Summary
Doğal ve sentetik bileşiklerin , bu durumda, nikotinamid ribozidin kas gelişimini ve büyümesini etkileme yeteneğini test etmek için kuluçkalanmamış ticari piliç yumurtalarını kullanan ovo besleme araştırma denemelerinde yürütmek için sağlam bir metodoloji geliştirilmiştir.
Abstract
Son otuz yılda, kırmızı et ve kümes hayvanları bilim adamları, embriyonik ve fetal gelişim sırasında kas gelişimini manipüle etmek için stratejiler ve teknolojiler geliştirmeye odaklandılar. Bu alan bir odak alanı olmaya devam ediyor, çünkü kas lifi sayısı bu süre zarfında belirleniyor ve gelecekteki tüm büyümenin temelini belirliyor. Kümes hayvanlarında, büyüme faktörlerinin, vitaminlerin veya diğer besin maddelerinin ovo beslenmesinde gösterilen çok sayıda çalışma, civciv embriyonik kasını ve bağırsak gelişimini iyileştirmiştir. Ovo kas gelişiminin iyileştirilmesi, muhtemelen et verimini, büyüme hızını veya miyopati koşullarını etkileyerek kanatlı hayvan endüstrisine fayda sağlayabilir. Geçtiğimiz beş yıl boyunca, Georgia Üniversitesi'ndeki Gonzalez Laboratuvarı, broiler-tavuk embriyoları için ovo besleme metodolojisinde kas gelişimini değiştiren bir nikotinamid ribozid geliştirdi. Gelişmekte olan bir embriyonun yumurta sarısı kesesine enjekte edildiğinde, nikotinamid ribozid pektoralis majör kas ağırlığını ve kapaktaki kas lifi yoğunluğunu arttırdı. Bu protokol, ticari standart ve yüksek verimli piliç embriyolarını kullanarak ovo besleme çalışmalarında doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde yürütülecek bir metodoloji gösterecektir. Bu veriler ve yöntemler, diğer araştırma gruplarının ovo besleme çalışmalarında çok başarılı ve tekrarlanabilirlikle performans göstermelerini sağlayacaktır.
Introduction
1960'tan bu yana, Amerika Birleşik Devletleri'nin kümes hayvanlarından kişi başına düşen et tüketimi şaşırtıcı bir oranda artarken, diğer birincil protein kaynakları durgun, azalmış veya asgari düzeyde artmıştır. Kanatlı hayvan endüstrisi, talebe ayak uydurmak için verimli bir kuş üretmek için beslenme ve genetiği optimize etmek için önemli ölçüde zaman ve araştırma çabalarına yatırım yaptı. Kanatlı hayvan endüstrisinin temel amacı, ete dönüştürmek için kas üretmek olduğundan, çabaları kuşun hasattaki nihai kas kütlesini büyük ölçüde değiştirmiştir.
Çoğu tür gibi, kümes hayvanları da bifazik bir şekilde kas geliştirir. Primer miyogenez, kas lifi gelişiminin ikinci dalgası için iskele görevi gören birincil kas lifleri üretmek için mezenkimal kök hücreleri kullanır1. Kümes hayvanlarında, primer miyogenez embriyonik günlerde 3 ila 8 arasında ortaya çıkar ve ikincil miyogenez 8 ila 21. günler arasında gerçekleşir2. Bir kez geliştirildikten sonra, birincil ve ikincil kas lifleri, hücresel hipertrofi yoluyla gelecekteki tüm kas büyümesinin temelini oluşturur. Bu nedenle, bilim adamları ve endüstri, et verimini en üst düzeye çıkarmak için et üreten tüm türlerde birincil ve ikincil miyogenezi manipüle etmeye çalışmak için büyük çaba harcadılar.
