Summary
Det funktionelle genomiske værktøjssæt til de parasitære nematoder Strongyloides stercoralis og Strongyloides ratti omfatter transgenese, CRISPR/Cas9-medieret mutagenese og RNAi. Denne protokol vil demonstrere, hvordan man bruger intragonadal mikroinjektion til at introducere transgener og CRISPR-komponenter i S. stercoralis og S. ratti.
Abstract
Slægten Strongyloides består af flere arter af hudgennemtrængende nematoder med forskellige værtsområder, herunder Strongyloides stercoralis og Strongyloides ratti. S. stercoralis er en human-parasitisk, hudpenetrerende nematode, der inficerer ca. 610 millioner mennesker, mens rotteparasitten S. ratti er nært beslægtet med S. stercoralis og ofte bruges som laboratoriemodel for S. stercoralis. Både S. stercoralis og S. ratti er let modtagelige for dannelsen af transgenik og knockouts gennem den eksogene nukleinsyreleveringsteknik af intragonadal mikroinjektion og er som sådan opstået som modelsystemer for andre parasitære helminths, der endnu ikke er modtagelige for denne teknik.
Parasitiske Strongyloides voksne beboer tyndtarmen af deres vært og frigiver afkom i miljøet via afføringen. En gang i miljøet udvikler larverne sig til fritlevende voksne, der lever i afføring og producerer afkom, der skal finde og invadere en ny vært. Denne miljøgeneration er unik for Strongyloides-arten og ligner nok i morfologi til modellen fritlevende nematode Caenorhabditis elegans , at teknikker udviklet til C. elegans kan tilpasses til brug med disse parasitære nematoder, herunder intragonadal mikroinjektion. Ved hjælp af intragonadal mikroinjektion kan en lang række transgener indføres i Strongyloides. CRISPR/Cas9-komponenter kan også mikroinjektioneres for at skabe mutante Strongyloides larver. Her beskrives teknikken til intragonadal mikroinjektion i Strongyloides, herunder fremstilling af fritlevende voksne, injektionsproceduren og udvælgelsen af transgent afkom. Billeder af transgene Strongyloides larver skabt ved hjælp af CRISPR/Cas9 mutagenese er inkluderet. Formålet med denne artikel er at gøre det muligt for andre forskere at bruge mikroinjektion til at skabe transgene og mutante Strongyloides.
Introduction
Strongyloides stercoralis har længe været overset som et vigtigt humant patogen sammenlignet med de mere almindeligt anerkendte hageorm og rundorm Ascaris lumbricoides1. Tidligere undersøgelser af ormebyrden undervurderede ofte alvorligt forekomsten af S. stercoralis på grund af den lave følsomhed af almindelige diagnostiske metoder til S. stercoralis2. I de senere år har epidemiologiske undersøgelser baseret på forbedrede diagnostiske værktøjer anslået, at den sande forekomst af S. stercoralis-infektioner er meget højere end tidligere rapporteret, ca. 610 millioner mennesker over hele verden2.
Både S. stercoralis og andre Strongyloides-arter, herunder den nært beslægtede rotteparasit og fælles laboratoriemodel S. ratti, har en usædvanlig livscyklus, der er fordelagtig for eksperimentelle genomiske undersøgelser, fordi den består af både parasitære og fritlevende (miljømæssige) generationer3 (figur 1). Specifikt kan både S. stercoralis og S. ratti cykle gennem en enkelt fritlevende generation. Den fritlevende generation består af postparasitære larver, der udvikler sig til fritlevende voksne mænd og kvinder; alle afkom af de fritlevende voksne udvikler sig til infektiøse larver, som skal inficere en vært for at fortsætte livscyklussen. Desuden kan denne miljømæssige eller fritlevende generation eksperimentelt manipuleres i laboratoriet. Fordi fritlevende Strongyloides voksne og C. elegans voksne deler lignende morfologi, kan teknikker som intragonadal mikroinjektion, der oprindeligt blev udviklet til C. elegans, tilpasses til brug med fritlevende voksne Strongyloides 4,5. Mens DNA generelt introduceres i fritlevende voksne kvinder, kan både mænd og kvinder af Strongyloides mikroinjekt6. Således er funktionelle genomiske værktøjer tilgængelige for at forhøre mange aspekter af Strongyloidernes biologi. Andre parasitære nematoder mangler en fritlevende generation og er derfor ikke så let modtagelige for funktionelle genomiske teknikker3.
Figur 1: Strongyloides stercoralis livscyklus. S. stercoralis parasitære kvinder beboer tyndtarmen hos deres pattedyrværter (mennesker, ikke-menneskelige primater, hunde). De parasitære hunner reproducerer ved parthenogenese og lægger æg i tyndtarmen. Æggene klækkes, mens de stadig er inde i værten, til postparasitære larver, som derefter overføres til miljøet med afføring. Hvis de postparasitære larver er mandlige, udvikler de sig til fritlevende voksne mænd. Hvis de postparasitære larver er kvindelige, kan de enten udvikle sig til fritlevende voksne hunner (indirekte udvikling) eller tredje fase infektiøse larver (iL3s; direkte udvikling). De fritlevende mænd og kvinder reproducerer seksuelt for at skabe afkom, der er begrænset til at blive iL3'er. Under visse betingelser kan S. stercoralis også gennemgå autoinfektion, hvor nogle af de postparasitære larver forbliver inde i værtstarmen i stedet for at passere ind i miljøet i afføring. Disse larver kan udvikle sig til autoinfektive larver (L3a) inde i værten, trænge gennem tarmvæggen, migrere gennem kroppen og til sidst vende tilbage til tarmen for at blive reproduktive voksne. Livscyklussen for S. ratti er ens, bortset fra at S. ratti inficerer rotter og ikke har en autoinfektiv cyklus. Miljøgenerationen er nøglen til at bruge Strongyloides-arter til genetiske undersøgelser. De fritlevende voksne kvinder (P0) kan mikroinjekteres; deres afkom, som alle bliver iL3'er, er de potentielle F1-transgene. Dette tal er blevet ændret fra Castelletto et al. 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
S. stercoralis deler mange aspekter af sin biologi med andre gastrointestinale human-parasitiske nematoder, herunder værtsinvasion og værtsimmunmodulation. For eksempel inficerer human-parasitiske hookworms i slægterne Necator og Ancylostoma også ved hudindtrængning, navigerer på samme måde gennem kroppen og i sidste ende befinder sig som parasitære voksne i tyndtarmen7. Således bruger mange gastrointestinale nematoder sandsynligvis almindelig sensorisk adfærd og immununddragelsesteknikker. Som følge heraf vil den viden, der er hentet fra Strongyloides , supplere fund i andre mindre genetisk medgørlige nematoder og føre til en mere fuldstændig forståelse af disse komplekse og vigtige parasitter.
