Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Глубокая сосудистая визуализация в глазу с помощью ультразвука с усилением потока

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62986
Automatic Translation
1,2, 3
1Aarhus Institute of Advanced Studies, Aarhus University, 2Zoophysiology, Department of Biology, Aarhus University, 3Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Представлена неинвазивная ультразвуковая методика генерации трехмерных ангиографий в глазу без использования контрастных веществ.

Abstract

Сетчатка в глазу является одной из самых энергоемких тканей в организме и, таким образом, требует высоких скоростей доставки кислорода из богатого кровоснабжения. Капиллярная пластинка сосудистой оболочки выстилает внешнюю поверхность сетчатки и является доминирующим источником кислорода в большинстве сетчаток позвоночных. Тем не менее, это сосудистое русло сложно изобразить с помощью традиционных оптических методов из-за его положения позади сетчатки с высоким поглощением света. Здесь описана высокочастотная ультразвуковая методика с последующим увеличением потока до изображения глубоких сосудистых русл (0,5-3 см) глаза с высоким пространственно-временным разрешением. Этот неинвазивный метод хорошо работает у видов с ядерными эритроцитами (немлекопитающие и фетальные животные модели). Он позволяет генерировать неинвазивные трехмерные ангиографии без использования контрастных веществ и не зависит от углов кровотока с более высокой чувствительностью, чем методы ультразвуковой визуализации на основе допплера.

Introduction

Высокий метаболизм на сетчатке позвоночных накладывает внутренний компромисс между двумя противоположными потребностями; высокая скорость кровотока и легкий путь, лишенный кровеносных сосудов. Чтобы избежать нарушения зрения перфузирующих эритроцитов, сетчатка всех позвоночных получает кислород и питательные вещества через лист капилляров за фоторецепторами, хориокапиллярий1,2,3. Однако этот единственный источник питательных веществ и кислорода накладывает диффузионное ограничение на толщину сетчатки4,5, поэтому многие визуально активные виды обладают различными сложными сосудистыми сетями, чтобы обеспечить дополнительное кровоснабжение этого метаболически активного органа6. Эти сосудистые русла включают кровеносные сосуды, перфузирующие внутренние слои сетчатки у млекопитающих и некоторых рыб4,7,8,9,10, кровеносные сосуды на внутренней (светлой) стороне сетчатки, обнаруженные у многих рыб, рептилий и птиц4,11,12,13, и противоточное сосудистое расположение сосудистой оболочки рыбы, сосудистой оболочки мирабиле, что позволяет генерировать суператмосферные парциальные давления кислорода14,15,16,17,18,19,20. Несмотря на то, что эти дополнительные нехироиоидальные пути для снабжения питательными веществами сетчатки играют важную роль в подпитке метаболических потребностей превосходного зрения4, трехмерная анатомия этих сосудистых структур плохо изучена, что ограничивает наше понимание морфологической эволюции глаза позвоночных.

Традиционно кровоснабжение сетчатки изучалось с использованием оптических методов, таких как офтальмоскопия глазного дна. Эта категория методов обеспечивает высокопроизводительную неразрушающую информацию об анатомии нехироиоидальных кровеносных сосудов в высоком разрешении21 и поэтому легко используется в клинической диагностике аномалий в структуре сосудов сетчатки22. Однако пигментный эпителий сетчатки поглощает проходящий свет и ограничивает глубину обзора в этих оптических методах, обеспечивая уменьшенную информацию о структуре и функции хориоидальной кислоты без использования контрастного вещества21. Аналогичные ограничения глубины наблюдаются при оптической когерентной томографии (ОКТ). Этот метод может генерировать ангиографию глазного дна высокого разрешения с использованием световых волн за счет технического проникновения на глубину23, в то время как расширенная глубинная визуализация OCT может визуализировать сосудистую оболочку за счет качества визуализации сетчатки24. Магнитно-резонансная томография преодолевает оптические ограничения офтальмоскопии и ОКТ и может отображать сосудистые слои в сетчатке, хотя и с низким разрешением25. Гистология и микрокомпьютерная томография (μCT) поддерживают высокое разрешение оптических методов и предоставляют информацию о морфологии сосудов всего глаза4, но оба метода требуют забора глаз и поэтому невозможны в клинике или редких или исчезающих видах. Чтобы преодолеть некоторые из ограничений этих установленных методов визуализации сетчатки, в исследовании здесь представлен протокол ультразвука на анестезированных животных, где движение крови отображается in silico на серии равноразмерных двумерных ультразвуковых сканирований, охватывающих весь глаз, путем применения сопоставимой техники, описанной ранее для эмбриональной и сердечно-сосудистой визуализации26,27, 28 и в ОКТ ангиографии29. Этот подход позволяет генерировать неинвазивные трехмерные глубокие глазные ангиографии без использования контрастного вещества и открывает новые возможности для картирования распределения кровотока в глазу между видами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Приведенный ниже протокол был выполнен с разрешения Датской инспекции по экспериментам на животных в рамках Министерства продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства Дании, Датского управления ветеринарии и продовольствия (номер разрешения 2016-15-0201-00835).

