Summary
Wir stellen eine nicht-invasive Ultraschalltechnik vor, um dreidimensionale Angiographien im Auge ohne den Einsatz von Kontrastmitteln zu erzeugen.
Abstract
Die Netzhaut im Auge ist eines der energieintensivsten Gewebe im Körper und benötigt daher eine hohe Sauerstoffzufuhr aus einer reichhaltigen Blutversorgung. Die Kapillarlamina der Aderhaut kleidet die äußere Oberfläche der Netzhaut aus und ist die dominierende Sauerstoffquelle in den meisten Netzhaut von Wirbeltieren. Dieses Gefäßbett ist jedoch aufgrund seiner Position hinter der stark lichtabsorbierenden Netzhaut mit traditionellen optischen Techniken schwierig abzubilden. Hier beschreiben wir eine Hochfrequenz-Ultraschalltechnik mit anschließender Strömungsverstärkung, um tiefe Gefäßbetten (0,5-3 cm) des Auges mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung abzubilden. Diese nicht-invasive Methode funktioniert gut bei Arten mit kernhaltigen roten Blutkörperchen (nicht-säugetierische und fötale Tiermodelle). Es ermöglicht die Erstellung nicht-invasiver dreidimensionaler Angiographien ohne den Einsatz von Kontrastmitteln und ist unabhängig von Blutflusswinkeln mit einer höheren Empfindlichkeit als Doppler-basierte Ultraschall-Bildgebungsverfahren.
Introduction
Der hohe Stoffwechsel auf der Netzhaut von Wirbeltieren erlegt einen intrinsischen Kompromiss zwischen zwei gegensätzlichen Bedürfnissen dar; hohe Blutflussraten und ein Lichtweg ohne Blutgefäße. Um Sehstörungen bei der Durchblutung roter Blutkörperchen zu vermeiden, erhält die Netzhaut aller Wirbeltiere Sauerstoff und Nährstoffe über eine Kapillarschicht hinter den Photorezeptoren, die Choriocapillaris1,2,3. Diese einzige Quelle von Nährstoffen und Sauerstoff erlegt jedoch eine Diffusionsbegrenzung der Dicke der Netzhaut vor4,5, so dass viele visuell aktive Spezies eine Vielzahl von ausgeklügelten Gefäßnetzwerken besitzen, um dieses metabolisch aktive Organ zusätzlich mit Blut zu versorgen6. Zu diesen Gefäßbetten gehören Blutgefäße, die die inneren Netzhautschichten bei Säugetieren und einigen Fischen durchbluten4,7,8,9,10, Blutgefäße auf der inneren (lichtzugewandten) Seite der Netzhaut, die bei vielen Fischen, Reptilien und Vögeln zu finden sind4,11,12,13 und gegenstromförmige Gefäßanordnungen der Fischaderhaut, der Aderhautrete Mirable, das die Erzeugung von Super-Luftsauerstoff-Partialdrücken ermöglicht14,15,16,17,18,19,20. Obwohl diese zusätzlichen nicht-choroidalen Pfade für die retinale Nährstoffversorgung eine wesentliche Rolle bei der Deckung der metabolischen Anforderungen des überlegenen Sehens spielen4, ist die dreidimensionale Anatomie dieser Gefäßstrukturen kaum verstanden, was unser Verständnis der morphologischen Entwicklung des Wirbeltierauges einschränkt.
