Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Automatisere aggregert kvantifisering i Caenorhabditis elegans

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/62997
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, 2Department of Computer and Information Science and Engineering, University of Florida

Summary

Følgende protokoll beskriver utvikling og optimalisering av en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning for ormdyrking, fluorescensavbildning og automatisert bildebehandling for å kvantifisere polyglutaminaggregater som en vurdering av endringer i proteostase.

Abstract

En økning i forekomsten av nevrodegenerative proteinkonformasjonssykdommer (PCD) har fostret stor interesse for dette emnet gjennom årene. Denne økte oppmerksomheten har krevd diversifisering og forbedring av dyremodeller som er i stand til å reprodusere sykdomsfenotyper observert hos mennesker med PCD. Selv om murine modeller har vist seg uvurderlige, er de dyre og er forbundet med arbeidskrevende metoder med lav gjennomstrømning. Bruk av Caenorhabditis elegans nematodemodell for å studere PCD-er har blitt rettferdiggjort av dens relative enkle vedlikehold, lave kostnader og raske generasjonstid, noe som muliggjør applikasjoner med høy gjennomstrømning. I tillegg gjør høy bevaring mellom C. elegans og menneskelige genomer denne modellen til et uvurderlig oppdagelsesverktøy. Nematoder som uttrykker fluorescerende merkede vevsspesifikke polyglutamin (polyQ) kanaler utviser alders- og polyQ lengdeavhengig aggregering preget av fluorescerende foci. Slike reportere blir ofte brukt som stedfortredere for å overvåke endringer i proteostase på tvers av vev. Manuell aggregert kvantifisering er tidkrevende og begrenser eksperimentell gjennomstrømning. Videre kan manuell foci-kvantifisering introdusere skjevhet, da samlet identifikasjon kan være svært subjektiv. Her ble en protokoll bestående av ormdyrking, bildeinnsamling og databehandling standardisert for å støtte høy gjennomstrømningsaggregatkvantifisering ved bruk av C. elegans som uttrykker tarmspesifikk polyQ. Ved å implementere en C. elegans-basert bildebehandlingspipeline ved hjelp av CellProfiler, en bildeanalyseprogramvare, har denne metoden blitt optimalisert for å skille og identifisere individuelle ormer og nummerere deres respektive aggregater. Selv om automatiseringsbegrepet ikke er helt unikt, er behovet for å standardisere slike prosedyrer for reproduserbarhet, eliminering av skjevhet fra manuell telling og økt gjennomstrømning høyt. Det forventes at disse metodene drastisk kan forenkle screeningsprosessen av store bakterielle, genomiske eller narkotikabiblioteker ved hjelp av C. elegans-modellen .

Introduction

Aldersavhengige nevrodegenerative proteinkonformasjonssykdommer (PCD) som Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdommer, eller amyotrofisk lateral sklerose, er preget av proteinfeilfolding som fører til aggregering, celledød og vevsdegenerasjon1. Mens protein misfolding er anerkjent som den skyldige, er etiologien til disse sykdommene ikke klar. Som sådan har utviklingen av effektive terapier blitt hindret av mangel på kunnskap om faktorer og forhold som bidrar til sykdomsutbrudd og progresjon. Nylige studier tyder på at endringer i mikrobiomet påvirker utbruddet, progresjonen og alvorlighetsgraden av PCD 2,3,4. Kompleksiteten til det menneskelige, eller til og med murine, mikrobiomet gjør det imidlertid vanskelig å gjennomføre studier som vil avsløre den nøyaktige innflytelsen av mikrober på verten. Derfor brukes enklere organismer, som Caenorhabditis elegans, ofte som et oppdagelsesverktøy 5,6,7,8. Nyere studier har benyttet C. elegans for å undersøke effekten av bakterier på vertsproteostase og sykdomspatogenese 9,10. Bakteriell kolonisering, hormesis og genomiske endringer er blant eksempler på forhold som påvirker aggregering av polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. I tillegg viser disse feilfoldede proteinklyngene polyQ lengde- og aldersavhengig akkumulering i verten og er forbundet med nedsatt motilitet 9,13. Den relativt enkle tilnærmingen til å kvantifisere fluorescerende merket puncta kan generere viktige data om forhold, faktorer eller legemidler som påvirker proteinfolding og aggregering.

Selv om kvantifisering av fluorescerende puncta har vist seg å være en pålitelig og relativt enkel prosedyre, er utfordringen fortsatt å utvikle en protokoll som vil lette storskala screening av forbindelser, bakterier eller forhold som påvirker proteinaggregering. Konseptet med automatisert C. elegans bildebehandling og puncta kvantifisering er ikke helt nytt, da en rekke praktiske støtteverktøy er utviklet14,15. Integrering av dyrking, bildeinnhenting og en behandlingspipeline er imidlertid avgjørende for å eliminere variasjon i resultater og muliggjøre skjermer med høyere gjennomstrømning.

Som sådan er hensikten med dette manuskriptet å standardisere prosedyren som brukes til å kvantifisere polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy for å oppdage endringer i proteostase. Denne oppgaven ble oppnådd ved å bruke CellProfiler, en åpen kildekode bildeanalyseprogramvare16 som er i stand til automatisert orm- og aggregatidentifikasjon, og er integrert i en større protokoll for dyrking av ormer, anskaffelse av bilder og behandling av data.

Protocol

Alle prosedyrer fulgte sikkerhetsretningslinjene som ble gjennomgått og godkjent av Institutional Biosafety Committee ved University of Florida. Egnede biosikkerhetstiltak ble truffet for å redusere risikoen for eksponering for bakterier på nivå 2 for biologisk sikkerhet.

MERK: For alle eksperimenter må C. elegans forplantes og vedlikeholdes på nematodevekstmedier (NGM) plater sådd med Escherichia coli OP50.

1. Tilberedning av 10 cm NGM-plater

  1. Kombiner 3 g NaCl, 2,5 g trypticase-pepton og 17 g agar i en 2 L kolbe, og fyll til 1 L med dobbelt destillert vann (ddH2O). Tilsett magnetisk rørestang før autoklavering.
  2. Autoklav blandingen i 45 minutter ved 121 °C og et trykk på 21 psi. La blandingen avkjøles til 50 °C i et vannbad.
  3. Bruk aseptiske teknikker til å tilsette følgende sterile oppløsninger: 1 ml 1 M CaCl2· 2H2O, 1 ml 1 M MgSO4 · 7H2O, 1 ml 5 mg / ml kolesterol oppløst i 100% etanol (oppvarmet til romtemperatur) og 25 ml 1 M KH2PO4 (pH = 6,0). Bland med en magnetisk røreplate. Blanding kan utføres i 1 min ved 700 RPM.
  4. Hell til blandingen fyller hele 10 cm platen. Alternativt kan du bruke en gradert serologisk pipette for å tilsette ca. 20 ml blanding per plate.
  5. La platene tørke i 24 timer ved romtemperatur før såing med bakterier, eller oppbevar de vanlige platene ved 4 °C etter tørking.
    MERK: Alle mediekomponenter håndteres ved hjelp av aseptiske teknikker. Trinn 1.3-1.4 skal utføres i en laminær strømningshette.