1. Анестезия и ультразвуковая среда

  1. Обезболить исследуемого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тип и доза соответствующей анестезии сильно зависят от вида. В целом, иммерсионные анестетики, такие как MS-222 (этил-3-аминобензоат метансульфоновая кислота), бензокаин (этил4-аминобензоат) и пропофол (2,6-диизопропилфенол), полезны у рыб и амфибий, которые легко поглощают анестетик над жабрами или кожей (например, 0,05 мг· L-1 бензокаин в радужной форели). Для амниотов доступен ряд растворенных соединений, которые можно вводить внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, как и анестетики на газовой основе. Альфаксалон, вводимый внутримышечно, полезен у рептилий (например, 30 мг·кг-1 у ящериц), а изофлуран, вводимый в виде газа, полезен птицам (например, 2% в воздухе для голубей). Обратитесь к опубликованной литературе30,31,32 для полного обзора доступных анестетиков по видам.
  2. Проверка рефлексов у животного для подтверждения оптимального уровня анестезии. Убедитесь, что животное полностью неподвижно во время процедуры, так как ультразвуковая процедура с усиленным потоком чувствительна к шуму движения.
    1. Слишком глубокая анестезия может изменить характер кровотока, поэтому проведите титрование дозы на начальном этапе эксперимента.
    2. Увеличивайте дозировку анестезии поэтапно и наблюдайте за кровотоком в глазу с помощью ультразвукового исследования в режиме простой яркости (B-режим).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный уровень анестезии получается, когда животное неподвижно (кроме дыхания) с видимым глазным кровотоком.
  3. Если тип/доза анестетика не является разрешительной для дыхательных движений, то обеспечьте адекватную вентиляцию животного, например, используя воздушный насос для насыщения кислородом воды для водных видов или вентилятор для дышащих воздухом видов.
  4. Расположите животное в позе, которая обеспечивает прямой доступ сверху к глазу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от вида, это может быть как в лежачем, так и в боковом положении. Может быть полезно сконструировать простое удерживающее устройство с использованием небольшого куска нереактивного металла (например, нержавеющей стали) и свободных резиновых лент (см. Рисунок 1).
  5. Поместите соответствующую ультразвуковую среду на глаз животного. Если чешуйчатые веки (ультразвуковые непроницаемые) закрывают глаза, то аккуратно смещайте их ватным тампоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для водных видов лучшей ультразвуковой средой является чистая резервуарная вода, в которой обычно живет животное. Для наземных видов большое количество ультразвукового геля обеспечивает свободные движения и визуализацию ультразвукового преобразователя (т. Е. Зонда линейной решетки) по всей поверхности глаза. Ветеринарная мазь на контралатеральный глаз требуется наземным видам.