Traditionell wurde die retinale Blutversorgung mit optischen Techniken wie der Fundus-Ophthalmoskopie untersucht. Diese Kategorie von Techniken liefert zerstörungsfreie Hochdurchsatzinformationen über die nicht-choroidale Blutgefäßanatomie in hoher Auflösung21 und wird daher leicht in der klinischen Diagnose von Anomalien in der Netzhautgefäßstruktur verwendet22. Das retinale Pigmentepithel absorbiert jedoch das durchgelassene Licht und begrenzt die Sichttiefe bei diesen optischen Techniken, wodurch die Informationen über die Struktur und Funktion der Aderhaut ohne den Einsatz von Kontrastmitteln reduziert werden21. Ähnliche Tiefenbeschränkungen treten bei der optischen Kohärenztomographie (OCT) auf. Diese Technik kann hochauflösende Fundusangiographien unter Verwendung von Lichtwellen auf Kosten der Tiefenpenetration erzeugen23, während die erweiterte Tiefenbildgebung OCT die Aderhaut auf Kosten der retinalen Bildgebungsqualität visualisieren kann24. Die Magnetresonanztomographie überwindet die optischen Einschränkungen von Ophthalmoskopie und OCT und kann Gefäßschichten in der Netzhaut abbilden, wenn auch mit niedriger Auflösung25. Histologie und Mikrocomputertomographie (μCT) halten die hohe Auflösung der optischen Techniken aufrecht und liefern Informationen über die Ganzaugen-Gefäßmorphologie4, aber beide Techniken erfordern eine Augenprobenahme und sind daher in der Klinik oder bei seltenen oder gefährdeten Arten nicht möglich. Um einige der Einschränkungen dieser etablierten retinalen Bildgebungsverfahren zu überwinden, präsentiert die Studie hier ein Ultraschallprotokoll an anästhesierten Tieren, bei dem die Blutbewegung in silico auf einer Reihe von zweidimensionalen Ultraschalluntersuchungen mit gleichem Abstand abgebildet wird, die ein ganzes Auge überspannen, indem eine vergleichbare Technik angewendet wird, wie zuvor für embryonale und kardiovaskuläre Bildgebung beschrieben26,27, 28 und in der Angiographie des OKT29. Dieser Ansatz ermöglicht die Generierung nicht-invasiver dreidimensionaler Tiefen-Augenangiographien ohne Verwendung eines Kontrastmittels und eröffnet neue Wege zur Kartierung der Blutflussverteilung innerhalb des Auges über Spezies hinweg.
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Protocol
Das folgende Protokoll wurde mit Genehmigung der dänischen Aufsichtsbehörde für Tierversuche innerhalb des dänischen Ministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Fischerei, der dänischen Veterinär- und Lebensmittelbehörde durchgeführt (Genehmigungsnummer 2016-15-0201-00835).
1. Anästhesie- und Ultraschallmedium
- Betäuben Sie das Forschungstier.
HINWEIS: Art und Dosis der geeigneten Anästhesie sind stark artabhängig. Im Allgemeinen sind immersionsbasierte Anästhetika wie MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonsäure), Benzocain (Ethyl-4-aminobenzoat) und Propofol (2,6-Diisopropylphenol) bei Fischen und Amphibien nützlich, die das Anästhetikum leicht über Kiemen oder Haut aufnehmen (z. B. 0,05 mg). L-1 Benzocain in Regenbogenforellen). Eine Reihe von gelösten Verbindungen, die intravenös, intramuskulär, intraperitoneal verabreicht werden können, ist für Amnioten verfügbar, ebenso wie Anästhetika auf Gasbasis. Alfaxalon, das intramuskulär verabreicht wird, ist bei Reptilien nützlich (z. B. 30 mg·kg-1 bei Eidechsen), und Isofluran, das als Gas verabreicht wird, ist bei Vögeln nützlich (z. B. 2% in Luft für Tauben). Einen vollständigen Überblick über die verfügbaren Anästhetika in allen Arten finden Sie in der veröffentlichten Literatur30,31,32. - Testen Sie Reflexe im Tier, um ein optimales Anästhesieniveau zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass das Tier während des Eingriffs völlig bewegungslos ist, da das strömungsverstärkte Ultraschallverfahren empfindlich auf Bewegungsgeräusche reagiert.
- Eine zu tiefe Anästhesie kann die Blutflussmuster verändern, also führen Sie eine Dosistitration in der Startphase eines Experiments durch.
- Erhöhen Sie die Anästhesiedosis in Schritten und beobachten Sie den Blutfluss im Auge, unterstützt durch Ultraschall im einfachen Helligkeitsmodus (B-Modus).
HINWEIS: Ein optimales Maß an Anästhesie wird erreicht, wenn das Tier bewegungslos ist (außer Atmung) mit sichtbarem okulärem Blutfluss.
- Wenn die Art / Dosis des Anästhetikums für Atembewegungen nicht zulässig ist, stellen Sie eine ausreichende Belüftung des Tieres sicher, z. B. mit einer Luftpumpe, um das Wasser für aquatische Arten mit Sauerstoff zu versorgen, oder einem Beatmungsgerät für luftatmende Arten.
- Positionieren Sie das Tier in einer Haltung, die einen direkten Zugang von oben zum Auge ermöglicht.