2. Fremstilling av NGM-agar med FUDR i 24-brønns plater

  1. Følg trinn 1.1–1.3.
  2. Suppler NGM med 5-Fluoro-2′-deoksyuridin (FUDR) og bland for å oppnå en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml.
    MERK: FUDR hemmer DNA-replikasjon og blokkerer som et resultat C. elegans reproduksjon ved å målrette germline og embryogenese, noe som til slutt påvirker levetiden. Derfor er det viktig å la ormer utvikle seg fullt ut til unge voksne før de overføres til FUDR-holdige plater.
    FORSIKTIG: FUDR er giftig og skal håndteres i henhold til produsentens sikkerhetsdatablad.
  3. Bruk en pipettepistol til å dispensere 1 ml NGM-FUDR i hver brønn.
    MERK: Denne prosessen kan forenkles ved bruk av et automatisert platehellingssystem.
  4. La platen tørke i 24 timer ved romtemperatur før du sår med bakterier eller lagrer vanlige plater ved 4 °C.

3. Såing av plater: OP50 og ytterligere testbakterier

  1. For å tilberede en nattlig E. coli OP50-kultur, tilsett 200 μL av en bakteriell aliquot fra en frossen kraft i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe som inneholder 250 ml fersk, steril Luria-buljong (LB).
    MERK: Volumet på mediet avhenger av antall plater som må sås. For å tilberede andre bakteriekulturer inokulerer du et 16 ml dyrkningsrør som inneholder 5 ml vekstmedium med bakterier fra frossen kraft ved hjelp av en steril mikropipettespiss.
  2. Rug over natten i en 37 °C inkubator, rist ved 220 RPM (rotasjoner per minutt).
    MERK: Bruk steriliserte kolber med minst dobbelt så stort arbeidsvolum som media og forsegl med autoklavert aluminiumsfolie. Utfør inokulasjonstrinnet og bakteriell dispensering ved hjelp av aseptiske teknikker.
  3. Dispenser 1-2 ml av nattenS E. coli OP50-kultur på midten av hver 10 cm NGM-plate. Denne kulturen trenger ikke å spres rundt NGM-platen.
  4. La platene tørke i romtemperatur før bruk/oppbevaring.
    MERK: Seeded plater med lokk på kan plasseres i en hette med luftstrøm for å lette tørking.

4. Dyrking og såing av plater: 24-brønns plater

  1. Forbered en nattkultur med ønskede bakteriestammer, og følg dyrkingsinstruksjonene som finnes i trinn 3.1-3.2.
  2. Overfør 200 μL av hver bakteriekultur til hver brønn i en 24-brønns plate som inneholder NGM-agar. Et volum på 200 μL bakterier vil dekke hele agarområdet, og maksimere mengden mat for å sikre at ormer ikke vil unngå bakterieplenen.
  3. La platene stå åpne i et biologisk sikkerhetsskap (BSC) for å lette tørkingen. Kontroller platene med jevne mellomrom for å forhindre overdreven dehydrering og endre plateretning for å fremme jevn luftstrøm og tørking. Platen skal tørke innen 5 timer.
    MERK: Ethvert arbeid med biologisk sikkerhetsnivå-2-bakterier må utføres i sertifiserte BSC-er og godkjennes av Institutional Biosafety Committee.

5. Synkronisering av alder

MERK: Alle trinn skal utføres ved hjelp av riktige aseptiske teknikker (dvs. arbeid nær en flamme eller inne i en BSC).

  1. Vask gravide hermafroditter av 10 cm OP50-plater ved bruk av filtersterilisert M9-løsning (5,8 g Na2HPO4 · 7H2O, 3,0 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO4·7H2O, i 1 L ddH2O).
    1. Pipette M9-oppløsning på platen flere ganger ved hjelp av et sterilt glass eller plast serologisk pipet for å løfte ormer fra bakterieplenen.
    2. Samle ormsuspensjonen og overfør løsningen til et 15 ml polystyren konisk rør.
  2. Sentrifuge ved 270 x g, romtemperatur (RT, ~23 °C), i 2 minutter.
  3. Aspirer ved hjelp av en vakuumfellekolbe og kast supernatanten, og la ormepelleten være uforstyrret.
    1. Resuspender pelleten i 5-10 ml M9 for å vaske ormene og gjenta trinn 5,2-5,3 to ganger.
  4. Tilsett 5 ml 20 % blekemiddel (8,25 ml ddH2O, 3,75 ml 1M NaOH, 3,0 ml ikke-bakteriedrepende blekemiddel) til røret og inverter kontinuerlig for å oppløse ormene. Ormer er klare til å sentrifugere når de er nesten helt oppløst.
    MERK: Bleketider og volum av blekeoppløsning vil avhenge av størrelsen på prøven. Over- og underbleking er vanlige feil. Som sådan krever denne prosessen vanligvis optimalisering for å bestemme når prøven er klar for sentrifugering.
  5. Sentrifuger i 2 minutter ved 423 x g og kast supernatanten.
  6. Tilsett 10 ml steril M9 for å resuspendere eggpelleten.
    1. Sentrifuger røret i 2 minutter ved 423 x g for å pelletere eggene. Fjern supernatanten med en aspiratorkolbe.
    2. Gjenta trinn 5.6-5.6.1.
  7. Resuspender eggpelleten i 5 ml steril M9 og legg den på en mutter over natten ved ønsket temperatur.
    MERK: Alderssynkroniserte L1-larver vil være klare til å overføres til plater dagen etter.