Kümes hayvanlarında araştırılan ve ovo besleme olarak adlandırılan bir teknoloji, bileşiklerin enjeksiyon yoluyla beslenmesini içerir. Kanatlı hayvan endüstrisi tarafından yaklaşık 40 yıldır kullanılan bir teknoloji olan ovo beslemede, başlangıçta aşı uygulaması için geliştirilmiştir3. Literatür, yumurta içindeki farklı gelişim dönemlerinde ve konumlarında çeşitli bileşiklerin ve besin maddelerinin ovo beslenmesinde ovo kas gelişimi ve büyümesinde olumlu yönde etkilendiğini belgelemektedir 4,5,6. Bugüne kadar, Georgia Üniversitesi'ndeki Gonzalez Laboratuvarı, kümes hayvanı kas gelişimini manipüle etmek için ovo beslemede nikotinamid ribozid kullanmanın öncüsüdür.
B3 vitamininin piridin-nükleozid analoğu olan nikotinamid ribozit, kurtarma yolu7 boyunca NAD + üretir. Bu yol, NAD + üretmek için daha az enzimatik adım kullandığından, üretim en verimli8'dir. Gonzalez ve Jackson 9, gelişmekte olan piliç embriyo yumurta sarısı kesesinin nikotinamid ribozid ile takviyesinin, yumurtadan çıkmış nohutralis majör kas ağırlığını ve kas lifi yoğunluğunu arttırdığını göstermiştir. Bu daha sonra Xu ve ark.10 tarafından doğrulandı ve artan nikotinamid ribozid dozunun kas ağırlığını arttırdığını ve kas lifi yoğunluğunu arttırdığını buldu. Bu ilk iki çalışma ticari bir verim piliçlerinde gerçekleştirildi. Yüksek verimli piliçler, nihai kas kütlesi büyüklüğü için daha önemli bir genetik potansiyele sahip olduklarından, çalışmanın amacı, nikotinamid ribozid dozunun yüksek verimli piliç yumurtadan çıkmış nohut pektoralis majör kas gelişimi ve kapakta büyüme üzerindeki etkilerini belirlemekti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm metodolojiler Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yumurta inkübasyonu ve tedavi uygulaması
- Yumurta temini ve tedavi ataması
- Kuluçkalanmamış, döllenmiş yüksek verimli piliç yumurtaları elde edin ve bunları laboratuvara taşıyın.
- Düşük kaliteli olduğu düşünülen yumurtaları inceleyin ve atın.
NOT: Şekilsiz yumurtaları (yuvarlak, uzun, levha taraflı), çatlamış, kirli/lekeli, ince kabuklu ve buruşuk yumurtaları ortadan kaldırın. Bu, çürük yumurta riskini en aza indirmek için önemlidir. - Tek tek yumurta numaraları atayın, tartın ve yumurta numaralarını ve ağırlıklarını bir elektronik tablo yazılım programına kaydedin.
- Yumurtaları ağırlığa göre sıralamak için elektronik tablo yazılım programını kullanın.
- Yumurta sayısını ve yumurta ağırlığı sütunlarını vurgulayın.
- Veri sekmesini ve ardından Sırala - verileri yumurta ağırlığına göre en küçüğünden en büyüğüne doğru sırala'yı seçin.
NOT: En iyi kuluçka hızı için, 40 ila 70 g ağırlığındaki yumurtaları kullanın. - Deneyin tasarımına dayanarak, yumurtalara (sayısal veya alfabetik olarak) bir enjeksiyon tedavisi ve ötenazi günü atayın. Ötanazi tedavi numarasını ve gününü ayrı sütunlara girin ve bu faktörleri her tabakaya rastgele atayın.
NOT: Bu yayın için, tedaviler her 8 yumurtalı tabaka içinde rastgele atanmıştır.
- Her tedavinin benzer başlangıç yumurtası ağırlıklarına sahip olduğundan emin olmak için elektronik tablo yazılım programında bir PivotTable oluşturun.
- Analiz edilecek elektronik tablodaki tüm verileri vurgulayın.
- Ekle sekmesi altında PivotTable seçeneğini belirleyin .
- PivotTable Alanları alt penceresinde bağımsız değişkeni (Ötenazi Günü sütunu) seçin ve Satırlar alanına sürükleyin.
- B alt penceresinde bağımsız değişkeni (Tedavi sütunu) seçin ve Ötenazi Günü altındaki Satırlar alanına sürükleyin.
- İlgilenilen bağımlı değişkeni (Yumurta Ağırlığı) seçin ve Değerler alanına sürükleyin.
- Bağımlı değişkene tıklayıp Değer Alanı Ayarları'nı seçerek Değer alanı ayarlarını değiştirin.
- Ayarı Ortalama olarak değiştirin.
- Tepsi ataması
- Elektronik tablo yazılım programında, yumurtaları bir tepsiye (sayısal veya alfabetik olarak) atayın, böylece tedaviler bir tepsi içinde eşit olarak temsil edilir.
- Atanmış tedavilerle ilk dört yumurtayı tepsi 1'e atayın. Sonraki dört yumurtayı tepsi 2'ye atayın ve tüm yumurtalar bir tepsiye atanana kadar devam edin.
NOT: Bu adım, deneyde kullanılan inkübatör ve tepsi sayısına bağlı olarak değişecektir.
- Atanmış tedavilerle ilk dört yumurtayı tepsi 1'e atayın. Sonraki dört yumurtayı tepsi 2'ye atayın ve tüm yumurtalar bir tepsiye atanana kadar devam edin.
- Elektronik tablo yazılım programında, yumurtaları bir tepsiye (sayısal veya alfabetik olarak) atayın, böylece tedaviler bir tepsi içinde eşit olarak temsil edilir.
- PivotTable işlevini kullanarak tüm işlemlerin bir tepside eşit olarak temsil edildiğinden emin olun.
- Analiz edilecek elektronik tablodaki tüm verileri vurgulayın.
- Ekle sekmesinin altındaki PivotTable seçeneğini belirleyin.
- PivotTable Alanları alt penceresinde bağımsız değişkeni (Tepsi sütunu) seçin ve Satırlar alanına sürükleyin.
- İlgilenilen bağımlı değişkeni (Yumurta Ağırlığı) seçin ve Değerler alanına sürükleyin.
- Bağımlı değişkene tıklayıp Değer Alanı Ayarları'nı seçerek Değer alanı ayarlarını değiştirin.
- Ayarı Say olarak değiştirin.
- Kuluçka
- Yumurtaları uygun kuluçka tepsisine yerleştirin ve 6 saat boyunca% 40 ±% 4 bağıl nem ile 26.6 ° C'de ön inkübe edin.
NOT: Bazı inkübatörler, tamamen doğru olmayabilecek kendi kendini izleme sistemlerine sahiptir. Koşulları kontrol etmek için diğer sıcaklık ve nem izleme cihazlarını kullanın. - İnkübatör sıcaklığını% 40 ±% 4 bağıl nem ile 37 ° C'ye yükseltin ve bu koşulları inkübasyon günü 18'e kadar koruyun.
- Uygun inkübatör sıcaklığını sağlamak için, yüzey sıcaklıklarının 37 ° C olduğundan emin olmak için inkübatör boyunca günde iki kez birkaç yumurtanın yüzey sıcaklığını termal yüzey termometresi ile ölçün.
- Yeniden konumlandırmak için yumurtaları saatlik olarak döndürün.
- Kuluçkanın ilk 18.5 günü boyunca% 10 -% 12.5 yumurta ağırlığı kaybını sağlamak için günlük yumurta ağırlıklarını kaydedin.
NOT: Kilo kaybı istenen aralıkta değilse, nemi ayarlayın (artırın veya azaltın).
- Yumurtaları uygun kuluçka tepsisine yerleştirin ve 6 saat boyunca% 40 ±% 4 bağıl nem ile 26.6 ° C'de ön inkübe edin.
- Ovo enjeksiyonlarında kuluçka günü-10
- Her yumurta sarısı kesesine enjekte edilen 100 μL çözelti ile 290.07 g / mol formül ağırlığını kullanarak her tedavi için gereken nikotinamid ribozid miktarını hesaplayın.
NOT: Tüm çözeltiler için seyreltici olarak steril salin (%0,9) çözeltisi kullanılacaktır.
Hesaplama: 50 yumurta × 100 μL = 5.000 μL (5 mL) çözelti gereklidir. Enjeksiyon için yeterli çözeltinin mevcut olduğundan emin olmak için 6 mL'ye kadar yuvarlayın (Şekil 1).- Çözeltiler yapıldıktan sonra, yumurtaların sıcaklığında tutmak için 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Yumurtaları inkübatörden her seferinde bir tepsiden çıkarın ve ılık bir havluyla örtün.
- Sarısı kesesini bulmak ve enjeksiyon alanını% 70 etanol ile temizlemek için mum yumurtası.
- Yumurta kabuğuna steril bir 20 G, 2.54 cm hipodermik iğne ~ 1 cm yerleştirin ve verilen dozu yumurta sarısı kesesine enjekte edin. Yumurtaları 0 mM nikotinamid ribozid tedavisinden 100 μL steril salin (% 0.9) ile enjekte edin.
- Hemen, aşırı nem kaybını önlemek için enjeksiyon bölgesini küçük bir parça mutlak su geçirmez bantla örtün.
- Tüm yumurtalar tedavilerini aldıktan sonra, tepsiyi tekrar inkübatöre yerleştirin.
- Kuluçka günü 18'de, yumurtaları tepsilerden çıkarın ve tedavilerine göre kuluçka kutularına yerleştirin.
- Kuluçka kutularını inkübatöre yerleştirin ve tüm yumurtalar yumurtadan çıkana kadar veya inkübasyonun 23. gününe kadar nemi% 60 ±% 2'ye yükseltin.
NOT: Yumurtalar konservede embriyo içermiyorsa, yumurtayı atın. Bu çürük yumurta oluşumunu önleyecektir.
- Her yumurta sarısı kesesine enjekte edilen 100 μL çözelti ile 290.07 g / mol formül ağırlığını kullanarak her tedavi için gereken nikotinamid ribozid miktarını hesaplayın.
2. Ötenazi ve pektoralis majör kas örneği toplama
- Civciv ötenazisi
- Kuluçka günü 18'de, embriyonik yumurtaları inkübatörden çıkarın ve metabolizmayı durdurmak için 1 saat oda sıcaklığına yerleştirin. Embriyoları yumurtalardan çıkarın, yumurta sarısı kesesi olmadan tartın ve sonra kafasını kesin. Kuluçkadan 12 saat sonra, civcivleri 10 dakika boyunca CO2'ye maruz bırakarak ötenazi yapın, tartın, hızlı bir şekilde taçtan yumruya uzunluk ölçümü toplayın ve ardından kafasını kesin.
NOT: Kuşun artık kafasına sahip olmaması ötenaziyi garanti eder. - Embriyolar ve civcivler için dijital kumpaslar kullanarak aşağıdaki ölçümleri (adım 2.1.2.1-2.1.2.4) göz önünde bulundurun.
- Taç-yumru uzunluğunu belirlemek için, civcivi başı sıkışmış ve bacakları vücudunun altına sıkışmış olarak yan tarafına koyun. Başın üstünden kuyruğa kadar ölçün.
- Kafa genişliğini ölçmek için, bir kulak deliğinden diğer kulak deliğine kadar ölçüm yapın.
- Kafa uzunluğunu belirlemek için, gaganın arkasından kafatasının arkasına kadar ölçün.
- Elastik olmayan bir ip alın ve baş çevresini ölçmek için kafatasının etrafına bir kulak deliğinden diğerine sarın. Ölçüm elde etmek için dizeyi metrik cetvelin üzerine yerleştirin.
- Göğsün etrafına, kanatların vücuda temas ettiği yerin altına bir ip sararak ve ölçümü elde etmek için ipi metrik bir cetvel üzerine yerleştirerek göğüs çevresini toplayın.
- Göğüsleri% 70 etanol ile püskürtün ve parmakları kullanarak, pektoralis majör kaslarını ortaya çıkarmak için tüyleri ve cildi çekin ve ölçümleri (adım 2.1.4.1-2.1.4.2) dijital kumpaslarla yapın.
- Göğüs genişliğini belirlemek için, kanatların vücuda temas ettiği göğüs boyunca ölçün.
- Göğüs uzunluğunu belirlemek için, klavikulanın altından yağ yastığının üstüne kadar ölçün.
- Kuluçka günü 18'de, embriyonik yumurtaları inkübatörden çıkarın ve metabolizmayı durdurmak için 1 saat oda sıcaklığına yerleştirin. Embriyoları yumurtalardan çıkarın, yumurta sarısı kesesi olmadan tartın ve sonra kafasını kesin. Kuluçkadan 12 saat sonra, civcivleri 10 dakika boyunca CO2'ye maruz bırakarak ötenazi yapın, tartın, hızlı bir şekilde taçtan yumruya uzunluk ölçümü toplayın ve ardından kafasını kesin.
- Pektoralis majör kasının çıkarılması, ölçümü ve toplanması
- Cerrahi makas veya neşter ve forseps kullanarak, omurga kemiği boyunca keserek ve kası vücut duvarından serbest bırakarak sağ pektoralis majör kasını çıkarın.
NOT: Kasın göğüs kafesinde kaldığını görsel olarak tanımlayarak pektoralis minör kasını toplamadığınızdan emin olun. - Pektoralis majör kasını çıkardıktan sonra, kası bir popsicle çubuğu üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve dijital kumpaslar kullanarak aşağıdaki ölçümleri (adımlar 2.2.2.1-2.2.2.3) toplayın.
- Kas uzunluğunu belirlemek için, kranial kasın kaudal kısmına kadar ölçün.
- Kas genişliğini belirlemek için, kasın kafatası kısmının en geniş kısmında ölçüm yapın.
- Kas kalınlığını belirlemek için, forseps ile memeyi alın ve kasın kranial kısmının en kalın kısmında ölçün.
- İstenirse, bu kası ve sol pektoralis majör kasını daha ileri analizler için (histoloji, protein ve gen ekspresyonu vb.) bir yıla kadar -80 ° C'de saklayın.
- Cerrahi makas veya neşter ve forseps kullanarak, omurga kemiği boyunca keserek ve kası vücut duvarından serbest bırakarak sağ pektoralis majör kasını çıkarın.
3. İstatistik
- Verileri deney birimi olarak yumurta / civciv ile tamamen rastgele bir tasarım olarak analiz edin.
NOT: Nikotinamid ribozid dozu (DOS) sabit etki olarak görev yaptı. Tüm veriler istatistiksel bir analiz yazılımı programı ile analiz edildi (bakınız Malzeme Tablosu) ve en küçük kare tedavi araçları arasındaki ikili karşılaştırmalar hesaplandı. P < 0.05'te farklılıklar anlamlı bulundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
18. gün embriyolarının ve yumurtadan çıkan civcivlerin vücut ağırlığı için DOS etkisi yoktu (P > 0.52; Şekil 2). Tüm gün-18 embriyo pektoralis majör kas ölçümleri için DOS etkisi yoktu (P > 0.24; Şekil 3). Yumurtadan çıkan nohut piktoralis majör kas uzunluğu ve genişliği ölçümleri için DOS etkisi yoktu (P > 0.26); Bununla birlikte, DOS kas ağırlığını ve derinliğini etkilemiştir (P < 0.03; Şekil 4). Nikotinamid ribozid enjekte edilmeyen embriyolardan elde edilen civcivler, 500 ve 1.000 mM nikotinamid ribozid (P < 0.03) enjekte edilen embriyolardan gelen civcivden daha az ağırlığa sahip pektoralis majör kaslarına sahipti, ancak bu tedaviler birbirinden farklı değildi (P = 0.41). 250 mM nikotinamid ribozid enjekte edilen embriyolardan elde edilen civcivler, pektoralis majör ağırlığında diğer tedavilere göre değişmedi (P > 0.06). 0 ve 250 mM nikotinamid ribozid enjekte edilen embriyolardan elde edilen civcivler, 500 ve 1.000 mM nikotinamid ribozid enjekte edilen embriyolardan elde edilen civcivlerden daha az pektoralis majör derinliğe sahipti (P < 0.05), ancak bu tedaviler farklı değildi (P = 0.95). 500 ve 1.000 mM nikotinamid ribozid ile enjekte edilen embriyolardan elde edilen civciv, pektoralis majör derinliğinde değişmedi (P = 0.73).
