullend bestand 4) die kunnen worden gebruikt voor driedimensionale volumerendering (figuur 2D) en anatomische modellering (figuur 2E en aanvullend bestand 5). Doppler-gebaseerde echografie biedt ook de mogelijkheid om specifiek de bloedstroom in beeld te brengen, maar met minder gevoeligheid dan de beschreven methode (vergelijk figuur 2G met figuur 2H en figuur 2I), en belangrijk niet als de oriëntatie van de bloedstroom direct of dicht bij loodrecht op de richting van de geluidsgolf staat. De flow-enhanced procedure beschreven in dit protocol is onafhankelijk van de oriëntatie van de bloedstroom, zowel in het vlak als buiten het vlak.
De flow-enhanced ultrasone procedure maakt beeldvorming van de bloedstroom mogelijk in een reeks soorten met nucleaire rode bloedcellen (figuur 3A-D). Diepe oculaire vaatbedden zoals de vaatvliesrete mirabile bij sommige vissen kunnen worden afgebeeld als ze in de soort aanwezig zijn (gele pijlpunt in figuur 2, figuur 3B, figuur 4). De methode wordt beperkt door de afwezigheid van nucleated rode bloedcellen bij volwassen zoogdieren waarbij de flow enhancement procedure een zekere mate van bloedstroomcontrast produceert, maar niet zo verschillend is als bij soorten met nucleated rode bloedcellen (Figuur 3E,F).
Flow-enhanced ultrasound is gevoelig voor bewegingsruis en ademhalingsbewegingen kunnen bijvoorbeeld beeldvervaging en artefacten zoals weefselrandverbetering veroorzaken (Figuur 4A-C, Aanvullend bestand 6). Prospectieve of retrospectieve gating kan worden gebruikt om te corrigeren voor bewegingsruis (figuur 4D,E).
Figuur 1: Voorbeelden van de verscheidenheid aan soorten die geschikt zijn voor flow-enhanced echografie van oculaire vasculatuur. (A) Goudvis (Carassius auratus). (B) Siberische steur (Acipenser baerii). (C) Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax). (D) Clown featherback (Chitala ornata). (E) Krokooikarper (Carassius carassius). (F) Embryonale als huisdier gehouden kip (Gallus gallus domesticus). Het kan nuttig zijn om een eenvoudig houdapparaat te bouwen met behulp van een niet-reactief metalen gewicht en losse elastiekjes (A, C, D). Zowel grote, immobiele laboratoriumgebaseerde echografiesystemen kunnen worden gebruikt voor de procedure (A-D, F) als kleine veldoperatieve systemen (E). Bij het afbeelden van kleine en zeer temperatuurgevoelige soorten die niet kunnen worden vastgehouden in een temperatuurgecontroleerd waterbad zoals embryonale vogels, kan beeldvorming worden uitgevoerd terwijl het monster zich in de incubator bevindt (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effect van stromingsverbetering op oculaire echografieën. (A) Voorbeelden van ruwe B-modus echografische beelden van het oog van een goudvis in een 1000 frame cine-opname. Terwijl de bloedstroom kan worden waargenomen in de cine-opname (aanvullend dossier 2), is het moeilijk om in statische frames te zien. (B) Afbeelding met verbeterde grijswaarden (hetzelfde segment als in A). Zowel retinale als post-retinale vaatbedden zijn verbeterd. (C) Pseudo-gekleurde versie van de afbeelding in B met ImageJ Fire Look Up Table. (D) Volume-weergegeven weergave van de bloedstroom in het oog van dezelfde goudvis als in A-C, op basis van 3D-acquisitie. (E) Twee-segment (retinale en post-retinale vaten) anatomisch model van het oog in A-D (voor interactief model zie aanvullend materiaal 5). (F-I) Ruwe B-modus echografische afbeelding van het oog van een andere goudvis (F) die kleur Doppler gebaseerde flow imaging (G) vergelijkt met de flow-enhanced methoden beschreven in dit protocol (H-I, opmerking I is een overlay van H op F). Groene pijlen geven retinale vaten aan, gele pijlpunten geven de vaatvliesrete mirabile aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve voorbeelden van flow-enhanced oculaire echografiebeelden bij een verscheidenheid aan gewervelde soorten. (A) Senegal bichir (Polypterus senegalus). (B) Roodbuikpiranha (Pygocentrus nattereri). (C) Groene leguaan (Iguana iguana). D) Embryonale (dag 18) als huisdier gehouden