2. Получение 2D и 3D глазных ультразвуковых изображений

  1. Расположите ультразвуковой преобразователь медиально к глазу в дорсальной/вентральной или ростральной/каудальной ориентации в зависимости от желаемой ориентации изображения.
  2. В B-режиме, с максимальной глубиной резкости, визуализируйте медиальную и самую глубокую часть глаза и убедитесь, что все интересующие структуры видны в поле изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: У некоторых видов хрусталик занимает сравнительно большую долю стекловидного тела, которое может поглощать ультразвук, особенно на более высоких частотах.
  3. Медленно переводите преобразователь в каждую сторону, проверяя изображения в режиме реального времени. Убедитесь, что все интересующие структуры видны в поле изображения; если нет, переключитесь на преобразователь с более низкой частотой и большей глубиной резкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие центральные частоты допускают следующую максимальную глубину резкости: 21 МГц: 3 см, 40 МГц: 1,5 см, 50 МГц: 1 см (см. Таблицу 1). Однако эти максимальные значения глубины резкости могут быть заметно ниже, если глаз содержит кальцинированные или другие ультразвуковые непроницаемые структуры.
  4. Настройте глубину изображения, смещение глубины (расстояние от верхней части изображения до интересующей структуры), ширину изображения, а также количество и положение фокусных зон для охвата желаемой области интереса во всех трех пространственных измерениях (например, глубина изображения 1 см, смещение глубины 2 мм, ширина изображения 1 см, одна фокусная зона).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя конкретные названия кнопок, которые регулируют эти параметры, могут варьироваться в зависимости от ультразвуковых систем, большинство систем будут иметь кнопки с логическими именами для этих настроек. Эти настройки параметров изображения обычно влияют на диапазон возможных временных разрешений получения ультразвука.
  5. Установите частоту кадров в диапазоне 50-120 кадров·с-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временное разрешение (т.е. временной интервал между последовательными B-сканированиями) должно быть достаточным для отображения большой изменчивости интенсивности пикселей в изображенных кровеносных сосудах, т.е. временное разрешение не должно быть слишком высоким. С другой стороны, чтобы завершить полную 3D-запись глаза за разумное время, временное разрешение не может быть слишком низким. Временное разрешение в диапазоне от 50-120 кадров·с-1 обычно достаточно для процедуры с усилением потока у большинства видов. На некоторых ультразвуковых системах это желаемое временное разрешение может быть получено путем переключения между режимами «общая визуализация» (высокое пространственное / низкое временное разрешение) и «кардиология» (низкое пространственное / высокое временное разрешение).
  6. Отрегулируйте коэффициент усиления 2D до уровня (~5 дБ), чтобы анатомические структуры были видны только в B-режиме, чтобы увеличить отношение сигнал/шум при последующей реконструкции с усилением потока.
  7. Чтобы получить 2D-изображение с улучшенным потоком в положении одного среза, переведите преобразователь в это положение и продолжите на шаге 3.1.
  8. Чтобы получить 3D-запись целой интересующей области, например, сетчатки, переведите преобразователь в одну крайность интересующей области.
    1. Чтобы определить точное положение крайнего конца интересующей области, кратко увеличьте коэффициент усиления 2D.
    2. После завершения правильного размещения датчика уменьшите коэффициент усиления 2D перед записью, чтобы обеспечить максимальное соотношение сигнал/шум при последующей реконструкции с увеличением потока.
  9. Для каждого шага (среза) в 3D-записи приобретайте ≥100 кадров (оптимально ≥1000 кадров).
  10. Используя микроманипулятор или встроенный двигатель преобразователя, переведите преобразователь по всей интересующей области на ступени, например, 25 мкм или 50 мкм (не забудьте отметить размер шага) и повторите получение ≥100 кадров для каждого шага.
  11. Усыплите исследуемое животное в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными учреждения.

