Summary
Bu protokol, yaprak haznesinin tükürük proteinlerini ve yaprak haznesi vektörleri tarafından salınan bitki viral proteinlerini tespit etmek için bitki konağının nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Abstract
Böcek vektörleri yatay olarak tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsünü iletir. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, delici emici ağız kısımlarına sahip hemipteran böcekler tarafından bulaşır. Viral bulaşma sırasında, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçıyı köprüler, çünkü tükürük vektörleri virüsleri ve böcek proteinleri, bitkilerin böceklerden bitki konakçılarına bağışıklık tepkisini tetikler veya bastırır. Tükürük proteinlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri, arbovirüs-konakçı etkileşimlerinin araştırma alanında yeni bir odak alanı haline gelmektedir. Bu protokol, bitki konağını kullanarak yaprakçıkların tükürüğündeki proteinleri tespit etmek için bir sistem sağlar. Pirinç cüce virüsü (RDV) ile enfekte olmuş yaprak vektörü Nephotettix cincticeps buna bir örnek teşkil eder. N. cinctiacps'ın tükürüğü tarafından vektörleştirilen RDV'nin vitellogenin ve majör dış kapsid proteini P8, N. cinctiacps'ın beslendiği pirinç bitkisinde aynı anda tespit edilebilir. Bu yöntem, böcek beslemesinden sonra bitki konakçısında geçici olarak tutulan tükürük proteinlerini test etmek için geçerlidir. Bu tespit sisteminin hemipteran-virüs-bitki veya hemipteran-bitki etkileşimlerinin incelenmesine fayda sağlayacağına inanılmaktadır.
Introduction
Temel bir problem olan arbovirüslerin vektör-konakçı iletim modu, biyoloji biliminin sınırındadır. Tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsü, böcek vektörleri1 tarafından yatay olarak bulaşır. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers ve thrips dahil olmak üzere hemipteran böcekler tarafından vektörleştirilir. Bu böcekler, bitki virüslerini verimli bir şekilde iletmelerini sağlayan farklı özelliklere sahiptir1. Delici emici ağız kısımlarına sahiptirler ve floem ve ksilemden gelen özsu ile beslenirler ve tükürüklerini 1,2,3,4 salgılarlar. Tekniklerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesiyle, tükürük bileşenlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri yoğun araştırmaların yeni bir odağı haline gelmektedir. Tükürükteki bilinen tükürük proteinleri, diğerlerinin yanı sıra pektinesteraz, selülaz, peroksidaz, alkali fosfataz, polifenol oksidaz ve sukraz gibi çok sayıda enzim içerir 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tükürükteki proteinler ayrıca konakçı savunma tepkisini tetikleyen, böylece böceklerin performansını değiştiren elisitörleri ve konakçı savunmasını baskılayan efektörleri içerir, bu da böcek uygunluğunu arttırır ve konakçı patolojik yanıtlarını indükleyen bileşenler14,15,16,17. Bu nedenle, tükürük proteinleri böcekler ve konakçılar arasındaki iletişim için hayati öneme sahip malzemelerdir. Virüslerin bulaşması sırasında, delici emici virülifer böceklerin tükürük bezleri tarafından salgılanan tükürük de viral proteinler içerir. Viral bileşenler, onları böcekten bitki konağına serbest bırakmak için tükürük akışını kullanır. Bu nedenle, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçı tritrofik etkileşimini köprüler. Virülifer böcekler tarafından salgılanan tükürük proteinlerinin biyolojik fonksiyonunun araştırılması, virüs-vektör-konakçı ilişkisinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Hayvan virüsleri için, sivrisineklerin tükürüğünün Batı Nil virüsü (WNV) ve Dang virüsünün (DENV) bulaşmasına ve patojenitesine aracılık ettiği bildirilmektedir. Tükürük proteini AaSG34, dang humması-2 virüsü replikasyonunu ve iletimini teşvik ederken, tükürük proteini AaVA-1, otofajiyi aktive ederek DENV ve Zika virüsü (ZIKV) bulaşmasını teşvik eder18,19. Sivrisineklerin tükürük proteini D7, DENV viryonları ve rekombinant DENV zarf proteini20 ile doğrudan etkileşim yoluyla in vitro ve in vivo DENV enfeksiyonunu inhibe edebilir. Bitki virüslerinde, begomovirüs domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV), beyaz sineklerin tercihini ve performansını arttırmak için bitki konağının WRKY33 aracılı bağışıklığını baskılayan beyaz sinek tükürük proteini Bsp9'u indükler ve sonunda virüslerin bulaşmasını arttırır21. Böcek tükürük proteinlerinin bitki konakçılarında oynadığı rol üzerine yapılan çalışmalar, hayvan konakçılarınınkinin gerisinde kaldığından, bitki konakçılarındaki tükürük proteinlerini tespit etmek için kararlı ve güvenilir bir sisteme acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Pirinç cüce virüsü (RDV) olarak bilinen bitki virüsü, yaprak haznesi Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) tarafından yüksek verimlilikle ve sürekli çoğalan bir şekilde bulaşır22,23. RDV'nin ilk olarak bir böcek vektörü tarafından bulaştığı ve Asya'da ciddi bir pirinç hastalığına neden olduğu bildirilmiştir24,25. Virion ikosahedral ve çift katmanlı küreseldir ve dış tabaka P8 dış kapsid proteini22'yi içerir. N. cinctiaceps'te RDV'nin dolaşım süresi 14 gün 26,27,28,29,30'dur. RDV tükürük bezlerine ulaştığında, virionlar ekzositoz benzeri bir mekanizma 23 aracılığıyla tükürük bezlerindeki tükürük depolanan boşluklara salınır. Vitellogenin (Vg), dişi böceklerde oosit gelişimi için gerekli olan yumurta sarısı proteini öncüsüdür31,32,33. Çoğu böcek türü, yaklaşık 220 kDa'lık bir öncü proteini kodlayan 6-7 kb'lik en az bir Vg transkriptine sahiptir. Vg'nin protein öncülleri genellikle yumurtalık 18,19'a girmeden önce büyük (140 ila 190 kDa) ve küçük (<50 kDa) parçalara ayrılabilir. Önceki proteomik analiz, Vg'den türetilen peptitlerin, işlevleri bilinmemekle birlikte, yaprakçık Recilia dorsalis'in salgılanan tükürüğünde varlığını ortaya koymuştur (yayınlanmamış veriler). Bitkilerden ağızdan salgılanan Vg'nin, bitkilerin savunmalarına zarar vermek için bir efektör olarak işlev gördüğü yeni bildirilmiştir34. N. cinctiaces'in Vg'sinin tükürük akışıyla bitki konakçısına da salınıp bırakılamayacağı ve daha sonra bitki savunmasına müdahale etmek için bitkide rol oynayıp oynayamayacağı bilinmemektedir. N. cinctiaceps'in bitki savunmasını inhibe etmek veya aktive etmek için Vg gibi tükürük proteinlerini kullanıp kullanmadığını ele almak için ilk adım, beslenme sırasında bitkiye salınan proteinleri tanımlamaktır. Bitkide bulunan tükürük proteinlerini tanımlama yöntemini anlamak, tükürük proteinlerinin işlevini ve Hemiptera ile bitkiler arasındaki etkileşimleri açıklamak için potansiyel olarak gereklidir.
Burada sunulan protokolde, N. cinctiacps , böcek besleme yoluyla tanıtılan bitki konakçısında tükürük proteinlerinin varlığını incelemek için bir yöntem sağlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Protokol öncelikle tükürük proteinlerinin toplanmasını ve tespitini detaylandırır ve çoğu hemipteran üzerinde daha fazla araştırma için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Virülifer olmayan yetişkin yaprakçıklar, Çin'deki Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi'ndeki Vektör Kaynaklı Virüs Araştırma Merkezi'nde çoğaltıldı.
1. Virülifer olmayan böcek yetiştiriciliği
- Yetişkinleri pirinç fideleri üzerinde 40 cm x 35 cm x 20 cm (uzunluk x genişlik x yükseklik) olan bir küp kafeste arkadan yerleştirin. Havalandırma için kafesin bir tarafını böcek geçirmez bir ağ ile örtün.
- Yaprakçıklı kafesleri, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyot altında% 60-75 bağıl nem ile 26 ° C'de dahili bir nem kontrolörü içeren bir inkübatörde saklayın.
- Tüm yetişkinleri kafeslerinden her hafta taze pirinç fideleri içeren yeni bir kafese nazikçe aktarmak için bir aspiratör kullanın.
- 200'den fazla yetişkinin çiftleşmesine ve pirincin içine yumurta bırakmasına izin verin.
- Perileri ortaya çıkarmak için eski pirinç fidelerini saklayın. Bu yeni virülifer olmayan nimfleri 2-instar aşamasına kadar destekleyin.
2. Virüs edinimi ve virülifer böceklerin toplanması
- 2-instar nonviruliferous nimfleri, aspiratör kullanarak açlık için 1-2 saat boyunca bir cam kültür tüpüne (2,5 cm çapında 15 cm yüksekliğinde) dikkatlice aktarın.
- Perileri bir tencerede yetişen RDV ile enfekte olmuş bir pirinç bitkisi içeren bir kafese bırakın.
- Perileri enfekte olmuş pirinç bitkisinde 2 gün boyunca beslenmelerine izin verin.
NOT: Pirinç bitkisini dikkatlice sulayın ve nimfleri yıkamaktan kaçının. 2 yıldızlı nimfler yaklaşık 1.6-2 mm uzunluğundadır.
- Bu nimfleri, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyot altında% 60-75 bağıl neme sahip taze virüssüz pirinç fideleri içeren yeni bir kafese dikkatlice aktarın. RDV'nin dolaşım iletim süresini tamamlamak için nimflerin enfekte olmuş pirinç bitkisinde 12 gün boyunca beslenmelerine izin verin.
3. Bir besleme kafesi kullanarak tükürük proteinlerinin toplanması
- Bir ucunun böcek geçirmez ağ ile kaplandığı beş küçük boru benzeri besleme kafesi (2,5 cm çapında ve 4 cm yüksekliğinde) hazırlayın.
- Her besleme kafesinde 15-20 yaprak haznesini sınırlayın ve ardından kafesin diğer ucunu ince bir köpük paspasla örtün.
- Bir pirinç fidesini (5-6 cm yüksekliğinde) kafesin ucu ile bantlı bir köpük paspas arasına sabitleyin. Besleme kafesindeki yaprakçıkların, kafesin içine maruz kalan pirinç fideleriyle beslenebildiğinden emin olun.
- Fide köklerini suya batırın, böylece pirinç bitkisi canlı kalır. Yaprakçıkların 2 gün boyunca onlarla beslenmesine izin verin.
- Yaprakçıkları besleme kafeslerinden çıkarın ve beslendikleri pirinç fidelerini toplayın. Fidelerin parçalarını kafesin dışına kesin ve fidelerin beslenme bölgelerini geri kazanın.
NOT: Bu numune, algılama için anında kullanılmadığı takdirde -80 °C'de en fazla 3 ay saklanabilir.
4. Reaktif hazırlama
- 5xTris-glisin tamponu hazırlamak için 15.1 g Tris-baz, 94 g glisin ve 5 g SDS'yi 1 L steril suda çözün. 1xTris-glisin tamponu hazırlamak için 200 mL 5xTris-glisin tamponunu 800 mL steril su ile seyreltin (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız).
- 10xTris tamponlu salin (TBS) tamponu hazırlamak için 80 g NaCl, 30 g Tris baz ve 2 g KCl'yi 1 L steril suda çözün. Çözeltiyi 121 ° C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın.
- 4x protein numune tamponu hazırlamak için 8 g SDS, 4 mL ß-merkaptoetanol, 0.02 g bromofenol mavisi ve 40 mL gliserol 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) içinde çözün.
- Transfer tamponunu hazırlamak için 800 mL Tris-glisin tamponunu 200 mL metanol ile karıştırın.
- TBS tamponunu Tween 20 (TBST) çözeltisiyle hazırlamak için 100 mL 10xTBS çözeltisi ve 3 mL Tween 20 ila 900 mL steril su ekleyin.
5. Tükürük ve viral proteinleri tespit etmek için Batı lekelenmesi
- Pirinç numunelerinin 0,1 gramını, doku toz haline gelene kadar sıvı azotla öğütün. Numuneye 200 μL 4x protein numune tamponu ekleyin ve 10 dakika kaynatın. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı çıkarın ve yeni bir şişeye yerleştirin. Numunenin 10 μL'sini bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve 45-60 dakika boyunca 150 V'ta Tris-glisin tamponunda çalıştırın.
NOT: Santrifüjleme sonrası kalıntı atılabilir.
- Süpernatantı çıkarın ve yeni bir şişeye yerleştirin. Numunenin 10 μL'sini bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve 45-60 dakika boyunca 150 V'ta Tris-glisin tamponunda çalıştırın.
- 0,45 μm nitroselüloz membranı ve diğer sandviç malzemelerini Transfer tamponuna 30 dakika boyunca koyun.
NOT: Bu adım, jel çalışmasını tamamlamadan önce yapılabilir. - Jeli sandviçleyin ve Transfer tamponunda 100 V'ta 90-120 dakika boyunca aktarın.
- Membranı alın ve 20 dakika boyunca TBST çözeltisinde% 7 yağsız kuru süt bloke edici çözeltiye yerleştirin. RDV, P8 veya Vg'ye karşı spesifik antikoru, TBST'de% 7'lik bir yağsız kuru süt çözeltisine ekleyin. Membranı 2 saat veya gece boyunca boyamak için antikor ile inkübe edin.
- Membranı TBST çözeltisi ile üç kez, her seferinde 5 dakika yıkama ile yıkayın.
- Keçi anti-tavşan IgG'yi, TBST ile% 7 yağsız kuru süte ikincil bir antikor olarak ekleyin. Oda sıcaklığında 60-90 dakika boyunca antikor ile inkübe edin.
- Membranı TBST çözeltisi ile her seferinde 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Kemilüminesan yöntemi için ECL Western kitini kullanın. Kitteki Karışım Algılama Reaktifleri 1 ve 2, bir tüpte 1: 1 oranında. Karışık reaktifi membranın üzerine koyun ve lekeyi 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Fazla reaktifi boşaltın ve kemilüminesan resmin kolorimetrik bir resmini çekin. Merdiveni protein bantlarıyla görmek için bunları birleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bu protokoldeki tüm adımları göstermektedir: böcek yetiştiriciliği, virüs edinimi, pirinç besleme yoluyla tükürük proteinlerinin toplanması ve batı lekesi. Batı lekeleri sonuçları, Vg'ye karşı antikorlarla inkübe edilen zardaki böceklerin pirinç ve tükürük bezlerinin beslenme örneklerinde yaklaşık 220 kDa'lık spesifik ve beklenen bantların gözlendiğini göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen pirinç örneğinde bant gözlenmemiştir. Şekil 2'deki sonuç, Vg'nin bitki konakçısına tükürük proteini olarak salındığını göstermektedir. RDV P8'e karşı antikorlarla inkübe edilen membran üzerinde, beslenmeye tabi tutulan pirinçten alınan örneklerde ve virülifer böcek cisimciklerinin vücutlarında yaklaşık 46 kDa'lık spesifik ve beklenen bir bant da gözlenmiştir. Buna karşılık, Şekil 3'te gösterildiği gibi, beslenmeyen pirinç örneğinde ve virülifer olmayan yaprak haznesi gövdelerinde bant gözlenmemiştir. Bu sonuç, viral proteinlerin yem bitkilerinde de tespit edilebileceğini kanıtladı.
Şekil 1: Tükürük proteinlerinin tespitindeki adımlara genel bakış. Adımlar arasında böcek yetiştiriciliği, virüs edinimi, bitki besleme yoluyla tükürük proteinlerinin toplanması ve batı lekelenmesi yer almaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bitki ve böcek örneklerinde Vg'nin Batı leke testi. Şerit 1, beslemeyen bitkiler; Şerit 2, virülifer yaprak hazne besleme tesisleri; Şerit 3, virülifer yaprakçık tükürük bezleri; Şerit M, işaretleyici. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bitki ve böcek örneklerinde P8'in Batı leke testi. Şerit 1, beslemeyen bitkiler; Şerit 2, virülifer yaprak hazne besleme tesisleri; Şerit 3, virülifer yapraklı gövdeler; Şerit 4, virülifer olmayan yaprak haznesi gövdeleri; M, işaretleyici. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek | Kompozisyon | Yorumlar/Açıklama |
| 5x Tris-glisin tamponu | 15,1 g Tris taban 94 g Glisin 1 L steril suda 5 g SDS |
Stok çözümü |
| 1x Tris-glisin tamponu | 200 mL 5x Tris-glisin tamponu 800 mL steril su |
SDS-PAGE için iş çözümü |
| 10x Tris tamponlu salin (TBS) tamponu | 80 g NaCl 30 g Tris taban 2 g KCl 1 L steril suda |
Stok çözümü |
| Tween 20 (TBST) çözümlü TBS | 100 mL 10x TBS çözeltisi 3 mL Ara 20 900 mL steril su |
İş çözümü |
| 4x protein numune tamponu | 8 g SDS 4 mL β-merkaptoetanol 0.02 g bromofenol mavisi 40 mL gliserol 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) içinde |
Protein ekstraksiyonu için |
| Transfer tamponu | 800 mL Tris-glisin tamponu 200 mL metanol |
Protein transferi için |
Tablo 1: Çalışmada kullanılan tamponlar, çözeltiler ve reaktifler. Tamponların ve çözeltilerin bileşimi, kullanımlarıyla birlikte listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Delici emici böceklerin tükürük bezleri tarafından doğrudan salgılanan tükürük çok önemli bir rol oynar, çünkü konakçı dokuları ve vektörlerin krallıklar arası biyolojik faktörlerini konakçılara önceden sindirir ve detoksifiye eder 1,3,4. Elicitors, efektörler ve küçük RNA dahil olmak üzere krallıklar arası biyolojik faktörler, böcek-konakçı iletişimi için kritik öneme sahiptir14,15,16. Bu nedenle, tükürük bileşenlerinin daha fazla çeşidini ve işlevini ortaya çıkarmak, böcekler ve konakçılar arasındaki ilişkiyi anlamayı teşvik edecektir. Burada, bitki konakçısındaki tükürük proteinleri için bir tespit sistemi sağlanmıştır, bu da bitki konakçılarında tükürük proteininin işlevi hakkında daha fazla araştırma yapılmasını sağlayacaktır.