6. Klargjøring av ormen etter alderssynkronisering

  1. Sentrifuger de alderssynkroniserte ormene ved 270 x g i 3 minutter ved RT (~23 °C).
  2. Aspirer supernatanten i et rent miljø, for eksempel en strømningshette eller ved siden av en Bunsen-brenner. La ca. 200 μL av supernatanten ligge igjen og resuspendere ormene.
  3. Bruk en mikropipette til å overføre den konsentrerte ormesuspensjonen til 10 cm NGM-plater som tidligere har blitt sådd med OP50.
    MERK: Hver tallerken kan støtte 1,500 ormer uten å gå tom for mat; Denne konsentrasjonen kan imidlertid kreve justering avhengig av tettheten til bakterieplenen og veksttemperaturen. Det anbefales å bruke flere plater for å forhindre at ormer sulter. Det er viktig å merke seg at disse platene ikke må inneholde FUDR.
  4. La platene tørke; Deretter inverteres og oppbevares ved 25 °C i 48 timer.
    MERK: Avhengig av skjermens tilstand kan ormer fra trinn 6.1 plasseres direkte på testplater (som inneholder bakterier, medisiner eller testforbindelser). Hvis den ønskede testtilstanden påvirker utviklingen, bør ormer dyrkes på NGM som inneholder OP50 til unge voksne (~ 48 timer) før de utsettes for testforhold.
  5. Etter 48 timers inkubasjon, vask ormene fra platene med steril M9-løsning og legg dem i koniske rør.
    MERK: Voksne ormer vil synke til bunnen av røret. Den nøyaktige tiden vil variere i henhold til antall ormer gjenvunnet fra 10 cm plater. Under disse forholdene slår ormene seg ned innen 10 minutter.
  6. Utfør visuell inspeksjon for å bestemme varigheten av sedimenteringstiden slik at eventuelle gjenværende egg eller klekkede larver fjernes.
  7. Tilsett ytterligere 10 ml M9 for å skylle de resterende bakteriene fra ormelegemer.
    1. Sentrifuger ormene i 2-3 min ved 270 x g ved 23 °C.
    2. Utfør vasketrinnet ytterligere 3 ganger. For best resultat, la ca 1-1,5 ml M9 oppløsning i røret etter den endelige vasken.
    3. Overfør 10 μL av ormesuspensjonen på et glassglass og tell antall ormer.
    4. Juster ormens tetthet til ca. 150 ormer per 10 μL M9. Konsentrasjonen av ormer i suspensjon kan justeres ved enten å fjerne eller tilsette M9-oppløsning etter sentrifugering.
    5. Bekreft at ønsket konsentrasjon er etablert ved gjennomsnittlig antall fra flere forskjellige dråper. Det anbefales å gjennomsnittlig teller fra minst tre dråper.
  8. Ved hjelp av aseptiske teknikker overfører du 10 μL av ormesuspensjonen som inneholder ca. 150 ormer til hver brønn på testplaten.
  9. Inspiser brønnene under et mikroskop for å sikre at hver har et tilstrekkelig antall ormer. Ytterligere ormer kan tilsettes før inkubasjon.
  10. La platene tørke i ca. 10 minutter; og deretter invertere og overføre til en 25 ° C inkubator i 72 timer.
    MERK: Den endelige inkubasjonsperioden kan justeres for å imøtekomme eksperimentets behov. Inkubasjonstiden på 72 timer er tilstrekkelig til å støtte veksten av 150 dyr som lever av 200 μL bakterier i en 24-brønns plate ved 25 °C.

7. Forbereder ormer for bildebehandling

  1. For å lette mer effektiv sedimentering og minimere prøvetap, immobiliser ormene før vask for å forhindre svømming.
    MERK: Hvis du arbeider med få prøver, kan dette oppnås ved eksponering for levamisol (100 μM). Men hvis du arbeider med et stort antall prøver, kan ormer immobiliseres ved frysing. I tillegg vil utvidet frysing (18-24 timer) forhindre videre utvikling av polyQ-aggregater under tilberedning.
    1. Plasser flerbrønnsplater ved -20 °C i 15-20 minutter eller til ormene ikke lenger beveger seg.
    2. Fjern prøvene fra fryseren og la dem sitte i 5 minutter.
  2. Bruk en mikropipette til å tilsette 1 ml M9, kjølt til 4 °C, til en brønn av interesse, trykk gjentatte ganger og trykk ned stempelet 4-6 ganger for å vaske ormene i hver brønn.
    MERK: Noen ganger kan ormer holde seg til mikropipette tips. Som sådan bør forskjellige tips brukes mellom hver brønn for å forhindre blanding av ormer.
  3. Overfør ormesuspensjonen til et mikrocentrifugerør og la ormene synke til bunnen.
  4. Aspirer og kast supernatanten. Vask prøven totalt tre ganger.
  5. Etter at ormer har lagt seg til bunnen under den endelige vasken, aspirerer du 500 μL supernatant, og etterlater 500 μL til resuspend ormer.
  6. Overfør den gjenværende ormeopphenget til en ny flatbunnet 24-brønnsplate og legg den i en -20 °C fryser i 48 timer.
    MERK: Frysing av ormer reduserer bakgrunnsfluorescens og gir bedre visualisering av aggregater.

8. Bildebehandling

  1. Fjern platene fra fryseren og la tine, tørk bort overflødig kondens og fjern lokket før avbildning.
    MERK: Detaljene for bildeopptak vil variere i henhold til utstyret og programvaren som brukes. Protokoller for denne delen bør bare tjene som en veiledning, og endringer kan forventes. Det kreves også å ta bilder i tiff-filformatet.
  2. Under bildeopptak, bruk følgende mikroskopinnstillinger: Eksponeringstid, 500 ms; 40x forstørrelse med 0,63x kameraadapter (25,2x), GFP-intensitet satt til 100 %.
    MERK: Ulike mikroskopkonfigurasjoner og systemer kan skaffe bilder som er forskjellige fra de som er gitt i resultatdelen. For å oppnå en mer universell beskrivelse av bildene som kreves, er det gitt mer objektive detaljer om bilder. Aggregater må være mellom 1,0-10,0 piksler i diameter med en fluorescerende intensitet på 0,10-1,0 (vilkårlige enheter, skala 0-1) for å bli riktig identifisert av CellProfiler. Den fluorescerende bakgrunnen for disse samlede bildene er vanligvis under terskelen på 0,10. For brightfield-bilder varierer ormintensiteten fra 0,7-1,0 med en bakgrunnsintensitet på 0,1-0,2. Den gjennomsnittlige lengden på ormer i brightfield-bilder varierer fra 250 piksler til 350 piksler i lengde fra hode til hale.
  3. Juster overførte lyskontroller til ormene ser sterkt opplyst ut i forhold til den mørke bakgrunnen. Unngå overeksponering; det vil øke ormstørrelsen.
  4. Det kan være nødvendig å endre posisjonene til ormer i brønnen for å forhindre overdreven klumping. Spre klumpete ormer ved hjelp av en pipettespiss.
  5. Sett kanalen til GFP for å etablere et fokusplan for begge bildene.
    MERK: Det er viktig at fokalplanet bestemmes i GFP-kanalen. Enhver endring i fokus som gjøres mens du tar brightfield-bilder, vil resultere i feiljustering av aggregater og ormer under bildeanalyse.
  6. Ta et brightfield-bilde og ta umiddelbart det tilsvarende fluorescerende bildet uten å forstyrre platen.
  7. Kjør testbilder gjennom pipelinen for å bestemme intensitets- og størrelsesverdier for objekter i bildet i henhold til MERKNAD etter trinn 8.2.
    MERK: CellProfiler kan gi all nødvendig informasjon om intensiteten og lengden på objekter før analyse.
  8. For å vurdere bilder, last ned CellProfiler17 først. Åpne programvaren og dra og slipp bilder av interesse i Bilder-boksen.
  9. Klikk på bildene i fillisten for å åpne dem.
  10. Øverst til venstre på skjermen er flere ikoner; bruk dem til å måle størrelsen på objektene eller forstørre et bestemt område. Velg forstørrelsesglasset for å markere et interesseområde.
  11. Velg pilikonet for å måle lengden på både ormer og aggregater.
  12. Hold markøren over ønsket objekt for å bestemme intensitetsverdien som kan ses på den nederste delen av skjermen.
    MERK: Siden alle bilder er tatt i gråtoner, vil alle røde, blå og grønne bildepunktverdier være identiske.