3. Реконструкция изображения с улучшенным потоком

  1. Экспортируйте записи в формат цифровых изображений и коммуникаций в медицине (DICOM) (младший порядковый номер).
  2. Чтобы получить одно изображение с улучшенным потоком на основе кинозаписи ≥100 кадров (T), вычислите стандартное отклонение на уровне пикселей (STD(x,y)) по формуле:
    Equation 1
    Где It(x,y) — интенсивность пикселя в координате пикселя (x,y) в момент времени t, а Īt(x,y) — среднее арифметическое значение I с течением времени.
  3. Повторите шаг 3.2 для каждого фрагмента в 3D-записи.
  4. Чтобы автоматизировать процесс STD-вычисления и реконструкции изображения для нескольких срезов в 3D-записи, проведите эту операцию в пакетном режиме, используя, например, ImageJ и дополнительный макроскрипт (Дополнительный файл 1).
  5. Объедините все реконструированные фрагменты в один стек изображений (команда «Изображения в стек» в ImageJ).
  6. Укажите толщину фрагмента из размера шага, используемого при получении (команда «Свойства» в ImageJ).
  7. Сохраните стек изображений в виде 3D-файла TIF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Взвешенные потоком трехмерные записи глазных кровеносных сосудов впоследствии могут быть использованы для создания объемных рендеров и построения цифровых и физических анатомических моделей сосудистых структур глаза. Эти параметры обработки изображений выходят за рамки данного протокола; обратитесь к ранее опубликованным статьям для получения более подробной информации33,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ультразвуковой метод с усилением потока для изображения сосудистых русл глаза может применяться у целого ряда видов и в настоящее время используется у 46 различных видов позвоночных (рисунок 1, таблица 1). Наличие ядерных эритроцитов у позвоночных, не являющихся взрослыми млекопитающими, обеспечивает положительный контраст текучей крови по сравнению со статической тканью в кинозаписях (Дополнительный файл 2). Однако при анализе на покадровой основе четкое различие между кровью и окружающими тканями менее очевидно (рисунок 2А). Процедура улучшения кровотока, описанная в этом протоколе, по существу компилирует запись нескольких временных точек в 2D-пространстве (срез, состоящий из Т-кадров ) в одно изображение, в котором присущие колебания значения сигнала в пикселях, расположенных в текущей крови, оценивают более высокое стандартное отклонение, чем окружающая статическая ткань, что приводит к положительному контрасту (рисунок 2B). Чтобы ощутимо повысить контраст кровеносных сосудов, таблицы Look Up можно использовать для получения псевдоцветных изображений (рисунок 2C). В 3D-захватах несколько параллельных срезов с известным интервалом могут быть объединены в данные 3D-изображения (дополнительный файл 3 и дополнительный файл 4), которые можно использовать для трехмерного объемного рендеринга (рисунок 2D) и анатомического моделирования (рисунок 2E и дополнительный файл 5). Ультразвуковая визуализация на основе допплера также предоставляет возможность специально изображать кровоток, но с меньшей чувствительностью, чем описанный метод (сравните рисунок 2G с рисунком 2H и рисунком 2I), и, что важно, не в том случае, если ориентация кровотока прямо или близка к перпендикулярности направлению звуковой волны. Процедура, усиленная потоком, описанная в этом протоколе, не зависит от ориентации кровотока как в плоскости, так и вне плоскости.

Ультразвуковая процедура с усилением потока позволяет проводить визуализацию кровотока у ряда видов с ядерными эритроцитами (рисунок 3A-D). Глубокие глазные сосудистые русла, такие как сосудистой оболочкой rete mirabile у некоторых рыб, могут быть изображены, если они присутствуют у вида (желтый наконечник стрелки на рисунке 2, рисунок 3B, рисунок 4). Метод ограничен отсутствием ядерных эритроцитов у взрослых млекопитающих, у которых процедура усиления потока производит некоторую степень контраста кровотока, но не так отличается, как у видов с ядерными эритроцитами (рисунок 3E, F).

Ультразвук, усиленный потоком, чувствителен к шуму движения, и, например, дыхательные движения могут вызвать размытие изображения и артефакты, такие как улучшение границы ткани (рисунок 4A-C, дополнительный файл 6). Проспективный или ретроспективный гатинг может быть использован для корректировки шума движения (рисунок 4D, E).