Bu protokol, yemleme bitkilerini toplayarak delici-emici ağız kısımları ile yaprakçıkların tükürük proteinlerini tespit etmek için teknikler sağlar. En iyi ve güvenilir sonuçları elde etmek için bazı dikkat çekici noktalara dikkat edilmelidir. (1) Enfekte pirinç bitkilerinde viral yükleme kritiktir. Pirinç bitkilerindeki viral titreler, böceklerin edinimini doğrudan etkiler. Böcek kolonisi oldukça virülifer olduğunda, tükürükte viral proteinlerin in vitro olarak toplanma olasılığı artacaktır. Bu nedenle, tükürükten bitki konağına salınan viral proteinlerin tespit edilmesi çok daha kolay olacaktır. Önemli semptomlar gösteren enfekte olmuş bitkilerin seçilmesi, virüslerin kaynağı olarak hizmet etmesi önerilir. (2) Algılama zamanlaması. Tükürük proteinlerinin bir kısmının bitki konakçısında geçici olduğuna inanılmaktadır, çünkü bitki konakçısı tarafından bozunmaya maruz kalırlar veya bitkide seyreltilirler. 2 günlük yemlemeden sonra yem bitkilerinin anında tespiti tavsiye edilir. Ayrıca, bitkideki bazı spesifik tükürük proteinleri için daha uzun bir tutma süresinin daha iyi olacağı varsayılmıştır. Bu nedenle, bazı tükürük proteinlerinin tespit zamanlaması daha ileri çalışmalarda belirlenebilir. (3) Yeterli sayıda kopya olduğundan emin olun. Hayatta kalan böceklerin sayısı azalacaktır, çünkü beslenme kafesindeki sınırlı böcekler sınırlı aktiviteye ve beslenme kabiliyetine sahiptir. Yeterli miktarda replika kullanmak, tükürük proteinlerini zenginleştirmeye yardımcı olacaktır. Üç ila beş kopya tipik olarak yeterlidir. Sadece bir kopya varsa, 15-20 yaprakçıkları bir pirinç fidesiyle beslemek için sınırlamak daha iyi olacaktır.
Bu temsili sonuçlar, virülifer yaprakçıkların beslenme tesisinde viral protein P8'in varlığını göstermiştir. Tükürük akışıyla karışan virüsün tükürük bezlerinden salındığı ortaya çıktı. Daha sonra böcekten bitki konağına salındı ve sonuçta viral yatay iletimi bitirdi. Bununla birlikte, Vg'nin böcek besleme sürecinde elicitor veya efektör rolünü oynayıp oynamadığı ve bitki konağının bağışıklık tepkisini tetikleyip tetiklemediği veya baskılayıp baskılamadığı hala bilinmemektedir. Daha önce, 10.000'den fazla R. dorsalis'in tükürüğü membran besleme yoluyla toplandı ve LC-MS / MS (yayınlanmamış veriler) kullanılarak analiz edildi. Tükürükte Vg'nin varlığı, işlevi bilinmemekle birlikte doğrulanmıştır. Burada, Vg'nin N. cinctiaces'in tükürüğünde de var olduğu ve hatta bitkiye salındığı kanıtlanmıştır. Planthoppers16 üzerine yapılan çalışmalarla birleştirildiğinde, hemipteran tükürükte Vg varlığının evrensel olduğu varsayılmaktadır. Yeni bir bulgu, planthopper tükürüğünün Vg'sinin bitki savunma sistemine zarar veren bir efektör olduğunu bildirmektedir34. Çoğu hemipteran tükürükteki Vg'nin bir efektör olarak işlev görüp görmediğini ele almak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu protokolün, bitkilerde yaprakçıklar tarafından salgılanan tükürük proteinlerinin varlığını incelemek için istikrarlı ve güvenilir bir metodoloji sağladığına inanılmaktadır. Bu protokolün çoğu hemipteranın tükürük proteinlerinin tespiti için uygulanabilir olması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31772124 ve 31972239) ve Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi'nden (Grant KSYLX014) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y.
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant--insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M.
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