9. Bildeanalyse

  1. Hvis du vil bruke CellProfiler-bildeanalysepipelinen, navngir du bildeparene riktig. Bruk følgende format: P1_A01_S1_C1, der P1 refererer til den spesifikke platen og dens respektive numeriske betegnelse; "A", refererer til raden og "01" til kolonnen; "S" refererer til et bestemt bildepar for en enkelt brønn; "C" refererer til kanalen, der "1" brukes til å betegne brightfield-bilder og "2" for fluorescerende bilder.
  2. Last ned CellProfiler (versjon 4.1.3 eller høyere) fra den offisielle nettsiden17.
  3. Last ned pipelinen (tilleggsfil 1). Last opp pipelinen (Pipeline) til CellProfiler ved å velge File > Import > Pipeline from File.
    MERK: Modul 2 og 3 har blitt deaktivert da de har blitt ansett som unødvendige. Deres funksjon kan gjenopprettes dersom bildeanalyse ikke gir tilfredsstillende separasjon og identifisering av ormer; Det er imidlertid nødvendig med modifisering av rørledningen.
  4. For å innlemme disse modulene, velg boksene til venstre for hver modul. Gi nytt navn til inndata-binærbildet for "UntangleWorms"-modulen til utdatabildet fra "convertobjectstoimage"-modulen.
  5. Det kan vises en feilmelding under første gangs bruk relatert til modul 2. Hvis dette skjer, fortsett med analysen.
  6. Last opp et opplæringssett som brukes til å identifisere ormer, til modulen UntangleWorms. Dette treningssettet finner du i tilleggsfil 2.
    1. Velg UntangleWorms-modulen for å åpne innstillingene.
    2. Identifiser filnavnet for treningssett , og velg ikonet for opplastingsfil.
    3. Last opp tilleggsfil 2 (treningssett).
  7. Last opp bilder ved å velge Bilder-modulen øverst til venstre. Dra og slipp bilder med riktig navn som beskrevet i trinn 9.1.
  8. Før du analyserer bilder, velger du ønsket utdatamappe som skal brukes til å lagre resultatene.
    1. Klikk på Output Settings-knappen nederst til venstre i programmet.
    2. Velg mappeikonet til høyre for Standard utgang for å velge ønsket utgangssted.
  9. Velg ikonet Analyser bilder for å starte bildeanalyse.
  10. Hvis analysen tar for lang tid å fullføre og sitter fast og behandler et enkelt bilde, skyldes det sannsynligvis problemer fra bildeinnsamling. Hvis dette skjer, avbryter du kjøringen og fortsetter med å identifisere de ubehandlede bildene ved å sortere gjennom utdatamappen og merke hvilke bildenavn som ikke blir funnet.
    MERK: Bildene kan kreve ytterligere behandling for å fjerne store eller intenst opplyste artefakter som ikke kan behandles av rørledningen. I noen tilfeller kan slike bilder måtte utelukkes fra analysen.
  11. Etter fullstendig analyse vil programvaren organisere resultatene i et Excel-regneark som inneholder individuelle ormer (kolonne N) og deres respektive antall aggregater (kolonne K).
    MERK: En vellykket kjøring vil produsere et Excel-regneark som inneholder antall aggregater per identifisert orm for hver brønn. Disse dataene kan manipuleres på en måte bestemt av eksperimentøren.
  12. Last ned metadata organizer (Graphical User Interface) fra Supplemental File 3 (Windows) eller Supplemental File 4 (Mac) for å enkelt organisere data fra output CSV-filen fra CellProfiler.
    MERK: Denne programvaren har ikke en offisiell lisens og åpnes ikke automatisk etter nedlasting.
  13. Følg trinn 9.14-9.17 hvis du bruker Windows OS 64-bit. Programvaren fungerer ikke på Windows 32-bit. Følg trinn 9.18-9.20 hvis du bruker Mac OS. Trinn 9.21-9.22 er de samme for begge operativsystemene.
  14. For Windows OS, finn den nedlastede filen og pakk den ut til ønsket sted.
  15. Finn og åpne den utpakkede mappen som heter gui_windowsOS_64x og start programmet ved å klikke på "gui" applikasjonsikonet.
  16. En melding kan åpne og be om tillatelse til å kjøre. Velg Mer informasjon, og klikk deretter Klarer likevel.
  17. Metadataarrangøren er klar til å dra og slippe CellProfiler-utdata CSV-filer. Gå videre til trinn 9.21.
  18. For Mac OS, finn den nedlastede filen og åpne gui_macOS_64x.zip. Dette trinnet skal automatisk pakke ut alle filer.
  19. Åpne den utpakkede mappen som finnes i "Nedlastinger".
  20. Høyreklikk på "gui" -programmet og velg Åpne. Det vises en melding som ber om tillatelse til å åpne på grunn av mangel på en offisiell lisens. Velg Åpne og fortsett til trinn 9.21.
  21. Klikk på Last opp filene dine her eller dra og slipp de ønskede CellProfiler CSV-filene.
  22. Klikk på Organiser-knappen , som vil bringe brukeren til en ny skjerm med en Last ned filer-knapp . Klikk på knappen og velg ønsket sted for å lagre utdatafilen. Utdatafilen vises som det opprinnelige filnavnet med utvidelsen "_organized" lagt til filnavnet.

Representative Results

Beskrevet her er en C. elegans arbeidsflyt som inkluderer dyrking, bildeinnsamling og prosesseringsprotokoller som tillater vurdering av polyQ-aggregering i nærvær av forskjellige bakterier ved bruk av et 24-brønns plateformat som dyrkings- og bildebehandlingsplattform (figur 1). Denne protokollen kan justeres for å studere effekten av bakterier, spesifikke forhold, små molekyler, legemidler eller genomiske manipulasjoner på vertsproteostase. Den beskrevne metoden er optimalisert ved hjelp av ormer som konstitutivt uttrykker intestinal polyQ smeltet til et gult fluorescerende protein (vha6p: :p olyQ44: : YFP); Imidlertid kan andre modeller som rapporterer om proteostase i muskel eller nevroner også brukes med ytterligere optimalisering. For eksempel viser foreløpige eksperimenter anvendelsen av disse metodene i kvantifisering av proteinaggregater i andre vev som muskelpolyQ (Supplerende figur 1). Det vil imidlertid være nødvendig med endringer i rørledningen for å justere for tilslagsstørrelse og lysstyrke, som nevnt i avsnitt 8 NOTE.

Figure 1
Figur 1: Visuell representasjon av arbeidsflyten. De viktigste trinnene i protokollen inkluderer fem forskjellige stadier: ormpreparering og alderssynkronisering (trinn 1-5), intestinal kolonisering / ormbehandling (trinn 6), prøvepreparering for bildebehandling (trinn 7), bildeinnsamling (trinn 8) og bildebehandling (trinn 9). "Seksjoner" av protokollen er referert til som "Trinn" i figuren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De første optimaliseringseksperimentene avslørte ulike vanskeligheter forbundet med overbefolkning på grunn av et stort antall avkom, noe som resulterte i raskere matuttømming. Tilskudd av FUDR i NGM-plater beskrevet i avsnitt 2 løste dette problemet (figur 2). I tillegg, i nærvær av FUDR, hadde ormer som ble matet forskjellige bakterier en mer konsistent kroppsstørrelse, noe som tillot mer jevn og nøyaktig ormdeteksjon.

Figure 2
Figur 2: Bruk av FUDR forbedrer bildekvaliteten ved å redusere avkom. FUDR-supplerte plater eliminerer C. elegans avkom sammenlignet med ormer dyrket på ikke-FUDR-kontroll NGM-plater sådd med E. coli OP50. Bildene ble tatt med 25,2x forstørrelse (40x forstørrelse med en 0,63x kameraadapter). Skalafelt = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Bakgrunnsfluorescens bidro til falsk positiv påvisning av polyQ-aggregater. For å redusere slikt fluorescenssignal i tarmkanalen og forbedre automatisert deteksjon av aggregater, var det nødvendig å fryse ormer før avbildning. Frysing av ormer ved -20 °C i 18-48 timer forbedret polyQ-aggregatdeteksjon betydelig ved å eliminere bakgrunnsfluorescens (figur 3A). Det menneskelige øye er i stand til å skille mellom aggregater og bakgrunnsfluorescens; Derfor er den manuelle tellingen før og etter frysingen den samme (figur 3B). Automatisert telling er imidlertid ikke like nøyaktig, men frysing forbedret automatiserte tellinger betydelig med nøyaktighet som kan sammenlignes med manuell telling (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Frysing forbedrer aggregatdeteksjon. (A) Fluorescerende bilder av C. elegans som uttrykker tarmpolyQ44::YFP før og etter frysing. Innsettinger representerer nærbilder av det merkede området. Skalastenger = 500 μm. (B) Gjennomsnittlig antall aggregater per tarm i ormer kolonisert med P. aeruginosa MPAO1 før og etter frysing ved hjelp av manuell eller automatisert (pipeline) aggregatkvantifisering. Data representerer to biologiske replikasjoner (n = 60-109). Statistisk signifikans ble beregnet med Student t-test (**** p < 0,0001). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Invertert lysfeltbelysning ble brukt til å oppdage hele C. elegans (figur 4A) og GFP-kanalen for å avbilde polyQ44: : YFP-aggregater (figur 4B). Ormdeteksjon, detangling og aggregatkvantifisering for hver orm ble gjort ved å bruke en optimalisert CellProfiler-bildebehandlingspipeline (Supplemental File 1), som gjør det mulig å oppnå antall aggregater per individuell orm (Figur 4C-D). For å teste gjennomførbarheten av denne tilnærmingen og nøyaktigheten av den automatiserte aggregatdeteksjonen og kvantifiseringen, ble ormer som uttrykker tarmspesifikk polyQ44::YFP dyrket og klargjort for avbildning i henhold til de etablerte protokollene (avsnitt 1-7). Antall aggregater per orm ble vurdert enten ved hjelp av automatisert rørledning (§ 8-9) eller manuell telling. Hvert eksperiment ble utført i tre uavhengige forsøk med 90-571 ormer per tilstand. Mens gjennomsnittlig antall aggregater per tarm oppnådd med to forsøk ikke hadde noen signifikant forskjell, hadde ormer i den tredje studien signifikant færre aggregater når de ble kvantifisert ved hjelp av den automatiserte tilnærmingen (figur 5A). Gjennomsnittlig antall aggregater fra de tre studiene resulterte i noe, men signifikant færre aggregater når kvantifiseringen ble gjort ved hjelp av CellProfiler-rørledningen (seksjon 8-9) (figur 5B). Ikke desto mindre var forskjellen mellom de to tilnærmingene minimal, noe som indikerer at den automatiserte metoden kan brukes på store skjermer.

Figure 4
Figur 4: Samlet deteksjon ved hjelp av CellProfiler. (A) Brightfield-bilde brukt til å identifisere ormelegemer. (B) Originalt fluorescerende bilde tatt ved hjelp av GFP-kanal og brukt til å identifisere og kvantifisere et totalt antall intestinale polyQ44: : YFP-aggregater. (C) Aggregater identifisert ved hjelp av CellProfiler. (D) Et totalt antall identifiserte aggregater lagt over det opprinnelige fluorescerende bildet med orm og aggregatkonturer. Bildeopptak og bearbeiding ble utført ved hjelp av innstillingene beskrevet i §§ 8-9. Paneler E-H representerer nærbilder av de tilsvarende skisserte områdene i bilder A-D. Bildene ble tatt med 25,2x forstørrelse (40x forstørrelse med en 0,63x kameraadapter). Skalafelt = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekt av automatisert aggregert kvantifisering. (A) Gjennomsnittlig aggregert antall per tarm i ormer kolonisert med kontroll E. coli OP50 ved hjelp av manuell telling (Manuell) og automatisert CellProfiler-basert kvantifisering (Pipeline). Resultatene representerer data analysert i tre separate studier (T1-T3) (n = 90-571). (B) Gjennomsnittlig antall aggregater per tarm ble oppnådd ved hjelp av manuell eller automatisert (Pipeline) aggregatkvantifisering. Statistisk signifikans ble beregnet med Student t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å evaluere reproduserbarheten av resultatene blant forskjellige eksperimenter, ble bilder fra en plate som inneholdt seks brønner av ormer som ble matet enten Pseudomonas aeruginosa MPAO1 eller Escherichia coli OP50, anskaffet av tre individer, hvorav to ikke hadde noen tidligere erfaring med å avbilde ormer ved hjelp av disse protokollene. Bilder samlet fra hver brønn inneholdt hvor som helst mellom 30-115 oppdagede ormer. En ikke-signifikant forskjell i aggregering ble påvist i ormer fra de samme brønnene som ble avbildet av de tre eksperimentene. Mens gjennomsnittlig antall aggregater per tarm forble svært konsistent mellom de tre eksperimentene for ormer matet MPAO1 og OP50, var det noen statistisk signifikante forskjeller i gjennomsnittlig antall aggregater, men bare i ormer kolonisert av MPAO1 (Supplerende figur 2). Disse resultatene fremhever reproduserbarheten av resultatene selv mellom uerfarne eksperimenter.

For å sikre at reproduserbarheten av aggregatkvantifisering ikke påvirkes signifikant av ormposisjonen, ble et sett med 15 ormer valgt og avbildet 15 separate ganger etter omrøring mellom hvert bildeopptak ved hjelp av en pipettespiss. Bilder av aggregater i ormer matet med E. coli OP50 og P. aeruginosa MPAO1 ble samlet inn og analysert ved hjelp av CellProfiler. Gjennomsnittlig antall aggregater fra hvert av disse forskjellige settene med bilder var litt, men ikke signifikant forskjellig, noe som ytterligere støtter reproduserbarheten av denne tilnærmingen (supplerende figur 3).

Kolonisering av C. elegans tarm med gram-negative enteriske patogener har vist seg å forstyrre proteostase over vev, med P. aeruginosa som er blant de mest potente induktorene av polyQ-aggregering9. For å avgjøre om disse optimaliserte protokollene vellykket vil oppdage og kvantifisere P. aeruginosa-mediert forbedring av aggregering, ble ormer som uttrykker intestinal polyQ kolonisert med E. coli OP50 (kontrollbakterier), og P. aeruginosa MPAO1, seksjon 1-8 ble utført. De oppkjøpte bildene ble analysert ved hjelp av CellProfiler (seksjon 9, tilleggsfil 1). Resultatene av automatisert kvantifisering viser en signifikant økning i antall aggregater indusert av P. aeruginosa MPAO1, noe som konsekvent resulterer i en to ganger forbedring sammenlignet med ormer matet med kontroll E. coli OP50 (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Gjennomsnittlig antall aggregater per tarm i ormer kolonisert med kontroll E. coli OP50 og P. aeruginosa MPAO1. Antall aggregater per tarm ble vurdert med CellProfiler (seksjon 8-9). Data er representert som gjennomsnittlig antall aggregater per tarm i ormer kolonisert med OP50 (n = 1068) og MPAO1 (n = 1557). Statistisk signifikans ble beregnet med Student t-test (**** p < 0,0001). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den optimaliserte pipelinen ble designet for å støtte store skjermer for forhold som påvirker proteostase. For å teste gjennomførbarheten av denne tilnærmingen ved screening av store biblioteker av bakterier for deres effekt på vertsproteostase, ble rørledningen beskrevet her brukt (seksjon 1-9) for å teste effekten av 90 P. aeruginosa ikke-essensielle gen knock-out mutantstammer på polyQ aggregering18. Denne pilotskjermen er en del av et større prosjekt designet for å skjerme alle P. aeruginosa ikke-essensielle mutantstammer for deres evne til å påvirke vertsproteostase. Av 90 bakteriestammer som ble testet, viste kolonisering av C. elegans tarm med en kandidat en signifikant reduksjon i antall aggregater (figur 7). Oppfølgingseksperimenter for å evaluere sensitiviteten til denne analysen ble utført via manuelle aggregerte tellinger fra et tilfeldig utvalg av seks P. aeruginosa-mutanter som ikke var signifikante fra MPAO1-kontrollen. Disse eksperimentene ble utført ved hjelp av de mer tradisjonelle 6 cm NGM-platene, og overførte ormer til teststammer som L1-er for å rekapitulere tidligere etablerte metoder9. Bekreftelseseksperimentene ved manuell telling viste at ingen av mutantene, inkludert den som signifikant reduserte antall aggregater (figur 7), påvirket polyQ-aggregering (supplerende figur 4). I tillegg ble de subtile endringene i aggregering observert i skjermen av de 90 mutantstammene ikke oppdaget blant manuelle tellinger av utvalgte kandidater, noe som indikerer at slike endringer kan oppstå på grunn av biologisk og eksperimentell variabilitet, for eksempel lav n-verdi. Samlet indikerer resultatene at mens metoden vår pålitelig kan plukke opp betydelige endringer, vil subtile sannsynligvis bli savnet, og alle potensielle kandidater må bekreftes individuelt.

Figure 7
Figur 7: Antall aggregater per tarm i et representativt utvalg av ormer kolonisert av 92 bakteriestammer. Data er representert som gjennomsnittlig antall aggregater per tarm normalisert til ormer kolonisert med MPAO1. Stiplede linjer representerer gjennomsnittlig antall aggregater i ormer kolonisert med MPAO1 (topp, åpen sirkel) og OP50-kontroll (nederst, åpen firkant). Solide symboler representerer 90 forskjellige knock-out mutantstammer av P. aeruginosa MPAO1. Gjennomsnittlig antall aggregater per orm mellom ormer kolonisert med MPAO1 og en enkelt mutant var statistisk signifikant. Grå sirkler representerer prøver som ble bekreftet manuelt (supplerende figur 4). Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Multiple Comparison Dunnetts post hoc-test (** p < 0,01, **** p < 0,0001). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å administrere den store mengden data som genereres av CellProfiler, ble det utviklet et grafisk brukergrensesnitt (GUI) for å automatisere databehandling og organisering (figur 8). GUI ble utviklet ved hjelp av Tkinter, en åpen kildekode Python cross-platform widget verktøykasse. Fra de gitte metadataene trekker applikasjonen ut antall aggregater (kolonne K) fra hver brønn (kolonne J) som er tilstede i en plate. Et Python datahåndteringsbibliotek kalt "Pandas" ble brukt til å utføre den nevnte prosessen. GUI-applikasjonen gir dra-og-slipp-støtte for brukere å laste opp datafiler. Dataene i hver fil lagres i form av en todimensjonal tabellstruktur kalt en dataramme. Et tomt ordlistepar initialiseres for hver unike brønn som finnes i datarammen. Deretter telles de forskjellige aggregatene som finnes i hver brønn og legges til deres respektive ordbokpar. Kolonnen med mindre data er polstret med tomme verdsatte strenger for å sikre at hver kolonne er jevn i størrelse. Til slutt konverteres strukturen til en dataramme som eksporteres i form av et regneark til katalogen spesifisert av brukeren.

Figure 8
Figur 8 Grafisk brukergrensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Påvisning av muskelspesifikke polyQ-aggregater. Ormer som uttrykker muskelspesifikk polyQ35::YFP ble belagt som L1-er og dyrket på OP50 i 48 timer. Når ormer utviklet seg til unge voksne, ble de overført til 24-brønns NGM-plater, supplert med 100 μg / ml FUDR og sådd med MPAO1 i ytterligere 72 timer før avbildning. (A) Brightfield-bilde som brukes til å identifisere ormelegemer. (B) Originalt fluorescerende bilde tatt ved hjelp av GFP-kanal. (C) Aggregater identifisert ved hjelp av CellProfiler. (D) Et totalt antall identifiserte aggregater lagt over det opprinnelige fluorescerende bildet med orm og aggregatkonturer. Bildeopptak og bearbeiding ble utført ved hjelp av innstillingene beskrevet i §§ 8-9. Paneler E-H representerer nærbilder av de tilsvarende skisserte områdene i bilder A-D. Skala barer = 500 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Reproduserbarhet av aggregert kvantifisering mellom ulike eksperimenter. Gjennomsnittlig antall aggregater kvantifisert ved hjelp av CellProfiler for seks brønner av ormer kolonisert med P. aeruginosa MPAO1 (svarte barer) og seks brønner av ormer kolonisert med kontroll E. coli OP50 (grå barer). Hver brønn ble avbildet av tre eksperimenter (AVS, DMC, RDH). Data er representert som gjennomsnittlig antall aggregater per tarm (n = 30-115). Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest (* p < 0,05, ** p < 0,01). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Effekten av ormeposisjon på reproduserbarheten av aggregert kvantifisering. Gjennomsnittlig aggregert antall per tarm i ormer kolonisert med kontroll E. coli OP50 (grå barer) og P. aeruginosa MPAO1 (svarte søyler). Resultatene representerer gjennomsnittlig antall aggregater per tarm (15≥n≥12) kvantifisert ved hjelp av CellProfiler. Ormenes posisjon i brønnene ble endret ved omrøring mellom hver innsamling. Det ble ikke funnet statistisk signifikante forskjeller i noen av gruppene. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys flere sammenligningstest. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: Bekreftelse av pilotskjermen med manuell telling. Gjennomsnittlig antall aggregater per tarm ble kvantifisert manuelt. Data representerer aggregeringsprofiler av ormer kolonisert med seks MPAO1 knock-out mutanter (grå sirkler figur 7) sammenlignet med villtype MPAO1- og OP50-kontroller (n = 30). Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av multiple sammenligning Dunnetts post-hoc test (**** p < 0,0001). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 5: Effekten av FUDR på intestinal polyQ-aggregering. Data er representert som gjennomsnittlig antall polyQ44::YFP aggregater per tarm (n = 20). Ormer ble overført til kontrollplater (ingen FUDR) eller FUDR-holdige plater (100 μg/ml) etter 48 timers vekst ved 25 °C på E. coli OP50. Manuelle tellinger ble samlet inn etter ytterligere 48 timer. Statistisk signifikans ble beregnet med Student t-test (ns = ikke signifikant). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Proteostase-pipeline. Nedlastbart datasamlebånd for bildeanalyse for bruk i CellProfiler. Instruksjoner for søknad finnes i avsnitt 9. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Treningssett som løsner ormen. Filen som skal lastes opp til modulen "UntangleWorms". Dette spesielle treningssettet er spesifikt for ormene som ble brukt i den første tilnærmingen. Endringer i ormstørrelse og form vil endre nøyaktigheten og kvaliteten på identifikasjonen. Det kan være nødvendig å opprette en mer personlig opplæringsfil. Instruksjoner for å lage et nytt treningssett finner du på det offisielle CellProfiler-nettstedet17. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Grafisk brukergrensesnitt for Windows-operativsystemet. gui_windowsOS_64x.zip. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: Grafisk brukergrensesnitt for Mac-operativsystemet. gui_MacOS_64x.zip. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Den beskrevne protokollen skisserer prosedyrer for C. elegans dyrking, bildebehandling og bildebehandling som inkorporerer CellProfiler, en åpen kildekode-bildeanalyseprogramvare. De representative resultatene viser reproduserbarhet, reduksjon av skjevhet og skalerbarhet. Denne standardiserte prosedyren vil forbedre screeningstrategier som brukes med store bakterielle, genomiske eller narkotikabiblioteker. Mens andre automatiserte C. elegans metoder for objektdeteksjon eksisterer, tilbyr den beskrevne teknikken en standardisert, høyere gjennomstrømningsrørledning som integrerer dyrking, bildeoppkjøp og analyse.

Flere varianter av ormdyrking måtte testes for å optimalisere protokollen beskrevet her. I utgangspunktet ble ormer overført til prøvebakterier umiddelbart etter alderssynkronisering (L1-stadium). En slik tilnærming resulterte imidlertid i en populasjon av ormer med variable størrelser, selv blant ormer innenfor samme brønn. C. elegans er kjent for patogenunngåelse19, noe som kunne ha bidratt til den observerte variasjonen i størrelse og til slutt påvirke nedstrøms avbildningsormdeteksjon, spesielt. For å eliminere en slik variasjon ble hele NGM-området i hver brønn dekket av testbakterier. Videre ble ormer matet E. coli OP50 og fikk lov til å utvikle seg fullt ut til unge voksne i 48 timer ved 25 ° C. Å tillate ormer å nå voksen alder på E. coli OP50 før de overføres til testbakterier, resulterte i mer konsistent kroppsstørrelse. I tillegg ble overbefolkning og rask matutarming av avkom eliminert ved å supplere NGM-agar med FUDR. Implementeringen av FUDR fjernet avkom og forbedret automatisert ormeidentifikasjon, som ble skjult av avkom som blandet seg med foreldrepopulasjonen. Det er imidlertid viktig å være forsiktig og bruke passende kontroller ved bruk av FUDR, da forbindelsen er kjent for å påvirke C. elegans proteostase og levetid20,21. Under betingelsene beskrevet i denne protokollen påvirket FUDR ikke intestinal polyQ-aggregering (supplerende figur 5); Derfor var bruken egnet og gunstig for den beskrevne metoden.

Frysing av prøver før avbildning viste seg å være et kritisk skritt i den vellykkede ansettelsen av rørledningen. De aggregerte tellingene før frysing var signifikant høyere enn manuelle tellinger (figur 3B). Å holde ormer ved -20 °C i 18-48 timer før avbildning reduserte bakgrunnsfluorescens og forbedret til slutt aggregatdeteksjon (figur 3A). Effektene av frysing på aggregatdeteksjon er bare undersøkt for polyQ og bør ikke generaliseres til andre modeller uten ytterligere undersøkelser av slike effekter.

Til tross for at alle forholdene ble holdt de samme, ble det observert at gjennomsnittlig antall aggregater per orm kunne variere mellom forskjellige løp, mens forholdet mellom antall aggregater i dyr kolonisert med OP50 versus MPAO1 forble konsistent (figur 6, supplerende figur 2, supplerende figur 5). Derfor er det viktig å alltid inkludere E. coli OP50-kontroll, eller eventuelle ekstra passende referansekontroller, i hver kjøring. Slik variasjon i aggregerte tellinger mellom eksperimenter kan påvirkes av miljøforhold (temperatur, fuktighet)22,23 eller genetisk bakgrunn8. Faktisk ble det observert at etter langvarig kultur ble tarmfluorescens drastisk redusert eller helt tapt, noe som krevde tining av en ny stamme fra frossen bestand. Den observerte reduksjonen i fluorescens kan være et resultat av genetiske endringer som undertrykker giftige transgener, slik som de som uttrykker polyQ. Ikke desto mindre understreker den eksepsjonelle reproduserbarheten av resultatene observert mellom forskjellige eksperimenter (supplerende figur 2), mellom biologiske replikasjoner (figur 5) og innenfor samme prøve (supplerende figur 3) styrken av denne tilnærmingen.

Tallrike rapporter har brukt intestinal polyQ for å studere proteostase 9,11,12,13,24,25. En direkte sammenligning mellom resultatene kan imidlertid ikke gjøres på grunn av variasjon mellom eksperimentelle tilnærminger og avlesningsmetoder. Ikke desto mindre er noen få resultater fra tidligere publiserte data rekapitulert av den automatiserte kvantifiseringen som er beskrevet her, inkludert bakteriell induksjon av aggregering 9,13 og et sammenlignbart antall aggregater11. Samlet gir den beskrevne rørledningen et verdifullt verktøy for å studere proteostase.

Metoden beskrevet her har noen iboende utfordringer. For eksempel krever det tilstrekkelig tid til å mestre alle komponentene i denne protokollen, noe som spesielt gjelder for seksjon 8 i protokollen, som krever kjennskap til analysen for å avgjøre om bildene som er anskaffet, er passende for rørledningsanalyse. Avvik fra bildeinnhentingsinnstillingene som brukes i denne protokollen er mulige; Imidlertid vil det sannsynligvis være nødvendig med endring av innstillingene og ormtreningssettet. Denne rørledningen kan skille aggregater av forskjellige størrelser og de som berører, noe som begrenser "blanding" av aggregater og til slutt øker deteksjonsfølsomheten. Det kan imidlertid oppstå problemer når man forsøker å identifisere store aggregater som overskrider det aksepterte størrelsesområdet, da utvidelse av terskelen for øvre størrelse kan føre til feil forårsaket av dårlig identifikasjon, for eksempel manglende evne til å skille aggregater som berører. En balanse mellom nøyaktighet, størrelse og intensitet må finnes før bildeanalyse. Effektiviteten av samlet identifikasjon kan forbedres ytterligere ved å inkorporere maskinlæring for å skape et nevralt nettverk som er i stand til å forbedre aggregatdeteksjon. Slike forbedringer blir for tiden utforsket og vil i stor grad hjelpe til med å løse aktuelle problemer som påvisning av aggregater som ligger på forskjellige fokalplan eller som har unormale former.