Figure 1
Рисунок 1: Примеры разнообразия видов, пригодных для ультразвуковой визуализации глазной сосудистой системы. (А) Золотая рыбка (Carassius auratus). (Б) Осетр сибирский (Acipenser baerii). (C) Европейский сибас (Dicentrarchus labrax). (D) Клоун пернатый (Chitala ornata). (E) Карась (Carassius carassius). F) Эмбриональная домашняя курица (Gallus gallus domesticus). Может быть полезно построить простое удерживающее устройство с использованием нереактивного металлического веса и свободных резинок (A, C, D). Для процедуры могут использоваться как большие, неподвижные лабораторные системы ультразвуковой визуализации (A-D, F), так и небольшие полевые операционные системы (E). При визуализации небольших и высокочувствительных к температуре видов, которые не могут быть сохранены на водяной бане с контролируемой температурой, как эмбриональные птицы, визуализация может быть выполнена, когда образец находится внутри инкубатора (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние усиления потока на ультразвуковое сканирование глаз. (A) Примеры необработанных ультрасонографических изображений глаза золотой рыбки в 1000 кадрах киносъемки. В то время как кровоток можно наблюдать в кинозаписи (дополнительный файл 2), его трудно увидеть в статических кадрах. (B) Изображение в градациях серого с улучшенным потоком (тот же фрагмент, что и в A). Укрепляются как сосудистые русла сетчатки, так и постретинальные сосуды. (C) Псевдоцветная версия изображения в B с таблицей ImageJ Fire Look Up. (D) Объемное отображение кровотока в глазу той же золотой рыбки, что и в A-C, на основе 3D-захвата. (E) Двухсегментная (сосуды сетчатки и постиретинальные сосуды) анатомическая модель глаза в А-D (интерактивную модель см. в дополнительном материале 5). (Ф-И) Необработанное ультрасонографическое изображение глаза другой золотой рыбки (F), сравнивающее цветную доплеровскую визуализацию потока (G) с методами, улучшенными потоком, описанными в этом протоколе (H-I, примечание I является наложением H на F). Зелеными стрелками обозначены сосуды сетчатки, желтыми наконечниками стрел указывается на сосудистую оболочку rete mirabile. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные примеры ультразвуковых изображений глаз с усилением потока у различных видов позвоночных. (A) Сенегальский бишир (Polypterus senegalus). (B) Краснобрюхая пиранья (Pygocentrus nattereri). (C) Зеленая игуана (Iguana iguana). (D) Эмбриональная (день 18) домашняя курица (Gallus gallus domesticus). (E) Домовая мышь (Mus musculus). (F) Коричневая крыса (Rattus norvegicus). У видов с ядерными эритроцитами процедура усиления потока дает полезные изображения глазного кровотока (A-D), тогда как у взрослых млекопитающих (энуклеированных эритроцитов) она производит только ограниченный контраст между текущей кровью и окружающими тканями (E-F). Зелеными стрелками обозначены сосуды сетчатки; синие наконечники стрел указывают на сосуды после сетчатки, такие как хориокапилларис; желтые наконечники стрел указывают на сосудистую оболочку rete mirabile. У позднеэмбриональной домашней курицы может наблюдаться кровоток в пектене окули (нижняя зеленая стрелка в F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Дыхательные движения вызывают шум движения, который может быть уменьшен ретроспективным гейтингом. (А-Б) Пример дыхательных движений в глазу европейской камбалы (Pleuronectes platessa). Красная точка находится в той же координате изображения в A (срез 54/410) и B (срез 92/410), но можно заметить, что глаз сместил положение (см. также запись кино в дополнительном материале 6). (C) Попытка выполнить операцию увеличения потока на полной записи 410 кадров терпит неудачу из-за шума движения. Границы тканей искусственно усиливаются за счет движений. (D) ретроспективная операция гаширования на основе нормированной интенсивности сигнала (СИ) в красной точке в A-B. Для процедуры увеличения потока включаются только кадры с нормализованным СИ > 50 (всего 38 кадров), т.е. указывающие, что глаз находится в том же положении, что и в В. (E) Полученное изображение ретроспективно закрытой процедуры увеличения потока. Сравните с C. На закрытом изображении избегается искусственное усиление границы, и можно наблюдать кровоток в сосудистой оболочке rete mirabile (желтый наконечник стрелы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Список видов, на которых был использован ультразвуковой метод с усилением потока для изображения глазного кровотока. Применимость метода основана на способности производить контрастно-богатое представление сосудистых руслов по сравнению со статическим фоном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Макроскрипт для автоматизации вычислений улучшения потока. Скрипт написан на языке IJ1 Macro и может быть выполнен как с помощью макрофункции ImageJ (для записи одного фрагмента), так и с помощью пакетного процесса ImageJ (для многослойной 3D-записи). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Необработанная запись кино в B-режиме на глазу золотой рыбки (Carassius auratus). Кровоток можно наблюдать во время воспроизведения видео, но не на одном кадре, как на рисунке 2A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Нарежьте видео через глаз золотой рыбки (Carassius auratus) участков, усиленных кровотоком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Трехмерный TIF-файл усиленного потока глаза золотой рыбки (Carassius auratus). Изображения были объединены в формате 3 x 3 x 3 для минимизации размера файла (уменьшение пространственного разрешения и размера файла в 27 раз). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: Интерактивная 3D-модель сосудов до и после сетчатки в глазу золотой рыбки (Carassius auratus). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 6: Необработанная запись кино в B-режиме на глазу европейской камбалы (Pleuronectes platessa). Обратите внимание на дыхательные движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Визуализация сосудов с использованием ультразвука с усилением потока обеспечивает новый метод неинвазивной визуализации сосудистой системы глаза, который предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, но имеет свои внутренние ограничения. Основным преимуществом ультразвука с усилением потока является способность генерировать глазные ангиографии с глубиной резкости, превышающей пигментный эпителий сетчатки, что ограничивает глубину резкости в оптических методах. В ультразвуковой визуализации пространственное разрешение и глубина резкости в конечном итоге определяются частотой ультразвукового преобразователя, где более высокие частоты увеличивают пространственное разрешение, но за счет меньшей глубины резкости, таким образом, выбор частоты преобразователя вводит компромисс между глубиной изображения и пространственным разрешением. По нашему опыту, оптимальная ультразвуковая визуализация сетчатки достигается с помощью высокочастотных ультразвуковых преобразователей (≥50 МГц) в маленьких глазах с глубиной изображения <1 см и низкочастотных преобразователей (20-40 МГц) в больших глазах с глубиной изображения 1,5-3,0 см. Для 3D-ультразвукового сканирования разрешение дополнительного размера среза задается размером шага между сканированиями в стеке 2D-ультразвуковых сканирований. По нашему опыту, сложно провести 3D-сканирование с шагом размером менее 20 мкм.