HINWEIS: Je nach Art kann sich dies entweder in Rückenlage oder seitlich befinden. Es kann sinnvoll sein, eine einfache Haltevorrichtung mit einem kleinen Stück nicht reaktivem Metall (z. B. Edelstahl) und losen Gummibändern zu konstruieren (siehe Abbildung 1). - Legen Sie ein geeignetes Ultraschallmedium auf das Auge des Tieres. Wenn geschuppte Augenlider (ultraschallundurchlässig) das Auge bedecken, dann verdrängen Sie diese vorsichtig mit einem Wattestäbchen.
HINWEIS: Für aquatische Arten ist das beste Ultraschallmedium sauberes Tankwasser, in dem das Tier normalerweise lebt. Bei terrestrischen Spezies sorgt eine großzügige Menge an Ultraschallgel für freie Bewegungen und Bildgebung des Ultraschallwandlers (d.h. der linearen Array-Sonde) über die gesamte Oberfläche des Auges. Tierarztsalbe auf dem kontralateralen Auge ist für terrestrische Arten erforderlich.
2. 2D- und 3D-Bilderfassung von Augenultraschall
- Positionieren Sie den Ultraschallwandler medial zum Auge entweder in einer dorsalen/ventralen oder rostralen/kaudalen Ausrichtung, abhängig von der gewünschten Bildausrichtung.
- Stellen Sie im B-Modus mit maximaler Schärfentiefe den medialen und tiefsten Teil des Auges ab und stellen Sie sicher, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind.
HINWEIS: Bei einigen Arten nimmt die kristalline Linse einen vergleichsweise großen Anteil des Glaskörpers ein, der den Ultraschall absorbieren kann, insbesondere bei höheren Frequenzen. - Übersetzen Sie den Wandler langsam auf jede Seite, während Sie die Echtzeitbilder inspizieren. Stellen Sie sicher, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind. Wenn nicht, wechseln Sie zu einem Wandler mit einer niedrigeren Frequenz und größerer Schärfentiefe.
HINWEIS: Die folgenden Mittenfrequenzen ermöglichen die folgende maximale Schärfentiefe: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (siehe Tabelle 1). Diese maximalen Tiefenschärfewerte können jedoch deutlich niedriger sein, wenn das Auge verkalkte oder andere ultraschallundurchlässige Strukturen enthält. - Passen Sie die Bildtiefe, den Tiefenversatz (Abstand vom oberen Bildrand zur interessierenden Struktur), die Bildbreite sowie die Anzahl und Position der Fokuszonen an, um den gewünschten Interessenbereich in allen drei Raumdimensionen abzudecken (z. B. 1 cm Bildtiefe, 2 mm Tiefenversatz, 1 cm Bildbreite, eine Fokuszone).
HINWEIS: Obwohl die spezifische Benennung von Tasten, die diese Parameter anpassen, zwischen Ultraschallsystemen variieren kann, verfügen die meisten Systeme über Tasten mit logischen Namen für diese Anpassungen. Diese Bildparametereinstellungen wirken sich in der Regel auf den Bereich möglicher zeitlicher Auflösungen der Ultraschallerfassung aus. - Stellen Sie die Bildrate im Bereich von 50-120 Bildern·s-1 ein.
HINWEIS: Die zeitliche Auflösung (d.h. das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden B-Scans) muss ausreichend sein, um eine große Pixelintensitätsvariabilität in abgebildeten Blutgefäßen anzuzeigen, d.h. die zeitliche Auflösung darf nicht zu hoch sein. Auf der anderen Seite, um eine vollständige 3D-Aufnahme des Auges in einer angemessenen Zeit abzuschließen, kann die zeitliche Auflösung nicht zu niedrig sein. Eine zeitliche Auflösung von 50-120 Bildern·s-1 ist in der Regel für das strömungsverstärkte Verfahren bei den meisten Arten ausreichend. Bei einigen Ultraschallsystemen kann diese gewünschte zeitliche Auflösung durch Umschalten zwischen den Modi "allgemeine Bildgebung" (hohe räumliche/niedrige zeitliche Auflösung) und "Kardiologie" (niedrige räumliche/hohe zeitliche Auflösung) erreicht werden. - Passen Sie die 2D-Verstärkung auf einen Pegel (~ 5 dB) an, so dass anatomische Strukturen in der B-Mode-Erfassung gerade erst sichtbar sind, um das Signal-Rausch-Verhältnis in der anschließenden flussverstärkten Rekonstruktion zu erhöhen.