Denne mikroinjektionsprotokol skitserer metoden til at introducere DNA i Strongyloides fritlevende voksne kvinder for at lave transgene og mutante afkom. Kravene til vedligeholdelse af stammen, herunder udviklingstimingen af voksne orme til mikroinjektioner og indsamling af transgene afkom, er beskrevet. Protokoller og en demonstration af den komplette mikroinjektionsteknik sammen med protokoller til dyrkning og screening af transgene afkom er inkluderet sammen med en liste over alt nødvendigt udstyr og forbrugsstoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Gerbils blev brugt til passage S. stercoralis, og rotter blev brugt til passage S. ratti. Alle procedurer blev godkendt af UCLA Office of Animal Research Oversight (protokol nr. 2011-060-21A), som overholder AAALAC-standarder og vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr. Følgende opgaver skal udføres mindst en dag før mikroinjektion: ormedyrkning, forberedelse af mikroinjektionspuder, oprettelse af konstruktioner til mikroinjektionsblandingen og spredning af bakterier (E. coli HB101) på 6 cm Nematode Growth Media (NGM) plader8. De fritlevende hunner kræver mindst 24 timers post-fækal opsamling ved 25 °C for at udvikle sig til unge voksne, før de kan mikroinjekteres. Microinjection puder skal være helt tørre. Bakterieplader skal tørre og etablere en lille græsplæne.
1. Forberedelse af mikroinjektionsglas: mindst en dag før injektion
BEMÆRK: Orme er monteret på microinjection coverslips med tørre agar puder til injektion.
- Indstil en varmeblok til 90 °C.
- Tilsæt 5 ml ddH2O, derefter 100 mg agarose til et borosilikatglasrør.
- Varm agaroseblandingen i røret over en flamme, indtil agarosen er opløst.
- Røret anbringes i en varmeblok, der er indstillet ved 90 °C, for at holde agarosen i flydende tilstand.
- Slip ~ 180 μL af agaroseopløsningen på en dækslip ved hjælp af et pasteurglasrør eller et rør med en plastspids. Slip straks en anden dækslip ovenpå for at flade agarosen i en tynd pude.
- Efter 5-10 s skal du fjerne topdækslet ved at skubbe de to fra hinanden. Bestem, hvilket dias agarpuden er på, og læg den med forsiden opad.
- Vælg et lille stykke glasskår fra en brudt dækslip, og tryk det forsigtigt ind i agaren nær pudens øverste kant ved hjælp af tang (supplerende figur S1).
- Fortsæt med at lave mikroinjektionspuder med agaroseopløsningen.
- Tør agarosepuderne natten over på bænken eller i en ovn. Opbevares i dækslipboksen.
BEMÆRK: Agarosepuderne kan bruges i op til 2 måneder, men bruges kun til en injektionskørsel.
2. Dyrkning af Strongyloides for at opnå orme til mikroinjektion: 1 - 2 dage før injektion
BEMÆRK: En stammevedligeholdelsesprotokol findes i supplementmaterialet, som indeholder en detaljeret beskrivelse af, hvordan man inficerer gerbils og rotter med nematoder og høster nematoder fra afføring fra inficerede dyr.
- To dage før injektionsdagen anbringes de inficerede dyr 9,10 i opsamlingsbure natten over.
- Næste morgen samles angrebne afføring og laves fækale trækulplader 9,10.
- Anbring en plade ved 25 °C i 24 timer, så de fritlevende orme kan udvikle sig til unge voksne.
- Natten før injektionsdagen skal du placere uinficerede værtsdyr i opsamlingsbure.
- På injektionsdagen skal du samle uinficeret afføring til dyrkning efter injektion.
3. Fremstilling af mikroinjektionsblandingen: før eller på injektionsdagen
BEMÆRK: Mikroinjektionsblandingen består af plasmider af interesse fortyndet til den ønskede koncentration i ormbufferet saltvand (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.
- Koncentrationen af plasmidbestandene og den ønskede koncentration i mikroinjektionsblandingen bestemmes (tabel 1).
| Mikroinjektionsmix: reporterkonstruktion | |||
| Komponent | Koncentration af bestande | Beløb | Endelig koncentration |
| pMLC30 gpa-3::gfp | 300 ng/μL | 1,7 μL | 50 ng/μL |
| Bu | Na | 8,3 μL | Na |
| total | 10 μL | 50 ng/μL | |
| Blanding af mikroinjektion: CRISPR/Cas9 mutagenese | |||
| Komponent | Koncentration af bestande | Beløb | Endelig koncentration |
| pMLC47 skat-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2,7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-skat-4 HDR plasmid | 400 ng/μL | 2,0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9 plasmid | 350 ng/μL | 1,1 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 4,2 μL | Na |
| total | 10 μL | 200 ng/μL | |
| Mikroinjektionsblanding: piggyBac-integration | |||
| Komponent | Koncentration af bestande | Beløb | Endelig koncentration |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2,0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402 transposase plasmid | 450 ng/μL | 0,9 μL | 40 ng/μL |
| Bu | Na | 7,1 μL | Na |
| total | 10 μL | 100 ng/μL | |
Tabel 1: Eksempler på mikroinjektionsblandinger. Plasmiderne og koncentrationerne for tre eksempler på mikroinjektionsblandinger: en for en gpa-3::GFP reporterkonstruktion10, en for CRISPR/Cas9-medieret forstyrrelse af Ss-tax-4 locus 14,15 og en for piggyBac-medieret integration af en Ss-gpa-3::GFP-konstruktion 13,17,18. strCas9 betegner Strongyloides codon-optimerede Cas9-genet. De endelige koncentrationer, der er anført, anvendes almindeligvis i Strongyloides mikroinjektionsblandinger.
- Fortynd plasmiderne i BU til et samlet volumen på 10-20 μL.
- Drej blandingen gennem en filtersøjle ved 5.000 × g i 1-2 min.
- Brug mikroinjektionsblandingen med det samme, eller opbevar den ved -20 °C til fremtidig brug.
4. Saml unge voksne Strongyloides til mikroinjektion: morgen på injektionsdagen
- Baermann-apparatet opsættes med 1 fækalkulsplade af unge voksne Strongyloides (figur 2).
BEMÆRK: Fækal-trækulpladen kan indeholde nogle infektiøse larver. Personlige værnemidler består af en kittel, handsker og øjenbeskyttelse. Ingen hud bør udsættes mellem handsken og ærmet på kitlen.
Figur 2: Baermann-apparatet, der bruges til at indsamle parasitære orme fra kulturer10. Indholdet af en fækal-trækulplade placeres øverst på en søjle med varmt vand. Ormene vandrer ind i vandet og samler sig i bunden af tragten. (A) For at opsætte Baermann-apparatet er stativet til Baermann-tragten fastspændt til bænken med en C-klemme. Et gummirør fastgjort til enden af tragten lukkes med klemmeklemmer, og en fangstspand placeres under røret til dryp. Varmt vand tilsættes til glastragten. (B) Plastringholderen til fækal-trækulsblandingen er derefter foret med 3 stykker laboratorievæv (venstre). En træpind eller tungedepressor (i midten) bruges til at overføre indholdet af en fækal-trækulsplade (højre) til plastringholderen. (C) Et nærbillede af bunden af plastringholderen til fækalkulsblandingen, der viser det dobbelte lag nylontyl, der forer bunden af holderen. (D) Fækalkulsholderen placeres derefter på toppen af glastragten. (E) Laboratorievævet fugtes med vand og lukkes over fækal-trækulsblandingen. Mere varmt vand tilsættes for det meste at nedsænke fækalkulet. (F) Den komplette Baermann-opsætning med fækalkulskulturen nedsænket under varmt vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Installer en glastragt med gummiopsamlingsrør på et ringstativ ved hjælp af en O-ring og fastgør den med en klemme. Luk opsamlingsslangen med 2 klemmeklemmer (figur 2A).
- Placer en fangstspand under tragten for at fange dryp.
- Der tilsættes varmt (ca. 40 °C) vand til tragten til 5 cm under kanten. Kontroller, at systemet ikke lækker.
- Beklæd Baermann holderen, en sigte lavet af 2 plastringe med 2 lag nylon tylnet fastgjort mellem dem, med 3 overlappende stykker laboratorievæv. Der tilsættes fækal-trækulsblandingen til Baermann-holderen (figur 2B,C).
- Anbring Baermann-holderen med fækal-trækulsblandingen i tragten. Fold vævene omkring fækal-trækulblandingen og tilsæt nok vand til at nedsænke det meste af fækalkullet. Fyld ikke over 2 cm fra tragtens kant (figur 2D,E).
- Top tragten med et 15 cm plastik petriskållåg for at indeholde lugten. Mærk tragten efter behov (figur 2F).
- Vent 30 minutter til 1 time for at samle ormene fra Baermann-apparatet.
- Hold et 50 ml centrifugerør under gummislangen i bunden af tragten. Åbn forsigtigt klemmerne i bunden for at dispensere 30-40 ml vand indeholdende orme i 50 ml røret.
- Overfør 15 ml Baermann-vandet indeholdende ormene til et 15 ml centrifugerør. Centrifugerøret på 15 ml drejes i 1 minut ved ~750 × g (langsomt). Alternativt kan du lade ormene sætte sig i 10-15 min.
- Fjern supernatanten til ~ 2 ml og kassér supernatanten i en affaldsvæskebeholder med jod for at dræbe eventuelle orme.
- Tilsæt mere Baermann-vand til 15 ml opsamlingsrøret, og gentag centrifugeringen. Supernatanten fjernes til ~2 ml, og den kasseres som i trin 4.11.
- Trin 4.11 og 4.12 gentages, indtil alle ormene er opsamlet i 15 ml centrifugeglasset. Efter det sidste spin skal du fjerne så meget vand som muligt.
- Undersøg pelleten af orme (40-100 μL) i bunden af røret. Hvis der ikke er synlige orme, skal du vente i yderligere 1-2 timer og prøve at samle flere orme fra Baermann-apparatet.
- Overfør ormene i så lidt vand som muligt til en 6 cm 2% NGM-plade med en græsplæne af E. coli HB101. Brug denne plade som kildeplade til mikroinjektionen.
- Kassér fækal-trækulsblandingen ved at behandle den med fortyndet jod (en 50% fortynding af Lugols jod i vand), indpakke den i plastfilm for at fange dryp og placere den i en biofarlig affaldsbeholder.
- Tilsæt 10 ml fortyndet jod til fangstspanden og dræn overskydende vand fra Baermann i den.
- Vask de genanvendelige komponenter (tragten, fangstspanden, plastholderen med tyl, plastlåget og klemmerne) med 10% blegemiddel og skyl grundigt.
5. Træk og ilægning af mikroinjektionsnåle: lige før injektion
- Forbered mikroinjektionsnåle ved at trække glaskapillærrør ved hjælp af en nåletrækker.
BEMÆRK: Eksempelindstillinger for en kommerciel nåletrækker udstyret med en 3 mm platin / iridiumfilament er Varme = 810-820, Træk = 800-820, mikrometer = 2,5. - Se spidserne under et dissekeringsmikroskop. Hvis nålene har den ønskede form (figur 3A-F), skal du trække 4-6 nåle (2-3 kapillære rør). For at opnå den korrekte nåleform skal du ændre indstillingerne efter behov: Juster indstillingerne for varme eller træk med 10 og træk nye nåle, indtil formen på konusen og skaftet er mere passende.
Figur 3: Mikroinjektionsnåle og en Strongyloides stercoralis voksen hun med optimale steder for mikroinjektion identificeret. (A-F) Billeder af mikroinjektionsnåle. (A-B) Akselkonus (A) og spidsen (B) af en nål, der er korrekt formet til mikroinjektion. Spidsen er skarp nok til at gennembore neglebåndet og smal nok til ikke at forårsage overdreven skade. (C-D) Akselkonus (C) og spidsen (D) af en mikroinjektionsnål, der er forkert formet til mikroinjektivisering. Spidsen er for stump og bred og vil forårsage overdreven skade på ormen. (ØF) Akselkonussen (E) og spidsen (F) af en nål, der sandsynligvis vil være for lang og slank til at fungere til mikroinjektion. Spidsen i F ligner meget spidsen i D. Skaftet er dog smallere og for fleksibelt til effektivt at gennembore neglebåndet. Derudover tilstoppes meget slanke nåle let. (G) Et billede af hele ormen korrekt placeret til mikroinjektion, forudsat at nålen kommer ind fra højre. Anterior er nede og til venstre; vulva er angivet med pilespidsen. Gonaden er synlig langs højre side af kvinden. Denne kvinde har kun et æg i livmoderen (angivet med stjernen). (H, I) Forstørrede visninger af mikroinjektionsstederne. Pilens vinkel tilnærmer injektionsnålens vinkel. Vulva kan bruges som et vartegn; det er på den modsatte side af ormen fra gonadens arme. Gonadens arme kurver rundt om tarmen, og enderne med de delende kerner er modsat vulvaen. (H) Gonadens bageste arm; I) den forreste arm. En eller begge arme kan injiceres. For H, I, er konventioner som i G. Skalastænger = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Klik her for at se en større version af denne figur.
- Opbevar de trukne nåle i et 15 cm plast petriskål med et stykke rullet tape for at sikre nålene og for at undgå støvophobning på spidserne.
- Anbring en dråbe på 0,7 μL af mikroinjektionsblandingen på den åbne ende af skaftet. Hæng nålen vinkelret på en hylde ved hjælp af et rullet stykke tape for at fylde det koniske skaft med blandingen inden for 10 minutter. Forbered 2 nåle ad gangen, hvis den første ikke virker.
6. Forberedelse af mikroskopet og brud på nålen
BEMÆRK: Microinjection bruger et omvendt mikroskop med 5x og 40x mål udstyret med en mikroinjektoropsætning til at kontrollere nålens bevægelse. Det omvendte mikroskop skal placeres på et tungt bord eller vibrationsdæmpende luftbord for at reducere vibrationsstøj. Mikroinjektornålholderen er forbundet til nitrogengas, der anvender det tryk, der er nødvendigt for at levere mikroinjektionsblandingen. Et mindre dissekeringsmikroskop i nærheden bruges til at overføre ormene.
- Indstil gastankens tryk til ~ 40-60 psi for at bryde nålen og til ~ 30-50 psi for mikroinjektivisering, afhængigt af væskestrømmen.
- På dissekeringsmikroskopet skal du dække glasskårene på mikroinjektionspuden med halocarbonolie ved hjælp af en standard platinormpluk.
- Placer microinjection pad coverslip på microinjection scope og find glasskår dækket af olie. Juster glasskårene, så en kant er vinkelret på nålens retning for at tjene som overfladen, der bruges til at bryde nålen.
- Kontroller, at nålen ikke har bobler eller snavs i den koniske aksel ved hjælp af dissekeringsmikroskopet. Fastgør derefter nålen 1-1,5 cm i trykholderen.
- Placer spidsen af nålen i midten af mikroskopets synsfelt med øjet. Placer derefter nålens spids i synsfeltet vinkelret på siden af glasskårene under lav forstørrelse.
- Skift til høj effekt, og juster spidsen af nålen med kanten af glasset, nær, men rør ikke ved det.
BEMÆRK: Når de trækkes, smeltes nålene sammen. - For at bryde spidsen af nålen for at tillade væskestrøm skal du banke den forsigtigt på siden af glasstykket, mens du påfører kontinuerligt tryk fra gassen (supplerende figur S1). Når væsken begynder at strømme, skal du kontrollere spidsens form og sikre, at den er skarp med let flydende væske.
BEMÆRK: Hvis væsken flyder for hurtigt, eller enden er for stump, vil ormene blive beskadiget under mikroinjektion (video 1 og figur 3A-F). - Når væsken flyder godt fra nålen, skal du flytte mikroinjektionsglasset til dissekeringsomfanget og placere dråber af 1-2 μL halocarbonolie på agarpuden til placering af ormene.
- Overfør 20-30 unge voksne Strongyloides til en 2% NGM-plade uden bakterier i mindst 5 minutter for at fjerne overskydende overfladebakterier og vælg enkelte orme til mikroinjektion. Tilsæt flere orme til NGM-pladen efter behov under injektion.
7. Mikroinjektion af Strongyloides
- Brug en lille mængde halocarbonolie på en ormepluk til at vælge en Strongyloides ung voksen kvinde med 1-4 æg i hendes gonad fra 2% NGM-pladen uden bakterier.
- Overfør ormen til en lille dråbe olie på agarpuden. Brug ormeplukket til forsigtigt at placere ormen, så den ikke er oprullet, og gonaden er synlig og let tilgængelig. Bemærk gonadens retning (figur 3G).
- Placer ormen i mikroinjektionsmikroskopets synsfelt. Sørg for, at gonaden er på samme side som nålen og placeret, så nålen kommer i kontakt med gonaden i en lille vinkel (figur 3H,I).
- Bring spidsen af nålen til siden af ormen i samme brændplan. Sigt efter gonadarmen nær midten af ormen. Brug mikroinjektoren til at indsætte nålen forsigtigt i gonaden (Video 2).
- Påfør straks tryk på nålen for forsigtigt at fylde hele gonadarmen med DNA-opløsningen. Bestem med øjet, hvornår der er injiceret nok væske (Video 2).
BEMÆRK: Det kan tage op til 2 s at fylde gonaden. - Fjern nålen, og kontroller, at såret lukker.
BEMÆRK: Ormen er for beskadiget til at producere afkom, hvis gonaden stikker ud gennem kropsvæggen (Supplerende video S1). - Gentag med gonadens anden arm, hvis den er synlig.
- Når du er færdig med at injicere, skal du hurtigt kontrollere, at nålen ikke er tilstoppet ved at påføre tryk med spidsen af nålen på agarpuden. Overfør diaset med den injicerede orm til dissekeringsmikroskopet.
- For at genvinde den injicerede orm skal du først placere et par dråber BU på ormen for at flyde den ud af agarpuden.
- Saml en lille mængde HB101 bakterier på en orm pick. Rør ormen med de klæbende bakterier på ormvalget for at fjerne det fra væsken.
- Overfør forsigtigt ormen til genopretningspladen , en 2% NGM-plade indeholdende en HB101-græsplæne.
BEMÆRK: Ormen skal begynde at kravle inden for få minutter. - Efter at et par kvinder er blevet injiceret, skal du tilføje nogle uinjicerede mænd fra kildepladen.
BEMÆRK: Mindst en mand til fem kvinder er en god basislinje; et overskud af mænd foretrækkes. - Gentag alle trin, indtil der er injiceret nok kvinder til eksperimentet.
- Lad de voksne stå på restitutionspladen i mindst 1 time efter injektionen for at give ormene mulighed for at komme sig og parre sig.
8. Genopretning og dyrkning af injicerede Strongyloides
- Saml afføring natten over fra uinficerede værtsdyr ved hjælp af samme protokol som for inficerede dyr.
- Bland den uinficerede afføring med en lille mængde trækul (afføring til trækulforhold på ca. 2 til 1 for disse plader).
- Hæld en lille mængde af fækalkulblandingen i en 6 cm petriskål foret med fugtigt filterpapir. Sørg for, at blandingen ikke rører skålens låg.
- Oversvøm genopretningspladen med BU. Brug et pipettesæt til 3 μL, overfør ormene til afføringen i fækalkulpladen. Placer ormene direkte på afføringen, ikke på trækulet.
- Kontroller, at de voksne er på fækalkulpladen ved hjælp af et dissekeringsomfang.
- For at dyrke ormene skal du placere pladen i et befugtet kammer, dvs. en plastkasse med et tætsluttende låg foret med fugtige papirhåndklæder.
BEMÆRK: Efter 2 dage vil der være en blanding af larvestadier. Efter 5 dage vil de fleste larver have udviklet sig til iL3'er; et par yngre larver vil forblive. Efter 7 dage skal alle larverne være iL3'er.
9. Indsamling og screening af F 1 larver for at genvinde transgenik / knockouts
- Ved hjælp af en Baermann-opsætning opsamles larverne fra de små fækalkulsdyrkningsplader efter injektion. For at få så mange larver som muligt skal du vente i mindst 2 timer, før du genvinder ormene fra Baermann-apparatet.
- Koncentrer larverne i et 15 ml centrifugerør som i trin 4.10-4.14 og overfør larverne til et lille urglas med BU.
- Hvis larverne vil blive brugt til adfærdsmæssige eksperimenter, skal du bruge 2% NGM-plader med en tyk græsplæne af HB101 til screening.
- Overfør 20-30 larver til HB101 græsplænen.
BEMÆRK: Bakterierne vil bremse larvernes bevægelse. - Under et fluorescens dissekeringsmikroskop skal du identificere larverne, der udtrykker transgenet af interesse. Brug en ormpluk til at vælge de transgene larver og flyt dem til et lille urglas med BU.
- Brug en ny HB101-plade til at screene endnu et lille parti larver. Når der er indsamlet nok larver til eksperimentel brug, skal hb101-pladerne og de overskydende orme behandles med fortyndet jod (50% Lugols jod fortyndet i vand) og kasseres som biofarligt affald. Alternativt kan du dræbe de overskydende orme ved hjælp af koncentreret kennelrens indeholdende alkylbenzylammoniumchlorider.
- Brug ormene med det samme eller lad dem stå i et lavt urglas i en lille mængde BU natten over.
BEMÆRK: Orme kan blive hypoxiske, hvis væsken er for dyb. Det er muligt, at efterlade larver i BU natten over kan påvirke visse adfærd; Brug derfor larver til adfærdsmæssige eksperimenter inden for 6 timer.
- Overfør 20-30 larver til HB101 græsplænen.
- Hvis larverne vil blive brugt til mikroskopi og ikke adfærdsmæssige assays, skal du immobilisere ormene ved nikotinlammelse reversibelt til screening.
- Brug et barberblad til at score et gitter på plastbunden af en 10 cm kemotaxiplade12 for at gøre det lettere at holde styr på ormens placering på pladen.
- Slip ~ 3 μL larver i BU i en firkant på gitteret. Fyld så mange firkanter som nødvendigt. Brug ikke dem nær pladens kanter, da larverne kan krybe til siderne af pladen.
- Tilsæt 15-20 μL dråber 1% nikotin i vand til ormdråberne.
BEMÆRK: Efter 4 min vil ormene blive lammet. - Screen ormene ved hjælp af et fluorescens dissekeringsmikroskop.
- Brug en ormpluk til at overføre de transgene larver til et lille urglas med 1-2 ml BU.
BEMÆRK: Larverne vil være lammet i flere timer og kan let monteres på mikroskopglas til mikroskopi. Hvis de efterlades natten over i BU, vil iL3'erne komme sig og kan bruges til nogle assays eller pattedyrs værtsinfektion. Imidlertid kan nikotinlammelse og inkubation natten over i BU påvirke visse adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis forsøget var vellykket, vilF1 larverne udtrykke den transgene og / eller mutante fænotype af interesse (figur 4). Transformationshastigheder er imidlertid meget variable og afhænger af konstruktionerne, ormenes sundhed, dyrkningsbetingelserne efter injektion og eksperimentatorens dygtighed. Generelt vil et vellykket forsøg give >15 F1 larver pr. injiceret hun og en transformationshastighed på >3% for fluorescerende markører. Hvis det samlede antal levende afkom i gennemsnit er mindre end 10 larver/hunner, er det muligt, at konstruktionen er giftig, og de transformerede larver overlever ikke. At finde et stort antal fluorescerende æg, men ikke fluorescerende larver, er en anden indikation på, at injektionsblandingen kan være giftig. Når man først lærer teknikken, anbefales det at bruge en konstruktion, der udtrykker sig godt, såsom act-2::mRFPmars, som driver robust udtryk i kropsvægsmuskel13 (figur 4).
Ved generering af mutanter ved CRISPR/Cas9-medieret målrettet mutagenese anbefales det at anvende en reparationsskabelon, der indeholder en act-2::mRFPmars eller act-2::GFP transgen13, således at potentielle mutanter kan identificeres på grundlag af fluorescens 9,14,15. Det er vigtigt at bemærke, at fordi Strongyloides udtrykker transgener fra ekstrakromosomale arrays, kan fluorescerende F1-afkom udtrykke mRFPmars eller GFP fra arrayet alene eller udtrykke mRFPmars eller GFP fra både arrayet og et integreret transgen 3,9,16. Det er muligt at identificere larver, der er mere tilbøjelige til at have integrerede transgener baseret på mønsteret af fluorescerende udtryk: "ujævn" ekspression i kropsvægsmusklen (figur 4A) er mere almindelig, når transgenet ikke er integreret i genomet, mens konsistent ekspression i hele kropsvægsmusklen (figur 4B) ) indikerer ofte, men ikke altid, at transgenet er integreret i genomet. Udtryksmønstre alene kan dog ikke bruges til endeligt at identificere mutanter - nogle orme med ensartet udtryk i hele kropsvægsmusklen har muligvis ikke integrationshændelser. Desuden kan udtryksmønstre ikke skelne mutanter, der er homozygote, fra dem, der er heterozygote eller mosaik. Således skal hver orm være PCR-genotypet 9,14,15. Ved forstyrrelse af gener, der giver let synlige fænotyper, er det muligvis ikke nødvendigt at bruge en reparationsskabelon. For eksempel resulterer forstyrrelse af Strongyloides unc-22-genet i en dominerende "twitcher" -fænotype med hastigheder af heterozygote eller homozygote forstyrrelser over 10%9.
Figur 4: Transgene Strongyloides stercoralis larver. (A, B) S. stercoralis larver, der udtrykker en akt-2::mRFPmars transgen, som udtrykker i kropsvægsmusklen13. Transgenet blev indarbejdet i en reparationsskabelon til CRISPR/Cas9-medieret forstyrrelse af Ss-unc-22 locus9. (A) En S. stercoralis larve med et ufuldstændigt eller "ujævnt" act-2::mRFPmars udtryksmønster , der kan indikere udtryk fra et ekstrakromosomalt array. (B) En S. stercoralis iL3, der udtrykker det mere komplette act-2::mRFPmars ekspressionsmønster , der kan indikere genforstyrrelse og integration af reparationsskabelonen. For A, B viser paneler differentiel interferenskontrast (venstre), fluorescerende (midterste) og flettede (højre) billeder. Skalastænger = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Demonstration af nålebrydningsprocessen for at fremstille en brugbar nål. Nålens spids bankes mod kanten af et glasskår (genstand yderst til venstre). Når der kommer væske frem, trækkes nålen tilbage og flyttes ned på agaren. Nålespidsen kommer til et skarpt punkt, og væsken strømmer moderat hurtigt. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Demonstration af en vellykket injektion. Gonadens bageste arm er synlig som en lysegrå struktur til højre. Spidsen af nålen og gonaden skal være i samme fokusplan. Hvis nålen glider over eller under ormen eller langs kroppen uden at fange, skal du justere positionen. Nålens spids vil let indrykke kropsvæggen. Et hurtigt tryk på nåleholderen, der er fastgjort til mikromanipulatoren, skubber forsigtigt spidsen gennem kropsvæggen og ind i gonaden. Når nålen er inde i gonaden, skal du anvende tryk og injicere DNA-opløsningen. Væsken skal synligt oversvømme gonaden. Hvis såret lukker, når spidsen af nålen fjernes, vil ormen sandsynligvis overleve. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende materiale: Vedligeholdelse af strongyloides-belastning . Denne protokol beskriver vedligeholdelsesproceduren for S. stercoralis i gerbils og S. ratti hos rotter. Det omfatter den infektiøse dosis, der anvendes til hver nematode og vært. Værter inficeres via subkutane injektioner under anæstesi. Progressionen af infektioner fra patency til peak larveproduktion til tab af patency er beskrevet for hver nematode-værtskombination. Protokollen, der bruges til at indsamle inficeret afføring og fremstille dyrkningspladerne til fækalt trækul, er også beskrevet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S1: Et billede af et mikroinjektionsglas bestående af en tørret agarpude på en dækslip med et lille glasskår til at bryde mikroinjektionsnålen. Agar-omridset og skårkonturen tilføjes her for klarhedens skyld. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film S1: Demonstration af en injektion, der resulterer i en beskadiget gonad. Gonadens forreste arm er i fokus. Anvendelse af let tryk viser, at opløsningen i nålen stadig flyder frit ud. Nålens spids er i samme brændplan som gonaden og er rettet mod en lille vinkel. Når spidsen af nålen er indsat, injiceres opløsningen i ormen og fylder gonaden. Men når nålen fjernes, stikker et stykke af gonaden ud gennem såret i neglebåndet. Materialet flyder synligt ud. Denne orm er usandsynligt at overleve. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne mikroinjektionsprotokol beskriver metoderne til introduktion af konstruktioner til transgenese og CRISPR/Cas9-medieret mutagenese i S. stercoralis og S. ratti. For både S. stercoralis og S. ratti er overlevelse efter injektion og transgenese eller mutagenese underlagt flere variabler, der kan finjusteres.
Den første kritiske overvejelse for vellykket transgenese er, hvordan plasmidtransgener konstrueres. Tidligere undersøgelser har vist, at ekspression af eksogene transgener i Strongyloides kræver brug af Strongyloides 5' promotorer og 3' UTR-elementer 3,13,19. I lighed med C. elegans-konstruktioner bruger Strongyloides-konstruktioner generelt en genspecifik promotor og en fælles 3'UTR, såsom den fra Ss-æra-1-genet 13. Codon-optimering af kodningsområdet kan også være vigtig for udtryk i Strongyloides. For nylig blev Wild Worm Codon Adaptor, en webbaseret app, der codonoptimerer kodningssekvenser for Strongyloides og andre nematoder, udviklet20. Endelig, selvom de ikke er strengt testet i Strongyloides, har introns vist sig at øge ekspressionen af eksogene transgener i både C. elegans21 og den insektassocierede nematode Pristionchus pacificus22 og antages også at øge ekspressionen i Strongyloides. Wild Worm Codon Adaptor har muligheder for at inkludere op til tre introns i den modificerede sekvens20.
Sammensætningen og leveringen af mikroinjektionsblandingen påvirker transgenesehastigheden og overlevelsen afF1-afkom . BU saltvand bruges rutinemæssigt som fortyndingsmiddel til blandinger, selvom brug af ddH2O også er en mulighed. Koncentrationerne og/eller forholdet mellem komponenter i blandingen kan justeres for at forbedre transformationshastigheden. Højere koncentrationer af plasmider af interesse kan øge transgenesehastigheden, men resulterer ofte i færre samlede afkom. Hvis der ikke observeres noget transgene udtryk, eller der kun findes døde transgene æg, er det muligt, at transgene er giftige, eller at noget i plasmidbestandene forårsager transgenes død. I sidstnævnte tilfælde kan det være tilstrækkeligt at fremstille nye plasmidbestande ved hjælp af en anden metode (f.eks. ved hjælp af et andet miniprep-kit) til opnåelse af transgene lægemidler. Tilsætning af lipofectamin til mikroinjektionsblandingen kan også forbedre transgenesehastigheden23.
Formen på mikroinjektionsnålen, der leverer blandingen, påvirker også overlevelses- og transgenesehastighederne (figur 3A-F, video 1, video 2 og supplerende video S1). Nålen skal være skarp nok til at trænge ind i neglebåndet og smal nok til ikke at resultere i overdreven skade. Det anbefales at trække nåle lige før brug, da nåle, der opbevares i mere end en dag, kan akkumulere snavs og blive tilstoppede under mikroinjektioner. Gendannelse af injicerede hunner fra mikroinjektionspuden uden at beskadige dem kan opnås med et par forskellige metoder. En teknik er at flyde ormene fra injektionspuden i en dråbe BU og derefter bruge HB101 på en ormpluk til at samle ormene. Andre teknikker til genopretning omfatter at flyde ormene i BU og samle dem ved hjælp af en pipettespids eller en lille pensel eller blot bruge en ormpluk alene til at flytte ormene til en genopretningsplade.
Hvis der ikke blev opnået afkom fra de mikroinjicerede hunner, tyder dette på, at enten de injicerede hunner blev beskadiget i mikroinjektionsprocessen, eller at dyrkningsbetingelserne efter injektionen var suboptimale. Der er en række forskellige dyrkningsforhold efter injektion, der kan prøves. De småskala fækale trækulkulturer, der er beskrevet ovenfor, understøtter generelt bedre ormeoverlevelse end NGM-plader med HB101. Det kan dog være svært at følge overlevelsen af de injicerede orme og udviklingen af F1-larverne på fækale trækulplader, og æg er ikke synlige på disse plader. En fordel ved dyrkning af orme på NGM-plader med HB101 i stedet for fækale trækulsplader er at muliggøre omhyggelig observation af æglægning og larveudvikling, hvilket kan være nyttigt til fejlfinding. V12 plader med HB101 kan også bruges til at øge overlevelse24. Endelig kan en kemotaxiplade12 med en enkelt rotte fækal pille anvendes til S. ratti dyrkning efter injektion. Hannerne og injicerede hunner overføres direkte til rottefækal pellet. Om 5-7 dage opsamles orme fra agar og afføring ved hjælp af et Baermann-apparat, som beskrevet ovenfor.
For at opnå Strongyloides voksne til mikroinjektion kan frisklavede fækale trækulsplader inkuberes ved 25 ° C i 24 timer eller 20 ° C i 48 timer. Strongyloides voksne opdrættet ved 25 ° C i 24 timer er unge nok til at producere et stort antal afkom25. Men hvis hunnerne er for unge, overlever de muligvis ikke mikroinjektionsprocessen. Voksne indsamlet fra fækale trækulplader, der er blevet inkuberet ved 20 ° C i ~ 48 timer, er mere tilbøjelige til at tolerere mikroinjektionsprocessen. Men fordi disse voksne er ældre end voksne opnået fra en 24 timers inkubation ved 25 ° C, er de ikke så fecund og kan have en lavere transformationshastighed. Nybegyndere foretrækker måske at starte med ældre voksne og derefter skifte til lidt yngre voksne, efterhånden som færdighederne forbedres.
Ligesom C. elegans kan Strongyloides-arter udtrykke transgener fra ekstrakromosomale arrays og genomintegrerede konstruktioner i F1-generationen . I modsætning til C. elegans vil Strongyloides-arter kun udtrykke genomintegrerede transgener i F2 og efterfølgende generationer, selvom de ekstrakromosomale arrays stadig kan påvises af PCR13. F1 transgene larver, der udtrykker ekstrakromosomale arrays, kan bruges til eksperimenter, der ikke kræver genomintegration eller et stort antal transgene orme. Genomintegration kan være påkrævet for eksperimenter, der kræver mærkning af endogene gener eller test af et stort antal orme i populationsbaserede assays. Der er to metoder til genomintegration af transgener i Strongyloides: piggyBac transposon-medieret integration17 og CRISPR/Cas9-medieret integration9. piggyBac transposon-medieret integration bruger piggyBac-transposase til at målrette last til TTAA-steder i genomet26. Fordi TTAA-motivet er ret almindeligt i det AT-rige genom af Strongyloides-arter , er integration ofte på mere end et sted i genomet. I modsætning hertil kan CRISPR/Cas9-medieret integration bruges til at integrere transgener på et specifiktmållokus 9.
CRISPR/Cas9-systemet kan også bruges til at generere målrettede gen knockouts 9,27. På grund af Strongyloides-genomets AT-rigdom er det en udfordring at finde brugbare Cas9-målsteder, der indeholder den optimale 5'-N18GGNGG-3' sekvens for nematoder28. Ofte er der kun et eller to steder i et gen til målretning. Den foretrukne metode involverer integration af en reparationsskabelon indeholdende et transgen med en fluorescerende markør ved homologi-rettet reparation i det genomiske locus, hvilket resulterer i fuldstændig forstyrrelse af genet. Potentielle knockouts kan identificeres ved udtryk af transgenet 9,14,15,29. Transgene udtryk alene er imidlertid ikke tegn på genotype, da udtryk fra arrays vs. integrerede transgener ofte ikke kan skelnes. Således kræver F1 transgene larver post-hoc genotypning for at identificere homozygote knockouts9. I mangel af en reparationsskabelon forekommer mutagenese af mållokus ved høj frekvens, men kan resultere i store sletninger9.
Selvom generering af transgene eller mutante F1 larver er relativt ligetil i S. stercoralis, er det ekstremt vanskeligt at generere stabile linjer på grund af behovet for værtspassage. I laboratoriet er den mongolske gerbil en tilladende vært for S. stercoralis, men kræver en høj dosis orme for at etablere en infektion, der er i stand til at producere nok F2 larver til at etablere linje30. Kun ca. 6% af infektiøse larver bliver parasitære hunner30. Desuden, hvis de transgene larver har array-ekspression uden genomintegration, vil de ikke producere det transgenekspressive afkom, der kræves for at inficere en anden gerbil-vært. For at øge chancerne for, at et tilstrækkeligt antal genomintegrerede larver bliver reproduktive parasitære voksne, anbefales mindst 400-500 transgene larver i det indledende inokulum. Det kan være muligt at reducere antallet af larver, der kræves for at etablere en patentinfektion ved at behandle gerbilerne med prednison30. Ikke desto mindre vil det sandsynligvis være vanskeligt at samle nok integrerede transgene eller mutante orme til med succes at etablere en stabil linje af S. stercoralis. Det er dog normalt muligt at samle et tilstrækkeligt antal transgene S. stercoralis F1 larver til enkeltormsassays14,15.
Strongyloides ratti har den klare fordel, at det er mere muligt at generere stabile transgene eller knockout-linjer17,31. S. ratti fritlevende voksne hunner er mindre tolerante over for mikroinjektionsprocessen end S. stercoralis fritlevende voksne hunner; S. ratti hunner producerer generelt færre samlede larver end S. stercoralis hunner, og transformationshastigheden er også lavere31. Imidlertid kræves kun nogle få transgene eller knockout F1 larver for at etablere en stabil linje af S. ratti. Da S. ratti er en naturlig parasit af rotter, er kun få S. ratti infektiøse larver tilstrækkelige til at etablere en patentinfektion32. Det er således generelt muligt at samle et tilstrækkeligt antal transgene eller mutante larver til at etablere en stabil linje. Fordi Strongyloides-arter ikke vil udtrykke ekstrakromosomale arrays forbi F1-generationen, kan kun genomintegrerede F1-larver producere en stabil transgen linje13. Det er generelt umuligt at identificere orme med integrerede transgener før genotypning, så protokollen er at indsamle alle transgene F1 larver og injicere dem i en rotte. En lille procentdel af disse larver vil have den ønskede integrationsbegivenhed; disse larver vil danne grundlag for den stabile linje. Da piggyBac-metoden ofte resulterer i mere end én integrationshændelse i en enkelt orm, kan der opnås næsten 100% transmission af transgenet efter et par runder med passaging af transgene larver gennem en rotte17.
Sammenfattende kan teknikken beskrevet her bruges til at generere transgen eller knockout S. stercoralis og S. ratti. Dette muliggør en bred vifte af potentielle eksperimenter, herunder men ikke begrænset til det cellespecifikke udtryk for transgener, dannelsen af mutanter og den endogene mærkning af proteiner for at bestemme rumlige og tidsmæssige funktioner 14,15,29,33,34,35. I det lange løb kan viden opnået ved brug af transgene Strongyloides bruges til at udvikle nye strategier til bekæmpelse af humane infektioner med S. stercoralis og andre intestinale parasitiske nematoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
pPV540 og pPV402 var venlige gaver fra Dr. James Lok ved University of Pennsylvania. Vi takker Astra Bryant for nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af en Burroughs-Wellcome Fund Investigators i Patogenese of Disease Award, en Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award og National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