2D-ультразвук с усилением потока имеет высокое временное разрешение. В идеале для визуализации сосудов с расширенным потоком требуется ≥1000 кадров на изображение, поэтому требуется не менее 8 с на сканирование изображения. Временное разрешение значительно снижается при выполнении 3D-ультразвуковых исследований с усиленным потоком, где время сканирования увеличивается с количеством изображений в 3D-стеке сканирований. Учитывая высокое временное разрешение, рабочий процесс 2D-ультразвука с улучшенным потоком демонстрирует большой потенциал в качестве метода выявления временных изменений относительных скоростей кровотока и распределения кровотока во время экспериментальных манипуляций. Таким образом, будущие исследования могут использовать рабочий процесс для определения того, как измененные условия окружающей среды (например, температура, pO2, pCO2) или фармакологическое введение влияют на кровоток в глазу и других органах.

Рабочий процесс ультразвука опирается на положительный контраст ядерных эритроцитов большинства позвоночных, не относящихся к млекопитающим. Таким образом, энуклеированные эритроциты взрослых млекопитающих и некоторых видов саламандр37 обеспечивают слишком мало контраста, чтобы эффективно усилить кровоток с использованием текущего рабочего процесса (рисунок 3E, F). В традиционных ультразвуковых процессах сосудистая инъекция микропузырьков обеспечивает достаточно высокий контраст для идентификации сосудистой системы у млекопитающих38, которая использовалась для создания сосудистой ангиографии ретробульбарных сосудов в глазу крысы39. Однако микропузырьки лопаются в течение нескольких минут, поэтому генерация 3D-ангиографии требует последовательных инъекций микропузырьков.

Ультразвук с усилением потока зависит от последовательных записей в одном и том же положении глаза, поэтому этот метод невозможен у бодрствующих животных, где незначительные случайные движения могут компенсировать изображение и подорвать расчеты по увеличению потока. Таким образом, настоящий способ должен выполняться под надлежащей анестезией для иммобилизации для повышения качества изображения за счет уменьшения случайных движений. Тем не менее, регулярные движения глаза, которые происходят во время регулярных дыхательных движений, могут быть компенсированы проспективным или ретроспективным отклонением от модели вентиляции животного, поэтому в анализе данных используется только запись сканирования с того же интервала времени в цикле вентиляции. Хотя ретроспективный подход к смещению вентиляционных движений изображения значительно повышает стабильность изображения, он заметно уменьшает количество кадров, включенных в расчет стандартного отклонения интенсивности сигнала, что приводит к снижению отношения сигнал/шум (сравните рисунок 4E с рисунком 2C и рисунком 2I). ). Этот эффект смягчается с помощью проспективного гатинга на ультразвуковом сканере, в котором данные изображения получаются только тогда, когда животное находится в желаемой фазе дыхания. Однако это приводит к заметному увеличению времени приобретения, если необходимо приобрести желаемое количество кадров ≥1000.

Мы видим множество применений в зоологических и ветеринарных исследованиях для ультразвукового рабочего процесса с улучшенным потоком для отображения физиологии и анатомии сосудистой системы глаза. Сосудистая система лучепёрых рыб, млекопитающих и птиц относительно хорошо описана1,3,4,8,9,12,15,40, но это не относится к некостным рыбам (бесчелюстным позвоночным и хондрихтянам), амфибиям и рептилиям, которые представляют свои соответствующие более ранние расходящиеся родственные группы. Внедрение ультразвука с усилением потока на этих плохо изученных группах животных и интеграция этих данных со знаниями о более хорошо изученных группах обеспечит фундаментальное понимание эволюции сосудистой системы глаза позвоночных. Поскольку сосудистая система глаза сходна у близкородственных видов4, такая подробная информация о глазной сосудистой системе у широкого круга видов обеспечит точку отсчета для ветеринаров для выявления пороков развития в сосудистой системе глаза из-за дефектов развития, заболеваний или физических травм. Кроме того, способность получать 2D-информацию о кровотоке с высоким пространственно-временным разрешением обеспечивает средства для количественной оценки фармакокинетических эффектов на распределение кровотока в глубоких сосудистых руслах с широким применением в разработке и тестировании лекарств. Будущие исследования по этому методу должны быть сосредоточены на выявлении инъекционных соединений, которые усиливают контраст крови у видов с энуклеированными эритроцитами, что расширит применимость этого метода к млекопитающим с широким применением в биомедицинских исследованиях и клинической диагностике сосудистой дисфункции в глазу и других глубоких сосудистых руслах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что никаких завершающих интересов не существует.