- Um ein 2D-Flow-verbessertes Bild an einer einzelnen Slice-Position zu erhalten, übersetzen Sie den Wandler in diese Position und fahren Sie mit Schritt 3.1 fort.
- Um eine 3D-Aufnahme einer ganzen Region von Interesse, z. B. der Netzhaut, zu erhalten, übersetzen Sie den Wandler auf ein Extrem der interessierenden Region.
- Um die genaue Position des äußersten Endes der interessierenden Region zu bestimmen, erhöhen Sie die 2D-Verstärkung kurz.
- Nachdem die korrekte Platzierung des Wandlers abgeschlossen ist, verringern Sie die 2D-Verstärkung vor der Aufnahme, um ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis bei der anschließenden flussverstärkten Rekonstruktion zu gewährleisten.
- Erfassen Sie für jeden Schritt (Slice) in der 3D-Aufnahme ≥100 Frames (optimal ≥1000 Frames).
- Übersetzen Sie den Wandler mit einem Mikromanipulator oder einem eingebauten Wandlermotor über den gesamten Interessenbereich in Schritten von z. B. 25 μm oder 50 μm (denken Sie daran, die Schrittgröße zu beachten) und wiederholen Sie die Erfassung von ≥100 Bildern für jeden Schritt.
- Euthanasie das Forschungstier gemäß den Tierpflegerichtlinien der Einrichtung.
3. Flussverstärkte Bildrekonstruktion
- Exportieren Sie die Aufnahmen in das DICOM-Dateiformat (Digital Imaging and Communications in Medicine) (Little-Endian).
- Um ein einzelnes flussverstärktes Bild basierend auf einer Cine-Aufnahme mit ≥100 Bildern (T) zu erzeugen, berechnen Sie die Standardabweichung auf Pixelebene (STD(x,y)) mit der folgenden Formel:
Dabei ist It(x,y) die Intensität des Pixels an der (x,y) Pixelkoordinate zum Zeitpunkt t, und Īt(x,y) ist der arithmetische Mittelwert von I im Zeitverlauf. - Wiederholen Sie Schritt 3.2 für jedes Segment in der 3D-Aufnahme.
- Um die STD-Berechnung und Bildrekonstruktion für mehrere Slices in einer 3D-Aufnahme zu automatisieren, führen Sie diesen Vorgang im Batch-Modus durch, z. B. mit ImageJ und dem ergänzenden Makroskript (Supplementary File 1).
- Kombinieren Sie alle rekonstruierten Slices in einem Image-Stack (Befehl "Images to Stack" in ImageJ).
- Geben Sie die Segmentdicke anhand der während der Aufnahme verwendeten Schrittgröße an (Befehl Eigenschaften in ImageJ).
- Speichern Sie den Bildstapel als 3D-TIF-Datei.
HINWEIS: Flussgewichtete dreidimensionale Aufzeichnungen von Augenblutgefäßen können anschließend verwendet werden, um Volumen-Renderings zu erstellen und digitale und physikalische anatomische Modelle von Gefäßstrukturen des Auges zu erstellen. Diese Bildverarbeitungsoptionen liegen außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls. Weitere Informationen finden Sie in den zuvor veröffentlichten Artikeln33,34,35.
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Representative Results
Die strömungsverstärkte Ultraschalltechnik zur Abbildung von Gefäßbetten des Auges kann bei einer Reihe von Arten angewendet werden und wird derzeit bei 46 verschiedenen Wirbeltierarten angewendet (Abbildung 1, Tabelle 1). Das Vorhandensein von kernhaltigen roten Blutkörperchen bei nicht-erwachsenen Säugetierwirbeltieren bietet einen positiven Kontrast des fließenden Blutes im Vergleich zu statischem Gewebe in Kinoaufzeichnungen (Supplementary File 2). Bei einer Analyse nach und nach ist die klare Unterscheidung zwischen Blut und umgebendem Gewebe jedoch weniger offensichtlich (Abbildung 2A). Das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren zur Verbesserung des Blutflusses stellt im Wesentlichen eine Mehrzeitpunktaufnahme im 2D-Raum (eine Scheibe aus T-Frames) in einem einzigen Bild zusammen, in dem die inhärenten Signalwertschwankungen in Pixeln, die im fließenden Blut positioniert sind, eine höhere Standardabweichung als das umgebende statische Gewebe aufweisen und somit einen positiven Kontrast erzeugen (Abbildung 2B). Um den Blutgefäßkontrast wahrnehmbar zu verstärken, können Nachschlagetabellen verwendet werden, um pseudofarbige Bilder zu erzeugen (Abbildung 2C). Bei 3D-Aufnahmen können mehrere parallele Slices mit bekanntem Abstand zu 3D-Bilddaten (Supplementary File 3 und Supplementary File 4) kombiniert werden, die für dreidimensionales Volumen-Rendering (Figure 2D) und anatomische Modellierung (Figure 2E und Supplementary File 5) verwendet werden können. Die Doppler-basierte Ultraschallbildgebung bietet auch die Möglichkeit, den Blutfluss spezifisch abzubilden, jedoch mit geringerer Empfindlichkeit als die beschriebene Methode (vergleichen Sie Abbildung 2G mit Abbildung 2H und Abbildung 2I), und vor allem nicht, wenn die Blutflussorientierung direkt oder nahe senkrecht zur Richtung der Schallwelle liegt. Das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren zur Verbesserung des Durchflusses ist unabhängig von der Ausrichtung des Blutflusses sowohl innerhalb als auch außerhalb der Ebene.
Das flussverstärkte Ultraschallverfahren ermöglicht die Bildgebung des Blutflusses bei einer Reihe von Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen (Abbildung 3A-D). Tiefe okuläre Gefäßbetten wie die Aderhaut rete mirabile bei einigen Fischen können abgebildet werden, wenn sie in der Art vorhanden sind (gelbe Pfeilspitze in Abbildung 2, Abbildung 3B, Abbildung 4). Die Methode ist durch das Fehlen von kernhaltigen roten Blutkörperchen bei erwachsenen Säugetieren begrenzt, bei denen das Verfahren zur Verbesserung des Blutflusses ein gewisses Maß an Blutflusskontrast erzeugt, aber nicht so ausgeprägt ist wie bei Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen (Abbildung 3E, F).
Strömungsverstärkter Ultraschall reagiert empfindlich auf Bewegungsgeräusche, und z. B. können Atembewegungen zu Bildunschärfe und Artefakten wie der Verbesserung der Geweberänder führen (Abbildung 4A-C, Supplementary File 6). Prospektives oder retrospektives Gating kann verwendet werden, um Bewegungsgeräusche anzupassen (Abbildung 4D, E).
Abbildung 1: Beispiele für die Artenvielfalt, die für die strömungsverstärkte Ultraschallbildgebung von Augengefäßen geeignet sind. (A) Goldfisch (Carassius auratus). (B) Sibirischer Stör (Acipenser baerii). (C) Europäischer Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax). (D) Clown-Federrücken (Chitala ornata). (E) Karausche-Karpfen (Carassius carassius). (F) Embryonales Haushuhn (Gallus gallus domesticus). Es kann nützlich sein, eine einfache Haltevorrichtung mit einem nicht reaktiven Metallgewicht und losen Gummibändern (A, C, D) zu konstruieren. Für das Verfahren können sowohl große, unbewegliche laborbasierte Ultraschallbildgebungssysteme (A-D,F) als auch kleine Feldoperationssysteme (E) eingesetzt werden. Bei der Abbildung kleiner und hochtemperaturempfindlicher Arten, die nicht wie embryonale Vögel in einem temperaturkontrollierten Wasserbad gehalten werden können, kann die Bildgebung durchgeführt werden, während sich die Probe im Inkubator befindet (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Auswirkung der Durchflussverstärkung auf Augenultraschalluntersuchungen. (A) Beispiele für rohe Ultraschallbilder im B-Modus des Auges eines Goldfisches in einer Cine-Aufnahme mit 1000 Bildern. Während der Blutfluss in der Kinoaufzeichnung (Supplementary File 2) beobachtet werden kann, ist er in statischen Frames schwer zu erkennen. (B) Flussverstärktes Graustufenbild (gleicher Ausschnitt wie in A). Sowohl retinale als auch postretinale Gefäßbetten werden verbessert. (C) Pseudo-farbige Version des Bildes in B mit ImageJ Fire Look Up Table. (D) Volumengerenderte Anzeige des Blutflusses im Auge desselben Goldfisches wie in A-C, basierend auf 3D-Erfassung. (E) Zweisegmentiges (retinale und postretinale Gefäße) anatomisches Modell des Auges in A-D (für interaktives Modell siehe ergänzendes Material 5). (F-I) Rohes Ultraschallbild im B-Modus des Auges eines anderen Goldfisches (F) beim Vergleich der farbigen Doppler-basierten Flussbildgebung (G) mit den in diesem Protokoll beschriebenen strömungsverstärkten Methoden (H-I, Anmerkung I ist eine Überlagerung von H auf F). Grüne Pfeile zeigen Netzhautgefäße an, gelbe Pfeilspitzen zeigen die Aderhaut rete mirabile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Beispiele für strömungsverstärkte Augenultraschallbilder bei einer Vielzahl von Wirbeltierarten. (A) Senegal bichir (Polypterus senegalus). (B) Rotbauch-Piranha (Pygocentrus nattereri). (C) Grüner Leguan (Leguanleguan). (D) Embryonales (Tag 18) Haushuhn (Gallus gallus domesticus). (E) Hausmaus (Mus musculus). (F) Braune Ratte (Rattus norvegicus). Bei Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen liefert das Flussverstärkungsverfahren nützliche Bilder des okulären Blutflusses (A-D), während es bei erwachsenen Säugetieren (enukleierte rote Blutkörperchen) nur einen begrenzten Kontrast zwischen fließendem Blut und umgebendem Gewebe (E-F) erzeugt. Grüne Pfeile zeigen Netzhautgefäße an; blaue Pfeilspitzen zeigen postretinale Gefäße wie die Choriocapillaris an; Gelbe Pfeilspitzen zeigen die Aderhaut rete mirabile an. Beim späten embryonalen Haushuhn kann ein Blutfluss in den pecten oculi beobachtet werden (unterer grüner Pfeil in F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Atembewegungen induzieren Bewegungsgeräusche, die durch retrospektives Gating gelindert werden können. (A-B) Beispiel für Atembewegungen im Auge einer Scholle (Pleuronectes platessa). Der rote Punkt befindet sich an der gleichen Bildkoordinate in A (Slice 54/410) und B (Slice 92/410), aber es kann beobachtet werden, dass das Auge seine Position verschoben hat (siehe auch Cine-Aufnahme im Ergänzungsmaterial 6). (C) Der Versuch, den Flow-Enhancement-Vorgang für die vollständige 410-Frames-Aufnahme durchzuführen, schlägt aufgrund von Bewegungsrauschen fehl. Gewebegrenzen werden durch Bewegungen künstlich verstärkt. (D) retrospektiver Gating-Betrieb auf der Grundlage der normalisierten Signalintensität (SI) am roten Punkt in A-B. Nur Frames mit normalisiertem SI > 50 (insgesamt 38 Frames), d.h. die anzeigen, dass sich das Auge an der gleichen Position wie in B befindet, werden für das Flow-Enhancement-Verfahren berücksichtigt. (E) Resultierendes Bild eines retrospektiv gated Flow-Enhancement-Verfahrens. Vergleichen Sie mit C. Im Gated Image wird eine künstliche Randverstärkung vermieden und der Blutfluss in der Aderhaut rete mirabile (gelbe Pfeilspitze) beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Liste der Arten, bei denen die strömungsverstärkte Ultraschalltechnik zur Abbildung des okulären Blutflusses verwendet wurde. Die Anwendbarkeit der Methode basiert auf der Fähigkeit, eine kontrastreiche Darstellung von Gefäßbetten im Vergleich zum statischen Hintergrund zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1: Makroskript zur Automatisierung von Flussverbesserungsberechnungen. Das Skript ist in der IJ1-Makrosprache geschrieben und kann sowohl mit der ImageJ-Makrofunktion (für Einzelscheibenaufnahmen) als auch mit dem ImageJ-Batch-Prozess (für 3D-Aufnahmen mit mehreren Slices) ausgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: Rohe B-Mode-Cine-Aufnahme am Auge eines Goldfisches (Carassius auratus). Der Blutfluss kann während der Wiedergabe des Videos beobachtet werden, jedoch nicht auf einem einzelnen Frame wie in Abbildung 2A. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 3: Schneiden Sie Video durch das Auge eines Goldfisches (Carassius auratus) von blutflussverstärkten Abschnitten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsakte 4: Dreidimensionale TIF-Datei des strömungsverstärkten Auges des Goldfisches (Carassius auratus). Bilder wurden um 3 x 3 x 3 bindiert, um die Dateigröße zu minimieren (27-fache Reduzierung der räumlichen Auflösung und Dateigröße). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 5: Interaktives 3D-Modell prä- und postretinaler Gefäße im Auge eines Goldfisches (Carassius auratus). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzdatei 6: Rohe B-Mode-Cine-Aufnahme auf dem Auge einer europäischen Scholle (Pleuronectes platessa). Beachten Sie Atembewegungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die vaskuläre Bildgebung mit strömungsverstärktem Ultraschall bietet eine neue Methode für die nicht-invasive Bildgebung des Gefäßsystems des Auges, die mehrere Vorteile gegenüber derzeitigen Techniken bietet, aber ihre intrinsischen Grenzen hat. Der Hauptvorteil von strömungsverstärktem Ultraschall ist die Fähigkeit, Augenangiographien mit einer Schärfentiefe zu erzeugen, die das retinale Pigmentepithel übersteigt, was die Schärfentiefe in optischen Techniken einschränkt. In der Ultraschallbildgebung werden die räumliche Auflösung und die Schärfentiefe letztendlich durch die Ultraschallwandlerfrequenz bestimmt, wobei höhere Frequenzen die räumliche Auflösung erhöhen, jedoch auf Kosten einer flacheren Schärfentiefe, so dass die Wahl der Wandlerfrequenz einen Kompromiss zwischen Bildtiefe und räumlicher Auflösung einführt. Unserer Erfahrung nach wird eine optimale retinale Ultraschallbildgebung mit Hochfrequenz-Ultraschallwandlern (≥50 MHz) bei kleinen Augen mit Bildtiefen von <1 cm und niederfrequenten Wandlern (20-40 MHz) bei größeren Augen mit Bildtiefen von 1,5-3,0 cm erreicht. Bei einer 3D-Ultraschalluntersuchung wird die Auflösung der zusätzlichen Slice-Dimension durch die Schrittweite zwischen den Scans im Stapel von 2D-Ultraschallscans festgelegt. Nach unserer Erfahrung ist es schwierig, einen 3D-Scan mit einer Schrittweite kleiner als 20 μm durchzuführen.
Durchflussverstärkter 2D-Ultraschall hat eine hohe zeitliche Auflösung. Idealerweise sind ≥1000 Bilder pro Bild für die strömungsverstärkte Gefäßbildgebung erforderlich, so dass mindestens 8 s pro Bildscan erforderlich sind. Die zeitliche Auflösung wird bei der Durchführung von 3D-Flow-verstärkten Ultraschalluntersuchungen erheblich reduziert, wobei die Scanzeit mit der Anzahl der Bilder im 3D-Scanstapel zunimmt. Angesichts der hohen zeitlichen Auflösung zeigt der strömungsverstärkte 2D-Ultraschall-Workflow ein starkes Potenzial als Methode zur Identifizierung zeitlicher Veränderungen der relativen Blutflussgeschwindigkeiten und der Blutflussverteilung während der experimentellen Manipulation. So können zukünftige Studien den Workflow nutzen, um zu identifizieren, wie sich veränderte Umweltbedingungen (z. B. Temperatur, pO2, pCO2) oder die pharmakologische Verabreichung auf den Blutfluss im Auge und anderen Organen auswirken.
Der Ultraschall-Workflow beruht auf dem positiven Kontrast der kernhaltigen roten Blutkörperchen der meisten Nicht-Säugetier-Wirbeltiere. Daher bieten die enukleierten roten Blutkörperchen erwachsener Säugetiere und einiger Salamanderarten37 zu wenig Kontrast, um den Blutfluss mit dem vorliegenden Arbeitsablauf effektiv zu verbessern (Abbildung 3E,F). In traditionellen Ultraschall-Workflows bietet die vaskuläre Injektion von Mikrobläschen einen ausreichend hohen Kontrast, um das Gefäßsystem bei Säugetieren zu identifizieren38, das zur Erstellung von vaskulären Angiographien der retrobulbären Gefäße im Rattenauge verwendet wurde39. Die Mikrobläschen platzen jedoch innerhalb von Minuten, so dass die Generierung von 3D-Angiographien aufeinanderfolgende Mikroblaseninjektionen erfordert.
Flow-verstärkter Ultraschall hängt von sequentiellen Aufnahmen in der gleichen Position des Auges ab, so dass die Technik bei wachen Tieren nicht möglich ist, wo kleinere zufällige Bewegungen das Bild ausgleichen und Strömungsverbesserungsberechnungen untergraben können. Daher muss die vorliegende Methode unter richtiger Betäubung zur Immobilisierung durchgeführt werden, um die Bildqualität durch Verringerung zufälliger Bewegungen zu verbessern. Regelmäßige Bewegungen des Auges, die bei regelmäßigen Atembewegungen auftreten, können jedoch durch prospektives oder retrospektives Gating zum Beatmungsmuster des Tieres ausgeglichen werden, so dass in der Datenanalyse nur Scanaufnahmen aus dem gleichen Zeitintervall innerhalb des Beatmungszyklus verwendet werden. Während der retrospektive Gating-Ansatz zur Kompensation von Beatmungsbewegungen des Bildes die Bildstabilität erheblich verbessert, reduziert er die Anzahl der Frames, die in die Berechnung der Standardabweichung der Signalintensität einbezogen werden, was zu einer Abnahme des Signal-Rausch-Verhältnisses führt (vergleichen Sie Abbildung 4E mit Abbildung 2C und Abbildung 2I ). Abgemildert wird dieser Effekt durch prospektives Gating am Ultraschallgerät, bei dem Bilddaten nur erfasst werden, wenn sich das Tier in der gewünschten Phase der Atmung befindet. Dies führt jedoch zu einer deutlichen Erhöhung der Erfassungszeit, wenn die gewünschte Anzahl von Frames ≥1000 erworben werden muss.
Wir sehen mehrere Anwendungen in der zoologischen und veterinärmedizinischen Forschung für den strömungsverstärkten Ultraschall-Workflow zur Kartierung der Physiologie und Anatomie des Gefäßsystems des Auges. Das Gefäßsystem von Rochenfischen, Säugetieren und Vögeln ist relativ gut beschrieben1,3,4,8,9,12,15,40, aber dies ist nicht der Fall für nicht-knöcherne Fische (kieferlose Wirbeltiere und Chondrichthyans), Amphibien und Reptilien, die ihre jeweiligen früheren divergierenden Schwestergruppen darstellen. Die Implementierung von flussverstärktem Ultraschall an diesen schlecht verstandenen Tiergruppen und die Integration dieser Daten mit dem Wissen über die besser untersuchten Gruppen wird grundlegende Einblicke in die Entwicklung des Gefäßsystems des Wirbeltierauges geben. Da das Gefäßsystem des Auges bei eng verwandten Spezies ähnlich ist4, bieten solche detaillierten Informationen über das Augengefäßsystem bei einer breiten Palette von Arten einen Bezugspunkt für Tierärzte, um Fehlbildungen im Gefäßsystem des Auges aufgrund von Entwicklungsdefekten, Krankheiten oder körperlichen Verletzungen zu identifizieren. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, 2D-Blutflussinformationen mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung zu erfassen, die Möglichkeit, pharmakokinetische Effekte auf die Blutflussverteilung in tiefen Gefäßbetten zu quantifizieren, mit umfangreichen Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung und -prüfung. Zukünftige Studien zu dieser Technik sollten sich auf die Identifizierung injizierbarer Verbindungen konzentrieren, die den Kontrast von Blut in Spezies mit enukleierten roten Blutkörperchen verbessern, was die Anwendbarkeit dieser Technik auf Säugetiere mit umfangreichen Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und klinischen Diagnostik von vaskulärer Dysfunktion im Auge und anderen tiefen Gefäßbetten erweitern wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine abschließenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Carlsberg Foundation finanziert (CF17-0778; CF18-0658), die Lundbeck-Stiftung (R324-2019-1470; R346-2020-1210), die Velux-Stiftungen (00022458), die A.P. Møller-Stiftung zur Förderung der medizinischen Wissenschaft, das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung (Nr. 754513) und die Forschungsstiftung der Universität Aarhus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-222 | Sigma | E10521-50G | |
| Benzocaine | Sigma | E-1501 | |
| Propofol | B Braun | 12260470_0320 |
|
| Alfaxalon | Jurox | NA | |
| Isoflurane | Zoetis | 50019100 | |
| Ultrasound scanner | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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