Şekil 1: Nikotinamid ribozid dozunun genel hesaplanması ve mevcut deneyde kullanılan üç dozun örnekleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dört doz nikotinamid ribozidin in ovo beslenmesinin (A) gün-18 embriyo ve (B) kuluçkalık civciv vücut ağırlıkları üzerindeki etkisi. Embriyolar, inkübasyonun 10. gününde dört nikotinamid ribozid dozu ile yumurta sarısı kesesine enjekte edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dört doz nikotinamid ribozidin in ovo beslenmesinin gün-18 embriyo pektoralis majör kası üzerindeki etkisi. (A) Ağırlık. (B) Uzunluk. (C) Genişlik. (D) Derinlik. Embriyolar, inkübasyonun 10. gününde dört nikotinamid ribozid dozundan biriyle yumurta sarısı kesesine enjekte edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dört doz nikotinamid ribozidin in ovo beslenmesinin kapak nohut gövdesi pektoralis majör kası üzerine etkisi . (A) Ağırlık. (B) Uzunluk. (C) Genişlik. (D) Derinlik. Embriyolar, inkübasyonun 10. gününde dört nikotinamid ribozid dozundan biriyle yumurta sarısı kesesine enjekte edildi. a,b, bir alt şekil içinde birbirlerinden istatistiksel farkı gösterir (P < 0.05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bugüne kadar, Georgia Üniversitesi'ndeki Gonzalez Laboratuvarı, pektoralis majör kas gelişimi ve büyümesi üzerinde ovo beslenmesinde nikotinamid ribozidin olumlu etkilerini gösteren tek gruptur. İlk çalışma, 250 mM nikotinamid ribozidin ovo beslenmesinde, yumurta sarısı kesesi9'a enjekte edildiğinde kas ağırlığını ve boyutlarını arttırdığını bulmuştur. Takip çalışmasında, mevcut çalışmada test edilen dozlara benzer şekilde, yumurta sarısına artan nikotinamid ribozid dozunun enjekte edilmesi, pektoralis majör kas morfometrisini 250 mM doz10'un ötesinde arttırmamıştır. Bu iki çalışmada ticari bir verim piliç hattı kullanılmıştır; bu nedenle, bu çalışma, nikotinamid ribozid ile yüksek verimli piliç embriyolarının ovo beslenmesinin etkilerini göstermek için yapılmıştır.
Bu çalışmalar sayesinde, başarıyı belirleyen bu protokolde yer alan birkaç kritik adım belirlenmiştir. Bu süreç, bakteri yayılımını azaltmak ve yumurtadan çıkan civciv sonuçlarını önyargılı hale getirmemek için kuluçka için yumurta seçmeye aşina olmayanlar için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kirli veya şekilsiz yumurtaları seçmemek kritik derecede önemlidir, çünkü diğer yumurtaları engelleyebilecek bakterilere sahiptirler. Bu bakteriler inkübatörden hızla yayılacak ve çürük yumurta insidansının büyük ölçüde artmasına neden olacaktır; böylece, örnekleme için mevcut embriyo ve civciv sayısını etkiler.
Deneysel tedavilere yumurta atamaya gelince, araştırmacılar tüm tedaviye başlayan yumurta ağırlıklarının eşit olmasını sağlamak için yukarıda açıklanan elektronik tablo yazılım yöntemlerini kullanmalıdır. Bu adımın tamamlanması embriyo ve yumurtadan çıkmış civciv tüm vücut morfometrik verilerinde gösterilecektir. Bu, tüm deneysel tedavi kas farklılıklarının tedavi uygulamasından kaynaklanmasını sağlayacaktır. Gonzalez ve Jackson9 ve Xu ve ark.10 çalışmalarında tüm vücut morfometrik ölçümleri üzerinde nikotinamid ribozid etkisi yoktu. Bu tutarlı bulgular nedeniyle, tüm vücut morfometrisi üzerinde nikotinamid ribozid etkisinin eksikliğini belirlemek için mevcut araştırmada sadece embriyo ve yumurtadan çıkmış civciv vücut ağırlıkları ölçülmüştür; ancak, bu verileri toplamak isteyenler için bu yayında tüm vücut morfometrisini toplama metodolojileri sunulmuştur. Mevcut çalışmada embriyo veya civciv vücut ağırlıkları üzerinde nikotinamid ribozid doz etkisi yoktu ve daha önce bildirilen eğilimi sürdürdü.
Bu metodoloji kesinlikle ikincil miyogenezi etkilediğinden, gelecekteki araştırma ekipleri embriyoları daha erken bir zamanda enjekte etmeye cazip gelebilir. Yazarların deneyimlerine göre, erken enjeksiyon, 0 ila 5 kuluçka gününden itibaren, yumurtaların kuluçka kabiliyetini% 70 ila% 80'e kadar büyük ölçüde azaltır. Erken enjeksiyon, tekniğin önemli bir sınırlamasıdır. Gelecekteki bir araştırma alanı olarak hizmet edebilir, ancak yazarların deneyimlerine göre, erken enjeksiyon, bu teknolojinin değerini ciddi şekilde azaltan kuluçka kabiliyetine zararlıdır.
Pektoralis majör kasının morfometrisini ölçerken, araştırmacılar iki önemli husus üzerinde düşünmelidir. İlk olarak, yazarlar morfometrik analiz için kullanılan tüm kasları çıkarmak için iyi eğitimli tek bir araştırmacıya tavsiyede bulunurlar. Pektoralis majör kası çok küçük olduğu için, çok istenmeyen varyasyon veya önyargı, ilgilenilen kasın dışındaki diğer kasları toplayarak verilere dahil edilebilir. Tek bir araştırmacı kullanmak, aynı kasın kası tanımlamak için kullanılan tutarlı işaretlere göre toplanmasını sağlayacaktır. İkincisi, kasları ölçüm için ahşap yüzeye yerleştirirken, tüm kasların doğal bir pozisyona yerleştirilmesine özen gösterilmelidir. Bu özellikle uzunluk ölçümü için geçerlidir, çünkü ölçüm yüzeyine yerleştirilirken kasın gerilmesiyle manipüle edilebilir. Pektoralis majör kas morfometrisi için yapılan mevcut çalışmada 18. inkübasyon gününde nikotinamid ribozid etkisi görülmemiştir. Xu ve ark.10, 19. inkübasyon gününde pektoralis majör kas ağırlığı ve uzunluk farkı olmadığını bildirmiştir; Bu nedenle, nikotinamid ribozidin tüm kas morfometrisi üzerindeki etkisini göstermek, bu iki genetik piliç hattında inkübasyon günü 19'dan sonraya kadar ortaya çıkmayabilir.
Daha önce yayınlanmış çalışmalarla karşılaştırıldığında, mevcut çalışmadaki en önemli değişikliklerden biri, ticari olarak temin edilebilen kapsül formundaki nikotinamid ribozidin kullanılmasıydı. Önceki çalışmalarda 9,10, saf nikotinamid ribozid bir üreticiden temin edildi. Üreticinin yardımıyla, araştırma grubuna, mevcut çalışmada kullanılan ticari ürünün, ürüne karıştırılmış selüloz bileşenlerine sahip olduğu ve hesaplanan nikotinamid riboz konsantrasyonunun% 34 oranında azaldığı bildirildi. Bu nedenle, bu çalışmada, 500 ve 1.000 mM nikotinamid ribozid enjekte edilen yumurtadan çıkmış civcivlerden elde edilen pektoralis majör kas ağırlığı, 0 mM nikotinamid ribozid ile enjekte edilen embriyolardan elde edilen civcivlerden sırasıyla% 15 ve% 10 daha büyüktü. Bu ağırlık esas olarak bu tedavilerin pektoralis majör kas derinliğinin sırasıyla% 17 ve% 7 oranında artması nedeniyle artmıştır. Bu yanıt, önceki yanıtların yarısından azdı. Xu ve ark.10, nikotinamid ribozid takviyesi, 250 ila 1.000 mM konsantrasyonları, artan kas uzunluğu, genişliği ve derinliği nedeniyle pektoralis majör kas ağırlığını% 35 oranında arttırdığını bildirmiştir. Azalmış yanıt öncelikle hesaplanandan daha az nikotinamid ribozid takviyesinden kaynaklanabilirken, selüloz materyalinin miyogenezi engelleyip engellemediği de bilinmemektedir. Bu nedenle, yazarlar gelecekteki tüm araştırmaların saf nikotinamid ribozid kullanmasını ve ticari olarak temin edilemeyen ürünleri kullanmasını önerdi.
Mevcut sonuçlardan bağımsız olarak, bu yayında özetlenen metodolojileri takip etmek, ovo besleme çalışmalarının sağlam bir şekilde yürütülmesini sağlayacaktır. Gelecekteki araştırmacılar, ovo kas gelişimi ve büyümesinde piliç tavuğunu olumlu yönde etkileyebilecek diğer bileşikleri test etmek için yukarıdaki yöntemleri kullanabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, yumurtaların bağışı ve yumurta inkübasyonu konusunda teknik yardım sağladığı için Cobb Vantress, Inc.'e teşekkür eder. Yazarlar, nikotinamid ribozid teknik yardımı için ChromaDex, Inc.'e teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch | Fisher Scientific | 14-817-208 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword= |
| Analytical Balance | VWR | VWR-214B2 | https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances |
| Complete Dissection Set | DOCAZON | DK1001 | https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3 |
| Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD02 | https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020 |
| Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-464 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword= |
| HIGH INTENSITY EGG CANDLER | Titan Incubators | N/A | https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity |
| Infrared Forehead Thermometer | HALIDODO | XZ-001 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Neiko Tools Digital Caliper | Neiko Tools | 01408A | https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1 |
| Nexcare Absolute Waterproof Tape | Nexcare Brand | 732 | https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud |
| Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display | Omega | OM-HL-SP-TH | https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series |
| SAS 9.4 for Windows | SAS Institute | N/A | https://www.sas.com/en_us/home.html |
| Sportsman 1502 Incubator | GQF Manufacturing | 1502 | https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/ |
| Tru Niagen (Nicotinamide riboside) | ChromaDex, Inc. | N/A | https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product |
| Wood Craft Sticks | Creatology | M20001547 | https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html |
References
- Biressi, S., Molinaro, M., Cossu, G. Cellular heterogeneity during vertebrate skeletal muscle development. Developmental Biology. 308 (2), 281-293 (2007).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: Skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Sharma, J., Burmester, B. Resistance of Marek's disease at hatching in chickens vaccinated as embryos with the Turkey herpesvirus. Avian Diseases. 26 (1), 134-149 (1982).
- Al-Murrani, W. K. Effect of injecting amino acids into the egg on embryonic and subsequent growth in the domestic fowl. British Poultry Science. 23 (2), 171-174 (1982).
- Ohta, Y., Kidd, M. T., Ishibashi, T. Embryo growth and amino acid concentration profiles of broiler breeder eggs, embryos, and chicks after in ovo administration of amino acids. Poultry Science. 80 (10), 1430-1436 (2001).
- Zhao, M. M., et al. In ovo feeding of creatie pyruvate increases hatching weight, growth performance, and muscle growth but has no effect on meat quality in broiler chickens. Livestock Science. 206, 59-64 (2017).
- Bieganowski, P., Brenner, C. Discoveries of nicotinamide riboside as a nutrient and conserved NRK genes establish a Preiss Handler independent route to NAD1 in fungi and humans. Cell. 117 (4), 495-502 (2004).
- Chi, Y., Sauve, A. Nicotinamide riboside, a trace nutrient in foods, is a Vitamin B3 with effects on energy metabolism and neuroprotection. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 16 (6), 657-661 (2013).
- Gonzalez, J. M., Jackson, A. R. In ovo feeding of nicotinamide riboside affects pectoralis major muscle development. Translational Animal Science. 4 (3), 1-7 (2020).
- Xu, X., Jackson, A. R., Gonzalez, J. M. The effects of in ovo nicotinamide riboside dose on broiler myogenesis. Poultry Science. 100 (3), 100926 (2021).