Acknowledgments

Эта работа получила финансирование от Фонда Carlsberg (CF17-0778; CF18-0658), Фонд Лундбека (R324-2019-1470; R346-2020-1210), Фонды Velux (00022458), Фонд А.П. Мёллера по развитию медицинской науки, исследовательская и инновационная программа Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри (No 754513) и Исследовательский фонд Орхусского университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-222 Sigma E10521-50G
Benzocaine Sigma E-1501
Propofol B Braun
12260470_0320
Alfaxalon Jurox NA
Isoflurane Zoetis 50019100
Ultrasound scanner VisualSonics Vevo 2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary. Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).
  2. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 175-208 (2001).
  3. Country, M. W. Retinal metabolism: A comparative look at energetics in the retina. Brain Research. 1672, 50-57 (2017).
  4. Damsgaard, C., et al. Retinal oxygen supply shaped the functional evolution of the vertebrate eye. Elife. , 8 (2019).
  5. Buttery, R. G., Hinrichsen, C. F. L., Weller, W. L., Haight, J. R. How thick should a retina be? A comparative study of mammalian species with and without intraretinal vasculature. Vision Research. 31 (2), 169-187 (1991).
  6. Ames, A., Li, Y., Heher, E., Kimble, C. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
  7. Chase, J. The Evolution of retinal vascularization in mammals: A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  8. Johnson, G. L. Ophthalmoscopic studies on the eyes of mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 254 (794), 207-220 (1968).
  9. Johnson, G. L. I. Contributions to the comparative anatomy of the mammalian eye, chiefly based on ophthalmoscopic examination. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 194 (194-206), 1-82 (1901).
  10. Rodriguez-Ramos Fernandez, J., Dubielzig, R. R. Ocular comparative anatomy of the family Rodentia. Veterinary Ophthalmology. 16, 94-99 (2013).
  11. Copeland, D. E. Functional vascularization of the teleost eye. Current Topics in Eye Research. 3, 219-280 (1980).
  12. Meyer, D. B. The Visual System in Vertebrates. Handbook of Sensory Physiology. Crescitelli, F. 7, Springer. Berlin, Heidelberg. (1977).
  13. Potier, S., Mitkus, M., Kelber, A. Visual adaptations of diurnal and nocturnal raptors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 106, 116-126 (2020).
  14. Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. Active secretion of oxygen into the eye of fish. Nature. 194, 106-107 (1962).
  15. Damsgaard, C. Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye. Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840 (2021).
  16. Damsgaard, C., et al. A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina. Elife. 9, (2020).
  17. Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).
  18. Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile. Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).
  19. Berenbrink, M. Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes. Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).
  20. Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system. Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).
  21. Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: State of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
  22. Yung, M., Klufas, M. A., Sarraf, D. Clinical applications of fundus autofluorescence in retinal disease. International Journal of Retina and Vitreous. 2 (1), 12 (2016).
  23. Ang, M., et al. Optical coherence tomography angiography: a review of current and future clinical applications. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (2), 237-245 (2018).
  24. Spaide, R. F., Koizumi, H., Pozonni, M. C. Enhanced depth imaging spectral-domain optical coherence tomography. American Journal of Ophthalmology. 146 (4), 496-500 (2008).
  25. Shen, Q., et al. Magnetic resonance imaging of tissue and vascular layers in the cat retina. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 23 (4), 465-472 (2006).
  26. Tan, G. X., Jamil, M., Tee, N. G., Zhong, L., Yap, C. H. 3D reconstruction of chick embryo vascular geometries using non-invasive high-frequency ultrasound for computational fluid dynamics studies. Annals of Biomedical Engineering. 43 (11), 2780-2793 (2015).
  27. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ dynamics and fluid dynamics of the HH25 chick embryonic cardiac ventricle as revealed by a novel 4D high-frequency ultrasound imaging technique and computational flow simulations. Annals of Biomedical Engineering. 45 (10), 2309-2323 (2017).
  28. Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e57089 (2018).
  29. Jia, Y., et al. Split-spectrum amplitude-decorrelation angiography with optical coherence tomography. Optics Express. 20 (4), 4710-4725 (2012).
  30. Clarke, K. W., Trim, C. M., Trim, C. M. Veterinary Anaesthesia E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2013).
  31. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. , Elsevier Science & Technology. (2015).
  32. West, G., Heard, D., Caulkett, N. Zoo Animal and Wildlife Immobilization and Anesthesia. , John Wiley & Sons, Inc. (2014).
  33. Lauridsen, H., Hansen, K., Nørgård, M. Ø, Wang, T., Pedersen, M. From tissue to silicon to plastic: three-dimensional printing in comparative anatomy and physiology. Royal Society Open Science. 3 (3), 150643 (2016).
  34. Lauridsen, H., et al. Inside out: Modern imaging techniques to reveal animal anatomy. PLoS One. 6 (3), 17879 (2011).
  35. Ruthensteiner, B., Heß, M. Embedding 3D models of biological specimens in PDF publications. Microscopy Research and Technique. 71 (11), 778-786 (2008).
  36. Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep vascular imaging in the eye with flow-enhanced ultrasound. bioRxiv. , 447055 (2021).
  37. Mueller, R. L., Ryan Gregory, T., Gregory, S. M., Hsieh, A., Boore, J. L. Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders. Zoology. 111 (3), 218-230 (2008).
  38. Greis, C. Quantitative evaluation of microvascular blood flow by contrast-enhanced ultrasound (CEUS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 49, 137-149 (2011).
  39. Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye. Experimental Eye Research. 193, 107986 (2020).
  40. Walls, G. L. The vertebrate eye and its adaptive radiation. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).

Tags

Биология выпуск 176
Глубокая сосудистая визуализация в глазу с помощью ультразвука с усилением потока
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep… More

Damsgaard, C., Lauridsen, H. Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound. J. Vis. Exp. (176), e62986, doi:10.3791/62986 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter