Summary
Nous présentons une technique d’échographie non invasive pour générer des angiographies tridimensionnelles dans l’œil sans utiliser d’agents de contraste.
Abstract
La rétine dans l’œil est l’un des tissus les plus énergivores du corps et nécessite donc des taux élevés d’apport d’oxygène à partir d’un apport sanguin riche. La lame capillaire de la choroïde tapisse la surface externe de la rétine et est la source dominante d’oxygène dans la plupart des rétines vertébrées. Cependant, ce lit vasculaire est difficile à imager avec les techniques optiques traditionnelles en raison de sa position derrière la rétine très absorbant la lumière. Nous décrivons ici une technique d’échographie à haute fréquence avec une amélioration ultérieure du débit pour imager les lits vasculaires profonds (0,5-3 cm) de l’œil avec une résolution spatio-temporelle élevée. Cette méthode non invasive fonctionne bien chez les espèces avec des globules rouges nucléés (modèles animaux non mammifères et fœtaux). Il permet la génération d’angiographies tridimensionnelles non invasives sans l’utilisation d’agents de contraste, et il est indépendant des angles de flux sanguin avec une sensibilité plus élevée que les techniques d’imagerie par ultrasons basées sur Doppler.
Introduction
Le métabolisme élevé de la rétine des vertébrés impose un compromis intrinsèque entre deux besoins opposés; des débits sanguins élevés et un chemin de lumière dépourvu de vaisseaux sanguins. Pour éviter les troubles visuels de la perfusion des globules rouges, la rétine de tous les vertébrés reçoit de l’oxygène et des nutriments via une feuille de capillaires derrière les photorécepteurs, les choriocapillaires1,2,3. Cependant, cette source unique de nutriments et d’oxygène impose une limitation de diffusion à l’épaisseur de la rétine4,5, de sorte que de nombreuses espèces visuellement actives possèdent une variété de réseaux vasculaires élaborés pour fournir un apport sanguin supplémentaire à cet organe métaboliquement actif6. Ces lits vasculaires comprennent des vaisseaux sanguins perfusant les couches internes de la rétine chez les mammifères et certains poissons4,7,8,9,10, des vaisseaux sanguins sur la face interne (orientée vers la lumière) de la rétine que l’on trouve chez de nombreux poissons, reptiles et oiseaux4,11,12,13, et des arrangements vasculaires à contre-courant de la choroïde du poisson, la choroïde rete mirabile, qui permet la génération de pressions partielles d’oxygène super-atmosphérique14,15,16,17,18,19,20. Bien que ces voies non choroïdiennes supplémentaires pour l’apport en nutriments rétiniens jouent un rôle essentiel dans l’alimentation des besoins métaboliques d’une vision supérieure4, l’anatomie tridimensionnelle de ces structures vasculaires est mal comprise, ce qui limite notre compréhension de l’évolution morphologique de l’œil des vertébrés.
Traditionnellement, l’approvisionnement en sang rétinien a été étudié à l’aide de techniques optiques, telles que l’ophtalmoscopie du fond d’œil. Cette catégorie de techniques fournit des informations non destructives à haut débit sur l’anatomie des vaisseaux sanguins non choroïdiens en haute résolution21 et est donc facilement utilisée dans le diagnostic clinique des anomalies de la structure des vaisseaux rétiniens22. Cependant, l’épithélium pigmentaire rétinien absorbe la lumière transmise et limite la profondeur de vue dans ces techniques optiques, fournissant des informations réduites sur la structure et la fonction choroïdiennes sans l’utilisation d’agent de contraste21. Des limites de profondeur similaires sont rencontrées dans la tomographie par cohérence optique (OCT). Cette technique peut générer des angiographies de fond d’œil à haute résolution en utilisant des ondes lumineuses au détriment technique de la pénétration en profondeur23, tandis que l’OCT d’imagerie en profondeur améliorée peut visualiser la choroïde au détriment de la qualité de l’imagerie rétinienne24. L’imagerie par résonance magnétique surmonte les limites optiques de l’ophtalmoscopie et de l’OCT et peut cartographier les couches vasculaires de la rétine, bien qu’à faible résolution25. L’histologie et la microtartographie (μCT) maintiennent la haute résolution des techniques optiques et fournissent des informations sur la morphologie vasculaire de l’œil entier4, mais les deux techniques nécessitent un prélèvement oculaire et ne sont donc pas possibles en clinique ou chez les espèces rares ou menacées. Pour surmonter certaines des limites de ces techniques d’imagerie rétinienne établies, l’étude présente ici un protocole d’échographie sur des animaux anesthésiés, où le mouvement du sang est cartographié in silico sur une série d’échographies bidimensionnelles également espacées couvrant un œil entier en appliquant une technique comparable à celle décrite précédemment pour l’imagerie embryonnaire et cardiovasculaire26,27, 28 et en angiographie octodique29. Cette approche permet de générer des angiographies oculaires profondes tridimensionnelles non invasives sans utiliser d’agent de contraste et ouvre de nouvelles voies pour cartographier la distribution du flux sanguin dans l’œil entre les espèces.
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Protocol
Le protocole ci-dessous a été réalisé avec l’autorisation de l’Inspection danoise de l’expérimentation animale au sein du ministère danois de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche, administration vétérinaire et alimentaire danoise (numéro de permis 2016-15-0201-00835).
1. Anesthésie et milieu échographique
- Anesthésier l’animal de recherche.
REMARQUE: Le type et la dose d’anesthésie appropriée dépendent fortement de l’espèce. En général, les anesthésiques à base d’immersion tels que le MS-222 (acide 3-aminobenzoate d’éthyle méthanesulfonique), la benzocaïne (4-aminobenzoate d’éthyle) et le propofol (2,6-diisopropylphénol) sont utiles chez les poissons et les amphibiens qui absorbent facilement l’anesthésique sur les branchies ou la peau (par exemple, 0,05 mg· L-1 benzocaïne dans la truite arc-en-ciel). Une gamme de composés dissous qui peuvent être administrés par voie intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale est disponible pour les amniotes, tout comme les anesthésiques à base de gaz. Alfaxalon administré par voie intramusculaire est utile chez les reptiles (p. ex., 30 mg·kg-1 chez les lézards), et l’isoflurane administré sous forme de gaz est utile chez les oiseaux (p. ex., 2 % dans l’air pour les pigeons). Reportez-vous à la littérature publiée30,31,32 pour un aperçu complet des anesthésiques disponibles pour toutes les espèces. - Testez les réflexes chez l’animal pour confirmer un niveau optimal d’anesthésie. Assurez-vous que l’animal est complètement immobile pendant la procédure, car la procédure d’échographie améliorée par le flux est sensible au bruit de mouvement.
- Une anesthésie trop profonde peut modifier les schémas de circulation sanguine, alors effectuez une titration de dose dans la phase de démarrage d’une expérience.
- Augmentez la dose d’anesthésie par étapes et observez le flux sanguin dans l’œil aidé par une échographie en mode de luminosité simple (mode B).
REMARQUE: Un niveau optimal d’anesthésie est obtenu lorsque l’animal est immobile (sauf la respiration) avec un flux sanguin oculaire visible.
- Si le type ou la dose d’anesthésique n’est pas permissif pour les mouvements respiratoires, assurez-vous d’une ventilation adéquate de l’animal, par exemple en utilisant une pompe à air pour oxygéner l’eau pour les espèces aquatiques ou un ventilateur pour les espèces respirant de l’air.
- Positionnez l’animal dans une posture qui permet un accès direct d’en haut à l’œil.
REMARQUE: Selon les espèces, cela peut être en position couchée ou latérale. Il peut être utile de construire un dispositif de maintien simple à l’aide d’un petit morceau de métal non réactif (p. ex., acier inoxydable) et d’élastiques lâches (voir la figure 1). - Placez un milieu échographique approprié sur l’œil de l’animal. Si des paupières écailleuses (imperméables aux ultrasons) recouvrent l’œil, déplacez-les doucement avec un coton-tige.
REMARQUE: Pour les espèces aquatiques, le meilleur milieu ultrasonique est l’eau propre du réservoir dans lequel l’animal vit habituellement. Pour les espèces terrestres, une quantité généreuse de gel à ultrasons assure des mouvements libres et l’imagerie du transducteur à ultrasons (c.-à-d. sonde linéaire) sur toute la surface de l’œil. Une pommade vétérinaire sur l’œil controlatéral est nécessaire pour les espèces terrestres.
2. Acquisition d’images échographiques oculaires 2D et 3D
- Positionner le transducteur d’échographie médial à l’œil dans une orientation dorsale/ventrale ou rostrale/caudale selon l’orientation souhaitée de l’image.
- En mode B, avec une profondeur de champ maximale, imagez la partie médiale et la plus profonde de l’œil et assurez-vous que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image.
REMARQUE: Chez certaines espèces, le cristallin occupe une proportion relativement importante de l’humeur vitrée, qui peut absorber les ultrasons, en particulier à des fréquences plus élevées. - Traduisez lentement le transducteur de chaque côté tout en inspectant les images en temps réel. Assurez-vous que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image; sinon, passez à un transducteur avec une fréquence plus basse et une plus grande profondeur de champ.
REMARQUE: Les fréquences centrales suivantes permettent la profondeur de champ maximale suivante: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (voir tableau 1). Cependant, ces valeurs maximales de profondeur de champ peuvent être nettement inférieures si l’œil contient des structures calcifiées ou imperméables aux ultrasons. - Ajustez la profondeur de l’image, le décalage de profondeur (distance entre le haut de l’image et la structure d’intérêt), la largeur de l’image, ainsi que le nombre et la position des zones focales pour couvrir la région d’intérêt souhaitée dans les trois dimensions spatiales (par exemple, 1 cm de profondeur de profondeur, 2 mm de décalage de profondeur, 1 cm de largeur d’image, une zone focale).
REMARQUE: Bien que la dénomination spécifique des boutons qui ajustent ces paramètres puisse varier d’un système à ultrasons à l’autre, la plupart des systèmes auront des boutons avec des noms logiques pour ces ajustements. Ces paramètres d’image affectent généralement la plage de résolutions temporelles possibles de l’acquisition par ultrasons. - Définissez la fréquence d’images dans la plage de 50 à 120 images·s-1.
REMARQUE : La résolution temporelle (c.-à-d. l’intervalle de temps entre les balayages B successifs) doit être suffisante pour afficher une grande variabilité de l’intensité des pixels dans les vaisseaux sanguins imagés, c’est-à-dire que la résolution temporelle ne doit pas être trop élevée. D’autre part, pour compléter un enregistrement 3D complet de l’œil dans un délai raisonnable, la résolution temporelle ne peut pas être trop faible. Une résolution temporelle allant de 50 à 120 images·s-1 est généralement adéquate pour la procédure d’amélioration de l’écoulement chez la plupart des espèces. Sur certains systèmes à ultrasons, cette résolution temporelle souhaitée peut être obtenue en basculant entre les modes « imagerie générale » (haute résolution spatiale / basse résolution temporelle) et « cardiologie » (basse résolution spatiale / haute résolution temporelle). - Ajustez le gain 2D à un niveau (~ 5 dB), de sorte que les structures anatomiques ne soient que juste visibles dans l’acquisition en mode B pour augmenter le rapport signal/bruit dans la reconstruction ultérieure améliorée par le flux.
- Pour acquérir une image 2D améliorée par flux à une position de tranche unique, traduisez le transducteur à cette position et passez à l’étape 3.1.
- Pour acquérir un enregistrement 3D d’une région entière d’intérêt, par exemple la rétine, traduisez le transducteur à un extrême de la région d’intérêt.
- Pour déterminer la position exacte de l’extrémité de la région d’intérêt, augmentez brièvement le gain 2D.
- Une fois le placement correct du transducteur terminé, réduisez le gain 2D avant l’enregistrement pour assurer un rapport signal/bruit maximal lors de la reconstruction ultérieure améliorée du débit.
- Pour chaque étape (tranche) de l’enregistrement 3D, acquérez ≥ 100 images (≥1000 images de manière optimale).
- À l’aide d’un micromanipulateur ou d’un moteur de transducteur intégré, traduisez le transducteur dans toute la région d’intérêt par étapes, par exemple 25 μm ou 50 μm (n’oubliez pas de noter la taille du pas) et répétez l’acquisition de ≥100 images pour chaque étape.
- Euthanasier l’animal de recherche selon les directives de soins aux animaux de l’institution.
3. Reconstruction d’image améliorée par flux
- Exportez les enregistrements au format de fichier DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) (little-endian).
- Pour produire une image à flux unique améliorée basée sur un enregistrement ciné de ≥100 images (T), calculez l’écart-type au niveau des pixels (STD(x,y)) à l’aide de la formule suivante :
Où It(x,y) est l’intensité du pixel à la coordonnée du pixel (x,y) au temps t, et Īt(x,y) est la valeur moyenne arithmétique de I au fil du temps. - Répétez l’étape 3.2 pour chaque tranche de l’enregistrement 3D.
- Pour automatiser le processus de calcul STD et de reconstruction d’image pour plusieurs tranches dans un enregistrement 3D, effectuez cette opération en mode batch en utilisant, par exemple, ImageJ et le script de macro supplémentaire (fichier supplémentaire 1).
- Combinez toutes les tranches reconstruites en une seule pile d’images (commande Images to Stack dans ImageJ).
- Spécifiez l’épaisseur de la tranche à partir de la taille d’étape utilisée lors de l’acquisition (commande Propriétés dans ImageJ).
- Enregistrez la pile d’images en tant que fichier TIF 3D.
REMARQUE: Des enregistrements tridimensionnels pondérés en fonction du débit des vaisseaux sanguins oculaires peuvent ensuite être utilisés pour créer des rendus de volume et construire des modèles anatomiques numériques et physiques des structures vasculaires de l’œil. Ces options de traitement d’image ne relèvent pas du champ d’application de ce protocole ; reportez-vous aux articles publiés précédemment pour plus de détails33,34,35.
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Representative Results
La technique d’échographie améliorée par écoulement pour imager les lits vasculaires de l’œil peut être appliquée à diverses espèces et a actuellement été utilisée chez 46 espèces de vertébrés différentes (figure 1, tableau 1). La présence de globules rouges nucléés chez les vertébrés de mammifères non adultes offre un contraste positif entre le sang qui coule et les tissus statiques dans les enregistrements cinétiques (dossier supplémentaire 2). Cependant, lorsqu’on l’analyse image par image, la distinction claire entre le sang et les tissus environnants est moins évidente (figure 2A). La procédure d’amélioration du flux sanguin décrite dans ce protocole compile essentiellement un enregistrement ponctuel multi-temps dans l’espace 2D (une tranche faite d’images T ) en une seule image dans laquelle les fluctuations inhérentes de la valeur du signal en pixels positionnés dans le sang circulant marquent un écart type plus élevé que le tissu statique environnant, produisant ainsi un contraste positif (Figure 2B). Pour améliorer de manière perceptible le contraste des vaisseaux sanguins, les tables de recherche peuvent être utilisées pour produire des images en pseudocolores (Figure 2C). Dans les acquisitions 3D, plusieurs tranches parallèles avec un espacement connu peuvent être combinées en données d’image 3D (fichier supplémentaire 3 et fichier supplémentaire 4) qui peuvent être utilisées pour le rendu de volume tridimensionnel (figure 2D) et la modélisation anatomique (figure 2E et fichier supplémentaire 5). L’imagerie échographique Doppler offre également la possibilité d’imager spécifiquement le flux sanguin, mais avec moins de sensibilité que la méthode décrite (comparez la figure 2G avec la figure 2H et la figure 2I), et surtout pas si l’orientation du flux sanguin est directement ou proche de la perpendiculaire à la direction de l’onde sonore. La procédure d’amélioration du débit décrite dans ce protocole est indépendante de l’orientation du flux sanguin à la fois dans le plan et hors du plan.
La procédure d’échographie à débit amélioré permet l’imagerie du flux sanguin chez une gamme d’espèces avec des globules rouges nucléés (Figure 3A-D). Les lits vasculaires oculaires profonds tels que la choroïde rete mirabile chez certains poissons peuvent être imagés s’ils sont présents chez l’espèce (pointe de flèche jaune dans la figure 2, figure 3B, figure 4). La méthode est limitée par l’absence de globules rouges nucléés chez les mammifères adultes chez lesquels la procédure d’amélioration du flux produit un certain degré de contraste du flux sanguin, mais n’est pas aussi distincte que chez les espèces avec des globules rouges nucléés (figure 3E, F).
Les ultrasons à débit amélioré sont sensibles au bruit de mouvement et, par exemple, les mouvements respiratoires peuvent causer un flou d’image et des artefacts tels que l’amélioration de la bordure tissulaire (Figure 4A-C, Fichier supplémentaire 6). La grille prospective ou rétrospective peut être utilisée pour ajuster le bruit de mouvement (Figure 4D,E).
Figure 1 : Exemples de la variété d’espèces adaptées à l’imagerie échographique améliorée du système vasculaire oculaire. (A) Poisson rouge (Carassius auratus). (B) Esturgeon de Sibérie (Acipenser baerii). (C) Bar européen (Dicentrarchus labrax). (D) Dos de clown (Chitala ornata). (E) Carpe crucienne (Carassius carassius). (F) Poulet domestique embryonnaire (Gallus gallus domesticus). Il peut être utile de construire un dispositif de maintien simple en utilisant un poids métallique non réactif et des élastiques lâches (A, C, D). Les grands systèmes d’imagerie échographique immobiles en laboratoire peuvent être utilisés pour la procédure (A-D, F) ainsi que les systèmes opératoires sur petit terrain (E). Lors de l’imagerie de petites espèces très sensibles à la température qui ne peuvent pas être retenues dans un bain-marie à température contrôlée comme les oiseaux embryonnaires, l’imagerie peut être effectuée pendant que l’échantillon est à l’intérieur de l’incubateur (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Effet de l’amélioration du débit sur les échographies oculaires. (A) Exemples d’images ultrasonographiques brutes en mode B de l’œil d’un poisson rouge dans un enregistrement ciné de 1000 images. Alors que le flux sanguin peut être observé dans l’enregistrement cinétique (fichier supplémentaire 2), il est difficile de le voir dans des cadres statiques. (B) Image en niveaux de gris améliorée par flux (même tranche que dans A). Les lits vasculaires rétiniens et post-rétiniens sont améliorés. (C) Version pseudo-colorée de l’image en B avec imageJ Fire Look Up Table. (D) Affichage volumique du flux sanguin dans l’œil du même poisson rouge que dans A-C, basé sur l’acquisition 3D. (E) Modèle anatomique à deux segments (vaisseaux rétiniens et post-rétiniens) de l’œil en A-D (pour le modèle interactif, voir le matériel supplémentaire 5). (F-I) Image échographique brute en mode B de l’œil d’un autre poisson rouge (F) comparant l’imagerie d’écoulement couleur basée sur Doppler (G) aux méthodes d’écoulement amélioré décrites dans ce protocole (H-I, note I est une superposition de H sur F). Les flèches vertes indiquent les vaisseaux rétiniens, les pointes de flèches jaunes indiquent la choroïde rete mirabile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Exemples représentatifs d’images échographiques oculaires améliorées par écoulement chez diverses espèces de vertébrés. (A) Bichir du Sénégal (Polypterus senegalus). (B) Piranha à ventre rouge (Pygocentrus nattereri). (C) Iguane vert (Iguane). (D) Poulet domestique embryonnaire (jour 18) (Gallus gallus domesticus). (E) Souris domestique (Mus musculus). (F) Rat brun (Rattus norvegicus). Chez les espèces avec des globules rouges nucléés, la procédure d’amélioration du flux donne des images utiles du flux sanguin oculaire (A-D), tandis que chez les mammifères adultes (globules rouges énucléés), elle ne produit qu’un contraste limité entre le sang circulant et les tissus environnants (E-F). Les flèches vertes indiquent les vaisseaux rétiniens; les pointes de flèches bleues indiquent des vaisseaux post-rétiniens tels que les choriocapillaires; les pointes de flèches jaunes indiquent choroïde rete mirabile. Chez le poulet domestique embryonnaire tardif, on peut observer un flux sanguin dans le pecten oculi (flèche verte inférieure en F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les mouvements respiratoires induisent un bruit de mouvement qui peut être atténué par un contrôle rétrospectif. (A-B) Exemple de mouvements respiratoires dans l’œil d’une plie européenne (Pleuronectes platessa). Le point rouge est à la même coordonnée d’image dans A (tranche 54/410) et B (tranche 92/410), mais on peut observer que l’œil a changé de position (voir aussi enregistrement ciné dans le matériel supplémentaire 6). (C) La tentative d’exécution de l’opération d’amélioration du débit sur l’enregistrement complet de 410 images échoue en raison du bruit de mouvement. Les bordures tissulaires sont artificiellement améliorées en raison des mouvements. (D) fonctionnement rétrospectif du contrôle basé sur l’intensité normalisée du signal (SI) au point rouge de A à B. Seules les images avec un SI normalisé > 50 (au total 38 images), c’est-à-dire indiquant que l’œil est à la même position que dans B, sont incluses pour la procédure d’amélioration du débit. (E) Image résultante d’une procédure d’amélioration du flux rétrospectivement fermée. Comparez avec C. Dans l’image fermée, l’amélioration artificielle de la bordure est évitée et le flux sanguin dans la choroïde rete mirabile (pointe de flèche jaune) peut être observé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Liste des espèces sur lesquelles la technique d’échographie améliorée par écoulement pour imager le flux sanguin oculaire a été utilisée. L’applicabilité de la méthode est basée sur la capacité de produire une représentation riche en contraste des lits vasculaires par rapport au fond statique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Fichier supplémentaire 1 : Script de macro pour automatiser les calculs d’amélioration de flux. Le script est écrit en langage IJ1 Macro et peut être exécuté à la fois à l’aide de la fonction de macro ImageJ (pour l’enregistrement d’une seule tranche) ou du processus par lots ImageJ (pour l’enregistrement 3D à plusieurs tranches). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : Enregistrement ciné brut en mode B sur l’œil d’un poisson rouge (Carassius auratus). Le flux sanguin peut être observé pendant la lecture de la vidéo, mais pas sur une seule image comme dans la figure 2A. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 3 : Découpez la vidéo à travers l’œil d’un poisson rouge (Carassius auratus) de sections à flux sanguin amélioré. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 4 : Fichier TIF tridimensionnel de l’œil amélioré du poisson rouge (Carassius auratus). Les images ont été regroupées de 3 x 3 x 3 pour minimiser la taille du fichier (réduction de 27 fois de la résolution spatiale et de la taille du fichier). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 5 : Modèle 3D interactif de vaisseaux pré- et post-rétiniens dans l’œil d’un poisson rouge (Carassius auratus). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 6: Enregistrement ciné brut en mode B sur l’œil d’une plie européenne (Pleuronectes platessa). Notez les mouvements respiratoires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’imagerie vasculaire utilisant l’échographie améliorée par flux fournit une nouvelle méthode d’imagerie non invasive de la vascularisation de l’œil qui offre plusieurs avantages par rapport aux techniques actuelles, mais qui a ses limites intrinsèques. Le principal avantage de l’échographie à flux amélioré est la capacité de générer des angiographies oculaires avec une profondeur de champ qui dépasse l’épithélium pigmentaire rétinien, ce qui limite la profondeur de champ dans les techniques optiques. En imagerie par ultrasons, la résolution spatiale et la profondeur de champ sont finalement déterminées par la fréquence du transducteur à ultrasons, où des fréquences plus élevées augmentent la résolution spatiale, mais au détriment d’une profondeur de champ moins profonde, de sorte que le choix de la fréquence du transducteur introduit un compromis entre la profondeur de l’image et la résolution spatiale. D’après notre expérience, l’imagerie échographique rétinienne optimale est obtenue à l’aide de transducteurs à ultrasons à haute fréquence (≥50 MHz) dans les petits yeux avec des profondeurs d’image de <1 cm et de transducteurs à basse fréquence (20-40 MHz) dans les grands yeux avec des profondeurs d’image de 1,5 à 3,0 cm. Pour une échographie 3D, la résolution de la dimension de tranche supplémentaire est définie par la taille de l’étape entre les numérisations dans la pile d’échographies 2D. D’après notre expérience, il est difficile de réaliser un scan 3D avec une taille de pas inférieure à 20 μm.
L’échographie 2D améliorée par flux a une résolution temporelle élevée. Idéalement, ≥ 1000 images par image sont nécessaires pour l’imagerie vasculaire améliorée par flux, de sorte qu’au moins 8 s sont nécessaires par numérisation d’image. La résolution temporelle est considérablement réduite lors de l’exécution d’échographies améliorées par flux 3D, où le temps de numérisation augmente avec le nombre d’images dans la pile de numérisations 3D. Compte tenu de la haute résolution temporelle, le flux de travail d’échographie 2D amélioré par le flux montre un fort potentiel en tant que méthode d’identification des changements temporels dans les vitesses relatives du flux sanguin et la distribution du flux sanguin lors de manipulations expérimentales. Ainsi, les études futures peuvent utiliser le flux de travail pour identifier comment les conditions environnementales modifiées (par exemple, température, pO2, pCO2) ou l’administration pharmacologique affectent le flux sanguin dans l’œil et d’autres organes.
Le flux de travail de l’échographie repose sur le contraste positif des globules rouges nucléés de la plupart des vertébrés non mammifères. Ainsi, les globules rouges énucléés des mammifères adultes et de certaines espèces de salamandres37 offrent trop peu de contraste pour améliorer efficacement le flux sanguin en utilisant le flux de travail actuel (Figure 3E,F). Dans les flux de travail échographiques traditionnels, l’injection vasculaire de microbulles offre un contraste suffisamment élevé pour identifier la vascularisation chez les mammifères38, qui a été utilisée pour générer des angiographies vasculaires des vaisseaux rétrobulbaires dans l’œil du rat39. Cependant, les microbulles éclatent en quelques minutes, de sorte que la génération d’angiographies 3D nécessite des injections successives de microbulles.
L’échographie améliorée par le débit dépend d’enregistrements séquentiels dans la même position de l’œil, de sorte que la technique n’est pas possible chez les animaux éveillés, où des mouvements aléatoires mineurs peuvent décaler l’image et nuire aux calculs d’amélioration du débit. Ainsi, la présente méthode doit être réalisée sous anesthésie appropriée pour l’immobilisation afin d’améliorer la qualité de l’image en réduisant les mouvements aléatoires. Cependant, les mouvements réguliers de l’œil qui se produisent lors de mouvements respiratoires réguliers peuvent être compensés par une évaluation prospective ou rétrospective du schéma de ventilation de l’animal, de sorte que seul l’enregistrement de balayage à partir du même intervalle de temps dans le cycle de ventilation est utilisé dans l’analyse des données. Bien que l’approche rétrospective du contrôle pour compenser les mouvements ventilatoires de l’image améliore considérablement la stabilité de l’image, elle réduit considérablement le nombre d’images incluses dans le calcul de l’écart-type de l’intensité du signal, ce qui entraîne une diminution du rapport signal/bruit (comparer la figure 4E à la figure 2C et la figure 2I). ). Cet effet est atténué à l’aide d’une caméra prospective à l’échographe, dans laquelle les données d’image ne sont acquises que lorsque l’animal est dans la phase de respiration souhaitée. Cependant, cela entraîne une augmentation marquée du temps d’acquisition si le nombre souhaité de trames ≥1000 doit être acquis.
Nous voyons de multiples applications dans la recherche zoologique et vétérinaire pour le flux de travail d’échographie amélioré pour cartographier la physiologie et l’anatomie du système vasculaire de l’œil. La vascularisation des poissons à nageoires rayonnées, des mammifères et des oiseaux est relativement bien décrite1,3,4,8,9,12,15,40, mais ce n’est pas le cas pour les poissons non osseux (vertébrés sans mâchoire et chondrichtyanes), les amphibiens et les reptiles, qui représentent leurs groupes frères divergents respectifs. La mise en œuvre d’ultrasons améliorés sur ces groupes d’animaux mal compris et l’intégration de ces données aux connaissances sur les groupes les plus bien étudiés fourniront un aperçu fondamental de l’évolution de la vascularisation de l’œil des vertébrés. Étant donné que le système vasculaire de l’œil est similaire chez les espèces étroitement apparentées4, de telles informations détaillées sur le système vasculaire oculaire chez un large éventail d’espèces fourniront un point de référence aux vétérinaires pour identifier les malformations dans le système vasculaire de l’œil dues à des défauts de développement, des maladies ou des blessures physiques. En outre, la capacité d’acquérir des informations de flux sanguin 2D avec une résolution spatio-temporelle élevée fournit les moyens de quantifier les effets pharmacocinétiques sur la distribution du flux sanguin dans les lits vasculaires profonds, avec de vastes applications dans le développement et le test de médicaments. Les études futures sur cette technique devraient se concentrer sur l’identification de composés injectables qui améliorent le contraste du sang chez les espèces avec les globules rouges énucléés, ce qui élargira l’applicabilité de cette technique aux mammifères ayant de vastes applications dans la recherche biomédicale et le diagnostic clinique du dysfonctionnement vasculaire dans l’œil et d’autres lits vasculaires profonds.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’existe aucun intérêt complet.
Acknowledgments
Ce travail a reçu un financement de la Fondation Carlsberg (CF17-0778; CF18-0658), la Fondation Lundbeck (R324-2019-1470; R346-2020-1210), les Fondations Velux (00022458), la Fondation A.P. Møller pour l’avancement des sciences médicales, le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie (n° 754513) et la Fondation pour la recherche de l’Université d’Aarhus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-222 | Sigma | E10521-50G | |
| Benzocaine | Sigma | E-1501 | |
| Propofol | B Braun | 12260470_0320 |
|
| Alfaxalon | Jurox | NA | |
| Isoflurane | Zoetis | 50019100 | |
| Ultrasound scanner | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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