kip (Gallus gallus domesticus). (E) Huismuis (Mus musculus). (F) Bruine rat (Rattus norvegicus). Bij soorten met nucleated rode bloedcellen levert de flow-enhancement procedure nuttige beelden op van de oculaire bloedstroom (A-D), terwijl het bij volwassen zoogdieren (enucleated rode bloedcellen) slechts een beperkt contrast produceert tussen stromend bloed en het omliggende weefsel (E-F). Groene pijlen geven retinale vaten aan; blauwe pijlpunten geven post-retinale vaten aan, zoals de choriocapillaris; gele pijlpunten duiden op vaatvliesrete mirabile. Bij de late embryonale gedomesticeerde kip kan de bloedstroom in de pecten oculi worden waargenomen (onderste groene pijl in F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ademhalingsbewegingen induceren bewegingsgeluid dat kan worden verlicht door retrospectieve gating. (A-B) Voorbeeld van ademhalingsbewegingen in het oog van een Europese schol (Pleuronectes platessa). De rode stip bevindt zich op dezelfde beeldcoördinaat in A (plak 54/410) en B (plak 92/410), maar er kan worden waargenomen dat het oog van een verschoven positie is (zie ook cine-opname in aanvullend materiaal 6). (C) Poging om de stroomverbeterende bewerking uit te voeren op de volledige opname van 410 frames mislukt vanwege bewegingsruis. Weefselranden worden kunstmatig versterkt door bewegingen. (D) retrospectieve gating-operatie op basis van genormaliseerde signaalintensiteit (SI) op de rode stip in A-B. Alleen frames met genormaliseerde SI-> 50 (in totaal 38 frames), d.w.z. wat aangeeft dat het oog zich op dezelfde positie bevindt als in B, zijn opgenomen voor de stroomverbeteringsprocedure. (E) Resulterend beeld van retrospectief gated flow-enhancement procedure. Vergelijk met C. In de gated image wordt kunstmatige randverbetering vermeden en kan de bloedstroom in de choroid rete mirabile (gele pijlpunt) worden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Lijst van soorten waarop de flow-enhanced ultrasound-techniek is gebruikt om de oculaire bloedstroom in beeld te brengen. De toepasbaarheid van de methode is gebaseerd op het vermogen om een contrastrijke weergave van vaatbedden te produceren in vergelijking met de statische achtergrond. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Macroscript om stroomverbeterende berekeningen te automatiseren. Het script is geschreven in IJ1 Macro-taal en kan zowel worden uitgevoerd met behulp van de ImageJ-macrofunctie (voor opname met één segment) als het ImageJ Batch-proces (voor 3D-opname met meerdere segmenten). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: Ruwe B-mode cine-opname op het oog van een goudvis (Carassius auratus). De bloedstroom kan worden waargenomen terwijl de video wordt afgespeeld, maar niet op een enkel frame zoals in figuur 2A. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Snijd video door het oog van een goudvis (Carassius auratus) van bloedstroomverbeterde secties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 4: Driedimensionaal TIF-bestand van het stroomversterkte oog van goudvissen (Carassius auratus). Afbeeldingen zijn met 3 x 3 x 3 in de prullenbak geplaatst om de bestandsgrootte te minimaliseren (27-voudige vermindering van de ruimtelijke resolutie en bestandsgrootte). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 5: Interactief 3D-model van pre- en post-retinale vaten in het oog van een goudvis (Carassius auratus). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 6: Ruwe B-mode cine-opname op het oog van een Europese schol (Pleuronectes platessa). Let op ademhalingsbewegingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vasculaire beeldvorming met behulp van flow-enhanced echografie biedt een nieuwe methode voor niet-invasieve beeldvorming van de vasculatuur van het oog die verschillende voordelen biedt ten opzichte van de huidige technieken, maar zijn intrinsieke beperkingen heeft. Het belangrijkste voordeel van flow-enhanced echografie is het vermogen om oculaire angiografieën te genereren met een scherptediepte die het retinale pigmentepitheel overschrijdt, wat de scherptediepte in optische technieken beperkt. In echografie worden ruimtelijke resolutie en scherptediepte uiteindelijk bepaald door de ultrasone transducerfrequentie, waarbij hogere frequenties de ruimtelijke resolutie verhogen, maar ten koste van een ondiepere scherptediepte, dus de keuze van de transducerfrequentie introduceert een afweging tussen beelddiepte en ruimtelijke resolutie. In onze ervaring wordt optimale retinale echografie bereikt met behulp van hoogfrequente ultrasone transducers (≥50 MHz) in kleine ogen met beelddiepten van <1 cm en lagere frequentie transducers (20-40 MHz) in grotere ogen met beelddiepten van 1,5-3,0 cm. Voor een 3D-echografie wordt de resolutie van de extra segmentdimensie ingesteld door de stapgrootte tussen scans in de stapel 2D-echografieën. Onze ervaring is dat het lastig is om een 3D-scan uit te voeren met een stapmaat kleiner dan 20 μm.
Flow-enhanced 2D echografie heeft een hoge temporele resolutie. Idealiter zijn ≥1000 frames per afbeelding vereist voor flow-enhanced vasculaire beeldvorming, dus er zijn ten minste 8 s nodig per beeldscan. De temporele resolutie wordt aanzienlijk verminderd bij het uitvoeren van 3D-stroomverbeterde echografieën, waarbij de scantijd toeneemt met het aantal afbeeldingen in de 3D-stapel scans. Gezien de hoge temporele resolutie, toont de flow-verbeterde 2D-echografieworkflow een sterk potentieel als een methode voor het identificeren van temporele veranderingen in relatieve bloedstroomsnelheden en bloedstroomverdeling tijdens experimentele manipulatie. Toekomstige studies kunnen de workflow dus gebruiken om te identificeren hoe veranderde omgevingsomstandigheden (bijv. Temperatuur, pO2, pCO2) of farmacologische toediening de bloedstroom in het oog en andere organen beïnvloeden.
De ultrasone workflow is gebaseerd op het positieve contrast van nucleaire rode bloedcellen van de meeste niet-zoogdiergewervelde dieren. De enucleated rode bloedcellen van volwassen zoogdieren en sommige salamandersoorten37 bieden dus te weinig contrast om de bloedstroom effectief te verbeteren met behulp van de huidige workflow (figuur 3E, F). In traditionele ultrasone workflows biedt vasculaire injectie van microbubbels een voldoende hoog contrast om de vasculatuur bij zoogdieren te identificeren38, die is gebruikt om vasculaire angiografieën van de retrobulbaire vaten in het oog van de rat te genereren39. De microbubbels barsten echter binnen enkele minuten, dus het genereren van 3D-angiografieën vereist opeenvolgende microbubbelinjecties.
Flow-enhanced echografie is afhankelijk van sequentiële opnames in dezelfde positie van het oog, dus de techniek is niet mogelijk bij wakkere dieren, waar kleine willekeurige bewegingen het beeld kunnen compenseren en stroomversterkende berekeningen kunnen ondermijnen. De huidige methode moet dus onder de juiste anesthesie worden uitgevoerd voor immobilisatie om de beeldkwaliteit te verbeteren door willekeurige bewegingen te verminderen. Regelmatige bewegingen van het oog die optreden tijdens regelmatige ademhalingsbewegingen kunnen echter worden gecompenseerd door prospectief of retrospectief te gaten naar het ventilatiepatroon van het dier, dus alleen scanregistratie van hetzelfde tijdsinterval binnen de ventilatiecyclus wordt gebruikt in de gegevensanalyse. Hoewel de retrospectieve gating-benadering om beademingsbewegingen van het beeld te compenseren de beeldstabiliteit aanzienlijk verbetert, vermindert het het aantal frames dat is opgenomen in de berekening van de standaardafwijking van de signaalintensiteit, wat leidt tot een afname van de signaal-ruisverhouding (vergelijk figuur 4E met figuur 2C en figuur 2I ). Dit effect wordt verlicht door prospectieve gating bij de ultrasone scanner, waarbij beeldgegevens alleen worden verkregen wanneer het dier zich in de gewenste fase van ademhaling bevindt. Dit zorgt echter voor een duidelijke toename van de acquisitietijd als het gewenste aantal frames ≥1000 moet worden verkregen.
We zien meerdere toepassingen in zoölogisch en veterinair onderzoek voor de flow-enhanced ultrasone workflow om de fysiologie en anatomie van de vasculatuur van het oog in kaart te brengen. De vasculatuur van roggenvinvissen, zoogdieren en vogels zijn relatief goed beschreven1,3,4,8,9,12,15,40, maar dit is niet het geval voor niet-benige vissen (kaakloze gewervelde dieren en chondrichthyans), amfibieën en reptielen, die hun respectieve eerdere divergerende zustergroepen vertegenwoordigen. Het implementeren van flow-enhanced echografie op deze slecht begrepen diergroepen en het integreren van deze gegevens met kennis over de meer goed bestudeerde groepen zal fundamenteel inzicht geven in de evolutie van de vasculatuur van het gewervelde oog. Omdat de vasculatuur van het oog vergelijkbaar is bij nauw verwante soorten4, zal dergelijke gedetailleerde informatie over de oculaire vasculatuur in een breed scala van soorten een referentiepunt bieden voor dierenartsen om misvormingen in de vasculatuur van het oog te identificeren als gevolg van ontwikkelingsstoornissen, ziekten of lichamelijk letsel. Bovendien biedt de mogelijkheid om 2D-bloedstroominformatie te verkrijgen met een hoge spatiotemporale resolutie de middelen voor het kwantificeren van farmacokinetische effecten op de bloedstroomverdeling in diepe vaatbedden, met enorme toepassingen bij de ontwikkeling en het testen van geneesmiddelen. Toekomstige studies over deze techniek moeten zich richten op het identificeren van injecteerbare verbindingen die het contrast van bloed in soorten met enucleated rode bloedcellen verbeteren, wat de toepasbaarheid van deze techniek op zoogdieren zal uitbreiden met enorme toepassingen in biomedisch onderzoek en klinische diagnostiek van vasculaire disfunctie in het oog en andere diepe vaatbedden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen vervullende belangen bestaan.
Acknowledgments
Dit werk heeft financiering ontvangen van de Carlsberg Foundation (CF17-0778; CF18-0658), de Lundbeck Foundation (R324-2019-1470; R346-2020-1210), de Velux Foundations (00022458), de A.P. Møller Foundation for the Advancement of Medical Science, het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst (nr. 754513) en de Aarhus University Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-222 | Sigma | E10521-50G | |
| Benzocaine | Sigma | E-1501 | |
| Propofol | B Braun | 12260470_0320 |
|
| Alfaxalon | Jurox | NA | |
| Isoflurane | Zoetis | 50019100 | |
| Ultrasound scanner | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
- Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary. Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 175-208 (2001).
- Country, M. W. Retinal metabolism: A comparative look at energetics in the retina. Brain Research. 1672, 50-57 (2017).
- Damsgaard, C., et al. Retinal oxygen supply shaped the functional evolution of the vertebrate eye. Elife. , 8 (2019).
- Buttery, R. G., Hinrichsen, C. F. L., Weller, W. L., Haight, J. R. How thick should a retina be? A comparative study of mammalian species with and without intraretinal vasculature. Vision Research. 31 (2), 169-187 (1991).
- Ames, A., Li, Y., Heher, E., Kimble, C. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Chase, J. The Evolution of retinal vascularization in mammals: A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Johnson, G. L. Ophthalmoscopic studies on the eyes of mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 254 (794), 207-220 (1968).
- Johnson, G. L. I. Contributions to the comparative anatomy of the mammalian eye, chiefly based on ophthalmoscopic examination. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 194 (194-206), 1-82 (1901).
- Rodriguez-Ramos Fernandez, J., Dubielzig, R. R. Ocular comparative anatomy of the family Rodentia. Veterinary Ophthalmology. 16, 94-99 (2013).
- Copeland, D. E.
- Meyer, D. B. The Visual System in Vertebrates. Handbook of Sensory Physiology. Crescitelli, F. 7, Springer. Berlin, Heidelberg. (1977).
- Potier, S., Mitkus, M., Kelber, A. Visual adaptations of diurnal and nocturnal raptors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 106, 116-126 (2020).
- Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. Active secretion of oxygen into the eye of fish. Nature. 194, 106-107 (1962).
- Damsgaard, C. Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye. Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840 (2021).
- Damsgaard, C., et al. A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina. Elife. 9, (2020).
- Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).
- Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).
- Berenbrink, M. Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes. Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).
- Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system. Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).
- Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: State of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
- Yung, M., Klufas, M. A., Sarraf, D. Clinical applications of fundus autofluorescence in retinal disease. International Journal of Retina and Vitreous. 2 (1), 12 (2016).
- Ang, M., et al. Optical coherence tomography angiography: a review of current and future clinical applications. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (2), 237-245 (2018).
- Spaide, R. F., Koizumi, H., Pozonni, M. C. Enhanced depth imaging spectral-domain optical coherence tomography. American Journal of Ophthalmology. 146 (4), 496-500 (2008).
- Shen, Q., et al. Magnetic resonance imaging of tissue and vascular layers in the cat retina. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 23 (4), 465-472 (2006).
- Tan, G. X., Jamil, M., Tee, N. G., Zhong, L., Yap, C. H. 3D reconstruction of chick embryo vascular geometries using non-invasive high-frequency ultrasound for computational fluid dynamics studies. Annals of Biomedical Engineering. 43 (11), 2780-2793 (2015).
- Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ dynamics and fluid dynamics of the HH25 chick embryonic cardiac ventricle as revealed by a novel 4D high-frequency ultrasound imaging technique and computational flow simulations. Annals of Biomedical Engineering. 45 (10), 2309-2323 (2017).
- Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e57089 (2018).
- Jia, Y., et al. Split-spectrum amplitude-decorrelation angiography with optical coherence tomography. Optics Express. 20 (4), 4710-4725 (2012).
- Clarke, K. W., Trim, C. M., Trim, C. M. Veterinary Anaesthesia E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2013).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. , Elsevier Science & Technology. (2015).
- West, G., Heard, D., Caulkett, N. Zoo Animal and Wildlife Immobilization and Anesthesia. , John Wiley & Sons, Inc. (2014).
- Lauridsen, H., Hansen, K., Nørgård, M. Ø, Wang, T., Pedersen, M. From tissue to silicon to plastic: three-dimensional printing in comparative anatomy and physiology. Royal Society Open Science. 3 (3), 150643 (2016).
- Lauridsen, H., et al. Inside out: Modern imaging techniques to reveal animal anatomy. PLoS One. 6 (3), 17879 (2011).
- Ruthensteiner, B., Heß, M. Embedding 3D models of biological specimens in PDF publications. Microscopy Research and Technique. 71 (11), 778-786 (2008).
- Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep vascular imaging in the eye with flow-enhanced ultrasound. bioRxiv. , 447055 (2021).
- Mueller, R. L., Ryan Gregory, T., Gregory, S. M., Hsieh, A., Boore, J. L. Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders. Zoology. 111 (3), 218-230 (2008).
- Greis, C. Quantitative evaluation of microvascular blood flow by contrast-enhanced ultrasound (CEUS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 49, 137-149 (2011).
- Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye. Experimental Eye Research. 193, 107986 (2020).
- Walls, G. L. The vertebrate eye and its adaptive radiation. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).
