Summary
Das funktionelle genomische Toolkit für die parasitären Nematoden Strongyloides stercoralis und Strongyloides ratti umfasst Transgenese, CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese und RNAi. Dieses Protokoll wird zeigen, wie intragonadale Mikroinjektion verwendet werden kann, um Transgene und CRISPR-Komponenten in S. stercoralis und S. ratti einzuführen.
Abstract
Die Gattung Strongyloides besteht aus mehreren Arten von hautdurchdringenden Nematoden mit unterschiedlichen Wirtsbereichen, darunter Strongyloides stercoralis und Strongyloides ratti. S. stercoralis ist ein menschlich-parasitärer, hautdurchdringender Nematod, der etwa 610 Millionen Menschen infiziert, während der Rattenparasit S. ratti eng mit S. stercoralis verwandt ist und oft als Labormodell für S. stercoralis verwendet wird. Sowohl S. stercoralis als auch S. ratti sind leicht für die Erzeugung von Transgenen und Knockouts durch die exogene Nukleinsäure-Abgabetechnik der intragonadalen Mikroinjektion zugänglich und haben sich als solche als Modellsysteme für andere parasitäre Helminthen herausgestellt, die dieser Technik noch nicht zugänglich sind.
Parasitäre Strongyloides-Erwachsene bewohnen den Dünndarm ihres Wirtes und setzen Nachkommen über den Kot in die Umwelt frei. Einmal in der Umwelt, entwickeln sich die Larven zu frei lebenden Erwachsenen, die im Kot leben und Nachkommen produzieren, die einen neuen Wirt finden und eindringen müssen. Diese Umweltgeneration ist einzigartig für die Strongyloides-Arten und ähnelt in der Morphologie so sehr der modellhaft freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans, dass Techniken, die für C. elegans entwickelt wurden, für die Verwendung mit diesen parasitären Nematoden, einschließlich intragonadaler Mikroinjektion, angepasst werden können. Mit Hilfe der intragonadalen Mikroinjektion kann eine Vielzahl von Transgenen in Strongyloides eingeführt werden. CRISPR/Cas9-Komponenten können auch mikroinjiziert werden, um mutierte Strongyloides-Larven zu erzeugen. Hier wird die Technik der intragonadalen Mikroinjektion in Strongyloide , einschließlich der Vorbereitung freilebender Erwachsener, des Injektionsverfahrens und der Selektion transgener Nachkommen, beschrieben. Bilder von transgenen Strongyloides-Larven , die mit CRISPR/Cas9-Mutagenese erstellt wurden, sind enthalten. Ziel dieser Arbeit ist es, anderen Forschern die Möglichkeit zu geben, mit Hilfe der Mikroinjektion transgene und mutierte Strongyloide herzustellen.
Introduction
Strongyloides stercoralis wurde lange Zeit als wichtiger menschlicher Krankheitserreger im Vergleich zu den weiter verbreiteten Hakenwürmern und dem Spulwurm Ascaris lumbricoides1 übersehen. Frühere Studien zur Wurmbelastung unterschätzten die Prävalenz von S. stercoralis aufgrund der geringen Sensitivität gängiger Diagnosemethoden für S. stercoralisoft stark 2. In den letzten Jahren haben epidemiologische Studien, die auf verbesserten diagnostischen Instrumenten basieren, geschätzt, dass die tatsächliche Prävalenz von S. stercoralis-Infektionen viel höher ist als zuvor berichtet, etwa 610 Millionen Menschen weltweit2.
Sowohl S. stercoralis als auch andere Strongyloides-Arten, einschließlich des eng verwandten Rattenparasiten und des gemeinsamen Labormodells S. ratti, haben einen ungewöhnlichen Lebenszyklus, der für experimentelle genomische Studien von Vorteil ist, da er sowohl aus parasitären als auch aus freilebenden (Umwelt-) Generationen 3 besteht (Abbildung 1). Insbesondere können sowohl S. stercoralis als auch S. ratti durch eine einzige frei lebende Generation durchlaufen. Die freilebende Generation besteht aus postparasitären Larven, die sich zu frei lebenden erwachsenen Männchen und Weibchen entwickeln; Alle Nachkommen der frei lebenden Erwachsenen entwickeln sich zu infektiösen Larven, die einen Wirt infizieren müssen, um den Lebenszyklus fortzusetzen. Darüber hinaus kann diese ökologische oder frei lebende Generation im Labor experimentell manipuliert werden. Da freilebende Strongyloides-Erwachsene und C. elegans-Erwachsene eine ähnliche Morphologie aufweisen, können Techniken wie die intragonadale Mikroinjektion, die ursprünglich für C. elegans entwickelt wurden, für die Verwendung mit freilebenden erwachsenen Strongyloides 4,5 angepasst werden. Während DNA im Allgemeinen in frei lebende erwachsene Weibchen eingeführt wird, können sowohl Männer als auch Frauen von Strongyloides mikroinjiziert werden6. Somit stehen funktionelle genomische Werkzeuge zur Verfügung, um viele Aspekte der Biologie von Strongyloides zu untersuchen. Anderen parasitären Nematoden fehlt eine frei lebende Generation und sie sind daher nicht so leicht für funktionelle genomische Technikengeeignet 3.
Abbildung 1: Der Lebenszyklus von Strongyloides stercoralis. Die parasitären Weibchen von S. stercoralis bewohnen den Dünndarm ihrer Säugetierwirte (Menschen, nichtmenschliche Primaten, Hunde). Die parasitären Weibchen vermehren sich durch Parthenogenese und legen Eier in den Dünndarm. Die Eier schlüpfen, während sie sich noch im Inneren des Wirts befinden, zu postparasitären Larven, die dann mit Kot in die Umwelt gelangen. Wenn die postparasitären Larven männlich sind, entwickeln sie sich zu frei lebenden erwachsenen Männchen. Wenn die postparasitären Larven weiblich sind, können sie sich entweder zu frei lebenden erwachsenen Weibchen (indirekte Entwicklung) oder zu infektiösen Larven im dritten Stadium (iL3s; direkte Entwicklung) entwickeln. Die frei lebenden Männchen und Weibchen vermehren sich sexuell, um Nachkommen zu schaffen, die gezwungen sind, iL3s zu werden. Unter bestimmten Bedingungen kann S. stercoralis auch einer Autoinfektion unterzogen werden, bei der einige der postparasitären Larven im Darm des Wirts verbleiben, anstatt im Kot in die Umwelt überzugehen. Diese Larven können sich im Inneren des Wirts zu autoinfektiösen Larven (L3a) entwickeln, durch die Darmwand eindringen, durch den Körper wandern und schließlich in den Darm zurückkehren, um reproduktive Erwachsene zu werden. Der Lebenszyklus von S. ratti ist ähnlich, außer dass S. ratti Ratten infiziert und keinen autoinfektiösen Zyklus hat. Die Umweltgenerierung ist der Schlüssel zur Verwendung von Strongyloides-Arten für genetische Studien. Die frei lebenden erwachsenen Weibchen (P0) können mikroinjiziert werden; ihre Nachkommen, die alle zu iL3s werden, sind die potenziellen F 1-Transgenen. Diese Figur wurde von Castelletto et al. modifiziert. 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
S. stercoralis teilt viele Aspekte seiner Biologie mit anderen gastrointestinalen menschlich-parasitären Nematoden, einschließlich Wirtsinvasion und Wirtsimmunmodulation. Zum Beispiel infizieren sich auch humanparasitäre Hakenwürmer der Gattungen Necator und Ancylostoma durch Hautpenetration, navigieren ähnlich durch den Körper und leben schließlich als parasitäre Erwachsene imDünndarm 7. Daher verwenden viele gastrointestinale Nematoden wahrscheinlich gängige sensorische Verhaltensweisen und Immunevasionstechniken. Infolgedessen wird das aus Strongyloides gewonnene Wissen die Ergebnisse anderer weniger genetisch beherrschbarer Nematoden ergänzen und zu einem vollständigeren Verständnis dieser komplexen und wichtigen Parasiten führen.
Dieses Mikroinjektionsprotokoll beschreibt die Methode zur Einführung von DNA in Strongyloides freilebende erwachsene Frauen, um transgene und mutierte Nachkommen herzustellen. Die Anforderungen an die Aufrechterhaltung des Stammes, einschließlich des Entwicklungszeitpunkts von erwachsenen Würmern für Mikroinjektionen und der Sammlung transgener Nachkommen, werden beschrieben. Protokolle und eine Demonstration der vollständigen Mikroinjektionstechnik sowie Protokolle für die Kultivierung und das Screening transgener Nachkommen sind enthalten, zusammen mit einer Liste aller notwendigen Geräte und Verbrauchsmaterialien.
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Protocol
HINWEIS: Rennmäuse wurden an die Passage S. stercoralis und die Ratten an die Passage S. ratti gewöhnt. Alle Verfahren wurden vom UCLA Office of Animal Research Oversight (Protokoll Nr. 2011-060-21A) genehmigt, das sich an die AAALAC-Standards und den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren hält. Die folgenden Aufgaben müssen mindestens einen Tag vor der Mikroinjektion abgeschlossen werden: Wurmkultivierung, Vorbereitung von Mikroinjektionspads, Erstellen von Konstrukten für die Mikroinjektionsmischung und Ausbringen von Bakterien (E. coli HB101) auf 6 cm Nematodenwachstumsmedien (NGM) -Platten8. Die freilebenden Weibchen benötigen mindestens 24 Stunden nach der Kotsammlung bei 25 ° C, um sich zu jungen Erwachsenen zu entwickeln, bevor sie mikroinjiziert werden können. Mikroinjektionspads müssen vollständig trocken sein. Bakterienplatten müssen trocknen und einen kleinen Rasen bilden.
1. Vorbereitung von Mikroinjektionsobjektträgern: mindestens einen Tag vor der Injektion
HINWEIS: Würmer werden auf Mikroinjektions-Deckgläsern mit trockenen Agar-Pads zur Injektion montiert.
- Stellen Sie einen Heizblock auf 90 °C ein.
- Fügen Sie 5 ml ddH2O, dann 100 mg Agarose zu einem Borosilikatglasröhrchen hinzu.
- Erhitzen Sie die Agarosemischung in der Tube über einer Flamme, bis sich die Agarose aufgelöst hat.
- Legen Sie das Rohr in einen auf 90 °C eingestellten Wärmeblock, um die Agarose im flüssigen Zustand zu halten.
- Tropfen Sie ~ 180 μL der Agaroselösung auf ein Deckglas mit einer Pasteur-Pipette aus Glas oder einer Pipette mit einer Kunststoffspitze. Sofort ein zweites Deckglas darauf fallen lassen, um die Agarose zu einem dünnen Pad zu glätten.
- Entfernen Sie nach 5-10 s das obere Deckglas, indem Sie die beiden auseinanderschieben. Bestimmen Sie, auf welchem Dia sich das Agar-Pad befindet, und legen Sie es mit der Vorderseite nach oben.
- Wählen Sie ein winziges Stück Glasscherbe aus einem zerbrochenen Deckglas und drücken Sie es vorsichtig mit einer Pinzette in das Agar in der Nähe der Oberkante des Pads (Ergänzende Abbildung S1).
- Machen Sie weiterhin Mikroinjektionspads mit der Agaroselösung.
- Trocknen Sie die Agarosepads über Nacht auf der Bank oder in einem Ofen. In der Deckglasbox aufbewahren.
HINWEIS: Die Agarose-Pads können bis zu 2 Monate verwendet werden, werden jedoch nur für einen Injektionslauf verwendet.
2. Kultivierung von Strongyloiden , um Würmer für die Mikroinjektion zu erhalten: 1 - 2 Tage vor der Injektion
HINWEIS: Ein Stammwartungsprotokoll finden Sie im Ergänzungsmaterial, das eine detaillierte Beschreibung enthält, wie man Rennmäuse und Ratten mit Nematoden infiziert und Nematoden aus dem Kot infizierter Tiere erntet.
- Zwei Tage vor dem Injektionstag legen Sie die infizierten Tiere 9,10 über Nacht in Sammelkäfige.
- Am nächsten Morgen sammeln Sie befallenen Kot und machen Fäkalien-Holzkohleplatten 9,10.
- Legen Sie einen Teller bei 25 °C für 24 Stunden, damit sich die freilebenden Würmer zu jungen Erwachsenen entwickeln können.
- Legen Sie in der Nacht vor dem Injektionstag nicht infizierte Wirtstiere in Sammelkäfige.
- Sammeln Sie am Injektionstag unbefallenen Kot für die Kultivierung nach der Injektion.
3. Herstellung der Mikroinjektionsmischung: vor oder am Tag der Injektion
HINWEIS: Die Mikroinjektionsmischung besteht aus den interessierenden Plasmiden, die in wurmgepufferter Kochsalzlösung (BU) (50 mM Na 2 HPO 4, 22mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11 auf die gewünschte Konzentration verdünnt sind.
- Bestimmung der Konzentration der Plasmidbestände und der gewünschten Konzentration in der Mikroinjektionsmischung (Tabelle 1).
| Mikroinjektions-Mix: Reporter-Konstrukt | |||
| Bestandteil | Lagerkonzentration | Menge | Endkonzentration |
| pMLC30 gpa-3::gfp | 300 ng/μL | 1,7 μL | 50 ng/μL |
| Bu | Na | 8,3 μL | Na |
| gesamt | 10 μL | 50 ng/μL | |
| Mikroinjektionsmischung: CRISPR / Cas9-Mutagenese | |||
| Bestandteil | Lagerkonzentration | Menge | Endkonzentration |
| pMLC47 tax-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2,7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-tax-4 HDR-Plasmid | 400 ng/μL | 2,0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9 Plasmid | 350 ng/μL | 1,1 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 4,2 μL | Na |
| gesamt | 10 μL | 200 ng/μL | |
| Mikroinjektionsmischung: Huckepack-Integration | |||
| Bestandteil | Lagerkonzentration | Menge | Endkonzentration |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2,0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402 Transposase-Plasmid | 450 ng/μL | 0,9 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 7,1 μL | Na |
| gesamt | 10 μL | 100 ng/μL | |
Tabelle 1: Beispiele für Mikroinjektionsmischungen Die Plasmide und Konzentrationen für drei Beispiel-Mikroinjektionsmischungen: eine für ein gpa-3::GFP-Reporterkonstrukt 10, eine für CRISPR/Cas9-vermittelte Störung des Ss-tax-4-Locus 14,15 und eine für die piggyBac-vermittelte Integration eines Ss-gpa-3::GFP-Konstrukts 13,17,18. strCas9 bezeichnet das Strongyloides-Codon-optimierte Cas9-Gen. Die aufgeführten Endkonzentrationen werden üblicherweise in Strongyloides-Mikroinjektionsmischungen verwendet.
- Verdünnen Sie die Plasmide in BU auf ein Gesamtvolumen von 10-20 μL.
- Drehen Sie die Mischung durch eine Filtersäule bei 5.000 × g für 1-2 min.
- Verwenden Sie die Mikroinjektionsmischung sofort oder lagern Sie sie bei -20 °C für die zukünftige Verwendung.
4. Sammeln Sie junge Erwachsene Strongyloides für die Mikroinjektion: Morgen des Injektionstages
- Stellen Sie den Baermann-Apparat mit 1 Fäkalkohleplatte junger erwachsener Strongyloides auf (Abbildung 2).
HINWEIS: Die fäkale Holzkohleplatte kann einige infektiöse Larven enthalten. Die persönliche Schutzausrüstung besteht aus einem Laborkittel, Handschuhen und Augenschutz. Zwischen dem Handschuh und der Hülle des Laborkittels sollte keine Haut freigelegt werden.
Abbildung 2: Der Baermann-Apparat, der verwendet wird, um parasitäre Würmer aus Kulturen10 zu sammeln. Der Inhalt einer Fäkal-Holzkohleplatte wird an der Oberseite einer Säule aus warmem Wasser platziert. Die Würmer wandern ins Wasser und sammeln sich am Boden des Trichters. (A) Zur Aufstellung der Baermann-Vorrichtung wird der Ständer für den Baermann-Trichter mit einer C-Klemme an die Bank geklemmt. Ein Gummischlauch, der am Ende des Trichters befestigt ist, wird mit Klemmklemmen verschlossen, und ein Fangeimer wird unter dem Schlauch für Tropfen platziert. Warmes Wasser wird dem Glastrichter hinzugefügt. (B) Der Kunststoffringhalter für die Fäkal-Holzkohle-Mischung wird dann mit 3 Stück Laborgewebe ausgekleidet (links). Ein Holzstab oder Zungendrücker (Mitte) wird verwendet, um den Inhalt einer Fäkalien-Holzkohleplatte (rechts) in den Kunststoffringhalter zu übertragen. (C) Eine Nahaufnahme des Bodens des Kunststoffringhalters für die Fäkal-Holzkohle-Mischung, die die Doppelschicht Nylontüll zeigt, die den Boden des Halters auskleidet. (D) Der Fäkalien-Holzkohlehalter wird dann auf die Oberseite des Glastrichters gelegt. (E) Das Laborgewebe wird mit Wasser angefeuchtet und über dem Stuhl-Holzkohle-Gemisch verschlossen. Mehr warmes Wasser wird hinzugefügt, um die Fäkal-Holzkohle größtenteils zu tauchen. (F) Das komplette Baermann-Setup, wobei die Fäkalien-Holzkohle-Kultur unter warmes Wasser getaucht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Installieren Sie einen Glastrichter mit Gummisammelschlauch mit einem O-Ring auf einem Ringständer und sichern Sie ihn mit einer Klemme. Schließen Sie den Auffangschlauch mit 2 Klemmklemmen (Abbildung 2A).
- Legen Sie einen Fangeimer unter den Trichter, um Tropfen aufzufangen.
- Warmes (ca. 40 °C) Wasser in den Trichter bis 5 cm unterhalb des Randes geben. Stellen Sie sicher, dass das System nicht undicht ist.
- Auskleiden Sie den Baermann-Halter, ein Sieb aus 2 Kunststoffringen mit 2 Lagen Nylon-Tüll-Netz, das zwischen ihnen befestigt ist, mit 3 überlappenden Stücken Laborgewebe. Das Fäkal-Holzkohle-Gemisch in den Baermann-Halter geben (Abbildung 2B,C).
- Legen Sie den Baermann-Halter mit dem Fäkalien-Holzkohle-Gemisch in den Trichter. Falten Sie das Gewebe um die Fäkal-Holzkohle-Mischung und fügen Sie genug Wasser hinzu, um den größten Teil der Fäkal-Holzkohle zu tauchen. Nicht über 2 cm vom Rand des Trichters füllen (Abbildung 2D,E).
- Bedecken Sie den Trichter mit einem 15 cm langen Kunststoff-Petrischalendeckel, um den Geruch einzudämmen. Beschriften Sie den Trichter nach Bedarf (Abbildung 2F).
- Warten Sie 30 Minuten bis 1 Stunde, um die Würmer aus dem Baermann-Gerät zu sammeln.
- Halten Sie ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen unter den Gummischlauch am Boden des Trichters. Öffnen Sie vorsichtig die Klemmen an der Unterseite, um 30-40 ml Wasser mit Würmern in das 50-ml-Rohr zu geben.
- Geben Sie 15 ml des Baermann-Wassers, das die Würmer enthält, in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie das 15 ml Zentrifugenröhrchen für 1 min bei ~ 750 × g (langsam). Alternativ können Sie den Würmern erlauben, sich für 10-15 Minuten mit der Schwerkraft zu begnügen.
- Entfernen Sie den Überstand auf ~ 2 ml und entsorgen Sie den Überstand in einen flüssigen Abfallbehälter mit Jod, um Würmer abzutöten.
- Fügen Sie dem 15 ml Auffangrohr mehr Baermann-Wasser hinzu und wiederholen Sie den Spin. Entfernen Sie den Überstand auf ~2 ml und verwerfen Sie ihn wie in Schritt 4.11.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.11 und 4.12, bis alle Würmer im 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt sind. Nach dem letzten Spin so viel Wasser wie möglich entfernen.
- Untersuchen Sie das Pellet von Würmern (40-100 μL) am Boden des Rohres. Wenn keine Würmer sichtbar sind, warten Sie weitere 1-2 h und versuchen Sie, weitere Würmer aus dem Baermann-Gerät zu sammeln.
- Übertragen Sie die Würmer in so wenig Wasser wie möglich auf eine 6 cm große 2% NGM-Platte mit einem Rasen aus E. coli HB101. Verwenden Sie diese Platte als Quellplatte für die Mikroinjektion.
- Entsorgen Sie die Fäkal-Holzkohle-Mischung, indem Sie sie mit verdünntem Jod (eine 50%ige Verdünnung von Lugols Jod in Wasser) behandeln, sie in Plastikfolie wickeln, um Tropfen aufzufangen, und sie in einen biogefährlichen Abfallbehälter geben.
- Geben Sie 10 ml verdünntes Jod in den Fangeimer und lassen Sie das überschüssige Wasser aus dem Baermann hinein.
- Waschen Sie die wiederverwendbaren Komponenten (den Trichter, den Fangeimer, den Kunststoffhalter mit Tüll, den Kunststoffdeckel und die Klemmen) mit 10% Bleichmittel und spülen Sie sie gründlich aus.
5. Ziehen und Laden von Mikroinjektionsnadeln: kurz vor der Injektion
- Bereiten Sie Mikroinjektionsnadeln vor, indem Sie Glaskapillarröhrchen mit einem Nadelzieher ziehen.
HINWEIS: Beispieleinstellungen für einen handelsüblichen Nadelzieher, der mit einem 3-mm-Platin-/Iridium-Filament ausgestattet ist, sind Wärme = 810-820, Zug = 800-820, Mikrometer = 2,5. - Sehen Sie sich die Spitzen unter einem Seziermikroskop an. Wenn die Nadeln die gewünschte Form haben (Abbildung 3A-F), ziehen Sie 4-6 Nadeln (2-3 Kapillarröhrchen). Um die richtige Nadelform zu erreichen, ändern Sie die Einstellungen nach Bedarf: Passen Sie die Wärme- oder Zugeinstellungen um 10 an und ziehen Sie neue Nadeln, bis die Form der Verjüngung und des Schafts besser geeignet ist.
Abbildung 3: Mikroinjektionsnadeln und ein erwachsenes Weibchen von Strongyloides stercoralis mit optimalen Stellen für die Mikroinjektion identifiziert. (A-F) Bilder von Mikroinjektionsnadeln. (A-B) Der Schaft verjüngt sich (A) und die Spitze (B) einer Nadel, die für die Mikroinjektion richtig geformt ist. Die Spitze ist scharf genug, um die Nagelhaut zu durchbohren und schmal genug, um keine übermäßigen Schäden zu verursachen. (C-D) Die Wellenverjüngung (C) und die Spitze (D) einer Mikroinjektionsnadel, die für die Mikroinjektion falsch geformt ist. Die Spitze ist zu stumpf und breit und verursacht übermäßige Schäden am Wurm. (E-F) Die Welle verjüngt sich (E) und die Spitze (F) einer Nadel, die wahrscheinlich zu lang und schlank ist, um für die Mikroinjektion zu arbeiten. Die Spitze in F ist der Spitze in D sehr ähnlich. Der Schaft ist jedoch schmaler und zu flexibel, um die Kutikula effektiv zu durchbohren. Außerdem verstopfen sehr schlanke Nadeln leicht. (G) Ein Bild des gesamten Wurms, das korrekt für die Mikroinjektion positioniert ist, vorausgesetzt, die Nadel kommt von rechts. Anterior ist unten und links; Die Vulva wird durch die Pfeilspitze angezeigt. Die Gonade ist entlang der rechten Seite des Weibchens sichtbar. Dieses Weibchen hat nur ein Ei in ihrer Gebärmutter (gekennzeichnet durch das Sternchen). (H, I) Vergrößerte Ansichten der Mikroinjektionsstellen. Der Winkel des Pfeils nähert sich dem Winkel der Injektionsnadel an. Die Vulva kann als Wahrzeichen genutzt werden; Es befindet sich auf der gegenüberliegenden Seite des Wurms von den Armen der Gonade. Die Arme der Gonade krümmen sich um den Darm und die Enden mit den sich teilenden Kernen befinden sich gegenüber der Vulva. H) den hinteren Arm der Gonade; (I) der vordere Arm. Einer oder beide Arme können injiziert werden. Für H, I sind Konventionen wie in G. Skalenbalken = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Lagern Sie die gezogenen Nadeln in einer 15 cm großen Kunststoff-Petrischale mit einem Stück gerolltem Klebeband, um die Nadeln zu sichern und Staubansammlungen an den Spitzen zu vermeiden.
- Legen Sie einen 0,7 μL Tropfen der Mikroinjektionsmischung auf das offene Ende der Welle. Hängen Sie die Nadel senkrecht zu einem Regal mit einem gerollten Stück Klebeband, um den sich verjüngenden Schaft innerhalb von 10 Minuten mit der Mischung zu füllen. Bereiten Sie 2 Nadeln gleichzeitig vor, falls die erste nicht funktioniert.
6. Vorbereitung des Mikroskops und Brechen der Nadel
HINWEIS: Microinjection verwendet ein inverses Mikroskop mit 5x- und 40x-Objektiven, das mit einem Mikroinjektor-Setup ausgestattet ist, um die Bewegung der Nadel zu steuern. Das inverse Mikroskop sollte auf einem schweren Tisch oder einem Anti-Vibrations-Lufttisch platziert werden, um Vibrationsgeräusche zu reduzieren. Der Mikroinjektor-Nadelhalter ist mit Stickstoffgas verbunden, das den Druck ausübt, der für die Abgabe der Mikroinjektionsmischung erforderlich ist. Ein kleineres Seziermikroskop in der Nähe wird verwendet, um die Würmer zu übertragen.
- Stellen Sie den Druck des Gastanks auf ~ 40-60 psi für das Brechen der Nadel und auf ~ 30-50 psi für die Mikroinjektion ein, abhängig vom Flüssigkeitsfluss.
- Bedecken Sie auf dem Seziermikroskop die Glasscherbe auf dem Mikroinjektionspad-Deckglas mit Halogenkohlenwasserstofföl mit einem Standard-Platinwurmpickel.
- Legen Sie den Microinjection Pad Coverslip auf das Mikroinjektionsgerät und lokalisieren Sie die mit Öl bedeckte Glasscherbe. Richten Sie die Glasscherbe so aus, dass eine Kante senkrecht zur Richtung der Nadel steht, um als Oberfläche zum Brechen der Nadel zu dienen.
- Stellen Sie mit dem Seziermikroskop sicher, dass die Nadel keine Blasen oder Ablagerungen im konischen Schaft aufweist. Befestigen Sie dann die Nadel 1-1,5 cm in der Druckhalterung.
- Positionieren Sie die Nadelspitze mit dem Auge in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops. Positionieren Sie dann bei geringer Vergrößerung die Spitze der Nadel im Sichtfeld, senkrecht zur Seite des Glassplitters.
- Wechseln Sie zu hoher Leistung und richten Sie die Nadelspitze mit dem Rand des Glases aus, in der Nähe, aber ohne es zu berühren.
HINWEIS: Beim Ziehen werden die Nadeln geschlossen verschmolzen. - Um die Nadelspitze zu brechen, um den Flüssigkeitsfluss zu ermöglichen, klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Glasstücks, während Sie kontinuierlichen Druck aus dem Gas ausüben (Ergänzende Abbildung S1). Sobald die Flüssigkeit zu fließen beginnt, überprüfen Sie die Form der Spitze und stellen Sie sicher, dass sie bei leicht fließender Flüssigkeit scharf ist.
HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit zu schnell fließt oder das Ende zu stumpf ist, werden die Würmer während der Mikroinjektion beschädigt (Video 1 und Abbildung 3A-F). - Wenn die Flüssigkeit gut aus der Nadel fließt, bewegen Sie den Mikroinjektionsobjektträger in das Sezierfernrohr und legen Sie Tropfen von 1-2 μL Halogenkohlenwasserstofföl auf das Agarpad, um die Würmer zu platzieren.
- Übertragen Sie 20-30 junge erwachsene Strongyloide für mindestens 5 Minuten auf eine 2% ige NGM-Platte ohne Bakterien, um überschüssige Oberflächenbakterien zu entfernen und einzelne Würmer für die Mikroinjektion auszuwählen. Fügen Sie der NGM-Platte bei Bedarf während der Injektion weitere Würmer hinzu.
7. Mikroinjektion von Strongyloiden
- Verwenden Sie eine kleine Menge Halogenkohlenstofföl auf einem Wurmpickel, um ein Strongyloides-junges erwachsenes Weibchen mit 1-4 Eiern in ihrer Gonade aus der 2% igen NGM-Platte ohne Bakterien auszuwählen.
- Übertragen Sie den Wurm in einen winzigen Tropfen Öl auf dem Agar-Pad. Positionieren Sie den Wurm vorsichtig mit dem Wurmwähler, so dass er nicht gewunden ist und die Gonade sichtbar und leicht zugänglich ist. Notieren Sie sich die Richtung der Gonade (Abbildung 3G).
- Positionieren Sie den Wurm im Sichtfeld des Mikroinjektionsmikroskops. Stellen Sie sicher, dass sich die Gonade auf der gleichen Seite wie die Nadel befindet und so positioniert ist, dass die Nadel die Gonade in einem leichten Winkel berührt (Abbildung 3H,I).
- Bringen Sie die Nadelspitze an die Seite des Wurms in der gleichen Brennebene. Zielen Sie auf den Gomadenarm in der Nähe der Mitte des Wurms. Verwenden Sie den Mikroinjektor, um die Nadel vorsichtig in die Gonade einzuführen (Video 2).
- Üben Sie sofort Druck auf die Nadel aus, um den gesamten Gonadenarm vorsichtig mit der DNA-Lösung zu füllen. Stellen Sie mit dem Auge fest, wann genügend Flüssigkeit injiziert wurde (Video 2).
HINWEIS: Es kann bis zu 2 s dauern, um die Gonade zu füllen. - Entfernen Sie die Nadel und überprüfen Sie, ob sich die Wunde schließt.
HINWEIS: Der Wurm ist zu beschädigt, um Nachkommen zu produzieren, wenn die Gonade durch die Körperwand ragt (Supplemental Video S1). - Wiederholen Sie dies mit dem anderen Arm der Gonade, wenn er sichtbar ist.
- Wenn Sie mit der Injektion fertig sind, überprüfen Sie schnell, ob die Nadel nicht verstopft ist, indem Sie mit der Nadelspitze Druck auf das Agar-Pad ausüben. Übertragen Sie den Objektträger mit dem injizierten Wurm auf das Seziermikroskop.
- Um den injizierten Wurm wiederherzustellen, legen Sie zuerst ein paar Tropfen BU auf den Wurm, um ihn vom Agar-Pad zu schweben.
- Sammeln Sie eine kleine Menge HB101-Bakterien auf einem Wurmpick. Berühren Sie den Wurm mit den anhaftenden Bakterien auf dem Wurmpickel, um ihn aus der Flüssigkeit zu entfernen.
- Übertragen Sie den Wurm vorsichtig auf die Rückgewinnungsplatte , eine 2% NGM-Platte, die einen HB101-Rasen enthält.
HINWEIS: Der Wurm sollte innerhalb weniger Minuten mit dem Krabbeln beginnen. - Nachdem einige Weibchen injiziert wurden, fügen Sie einige nicht injizierte Männchen von der Quellplatte hinzu.
HINWEIS: Ein Minimum von einem Mann für fünf Frauen ist eine gute Basis; Ein Überschuss an Männchen wird bevorzugt. - Wiederholen Sie alle Schritte, bis genügend Weibchen für das Experiment injiziert wurden.
- Lassen Sie die Erwachsenen nach der Injektion mindestens 1 Stunde auf der Erholungsplatte, damit sich die Würmer erholen und paaren können.
8. Rückgewinnung und Kultivierung von injizierten Strongyloiden
- Sammeln Sie über Nacht Kot von nicht infizierten Wirtstieren und verwenden Sie das gleiche Protokoll wie für infizierte Tiere.
- Mischen Sie den unbefallenen Kot mit einer kleinen Menge Holzkohle (Kot zu Holzkohleverhältnis von etwa 2 zu 1 für diese Platten).
- Gießen Sie eine kleine Menge der Fäkal-Holzkohle-Mischung in eine 6 cm große Petrischale, die mit feuchtem Filterpapier ausgekleidet ist. Stellen Sie sicher, dass die Mischung den Deckel des Gerichts nicht berührt.
- Überfluten Sie die Rückgewinnungsplatte mit BU. Übertragen Sie die Würmer mit einem Pipettensatz bei 3 μL auf den Kot in der Fäkalkohleplatte. Legen Sie die Würmer direkt auf den Kot, nicht auf die Holzkohle.
- Überprüfen Sie, ob sich die Erwachsenen auf der Fäkalien-Holzkohleplatte befinden, indem Sie ein Sezierfernrohr verwenden.
- Um die Würmer zu kultivieren, legen Sie die Platte in eine befeuchtete Kammer, d. H. Eine Plastikbox mit einem eng anliegenden Deckel, der mit feuchten Papiertüchern ausgekleidet ist.
HINWEIS: Nach 2 Tagen wird es eine Mischung aus Larvenstadien geben. Nach 5 Tagen haben sich die meisten Larven zu iL3s entwickelt; Ein paar jüngere Larven werden bleiben. Nach 7 Tagen sollten alle Larven iL3s sein.
9. Sammeln und Screening von F 1-Larven zur Wiederherstellung von Transgenen / Knockouts
- Sammeln Sie die Larven mit einem Baermann-Setup von den kleinen Fäkal-Holzkohle-Kultivierungsplatten nach der Injektion. Um so viele Larven wie möglich zu erhalten, warten Sie mindestens 2 Stunden, bevor Sie die Würmer aus dem Baermann-Apparat bergen.
- Konzentrieren Sie die Larven in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen wie in den Schritten 4.10-4.14 und übertragen Sie die Larven auf ein kleines Uhrenglas mit BU.
- Wenn die Larven für Verhaltensexperimente verwendet werden, verwenden Sie 2% NGM-Platten mit einem dicken Rasen von HB101 für das Screening.
- Übertragen Sie 20-30 Larven auf den HB101-Rasen.
HINWEIS: Die Bakterien verlangsamen die Bewegung der Larven. - Identifizieren Sie unter einem Fluoreszenz-Seziermikroskop die Larven, die das Transgen von Interesse ausdrücken. Verwenden Sie einen Wurmpickel, um die transgenen Larven auszuwählen und sie zu einem kleinen Uhrenglas mit BU zu bewegen.
- Verwenden Sie eine neue HB101-Platte, um eine weitere kleine Charge von Larven zu screenen. Wenn genügend Larven für den experimentellen Einsatz gesammelt wurden, behandeln Sie die HB101-Platten und die überschüssigen Würmer mit verdünntem Jod (50% Lugol-Jod in Wasser verdünnt) und entsorgen Sie sie als biogefährliche Abfälle. Alternativ töten Sie die überschüssigen Würmer mit einem konzentrierten Zwingerreiniger, der Alkylbenzylammoniumchloride enthält.
- Verwenden Sie die Würmer sofort oder lassen Sie sie in einem flachen Uhrenglas in einer kleinen Menge BU über Nacht.
HINWEIS: Würmer können hypoxisch werden, wenn die Flüssigkeit zu tief ist. Es ist möglich, dass das Verlassen von Larven in BU über Nacht bestimmte Verhaltensweisen beeinflussen kann; Verwenden Sie daher Larven für Verhaltensexperimente innerhalb von 6 h.
- Übertragen Sie 20-30 Larven auf den HB101-Rasen.
- Wenn die Larven für die Mikroskopie und nicht für Verhaltenstests verwendet werden, immobilisieren Sie die Würmer durch Nikotinlähmung reversibel für das Screening.
- Ritzen Sie mit einer Rasierklinge ein Gitter auf den Kunststoffboden einer 10 cm langen Chemotaxisplatte12, um den Überblick über die Position der Würmer auf der Platte zu erleichtern.
- Tropfen Sie ~ 3 μL Larven in BU in ein Quadrat auf dem Gitter. Füllen Sie so viele Quadrate wie nötig. Verwenden Sie nicht die in der Nähe der Ränder der Platte, da die Larven zu den Seiten der Platte kriechen können.
- Fügen Sie 15-20 μL Tropfen von 1% Nikotin in Wasser zu den Wurmtropfen hinzu.
HINWEIS: Nach 4 Minuten sind die Würmer gelähmt. - Screenen Sie die Würmer mit einem Fluoreszenz-Seziermikroskop.
- Verwenden Sie einen Wurmpickel, um die transgenen Larven in ein kleines Uhrenglas mit 1-2 ml BU zu übertragen.
HINWEIS: Die Larven werden für mehrere Stunden gelähmt und können leicht auf Objektträgern für die Mikroskopie montiert werden. Wenn das iL3s über Nacht in der BU verbleibt, erholt es sich und kann für einige Assays oder eine Infektion des Säugetierwirts verwendet werden. Nikotinlähmung und die Inkubation über Nacht in BU können jedoch bestimmte Verhaltensweisen beeinflussen.
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Representative Results
Wenn das Experiment erfolgreich war, exprimieren die F 1-Larven den Transgen- und/oder Mutantenphänotyp von Interesse (Abbildung 4). Die Transformationsraten sind jedoch sehr unterschiedlich und hängen von den Konstrukten, der Gesundheit der Würmer, den Kultivierungsbedingungen nach der Injektion und den Fähigkeiten des Experimentators ab. Im Allgemeinen ergibt ein erfolgreiches Experiment >15 F1-Larven pro injizierter Frau und eine Transformationsrate von >3% für fluoreszierende Marker. Wenn die Gesamtzahl der lebenden Nachkommen im Durchschnitt weniger als 10 Larven / Weibchen beträgt, ist es möglich, dass das Konstrukt toxisch ist und die transformierten Larven nicht überleben. Das Auffinden einer großen Anzahl von fluoreszierenden Eiern, aber nicht fluoreszierenden Larven ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die Injektionsmischung giftig sein kann. Beim ersten Erlernen der Technik wird empfohlen, ein Konstrukt zu verwenden, das sich gut ausdrückt, z. B. act-2::mRFPmars, das den robusten Ausdruck im Körperwandmuskel13 fördert (Abbildung 4).
Bei der Erzeugung von Mutanten durch CRISPR/Cas9-vermittelte gezielte Mutagenese wird die Verwendung einer Reparaturvorlage empfohlen, die ein act-2::mRFPmars oder act-2::GFP-Transgen 13 enthält, damit potenzielle Mutanten anhand der Fluoreszenz 9,14,15 identifiziert werden können. Es ist wichtig zu beachten, dass, da Strongyloides Transgene aus extrachromosomalen Arrays exprimieren, fluoreszierende F1-Nachkommen mRFPmars oder GFP aus dem Array allein oder mRFPmars oder GFP sowohl aus dem Array als auch aus einem integrierten Transgen 3,9,16 exprimieren können. Es ist möglich, Larven zu identifizieren, die eher integrierte Transgene haben, basierend auf dem Muster der fluoreszierenden Expression: Die "lückenhafte" Expression im Körperwandmuskel (Abbildung 4A) ist häufiger, wenn das Transgen nicht in das Genom integriert ist, während eine konsistente Expression im gesamten Körperwandmuskel (Abbildung 4B) ) weist oft, aber nicht immer, darauf hin, dass sich das Transgen in das Genom integriert hat. Expressionsmuster allein können jedoch nicht verwendet werden, um Mutanten schlüssig zu identifizieren - einige Würmer mit konsistenter Expression im gesamten Körperwandmuskel haben möglicherweise keine Integrationsereignisse. Darüber hinaus können Ausdrucksmuster Mutanten, die homozygot sind, nicht von solchen unterscheiden, die heterozygot oder mosaisch sind. Somit muss jeder Wurm PCR-genotypisiertsein 9,14,15. Bei der Störung von Genen, die leicht sichtbare Phänotypen ergeben, ist es möglicherweise nicht erforderlich, eine Reparaturvorlage zu verwenden. Zum Beispiel führt eine Störung des Strongyloides unc-22-Gens zu einem dominanten "Twitcher" -Phänotyp mit Raten von heterozygoten oder homozygoten Störungen über 10%9.
Abbildung 4: Transgene Strongyloides stercoralis-Larven. (A, B) S. stercoralis-Larven, die ein act-2::mRFPmars-Transgen exprimieren, das im Körperwandmuskel13 exprimiert. Das Transgen wurde in eine Reparaturschablone für die CRISPR/Cas9-vermittelte Störung des Ss-unc-22-Locus 9 eingebaut. (A) Eine S. stercoralis-Larve mit einem unvollständigen oder "lückenhaften" act-2::mRFPmars-Ausdrucksmuster, das auf die Expression aus einem extrachromosomalen Array hinweisen kann. (B) Ein S. stercoralis iL3, das das vollständigere act-2::mRFPmars-Expressionsmuster exprimiert, das auf eine Genstörung und Integration der Reparaturvorlage hinweisen kann. Für A, B zeigen die Bedienfelder differenzielle Interferenzkontraste (links), fluoreszierende (Mitte) und zusammengeführte (rechts) Bilder. Maßstabsstäbe = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Demonstration des Nadelbruchprozesses zur Herstellung einer brauchbaren Nadel. Die Spitze der Nadel wird gegen den Rand einer Glasscherbe geklopft (Objekt ganz links). Wenn Flüssigkeit austritt, wird die Nadel zurückgezogen und auf den Agar bewegt. Die Nadelspitze kommt zu einer scharfen Spitze, und Flüssigkeit fließt mäßig schnell. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Demonstration einer erfolgreichen Injektion. Der hintere Arm der Gonade ist als hellgraue Struktur auf der rechten Seite sichtbar. Die Spitze der Nadel und die Gonade müssen sich in der gleichen Brennebene befinden. Wenn die Nadel über oder unter den Wurm oder entlang des Körpers gleitet, ohne sich zu verfangen, passen Sie die Position an. Die Spitze der Nadel wird die Körperwand leicht einrücken. Ein schnelles Tippen auf den Nadelhalter, der am Mikromanipulator befestigt ist, drückt die Spitze sanft durch die Körperwand und in die Gonade. Sobald sich die Nadel in der Gonade befindet, üben Sie Druck aus und injizieren Sie die DNA-Lösung. Die Flüssigkeit sollte die Gonade sichtbar überfluten. Wenn sich die Wunde schließt, wenn die Nadelspitze entfernt wird, wird der Wurm wahrscheinlich überleben. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Material: Strongyloides-Stammerhaltung . Dieses Protokoll beschreibt das Erhaltungsverfahren für S. stercoralis bei Rennmäusen und S. ratti bei Ratten. Es beinhaltet die infektiöse Dosis, die für jeden Nematoden und Wirt verwendet wird. Wirte werden durch subkutane Injektionen unter Narkose infiziert. Das Fortschreiten der Infektionen von der Durchgängigkeit über die Spitzenlarvenproduktion bis zum Verlust der Durchgängigkeit wird für jede Nematoden-Wirt-Kombination beschrieben. Das Protokoll, das verwendet wird, um befallenen Kot zu sammeln und die Kot-Holzkohle-Kultivierungsplatten herzustellen, wird ebenfalls beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S1: Ein Bild eines Mikroinjektionsobjektträgers, bestehend aus einem getrockneten Agar-Pad auf einem Deckglas mit einer kleinen Glasscherbe zum Brechen der Mikroinjektionsnadel. Der Agar-Umriss und der Shard-Umriss werden hier zur Verdeutlichung hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Supplemental Movie S1: Demonstration einer Injektion, die zu einer beschädigten Gonade führt. Der vordere Arm der Gonade ist im Fokus. Die Anwendung von leichtem Druck zeigt, dass die Lösung in der Nadel noch frei ausfließt. Die Spitze der Nadel befindet sich in der gleichen Brennebene wie die Gonade und ist in einem leichten Winkel ausgerichtet. Sobald die Nadelspitze eingeführt ist, wird die Lösung in den Wurm injiziert und füllt die Gonade. Wenn die Nadel jedoch entfernt wird, ragt ein Stück der Gonade durch die Wunde in der Nagelhaut. Material fließt sichtbar aus. Es ist unwahrscheinlich, dass dieser Wurm überlebt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Mikroinjektionsprotokoll beschreibt die Methoden zur Einführung von Konstrukten für Transgenese und CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese in S. stercoralis und S . ratti. Sowohl für S. stercoralis als auch für S. ratti unterliegen das Überleben nach der Injektion und die Transgenese- oder Mutageneserate mehreren Variablen, die fein abgestimmt werden können.
Die erste kritische Überlegung für eine erfolgreiche Transgenese ist, wie Plasmidtransgene aufgebaut sind. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Expression exogener Transgene in Strongyloides die Verwendung von Strongyloides 5' Promotoren und 3' UTR-Elementen3,13,19 erfordert. Ähnlich wie C. elegans-Konstrukte verwenden Strongyloides-Konstrukte im Allgemeinen einen genspezifischen Promotor und eine gemeinsame 3'-UTR, wie die aus dem Ss-era-1-Gen 13. Die Codon-Optimierung der Kodierungsregion kann auch für die Expression in Strongyloides wichtig sein. Vor kurzem wurde der Wild Worm Codon Adapter entwickelt, eine webbasierte App, die Codierungssequenzen für Strongyloides und andere Nematoden codonoptimiert,20. Schließlich, obwohl nicht streng in Strongyloides getestet, wurde gezeigt, dass Introns die Expression von exogenen Transgenen sowohl bei C. elegans21 als auch bei dem insektenassoziierten Nematoden Pristionchus pacificus22 erhöhen und vermutlich auch die Expression in Strongyloides erhöhen. Der Wild Worm Codon Adapter verfügt über Optionen für die Aufnahme von bis zu drei Introns in die modifizierte Sequenz20.
Die Zusammensetzung und Abgabe der Mikroinjektionsmischung beeinflussen die Transgeneserate und das Überleben der F1-Nachkommen . BU-Kochsalzlösung wird routinemäßig als Verdünnungsmittel für Mischungen verwendet, obwohl auch die Verwendung von ddH2O eine Option ist. Die Konzentrationen und/oder das Verhältnis der Komponenten im Mix können angepasst werden, um die Umwandlungsrate zu verbessern. Höhere Konzentrationen der interessierenden Plasmide können die Transgeneserate erhöhen, führen aber oft zu weniger Gesamtnachkommen. Wenn keine transgene Expression beobachtet wird oder nur tote transgene Eier gefunden werden, ist es möglich, dass die Transgene toxisch sind oder dass etwas in den Plasmidbeständen den Tod der Transgen verursacht. Im letzteren Fall kann die Herstellung neuer Plasmidbestände mit einer anderen Methode (z. B. mit einem anderen Miniprep-Kit) ausreichen, um Transgene zu erhalten. Die Zugabe von Lipofectamin zur Mikroinjektionsmischung kann auch die Transgeneserateverbessern 23.
Die Form der Mikroinjektionsnadel, die die Mischung liefert, beeinflusst auch die Überlebens- und Transgeneseraten (Abbildung 3A-F, Video 1, Video 2 und Supplemental Video S1). Die Nadel muss scharf genug sein, um in die Nagelhaut einzudringen, und schmal genug, um keine übermäßige Beschädigung zu verursachen. Es wird empfohlen, Nadeln kurz vor dem Gebrauch zu ziehen, da Nadeln, die länger als einen Tag gelagert werden, während Mikroinjektionen Ablagerungen ansammeln und verstopfen können. Die Wiederherstellung von injizierten Frauen aus dem Mikroinjektionspad, ohne sie zu beschädigen, kann mit einigen verschiedenen Methoden erreicht werden. Eine Technik besteht darin, die Würmer in einem Tropfen BU vom Injektionspad zu schweben und dann HB101 auf einem Wurmpick zu verwenden, um die Würmer zu sammeln. Andere Techniken zur Wiederherstellung umfassen das Schwimmen der Würmer in BU und das Sammeln mit einer Pipettenspitze oder einem kleinen Pinsel oder einfach mit einem Wurmplektrum allein, um die Würmer auf eine Wiederherstellungsplatte zu bewegen.
Wenn keine Nachkommen von den mikroinjizierten Weibchen erhalten wurden, deutet dies darauf hin, dass entweder die injizierten Weibchen im Mikroinjektionsprozess beschädigt wurden oder die Kultivierungsbedingungen nach der Injektion suboptimal waren. Es gibt eine Reihe von verschiedenen Kultivierungsbedingungen nach der Injektion, die ausprobiert werden können. Die oben beschriebenen kleinräumigen Fäkal-Holzkohle-Kulturen unterstützen im Allgemeinen ein besseres Wurmüberleben als NGM-Platten mit HB101. Es kann jedoch schwierig sein, das Überleben der injizierten Würmer und die Entwicklung der F1-Larven auf fäkalen Holzkohleplatten zu verfolgen, und Eier sind auf diesen Platten nicht sichtbar. Ein Vorteil der Kultivierung von Würmern auf NGM-Platten mit HB101 anstelle von fäkalen Holzkohleplatten besteht darin, eine sorgfältige Beobachtung der Eiablage und Larvenentwicklung zu ermöglichen, was für die Fehlerbehebung nützlich sein kann. V12-Platten mit HB101 können auch verwendet werden, um das Überleben24 zu erhöhen. Schließlich kann eine Chemotaxisplatte12 mit einem einzelnen Rattenkotpellet für die Kultivierung von S. ratti nach der Injektion verwendet werden. Die Männchen und injizierten Weibchen werden direkt auf das Kotpellet der Ratte übertragen. In 5-7 Tagen werden Würmer aus dem Agar und Kot mit einem Baermann-Apparat gesammelt, wie oben beschrieben.
Um Strongyloides-Erwachsene für die Mikroinjektion zu erhalten, können frisch zubereitete Fäkalkohleplatten bei 25 °C für 24 h oder 20 °C für 48 h inkubiert werden. Strongyloides-Erwachsene, die 24 h bei 25 °C aufgezogen werden, sind jung genug, um eine große Anzahl von Nachkommen25 zu produzieren. Wenn die Weibchen jedoch zu jung sind, überleben sie den Mikroinjektionsprozess möglicherweise nicht. Erwachsene, die aus fäkalen Holzkohleplatten gesammelt wurden, die bei 20 ° C für ~ 48 h inkubiert wurden, tolerieren den Mikroinjektionsprozess eher. Da diese Erwachsenen jedoch älter sind als Erwachsene, die aus einer 24-Stunden-Inkubation bei 25 ° C gewonnen werden, sind sie nicht so fruchtbar und können eine niedrigere Umwandlungsrate aufweisen. Anfänger ziehen es möglicherweise vor, mit älteren Erwachsenen zu beginnen und dann zu etwas jüngeren Erwachsenen zu wechseln, wenn sich die Fähigkeiten verbessern.
Wie C. elegans können Strongyloides-Spezies Transgene aus extrachromosomalen Arrays und genomintegrierten Konstrukten der F1-Generation exprimieren. Im Gegensatz zu C. elegans exprimieren Strongyloides-Spezies nur genomintegrierte Transgene in der F2 und nachfolgenden Generationen, obwohl die extrachromosomalen Arrays immer noch durch PCR13 nachweisbar sind. Die transgenen F 1-Larven, die extrachromosomale Arrays exprimieren, können für Experimente verwendet werden, die keine Genomintegration oder eine große Anzahl transgener Würmer erfordern. Die Genomintegration kann für Experimente erforderlich sein, bei denen endogene Gene markiert oder eine große Anzahl von Würmern in populationsbasierten Assays getestet werden müssen. Es gibt zwei Methoden zur Genomintegration von Transgenen in Strongyloides: piggyBac-Transposon-vermittelte Integration17 und CRISPR/Cas9-vermittelte Integration9. piggyBac Transposon-vermittelte Integration verwendet die piggyBac-Transposase, um Fracht auf TTAA-Stellen im Genom26 zu zielen. Da das TTAA-Motiv im AT-reichen Genom von Strongyloides-Spezies recht häufig vorkommt, erfolgt die Integration oft an mehr als einer Stelle im Genom. Im Gegensatz dazu kann die CRISPR/Cas9-vermittelte Integration verwendet werden, um Transgene an einem bestimmten Zielort9 zu integrieren.
Das CRISPR/Cas9-System kann auch verwendet werden, um gezielte Gen-Knockoutszu erzeugen 9,27. Aufgrund des AT-Reichtums des Strongyloides-Genoms ist es eine Herausforderung, brauchbare Cas9-Zielstellen zu finden, die die optimale 5'-N18GGNGG-3'-Sequenz für Nematoden28 enthalten. Häufig gibt es nur ein oder zwei Stellen in einem Gen für das Targeting. Die bevorzugte Methode beinhaltet die Integration einer Reparaturschablone, die ein Transgen mit einem fluoreszierenden Marker durch homologiegerichtete Reparatur enthält, in den genomischen Locus, was zu einer vollständigen Störung des Gens führt. Mögliche Knockouts können durch Expression des Transgens 9,14,15,29 identifiziert werden. Die Transgenexpression allein ist jedoch kein Hinweis auf den Genotyp, da die Expression von Arrays im Vergleich zu integrierten Transgenen oft nicht unterscheidbar ist. Daher erfordern die transgenen F1-Larven eine post-hoc-Genotypisierung, um homozygote Knockouts zu identifizieren9. In Ermangelung einer Reparaturvorlage tritt die Mutagenese des Ziellokus mit hoher Häufigkeit auf, kann aber zu großen Deletionen führen9.
Obwohl die Erzeugung transgener oder mutierter F1-Larven in S. stercoralis relativ einfach ist, ist die Erzeugung stabiler Linien aufgrund der Notwendigkeit einer Wirtspassage äußerst schwierig. Im Labor ist die mongolische Rennmaus ein freizügiger Wirt für S. stercoralis, benötigt aber eine hohe Dosis von Würmern, um eine Infektion zu etablieren, die in der Lage ist, genügend F 2-Larven zu produzieren, um die Linie30 zu etablieren. Nur etwa 6% der infektiösen Larven werden parasitäre Weibchen30. Wenn die transgenen Larven eine Array-Expression ohne Genomintegration haben, produzieren sie nicht die transgenexprimierenden Nachkommen, die erforderlich sind, um einen zweiten Rennmauswirt zu infizieren. Um die Chancen zu erhöhen, dass eine ausreichende Anzahl von genomintegrierten Larven zu reproduktiven parasitären Erwachsenen wird, wird ein Minimum von 400-500 transgenen Larven im anfänglichen Inokulum empfohlen. Es kann möglich sein, die Anzahl der Larven zu reduzieren, die erforderlich sind, um eine Patentinfektion zu etablieren, indem die Rennmäuse mit Prednison30 behandelt werden. Dennoch dürfte es schwierig sein, genügend integrierte transgene oder mutierte Würmer zu sammeln, um erfolgreich eine stabile Linie von S. stercoralis zu etablieren. Es ist jedoch in der Regel möglich, eine ausreichende Anzahl transgener S. stercoralis F 1-Larven für Einzelwurm-Assays 14,15 zu sammeln.
Strongyloides ratti hat den entscheidenden Vorteil der größeren Machbarkeit der Erzeugung stabiler transgener oder Knockout-Linien17,31. S. ratti freilebende erwachsene Weibchen sind weniger tolerant gegenüber dem Mikroinjektionsprozess als S. stercoralis freilebende erwachsene Weibchen; S. ratti Weibchen produzieren im Allgemeinen weniger Larven als S. stercoralis Weibchen, und die Transformationsrate ist auch niedriger31. Es sind jedoch nur wenige transgene oder Knockout-F1-Larven erforderlich, um eine stabile Linie von S. ratti zu etablieren. Da S. ratti ein natürlicher Parasit von Ratten ist, reichen nur wenige infektiöse Larven von S. ratti aus, um eine Patentinfektionfestzustellen 32. So ist es im Allgemeinen möglich, eine ausreichende Anzahl von transgenen oder mutierten Larven zu sammeln, um eine stabile Linie zu etablieren. Da Strongyloides-Spezies keine extrachromosomalen Arrays über die F 1-Generation hinaus exprimieren, können nur genomintegrierte F1-Larven eine stabile transgene Linie13 produzieren. Es ist im Allgemeinen unmöglich, Würmer mit integrierten Transgenen vor der Genotypisierung zu identifizieren, daher besteht das Protokoll darin, alle transgenen F 1-Larven zu sammeln und in eine Ratte zu injizieren. Ein kleiner Prozentsatz dieser Larven wird das gewünschte Integrationsereignis haben; Diese Larven bilden die Grundlage für die stabile Linie. Da die piggyBac-Methode bei jedem einzelnen Wurm oft zu mehr als einem Integrationsereignis führt, kann eine fast 100%ige Übertragung des Transgens nach einigen Runden transgener Larven durch eine Ratteerreicht werden 17.
Zusammenfassend kann die hier beschriebene Technik verwendet werden, um transgene oder Knockout-S. stercoralis und S. ratti zu erzeugen. Dies ermöglicht eine breite Palette potenzieller Experimente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die zellspezifische Expression von Transgenen, die Erzeugung von Mutanten und die endogene Markierung von Proteinen zur Bestimmung räumlicher und zeitlicher Funktionen 14,15,29,33,34,35. Langfristig können Erkenntnisse aus der Verwendung transgener Strongyloide genutzt werden, um neue Strategien zur Bekämpfung menschlicher Infektionen mit S. stercoralis und anderen intestinalen parasitären Nematoden zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
pPV540 und pPV402 waren freundliche Geschenke von Dr. James Lok von der University of Pennsylvania. Wir danken Astra Bryant für die hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, einem Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award und National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