En bemerkelsesverdig svakhet ved den beskrevne metoden er variasjonen i automatiserte aggregattellinger, da de ikke alltid rekapituleres ved manuelle tellinger i ormer som mates forskjellige bakteriestammer. For eksempel, basert på automatiserte tellinger, hadde ormer matet P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant færre aggregater sammenlignet med villtypestammen (MPAO1) (figur 7); Bekreftelsen av treffet viste imidlertid ingen signifikant forskjell (supplerende figur 4). Generelt har narkotikaskjermer med høy gjennomstrømning en høy grad av falsk positiv treffdeteksjon, og den beskrevne metoden er ikke noe unntak26. Dermed er det en kritisk del av protokollen å bekrefte alle potensielle treff.

Mens denne protokollen ble optimalisert for å passe til en screeningstrategi for å identifisere bakterier som påvirker vertsproteostase, kan hvert trinn modifiseres ytterligere for å teste effekten av genomiske RNAi-biblioteker, små molekyler eller andre forhold. Ytterligere modifikasjoner kan gjøres på hvert trinn for å dekke kravene til en bestemt screeningstrategi. Videre gir denne teknikken et nivå av fleksibilitet som gjør det mulig å optimalisere hvert trinn for å passe til en bestemt modell. For eksempel kan denne tilnærmingen utvides til polyQ-aggregering i andre vev eller ekstrahere andre funksjoner oppdaget i bilder som overvåking av genuttrykk ved hjelp av induserbare fluorescerende reportere (f.eks. Varmesjokkgener), vurdere subcellulær lokalisering av proteiner (f.eks. Nukleær lokalisering av DAF-16), studere aggregering i andre sykdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuclein, TDP-43, etc.) eller vurdere fysiologiske fenotyper, for eksempel ormstørrelse.

Disclosures

Forfatterne har erklært at det ikke eksisterer noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) og Infectious Diseases Society of America finansiering til DMC. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet. Vi takker medlemmene av Czyz Lab for korrekturlesing av manuskriptet. Tegneseriefigurer ble generert ved hjelp av BioRender betalt lisens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL Microtubes Olympus Plastics Cat#24-282 Microcentrifuge tubes
10 mL Serological Pipettes GenClone Cat#12-104 Plastic pipettes
15 mL Centrifuge Tubes, Racked Olympus Plastics Cat#28-101 Conical tubes
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Fisher Scientific D2235100MG FUDR
Accu-jet Pro Pipette Controller Genesee Scientific 91-600RB Pipette gun
Agar Fisher Scientific Cat#BP1423-2 Granulated agar
BioRender BioRender Graphical figure generator
Bleach (Regular) Clorox Bar# 044600324111, Splash-less Bleach 4.5% sodium hypochlorite
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] Morimoto Lab (Northwestern University) AM140, Q35::YFP Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] Morimoto Lab (Northwestern University) AM738, Q44::YFP Intestinal polyQ
CaCl2·2H2O Fisher Scientific Cat#C79-500 Calcium chloride dihydrate
CellProfiler Broad Institute Image analysis software
Cholesterol Fisher Scientific Cat#ICN10138201 Cholesterol
Circulating Water Bath Head Lauda 26LE Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO CoolLED 8114931 Fluorescent light control and emitter
16 mL Culture Tubes Olympus Plastics 21-129 Culture tubes, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 E. coli control strain
Ethanol, 200 Proof Decon Labs, Inc. 2701
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen Leica Microsystems 10450910 Eyepiece set
Filter Set ET GFP - MZ10F Leica Microsystems 10450588 Filter cube
GraphPad Prism v9.2.0 GraphPad Software, Inc. Statistical analysis tool
Heratherm Incubator IMP180 Thermo 51031562 Refrigerated incubator
Innova 4000 New Brunswick Scientific M1192-0000 Shaking incubator
K5 Camera Leica Microsystems 11547112 Stereomicroscope camera
KH2P04 Fisher Scientific Cat#P285-3 Potassium phosphate monobasic
LAS X Imaging Software Leica Microsystems Microscope imaging software
Leica MZ10 F Optics Carrier Leica Microsystems 10450103 Stereomicroscope
Levamisole Fisher Scientific Cat#0215522805 Levamisole hydrochloride
Luria Broth (Lennox) Apex Bioresearch Products Cat#11-125 LB
Magnetic Stir Plate Fisher Scientific 11-100-49S Stir plate
MgSO4·7H2O Alfa Aesar A14491 Magnesium sulfate heptahydrate
Microscope Slides Premiere 8205 Single frosted microscope slides
Na2HPO4·7H2O Fisher Scientific Cat#S373-500 Sodium phosphate dibasic heptahydrate
NaCl Fisher Scientific Cat#S671-500 Sodium chloride
NaOH Fisher Scientific Cat#S318-3 Sodium hydroxide pellets
Objective Achromat, f = 100 mm Leica Microsystems 10411597 Objective microscope lens
Petri Dishes Genesee Scientific Cat#32-107G 100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library Manoil Lab (University of Washington) P. aeruginosa mutant library
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-102 Used for worm growth and imaging
Trinocular Tube 100% M-series Leica Microsystems 10450043
Trypticase Peptone ThermoFisher, Difco Cat#211921
TX-400 Rotor Thermo Scientific Cat#75003181 Swing bucket rotor
Vacuum Driven Filter System GenClone Cat#25-227 500 mL, PES Membrane, .22 µm
Video Objective with C-Mount Leica Microsystems 10447367 0.63x camera adapter tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soto, C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).
  2. Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk. Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).
  3. Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. Our gut microbiome: The evolving inner self. Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).
  4. Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).
  5. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).
  6. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).
  7. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  8. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  9. Walker, A. C., et al. Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate. PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).
  10. Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
  11. Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
  12. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).
  13. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).
  14. Hakim, A., et al. WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms. BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).
  15. Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).
  16. Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).
  17. CellProfiler: an open-source image analysis software. , Available from: http://www.cellprofiler.org (2021).
  18. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  19. Schulenburg, H., Ewbank, J. J. The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans. Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).
  20. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  21. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).
  23. Shinn-Thomas, J. H. Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth. BMC Research Notes. 12 (1), (2019).
  24. Alexander-Floyd, J., et al. Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans. BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).
  25. Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
  26. Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. False positives in the early stages of drug discovery. Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).

Tags

Biologi utgave 176 C. elegans proteostase polyglutamin aggregering
Automatisere aggregert kvantifisering i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., … More

Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., Walker, A. C., Pagolu, C. N., Enslow, S. M., Czyż, D. M. Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (176), e62997, doi:10.3791/62997 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter