Summary
寄生性線虫 Strongyloides stercoralis および Strongyloides ratti のための機能的ゲノムツールキットには、トランスジェネシス、CRISPR/Cas9媒介突然変異誘発、およびRNAiが含まれる。このプロトコルは、生殖腺内マイクロインジェクションを使用して、導入遺伝子およびCRISPR成分を S. stercoralis および S. rattiに導入する方法を実証する。
Abstract
ストロンギロイデス属は、ストロンギロイデス・ステロイドおよびストロンギロイデス・ラティを含む、異なる宿主範囲を有する皮膚貫通線虫の複数種からなる。S. stercoralisは、約6億1000万人に感染するヒト寄生性の皮膚透過性線虫であり、ラット寄生虫S. rattiはS. stercoralisと密接に関連しており、S. stercoralisの実験室モデルとしてしばしば使用されている。 S. stercoralisとS. rattiの両方は、生殖腺内マイクロインジェクションの外因性核酸送達技術によるトランスジェニックおよびノックアウトの生成に容易に順応性であり、したがって、この技術にまだ順応していない他の寄生性蠕虫のモデルシステムとして浮上している。
寄生性 ストロンギロイデス 成虫は宿主の小腸に生息し、糞便を介して子孫を環境に放出する。環境に入ると、幼虫は糞便に住み、新しい宿主を見つけて侵入しなければならない子孫を産む自由生活の成虫に発達する。この環境生成は ストロンギロイデス 種に特有のものであり、モデルの自由生活線虫 Caenorhabditis elegansに形態が十分に類似しており、 C. elegans のために開発された技術は、性腺内マイクロインジェクションを含むこれらの寄生性線虫での使用に適合させることができる。生殖腺内マイクロインジェクションを用いて、多種多様な導入遺伝子を ストロンギロイデスに導入することができる。CRISPR/Cas9成分をマイクロインジェクションして、変異型 ストロンギロイデス 幼虫を作成することもできる。ここでは、自由生存成人の調製、注射手順、およびトランスジェニック子孫の選択を含む、 ストロンギロイデス への性腺内マイクロインジェクションの技術について説明する。CRISPR/Cas9突然変異誘発を用いて作製されたトランスジェニックスト ロンギロイデス 幼虫の画像が含まれる。この論文の目的は、他の研究者がマイクロインジェクションを使用してトランスジェニックおよび変異型の ストロンギロイデスを作成できるようにすることです。
Introduction
ストロンギロイデス・ステコラリスは、より広く認識されている鉤虫や回虫のアスカリス・ルンブリコイデス1と比較して、重要なヒト病原体として長い間見過ごされてきた。ワームの負担に関する以前の研究では、S.スターコラリス2の一般的な診断方法の感度が低いため、S.スターコラリスの有病率をしばしばひどく過小評価していました。近年、改良された診断ツールに基づく疫学的研究は、S.ステルコラリス感染症の真の有病率は、以前に報告されたよりもはるかに高く、世界中で約6億1000万人と推定されている2。
S. stercoralisと他のストロンギロイデス種(近縁のラット寄生虫および共通ラボモデルS. rattiを含む)は、寄生世代と自由生活(環境)世代の両方からなるため、実験的ゲノム研究に有利な異常なライフサイクルを持っています3(図1)。具体的には、S. stercoralisとS. rattiの両方が単一の自由生活世代を循環させることができます。自由生活世代は、自由生活の成人男性と女性に発達する寄生後の幼虫からなる。自由生活の成虫のすべての子孫は感染性の幼虫に発達し、ライフサイクルを継続するために宿主に感染しなければならない。さらに、この環境世代または自由生活世代は、実験室で実験的に操作することができる。自由生活のストロンギロイデス成虫とC.エレガンス成虫は類似の形態を共有しているため、もともとC.エレガンスのために開発された性腺内マイクロインジェクションなどの技術は、自由生活の成体ストロンギロイデス4,5での使用に適合させることができる。DNAは一般に自由生活の成人女性に導入されるが、ストロンギロイデスの男性と女性の両方にマイクロインジェクションすることができる6。したがって、機能的ゲノムツールは、ストロンギロイデスの生物学の多くの側面を調査するために利用可能である。他の寄生性線虫は自由生活世代を欠いており、その結果、機能的ゲノム技術に容易に順応していない3。
図1:ストロンギロイデス・ステロイドのライフサイクル S.ステルコラリス寄生雌は、哺乳類宿主(ヒト、非ヒト霊長類、イヌ)の小腸に生息する。寄生雌は単為生殖によって繁殖し、小腸内で卵を産む。卵は宿主の内部に留まっている間に孵化し、寄生後幼虫に孵化し、糞便とともに環境に渡される。寄生後の幼虫が雄である場合、それらは自由生活の成人男性に発達する。寄生後幼虫が雌である場合、それらは自由生活の成体雌(間接発達)または第3段階の感染性幼虫(iL3s;直接発達)のいずれかに発達することができる。自由生活の男性と女性は、iL3になるように制約されている子孫を作り出すために性的に繁殖します。特定の条件下では、S. stercoralisはまた、寄生後幼虫の一部が糞便中の環境に入るのではなく宿主腸内に留まる自己感染を受ける可能性がある。これらの幼虫は、宿主内で自己感染性幼虫(L3a)に発達し、腸壁を貫通し、体内を移動し、最終的に腸に戻って生殖成虫になることができる。S. rattiの生活環は、S. rattiがラットに感染し、自己感染サイクルを持たないことを除いて、類似している。環境生成は、遺伝学的研究にストロンギロイデス種を使用するための鍵です。自由生活の成人女性(P0)にはマイクロインジェクションすることができます。それらの子孫は、すべてiL3sになり、潜在的なF1遺伝子導入薬である。この図はカステルレットらから修正されたものである。3. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
S. stercoralisは 、宿主の侵入や宿主の免疫調節を含む他の胃腸ヒト寄生性線虫と生物学の多くの側面を共有しています。例えば、 Necator 属および Ancylostoma 属のヒト寄生性鉤虫も皮膚浸透によって感染し、同様に体内をナビゲートし、そして最終的には小腸に寄生成体として存在する7。したがって、多くの胃腸線虫は、一般的な感覚行動および免疫回避技術を使用する可能性が高い。その結果、 ストロンギロイデス から集められた知識は、他の遺伝的に扱いにくい線虫の発見を補完し、これらの複雑で重要な寄生虫のより完全な理解につながるでしょう。
このマイクロインジェクションプロトコルは、トランスジェニックおよび突然変異体の子孫を作るために 、ストロンギロイデス の自由生活の成人女性にDNAを導入する方法を概説しています。マイクロインジェクションのための成虫の発生時期およびトランスジェニック子孫の収集を含む、株維持要件が記載されている。プロトコルと完全なマイクロインジェクション技術のデモンストレーション、トランスジェニック子孫の培養とスクリーニングのためのプロトコルが、必要なすべての機器と消耗品のリストとともに含まれています。
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Protocol
注:スナネズミはS. ステルコラリスの継代に使用され、ラットは S.ラッティの継代に使用された。すべての手順は、AAALAC規格および実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しているUCLA動物研究監督局(議定書番号2011-060-21A)によって承認されました。以下のタスクは、マイクロインジェクションの少なくとも1日前に完了しなければならない:ワームの培養、マイクロインジェクションパッドの調製、マイクロインジェクションミックス用の構築物の作成、および細菌(大腸菌 HB101)を6cm線虫増殖培地(NGM)プレート上に広げる8。自由生活の女性は、マイクロインジェクションを受ける前に若年成人に発達するために、25°Cで最低24時間の糞便収集を必要とします。マイクロインジェクションパッドは完全に乾燥している必要があります。バクテリアプレートは乾燥して小さな芝生を確立しなければなりません。
1.マイクロインジェクションスライドの調製:注射の少なくとも1日前
注:ワームは、注射用の乾燥寒天パッドを備えたマイクロインジェクションカバースリップに取り付けられています。
- ヒートブロックを90°Cに設定します。
- 5mLのddH2O、次いで100mgのアガロースをホウケイ酸ガラス管に加える。
- チューブ内のアガロースミックスを、アガロースが溶解するまで炎で加熱する。
- 90°Cに設定したヒートブロックにチューブを置き、アガロースを液体状態に維持した。
- 約180μLのアガロース溶液を、ガラス製パスツールピペットまたはプラスチックチップ付きピペットを使用してカバースリップに滴下します。すぐに2枚目のカバースリップを上に落とし、アガロースを薄いパッドに平らにします。
- 5~10秒後、2つをスライドさせてトップカバースリップを外します。寒天パッドがどのスライド上にあるかを確認し、上を向いて置きます。
- 壊れたカバースリップから小さなガラス片を選択し、鉗子を使用してパッドの上端近くの寒天に静かに押し込みます(補足図S1)。
- アガロース溶液でマイクロインジェクションパッドを作り続けます。
- アガロースパッドをベンチまたはオーブンで一晩乾燥させます。カバースリップボックスに保管してください。
注:アガロースパッドは最大2ヶ月間使用できますが、1回の注入実行にのみ使用されます。
2.マイクロインジェクション用のワームを得るための ストロンギロイデス の培養:注射の1〜2日前
注:株維持プロトコルは、スナネズミやラットに線虫を感染させ、感染した動物の糞便から線虫を収穫する方法の詳細な説明を含む 補足資料に記載されています。
- 注射日の2日前に、感染した動物9,10を一晩収集ケージに入れる。
- 翌朝、蔓延した糞便を集め、糞便 - 木炭プレート9,10を作る。
- プレートを25°Cで24時間置いて、自由生活のワームが若年成人に発達できるようにします。
- 注射日の前夜に、感染していない宿主動物を収集ケージに入れる。
- 注射日に、注射後栽培のために蔓延していない糞便を集める。
3.マイクロインジェクションミックスを作る:注射の前または当日
注:マイクロインジェクションミックスは、ワーム緩衝生理食塩水(BU)中で所望の濃度に希釈された目的のプラスミド(50mM Na2HPO4、22mMKH2PO4、70mM NaCl)11からなる。
- プラスミドストックの濃度およびマイクロインジェクションミックス中の所望の濃度を決定する(表1)。
| マイクロインジェクションミックス:レポーターコンストラクト | |||
| コンポーネント | 在庫濃度 | 量 | 最終濃度 |
| pMLC30 GPA-3::gfp | 300 ng/μL | 1.7 μL | 50 ng/μL |
| ティッカー | ナ | 8.3 μL | ナ |
| トータル | 10 μL | 50 ng/μL | |
| マイクロインジェクションミックス:CRISPR/Cas9突然変異誘発 | |||
| コンポーネント | 在庫濃度 | 量 | 最終濃度 |
| pMLC47 tax-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2.7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-tax-4 HDRプラスミド | 400 ng/μL | 2.0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9プラス ミド | 350 ng/μL | 1.1 μL | 40 ng/μL |
| ティッカー | ナ | 4.2 ミリリットル | ナ |
| トータル | 10 μL | 200 ng/μL | |
| マイクロインジェクションミックス:ピギーバック統合 | |||
| コンポーネント | 在庫濃度 | 量 | 最終濃度 |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2.0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402トランスポザーゼプラスミド | 450 ng/μL | 0.9 μL | 40 ng/μL |
| ティッカー | ナ | 7.1 μL | ナ |
| トータル | 10 μL | 100 ng/μL | |
表1:マイクロインジェクションミックスの例3つの例えばマイクロインジェクションのためのプラスミドおよび濃度は、gpa−3::GFPレポーター構築物10のための1つ、Ss−tax−4遺伝子座14,15のCRISPR/Cas9媒介性破壊のための1つ、およびSs−gpa−3::GFP構築物13、17、18のpiggyBac媒介性統合のための1つを混合する。strCas9は、ストロンギロイデスコドン最適化Cas9遺伝子を示す。記載されている最終濃度は、ストロンギロイデスマイクロインジェクションミックスで一般的に使用されます。
- プラスミドをBU中の全量10〜20μLに希釈する。
- 5,000 × g のフィルターカラムを通してミックスを 1 ~ 2 分間回転させます。
- マイクロインジェクションミックスはすぐに使用するか、将来の使用のために-20°Cで保存してください。
4.マイクロインジェクションのためにヤング アダルトストロンギロイデス を集める:注射日の朝
- 若い成人の ストロンギロイデス の糞便チャコールプレート1枚でBaermann装置をセットアップします(図2)。
注:糞便 - 木炭プレートには、いくつかの感染性幼虫が含まれている可能性があります。個人用保護具は、ラボコート、手袋、および目の保護具で構成されています。手袋と白衣の袖の間に皮膚を露出させないでください。
図2:培養物10から寄生虫を採取するために使用したBaermann装置。 糞便 - 木炭プレートの内容物は、温水の柱の上部に配置される。ワームは水に移動し、漏斗の底に集まります。(A)Baermann装置を設置するには、Baermann漏斗用のスタンドをCクランプでベンチにクランプします。漏斗の端に取り付けられたゴムチューブをピンチクランプで閉じ、チューブの下にキャッチバケツを置いて滴り止めます。温水をガラス漏斗に加える。(B)糞便 - 木炭混合物用のプラスチックリングホルダーに、3枚の実験室組織(左)を裏打ちする。木製の棒または舌圧迫器(中央)を使用して、糞便炭プレート(右)の内容物をプラスチックリングホルダーに移します。(C)糞便-木炭ミックス用のプラスチックリングホルダーの底部のクローズアップで、ホルダーの底部にナイロンチュールの二重層を示す。(D)次いで、糞便炭ホルダーをガラス漏斗の上部に置く。(E)実験室組織を水で湿らせ、糞便 - 木炭混合物上で閉じる。より多くの温水が加えられ、主に糞便 - 木炭を沈める。(F) 糞便-木炭培養物を温水に沈めた完全なベアマン・セットアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- Oリングを使用してリングスタンドにゴム製収集チューブ付きのガラスロートを取り付け、クランプで固定します。2つのピンチクランプで収集チューブを閉じます(図2A)。
- 点滴をキャッチするために漏斗の下にキャッチバケツを置きます。
- リムから5cm下の漏斗に暖かい(約40°C)水を加えます。システムが漏れていないことを確認します。
- Baermannホルダーは、2つのプラスチックリングで作られたふるいに並び、2層のナイロンチュールネットがそれらの間に固定され、3つの重なり合ったラボ組織があります。糞便 - 木炭混合物をBaermannホルダーに加える(図2B、C)。
- 糞便 - 木炭混合物を含むBaermannホルダーを漏斗に入れます。糞便 - 木炭ミックスの周りの組織を折り畳み、糞便 - 木炭のほとんどを沈めるのに十分な水を加える。漏斗の縁から2cm以上を充填しないでください(図2D、E)。
- 臭いを封じ込めるために15cmのプラスチック製のペトリ皿の蓋で漏斗の上に。必要に応じて漏斗にラベルを付けます(図2F)。
- Baermann装置からワームを収集するために30分から1時間待つ。
- 漏斗の底にあるゴムチューブの下に50 mLの遠沈管を持ちます。底部のクランプを慎重に開き、ワームを含む30〜40mLの水を50mLチューブに分配する。
- ワームを含む15 mLのベアマン水を15 mL遠沈管に移す。15 mL 遠沈管を ~750 × g (低速) で 1 分間回転させます。あるいは、ワームに重力が10〜15分間沈降するのを許してください。
- 上清を〜2mLまで除去し、上清をヨウ素を含む廃液容器に捨てて、ワームを殺す。
- さらに15mLの収集管にバールマン水を加え、スピンを繰り返す。上清を約 2 mL まで取り出し、ステップ 4.11 のように廃棄します。
- すべてのワームが 15 mL 遠沈管に収集されるまで、手順 4.11 と 4.12 を繰り返します。最後のスピンの後、できるだけ多くの水を取り除きます。
- チューブの底にあるワームのペレット(40〜100μL)を検査する。ワームが見えない場合は、さらに1〜2時間待ってから、Baermann装置からさらにワームを集めてみてください。
- ワームをできるだけ少ない水で 大腸菌 HB101の芝生で6cm2%NGMプレートに移す。このプレートをマイクロインジェクションの ソースプレート として使用します。
- 糞便と木炭の混合物は、希釈ヨウ素(ルゴールのヨウ素を水に50%希釈したもの)で処理し、滴りをキャッチするためにプラスチックフィルムで包み、バイオハザード廃棄物容器に入れて廃棄します。
- 10mLの希釈ヨウ素をキャッチバケツに加え、余分な水をBaermannからその中に排出する。
- 再利用可能なコンポーネント(漏斗、キャッチバケツ、チュール付きプラスチックホルダー、プラスチック蓋、クランプ)を10%漂白剤で洗い流し、十分にすすいでください。
5.マイクロ注射針の引っ張りと装填:注射直前
- ニードルプーラーを用いてガラスキャピラリーチューブを引っ張ってマイクロインジェクション針を調製する。
メモ: 3 mm プラチナ/イリジウムフィラメントを搭載した市販のニードルプーラーの設定例は、ヒート = 810-820、プル = 800-820、マイクロメーター = 2.5 です。 - 解剖顕微鏡で先端を見る。針が所望の形状をしている場合(図3A-F)、4~6本の針(2~3本の毛細管)を引っ張ります。針の形状を正しくするには、必要に応じて設定を変更します。[ヒート] または [プル] の設定を 10 ずつ調整し、テーパーとシャフトの形状がより適切になるまで新しい針を引っ張ります。
図3:マイクロインジェクション針と、マイクロインジェクションに最適な部位が特定されたストロンギロイデス・ステロイド・アダルト・メス。(A-B)マイクロインジェクション用に正しい形状の針のシャフトテーパ(A)および先端(B)。先端はキューティクルを突き刺すほど鋭く、過度の損傷を引き起こさないほど狭い。(C-D)マイクロインジェクション用形状が間違っているマイクロインジェクション針のシャフトテーパ(C)および先端(D)。先端は鈍くて広く、ワームに過度の損傷を与えます。(E-F)針のシャフトテーパ(E)と先端(F)は、マイクロインジェクションに作用するには長すぎて細い可能性があります。F の先端は D の先端と非常によく似ています。しかし、シャフトはより狭く、柔軟性がありすぎてキューティクルを効果的に突き刺すことができません。また、非常に細い針が詰まりやすい。(G) マイクロインジェクションのために正しく配置されたワーム全体の画像で、針が右から入ってくると仮定して。前部は下向きで左側にあります。外陰部は矢印で示されます。生殖腺は女性の右側に沿って見えます。この女性は子宮内に卵子を1つだけ持っています(アスタリスクで示されます)。(H、I)マイクロインジェクション部位の拡大図。矢印の角度は注射針の角度に近似している。外陰部はランドマークとして使用することができます。それは生殖腺の腕からワームの反対側にあります。生殖腺の腕は腸の周りを湾曲し、分裂核の端は外陰部の反対側にあります。(H) 生殖腺の後腕;(i)前腕。一方または両方の腕を注入することができる。H、Iの場合、規約はGと同様である。スケールバー = 50 μm (B, D, F, H, I);100 μm (A, C, E, G).この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 引っ張った針を15cmのプラスチック製のペトリ皿にロールテープで保管し、針を固定し、先端にほこりが蓄積しないようにします。
- 0.7 μL のマイクロインジェクション ミックスをシャフトの開放端に置きます。ロール状のテープを使用して針を棚に垂直に吊り下げ、10分以内にテーパーシャフトをミックスで満たします。最初の針が機能しない場合に備えて、一度に2本の針を準備します。
6. 顕微鏡の準備と針の折れ
注:マイクロインジェクションは、針の動きを制御するためにマイクロインジェクタセットアップを備えた5xおよび40x対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用します。倒立顕微鏡は、振動騒音を低減するために、重いテーブルまたは防振エアテーブルに置く必要があります。マイクロインジェクターニードルホルダーは、マイクロインジェクションミックスを送達するために必要な圧力を加える窒素ガスに接続されています。近くの小さな解剖顕微鏡がワームを移すために使用されます。
- 液体の流れに応じて、ガスタンクの圧力を針を壊す場合は〜40〜60psi、マイクロインジェクションの場合は〜30〜50psiに設定します。
- 解剖顕微鏡で、マイクロインジェクションパッドカバースリップのガラスの破片を、標準的なプラチナワームピックを使用してハロカーボンオイルで覆います。
- マイクロインジェクションパッドカバースリップをマイクロインジェクションスコープに置き、オイルで覆われたガラスの破片を見つけます。針の方向に対してエッジが垂直になるようにガラスの破片を揃えて、針を壊すために使用する表面として機能します。
- 解剖顕微鏡を使用して、針のテーパーシャフトに気泡や破片がないことを確認します。次に、針を1〜1.5cm加圧ホルダーに固定します。
- 針の先端を顕微鏡の視野の中心に目で合わせる。次に、低倍率下で、針の先端をガラスの破片の側面に垂直に、視野内に配置します。
- 高出力に切り替えて、針の先端をガラスの端に合わせます。
メモ: 引っ張ると、針はヒューズを閉じて閉じます。 - 液体の流れを可能にするために針の先端を壊すには、ガスから連続的な圧力をかけながら、ガラス片の側面を静かに叩きます(補足図S1)。液体が流れ始めたら、先端の形状を確認し、流れやすい液体で鋭利であることを確認してください。
メモ:液体の流れが速すぎるか、端が鈍すぎると、マイクロインジェクション中にワームが損傷します(ビデオ1および図3A-F)。 - 液体が針からよく流れたら、マイクロインジェクションスライドを解剖範囲に移動し、1〜2μLのハロカーボンオイルの滴を寒天パッドの上に置き、ワームを配置する。
- 20〜30匹の若年成人 ストロンギロイデス を細菌なしで2%NGMプレートに少なくとも5分間移し、過剰な表面細菌を除去し、マイクロインジェクション用の単一ワームを選択する。注入中に必要に応じてNGMプレートにワームを追加します。
7. ストロンギロイデスのマイクロインジェクション
- ワームピックに少量のハロカーボンオイルを使用して、細菌を含まない2%NGMプレートから生殖腺に1〜4個の卵を持つ ストロンギロイデス の若年成人女性を選択します。
- 寒天パッド上の油の小さな滴にワームを移します。ワームピックを使用して、ワームがコイル状にならず、生殖腺が見えてアクセスしやすいように、ワームを静かに配置します。生殖腺の方向をメモします(図3G)。
- マイクロインジェクション顕微鏡の視野にワームを配置します。生殖腺が針と同じ側にあり、針がわずかな角度で生殖腺に接触するように配置されていることを確認します(図3H、I)。
- 針の先端を同じ焦点面内のワームの側面に持って行きます。ワームの中央付近の生殖腺の腕を目指します。マイクロインジェクターを使用して、針を生殖腺に優しく挿入します(ビデオ2)。
- 直ちに針に圧力をかけ、生殖腺アーム全体をDNA溶液で穏やかに充填する。十分な液体が注入された時期を目で確認します(ビデオ2)。
注:生殖腺を埋めるのに最大2秒かかることがあります。 - 針を外し、傷口が閉じているかどうかを確認します。
注:生殖腺が体壁から突き出ている場合、ワームはあまりにも損傷しているため、子孫を生み出すことはできません(補足ビデオS1)。 - 生殖腺のもう一方の腕が見える場合は、それを繰り返します。
- 注入が終わったら、寒天パッドに針の先端で圧力をかけて針が詰まっていないことを素早く確認する。注入したワームでスライドを解剖顕微鏡に移します。
- 注入されたワームを回復するには、まずワームに数滴のBUを入れて寒天パッドから浮かべます。
- ワームピックに少量のHB101バクテリアを集めます。ワームピックの付着菌でワームに触れて、液体から取り除きます。
- ワームを 回収 プレートに穏やかに移し、HB101芝生を含む2%NGMプレートとする。
注: ワームは数分以内にクロールを開始するはずです。 - 数匹の雌を注射した後、注射されていない雄をソースプレートから加える。
注:5人の女性に対して最低1人の男性が良いベースラインです。過剰な男性が好ましい。 - 実験のために十分な数の女性が注射されるまで、すべてのステップを繰り返します。
- ワームが回復して交尾できるように、注射後少なくとも1時間、成虫を回復プレートに残します。
8. 注射されたストロンギロイデスの回収と培養
- 感染していない宿主動物から一晩糞便を採取し、感染した動物と同じプロトコルを使用します。
- 蔓延していない糞便を少量の木炭と混ぜる(これらのプレートの糞便対木炭比は約2対1)。
- 少量の糞便 - 木炭混合物を湿ったろ紙で裏打ちされた6cmのペトリ皿に注ぐ。ミックスが皿のふたに触れないようにしてください。
- 回収プレートにBUを流し込みます。3 μLに設定したピペットを使用して、ワームを糞便 - 木炭プレートの糞便に移します。ワームを木炭ではなく、糞便に直接置きます。
- 解剖スコープを使用して、成虫が糞便 - 木炭プレート上にあることを確認します。
- ワームを培養するには、プレートを加湿した部屋、 すなわち湿ったペーパータオルが並ぶしっかりとフィットする蓋付きのプラスチック製の箱に入れます。
注:2日後、幼虫期が混在します。5日後、幼虫の大部分はiL3に発達する。いくつかの若い幼虫が残るでしょう。7日後、すべての幼虫はiL3であるはずです。
9. トランスジェニック/ノックアウトを回収するための F1 幼虫の収集とスクリーニング
- Baermannセットアップを使用して、注入後の小規模糞便 - 木炭培養プレートから幼虫を採取する。できるだけ多くの幼虫を得るには、Baermann装置からワームを回復する前に少なくとも2時間待ってください。
- ステップ4.10〜4.14のように幼虫を15mL遠沈管に濃縮し、幼虫をBUで小さな時計皿に移す。
- 幼虫を行動実験に使用する場合は、HB101の厚い芝生を含む2%NGMプレートをスクリーニングに使用してください。
- 20〜30匹の幼虫をHB101芝生に移す。
注:細菌は幼虫の動きを遅らせます。 - 蛍光解剖顕微鏡下で、目的の導入遺伝子を発現する幼虫を同定する。ワームピックを使用してトランスジェニック幼虫を選択し、BU付きの小さな時計皿に移動します。
- 新しいHB101プレートを使用して、幼虫の別の小さなバッチをスクリーニングします。実験用に十分な幼虫が収集されたら、HB101プレートと余分なワームを希釈ヨウ素(水で希釈したルゴールのヨウ素の50%)で処理し、バイオハザード廃棄物として廃棄します。あるいは、アルキルベンジルアンモニウムクロリドを含む濃縮犬小屋クリーナーを使用して余分なワームを殺す。
- ワームをすぐに使用するか、一晩中少量のBUで浅い時計皿に入れたままにします。
注:液体が深すぎると、ワームが低酸素になることがあります。幼虫を一晩BUに残すことは、特定の行動に影響を与える可能性があります。したがって、6時間以内に行動実験に幼虫を使用してください。
- 20〜30匹の幼虫をHB101芝生に移す。
- 幼虫が行動アッセイではなく顕微鏡検査に使用される場合は、スクリーニングのためにニコチン麻痺によって可逆的にワームを固定化する。
- カミソリの刃を使用して、10cmの走化性プレート12 のプラスチック底部にグリッドをスコアリングして、プレート上のワームの位置を追跡しやすくする。
- BU中の約3μLの幼虫をグリッド上の正方形に落とす。必要な数の正方形を塗りつぶします。幼虫がプレートの側面に這う可能性があるため、プレートの端の近くのものを使用しないでください。
- 15〜20μLの水中の1%ニコチンをワーム滴に加える。
注:4分後、ワームは麻痺します。 - 蛍光解剖顕微鏡を用いてワームをスクリーニングする。
- ワームピックを使用して、トランスジェニック幼虫を1〜2mLのBUを含む小さな時計皿に移します。
注:幼虫は数時間麻痺し、顕微鏡観察のために顕微鏡スライドに簡単に取り付けることができます。BUに一晩放置すると、iL3sは回復し、いくつかのアッセイまたは哺乳動物宿主感染に使用することができる。しかし、ニコチン麻痺およびBUでの一晩のインキュベーションは、特定の行動に影響を与える可能性がある。
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Representative Results
実験が成功した場合、F1幼虫は目的の導入遺伝子および/または変異表現型を発現する(図4)。しかし、形質転換率は非常に変動し、構築物、ワームの健康状態、注射後の培養条件、および実験者のスキルに依存する。一般に、実験が成功すると、注射された雌あたり>15F1幼虫が得られ、蛍光マーカーの形質転換率は>3%となる。生きている子孫の総数が平均して10匹未満の幼虫/雌である場合、構築物は有毒であり、形質転換された幼虫は生存していない可能性がある。蛍光幼虫ではなく蛍光卵を多数見つけることは、注入混合物が有毒である可能性があるという別の指標である。この手法を初めて学ぶときは、体壁筋13の堅牢な表現を駆動するact-2::mRFPmarsなど、よく表現するコンストラクトを使用することをお勧めします(図4)。
CRISPR/Cas9媒介標的突然変異誘発によって変異体を生成する場合、蛍光9、14、15に基づいて潜在的な変異体を同定できるように、act-2::mRFPmarsまたはact-2::GFP導入遺伝子13を含む修復テンプレートの使用が推奨される。ストロンギロイデスは染色体外アレイから導入遺伝子を発現するため、蛍光F1子孫はアレイ単独からmRFPmarsまたはGFPを発現するか、アレイおよび組込み導入遺伝子の両方からmRFPmarsまたはGFPを発現し得ることに注意することが重要です3,9,16。蛍光発現のパターンに基づいて導入遺伝子が組み込まれている可能性が高い幼虫を同定することが可能である:導入遺伝子がゲノムに組み込まれていない場合、体壁筋における「斑点状」発現(図4A)はより一般的であるが、体壁筋全体で一貫した発現(図4B)。)は、しばしば、常にではないが、導入遺伝子がゲノムに組み込まれたことを示す。しかし、発現パターンだけでは変異体を決定的に同定することはできない - 体壁の筋肉全体で一貫した発現を有するいくつかのワームは、統合事象を有しない可能性がある。さらに、発現パターンは、ホモ接合型である変異体とヘテロ接合型またはモザイク型の変異体とを区別することができない。したがって、各ワームはPCR遺伝子型9、14、15でなければなりません。容易に目に見える表現型をもたらす遺伝子を破壊する場合、修復テンプレートを使用する必要はないかもしれない。例えば、ストロンギロイデスunc-22遺伝子の破壊は、優勢な「ツイッチャー」表現型をもたらし、ヘテロ接合型またはホモ接合型破壊の割合は10%9を超える。
図4:トランスジェニックストロンギロイデス・ステラリス幼虫(A,B)体壁筋13において発現するact-2::mRFPmarsトランスジーンを発現するS.ステルコラリス幼虫。導入遺伝子は、Ss-unc-22遺伝子座9のCRISPR/Cas9媒介性破壊のための修復テンプレートに組み込まれた。(A)染色体外配列からの発現を示す可能性のある、不完全な、または「斑点のある」act-2::mRFPmars発現パターンを有するS. stercoralis幼虫。(B)より完全なact-2::mRFPmars発現パターンを発現するS.ステルコラリスiL3であって、修復テンプレートの遺伝子破壊および統合を示し得る。A、Bの場合、パネルには微分干渉コントラスト(左)、蛍光(中央)、およびマージ(右)画像が表示されます。スケールバー = 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:使用可能な針を作るための針切れプロセスのデモンストレーション。 針の先端をガラスの破片(左端の物体)の端に叩きつけます。液体が出てくると、針は引き戻され、寒天の上に下に移動します。針先が鋭利なところまで来ており、液体は適度に速く流れます。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:成功した注射のデモンストレーション。 生殖腺の後腕は、右側に明るい灰色の構造として見える。針の先端と生殖腺は同じ焦点面にある必要があります。針がワームの上または下、または体に沿って引っ掛かることなくスライドする場合は、位置を調整します。針の先端が体壁をわずかにくぼませます。マイクロマニピュレーターに取り付けられたニードルホルダーを軽くタップすると、先端が体壁を通って生殖腺に静かに押し込まれます。針が生殖腺の内側に入ったら、圧力をかけ、DNA溶液を注入する。液体は目に見えて生殖腺を溢れさせるはずです。針の先端が取り除かれたときに傷が閉じると、ワームは生き残る可能性があります。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足材料: ストロンギロイデス 株メンテナンス。 このプロトコルは、スナネズミのS. ステルコラリス とラットの S.ラッティ の維持手順を概説しています。これには、各線虫および宿主に使用される感染用量が含まれる。宿主は麻酔下で皮下注射を介して感染する。開存性からピーク幼虫出力への感染の進行から開存性の喪失までを、線虫と宿主の組み合わせごとに説明している。蔓延した糞便を収集し、糞便 - 木炭栽培プレートを作るために使用されるプロトコルも記載されている。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:マイクロインジェクション針を壊すための小さなガラスの破片を備えたカバースリップ上の乾燥寒天パッドからなるマイクロインジェクションスライドの画像。 寒天の輪郭とシャードの輪郭は、わかりやすくするためにここに追加されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービーS1:損傷した生殖腺をもたらす注射のデモンストレーション。 生殖腺の前腕に焦点が合っている。わずかな圧力をかけると、針の中の溶液がまだ自由に流出していることがわかります。針の先端は生殖腺と同じ焦点面にあり、わずかな角度を向いています。針の先端が挿入されると、溶液がワームに注入され、生殖腺が満たされる。しかし、針が取り除かれると、生殖腺の断片がキューティクルの創傷を通って突出する。物質は目に見えて流出しています。このワームは生き残る可能性は低いです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このマイクロインジェクションプロトコルは、トランスジェネシスおよびCRISPR/Cas9媒介突然変異誘発のための構築物を S. stercoralis および S. ratti に導入するための方法を詳述する。S. stercoralis と S. rattiの両方について、注射後の生存率およびトランスジェネシスまたは突然変異誘発の速度は、微調整可能ないくつかの変数の影響を受けます。
トランスジェネシスを成功させるための最初の重要な考慮事項は、プラスミド導入遺伝子がどのように構築されるかです。以前の研究では、ストロンギロイデスにおける外因性導入遺伝子の発現には、ストロンギロイデス5'プロモーターおよび3'UTRエレメント3、13、19の使用が必要であることが分かっている。C. elegans構築物と同様に、ストロンギロイデス構築物は、一般に、遺伝子特異的プロモーターおよびSs-era-1遺伝子13からのもののような共通の3' UTRを使用する。コード領域のコドン最適化もまた、ストロンギロイデスにおける発現にとって重要であり得る。最近、ストロンギロイデスや他の線虫のコード配列をコドン最適化するウェブベースのアプリであるWild Worm Codon Adaptorが開発されました20。最後に、ストロンギロイデスでは厳密に試験されていないが、イントロンはC. elegans21および昆虫関連線虫Pristionchus pacificus22の両方で外因性導入遺伝子の発現を増加させることが示されており、ストロンギロイデスにおいても発現を増加させると推定されている。ワイルドワームコドンアダプターは、改変配列20に最大3つのイントロンを含めるためのオプションを有する。
マイクロインジェクションミックスの組成および送達は、F1 子孫のトランスジェネシス速度および生存に影響を及ぼす。BU生理食塩水は、混合物の希釈剤として日常的に使用されているが、ddH2Oを使用することもオプションである。混合物中の成分の濃度および/または比率は、形質転換速度を改善するために調整することができる。目的のプラスミドの濃度が高いほど、トランスジェネシスの速度を上げることができますが、多くの場合、総子孫が少なくなります。導入遺伝子の発現が観察されない場合、または死んだトランスジェニック卵のみが見つかった場合、導入遺伝子が毒性であるか、プラスミドストック内の何かがトランスジェニックの死を引き起こしている可能性がある。後者の場合、異なる方法(例えば、異なるミニプレップキットを使用)を使用して新しいプラスミドストックを作製するだけで、トランスジェニックスを得るのに十分であり得る。マイクロインジェクションミックスにリポフェクタミンを添加することもまた、トランスジェネシス23の速度を改善し得る。
ミックスを送達するマイクロインジェクション針の形状も、生存率およびトランスジェネシス率に影響します(図3A-F、ビデオ1、ビデオ2、および補足ビデオS1)。 針はキューティクルを貫通するのに十分なほど鋭く、過度の損傷をもたらさないように十分に狭くなければなりません。1日以上保存した針は破片を蓄積し、マイクロインジェクション中に詰まる可能性があるため、使用直前に針を引くことをお勧めします。注入された雌を損傷することなくマイクロインジェクションパッドから回収することは、いくつかの異なる方法で達成することができる。1つのテクニックは、BUのドロップで注入パッドからワームを浮かべ、ワームピックでHB101を使用してワームを収集することです。回復のための他の技術には、ワームをBUに浮かべ、ピペットチップまたは小さなペイントブラシを使用してそれらを収集すること、または単にワームピックのみを使用してワームを回収プレートに移動することが含まれる。
マイクロインジェクションされた雌から子孫が得られなかった場合、これは、注射された雌がマイクロインジェクションプロセスで損傷を受けたか、または注射後の培養条件が最適ではなかったことを示唆している。試すことができる多くの異なる注射後培養条件がある。上記の小規模の糞便 - 木炭培養は、一般にHB101を用いたNGMプレートよりも良好なワーム生存を支持する。しかし、注入されたワームの生存および糞便 - 木炭プレート上のF1 幼虫の発生を追跡することは困難であり、卵はこれらのプレート上には見えない。糞便木炭プレートの代わりにHB101でNGMプレート上でワームを培養することの利点は、産卵および幼虫の発生を注意深く観察できることであり、これはトラブルシューティングに役立つ可能性がある。HB101を搭載したV12プレートは、生存率24を高めるためにも使用できます。最後に、単一のラット糞便ペレットを有する走化性プレート12 を 、S.ラッティ 注射後培養に使用することができる。雄および注射された雌は、ラット糞便ペレットに直接移される。5〜7日目に、上記のように、Baermann装置を用いて寒天および糞便からワームを収集する。
マイクロインジェクション用のストロンギロイデス成虫を得るためには、新しく調製した糞便 - 木炭プレートを25°Cで24時間または20°Cで48時間インキュベートすることができる。しかし、女性が若すぎると、マイクロインジェクションプロセスを生き残れない可能性があります。20°Cで約48時間インキュベートされた糞便 - 木炭プレートから収集された成虫は、マイクロインジェクションプロセスを許容する可能性がより高い。しかし、これらの成虫は25°Cで24時間インキュベーションから得られた成虫よりも年上であるため、フェクンドほどではなく、形質転換率が低い可能性がある。初心者は、高齢者から始めて、スキルが向上するにつれてわずかに若い成人に切り替えることを好むかもしれません。
C. elegansと同様に、ストロンギロイデス種は、F1世代において染色体外アレイおよびゲノム統合構築物から導入遺伝子を発現することができる。C. elegansとは異なり、ストロンギロイデス種は、染色体外アレイがPCR13によって依然として検出可能であるにもかかわらず、F2およびそれ以降の世代においてのみゲノム組み込み導入遺伝子を発現する。染色体外アレイを発現するF1トランスジェニック幼虫は、ゲノム組み込みまたは多数のトランスジェニックワームを必要としない実験に使用することができる。ゲノム統合は、内因性遺伝子にタグを付けたり、集団ベースのアッセイで多数のワームをテストしたりする必要がある実験に必要になることがあります。ストロンギロイデスにおける導入遺伝子のゲノム組み込みには、piggyBacトランスポゾン媒介性組込み17およびCRISPR/Cas9媒介性組込み9の2つの方法がある。piggyBacトランスポゾン媒介性組み込みは、piggyBacトランスポザーゼを使用して、ゲノム26中のTTAA部位への貨物を標的とする。TTAAモチーフはストロンギロイデス種のATリッチゲノムにおいて非常に一般的であるため、組み込みはしばしばゲノム中の複数の部位にある。対照的に、CRISPR/Cas9媒介性組込みは、導入遺伝子を特定の標的遺伝子座9に組み込むために使用することができる。
CRISPR/Cas9システムは、標的遺伝子ノックアウト9,27を生成するためにも使用することができる。ストロンギロイデスゲノムのATの豊富さのために、線虫28に最適な5'−N18 GGNGG−3'配列を含む使用可能なCas9標的部位を見つけることは課題である。多くの場合、標的とする遺伝子には1つまたは2つの部位しかありません。好ましい方法は、相同性指向性修復による蛍光マーカーを有する導入遺伝子を含む修復テンプレートをゲノム遺伝子座に組み込んで、遺伝子の完全な破壊をもたらすことを含む。潜在的なノックアウトは、導入遺伝子9、14、15、29の発現によって同定することができる。しかしながら、導入遺伝子発現のみでは、アレイからの発現と組込み導入遺伝子との差異がしばしば区別できないため、遺伝子型の指標とはならない。したがって、F1トランスジェニック幼虫は、ホモ接合型ノックアウト9を同定するためにポストホックジェノタイピングを必要とする。修復テンプレートがない場合、標的遺伝子座の突然変異誘発は高頻度で起こるが、大きな欠失をもたらし得る9。
トランスジェニックまたは変異型F1幼虫の生成はS. stercoralisでは比較的容易であるが、宿主継代の必要性のために安定株を生成することは極めて困難である。実験室では、モンゴルのスナネズミはS. stercoralisの許容宿主であるが、ライン30を確立するのに十分なF2幼虫を産生することができる感染を確立するために高用量のワームを必要とする。感染性幼虫の約6%のみが寄生雌になる30。さらに、トランスジェニック幼虫がゲノム統合なしに配列発現を有する場合、それらは第2のスナネズミ宿主に感染するのに必要な導入遺伝子発現子孫を産生しないであろう。十分な数のゲノム組み付け幼虫が生殖寄生成虫になる可能性を高めるために、初期接種物に最低400〜500匹のトランスジェニック幼虫が推奨される。スナネズミをプレドニゾン30で処理することによって特許感染を確立するために必要な幼虫の数を減らすことができるかもしれない。それにもかかわらず、S. stercoralisの安定した系統を首尾よく確立するために、十分に統合されたトランスジェニックまたは変異型ワームを蓄積することは困難である可能性が高い。しかしながら、通常、単一虫アッセイ14、15のために十分な数のトランスジェニックS.ステルコラリスF1幼虫を蓄積することが実行可能である。
ストロンギロイデス・ラッティは、安定なトランスジェニックまたはノックアウトライン17、31を生成するというより大きな実現可能性という明確な利点を有する。S. ratti 自由生活の成人女性は、S. stercoralis free living adult femalesよりもマイクロインジェクションプロセスに耐性が低い。S. ratti 雌は一般に S. stercoralis 雌よりも幼虫全体の生産量が少なく、形質転換率も低い31.しかしながら、少数のトランスジェニックまたはノックアウトF1幼虫のみが、S. rattiの安定した系統を確立するために必要とされる。S.ラッティはラットの天然寄生虫であるため、少数のS.ラッティ感染性幼虫のみが特許感染を確立するのに十分である32。したがって、一般に、安定な系統を確立するのに十分な数のトランスジェニックまたは変異幼虫を蓄積することができる。ストロンギロイデス種はF1世代を過ぎても染色体外アレイを発現しないので、ゲノム組み換えF1幼虫のみが安定なトランスジェニックライン13を産生することができる。ジェノタイピングの前に導入遺伝子が組み込まれたワームを特定することは一般に不可能であるため、プロトコルはすべてのトランスジェニックF1幼虫を収集し、ラットに注射することです。これらの幼虫のごく一部は、所望の統合事象を有するであろう。これらの幼虫は安定した系統の基礎を形成する。piggyBac法は、個々のワームにおいて複数の組み込み事象をもたらすことが多いので、導入遺伝子のほぼ100%の伝達は、ラットを通るトランスジェニック幼虫の継代数回のラウンドの後に達成され得る17。
要約すると、ここで説明する技術は、トランスジェニックまたはノックアウトS.スターコラリスおよびS.ラッティを生成するために使用することができる。これにより、導入遺伝子の細胞特異的発現、変異体の生成、および空間的および時間的機能を決定するためのタンパク質の内因性タグ付けを含むがこれらに限定されない、幅広い潜在的な実験が可能になる14、15、29、33、34、35。長期的には、トランスジェニックストロンギロイデスの使用から得られた知識は、S.スターコラリスおよび他の腸内寄生性線虫によるヒト感染と戦うための新しい戦略を開発するために使用することができる。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
pPV540とpPV402は、ペンシルベニア大学のジェームズ・ロック博士からの親切な贈り物でした。原稿に関する有益なコメントをくれたAstra Bryantに感謝します。この研究は、バローズ・ウェルカム基金の研究者から、疾患の病因賞、ハワード・ヒューズ医学研究所教員奨学生賞、国立衛生研究所R01 DC017959(E.A.H.)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
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