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Developmental Biology

माउस और मानव दांतों से एकल कोशिकाओं का तेजी से अलगाव

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63043
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3
1Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Masaryk University, 2Department of Molecular Neuroimmunology, Centre for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक लगातार बढ़ते माउस कृंतक, माउस दाढ़ और मानव दांतों से एकल-सेल आरएनए-सेक विश्लेषण के लिए उपयुक्त एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तेज, कुशल और कोमल विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

माउस और मानव दांत एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक या अन्य अनुप्रयोगों के लिए त्वरित और कुशल सेल अलगाव के लिए चुनौतीपूर्ण अंगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। दंत लुगदी ऊतक, बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में समृद्ध, एक लंबी और थकाऊ पृथक्करण प्रक्रिया की आवश्यकता होती है जो आमतौर पर एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए उचित समय से परे होती है। जीन अभिव्यक्ति में कृत्रिम परिवर्तनों से बचने के लिए, एक जानवर को euthanizing से गुजरे समय को तब तक जब तक कि एकल कोशिकाओं के विश्लेषण को कम करने की आवश्यकता न हो। यह काम एक तेज प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो माउस और मानव दांतों से एकल-सेल निलंबन को scRNA-seq (एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण) के लिए उपयुक्त उत्कृष्ट गुणवत्ता में प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल त्वरित ऊतक अलगाव चरणों, एंजाइमेटिक पाचन और अंतिम एकल-सेल निलंबन की बाद की तैयारी पर आधारित है। यह ऊतकों के तेजी से और कोमल प्रसंस्करण को सक्षम बनाता है और उच्च व्यवहार्यता और न्यूनतम ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के साथ सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए अधिक पशु या मानव नमूनों का उपयोग करने की अनुमति देता है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह प्रोटोकॉल न केवल माउस या मानव दांतों पर बल्कि उपास्थि, घने संयोजी ऊतक और डर्मिस सहित अन्य बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स-समृद्ध ऊतकों पर भी एससीआरएनए-सेक करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन कर सकता है।

Introduction

एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण विवो सेल जनसंख्या संरचना, पदानुक्रम, इंटरैक्शन और होमोस्टैसिस 1,2 में समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, इसके परिणाम दृढ़ता से इस उन्नत विश्लेषण के पहले चरण पर निर्भर करते हैं - जटिल, अच्छी तरह से संगठित ऊतक से सही गुणवत्ता के एकल-सेल निलंबन की तैयारी। इसमें कोशिकाओं को जीवित रखना और कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अवांछित, कृत्रिम परिवर्तनों को रोकना शामिल है3,4। इस तरह के परिवर्तनों से जनसंख्या संरचना के गलत लक्षण वर्णन और एकत्र किए गए डेटा की गलत व्याख्या हो सकती है।

ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला से बाहर अलगाव के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं5,6,7,8। वे आमतौर पर विभिन्न प्रोटियोलिटिक एंजाइमों के साथ आगे के इनक्यूबेशन के साथ संयोजन में यांत्रिक पृथक्करण को नियोजित करते हैं। इनमें आमतौर पर ट्रिप्सिन, कोलेजेनेस, डिस्पैज़, पपेन 6,7,8,9, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम मिश्रण जैसे कि Accutase, Tryple, आदि शामिल हैं। ट्रांसक्रिप्टोम की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाला सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा एंजाइमेटिक पाचन है। यह दिखाया गया था कि 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमों के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है और कई तनाव से संबंधित जीनों के अपरेगुलेशन का कारण बनती है10,11,12,13। अलगाव प्रक्रिया का अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर इसकी समग्र लंबाई है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि ऊतक ischemia14 के बाद सेल ट्रांसक्रिप्टोम बदल जाते हैं। यह प्रोटोकॉल माउस और मानव दांतों से एकल कोशिकाओं के कोमल अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, अन्य की तुलना में तेज, जटिल ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव के लिए पहले उपयोग किए गए प्रोटोकॉल5,6,9,11,13,15,16।

यह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कि हार्ड दांत से नरम ऊतक को जल्दी से कैसे विच्छेदित किया जाए और एससीआरएनए-सेक के लिए उपयुक्त एकल-सेल निलंबन तैयार किया जाए। यह विधि केवल एक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को नियोजित करती है और ऊतक हैंडलिंग और पाचन समय को कम करके और ऊतक और कोशिकाओं को अधिकांश समय 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर अवांछित ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के प्रभाव को कम करती है। प्रक्रिया एक उदाहरण के रूप में माउस incisors, दाढ़, और मानव ज्ञान दांतों से कोशिकाओं के अलगाव का प्रदर्शन करती है, लेकिन मुख्य रूप से विभिन्न जीवों में अन्य दांतों के लिए काम करना चाहिए। पूरा प्रोटोकॉल योजनाबद्ध रूप से चित्र 1 में विज़ुअलाइज़ किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग हाल ही में माउस और मानव दांतों से प्राप्त एक दंत कोशिका प्रकार एटलस उत्पन्न करने के लिए किया गया है1।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को अंतर्राष्ट्रीय और स्थानीय नियमों के अनुसार किया गया था और शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय, चेक गणराज्य (MSMT-8360/2019-2) द्वारा अनुमोदित किया गया था; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3)। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण पुरुष और मादा वाइल्डटाइप C57BL/6 और CD-1 चूहों दोनों के साथ और आनुवंशिक रूप से संशोधित Sox10::iCreERT2 mice17 (विभिन्न रिपोर्टर सिस्टम के साथ संयुक्त) के साथ C57BL/6 पृष्ठभूमि पर किया गया था। मानव नमूनों के साथ प्रयोग चिकित्सा संकाय की नैतिकता के लिए समितियों के अनुमोदन के साथ किया गया था, Masaryk University Brno और St. Anne's Faculty Hospital in Brno, चेक गणराज्य।

1. प्रयोगात्मक सेट-अप और समाधान की तैयारी

  1. उपकरण सेट-अप
    1. सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    2. इनक्यूबेशन कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    3. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) मशीन प्रारंभ करें और सॉर्टर (संग्रह ट्यूब धारक सहित) के सभी तापमानों को 4 °C पर सेट करें। उपकरण गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन, ड्रॉप देरी सेट करें।
    4. प्रारंभिक गेटिंग रणनीति सेट करें और परीक्षण सॉर्टिंग करें।
      नोट:: FACS का उपयोग करते समय, 100 μm नोजल का उपयोग करें।
  2. समाधान तैयार करें (चरण 1.2.1-1.2.3).
    1. धोएं समाधान: HBSS (हैंक्स संतुलित नमक समाधान) में ताजा 2% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) तैयार करें।
    2. पाचन मिश्रण: ताजा कोलेजनेस पी (3 यू / एमएल) पूरी तरह से एचबीएसएस में भंग हो तैयार करें।
    3. वैकल्पिक: ताजा HBSS + BSA (0.04%) तैयार करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर एकल-सेल निलंबन को संग्रहीत करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में विश्लेषणात्मक ग्रेड मेथनॉल को ठंडा करें।
      नोट:: चरण 1 प्रयोग की शुरुआत से पहले प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। उपयोग किए गए समाधानों की संरचना को अनुपूरक तालिका 1 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

2. प्रयोगात्मक जानवरों और मानव दांत की तैयारी

  1. प्रयोगात्मक जानवरों (माउस) तैयार करें।
    1. स्थानीय नियमों के अनुसार माउस Euthanize; उदाहरण के लिए एनेस्थेटिक्स ओवरडोज द्वारा जैसा कि पहले वर्णित है1।
      सावधानी: प्रयोगात्मक जानवरों के मानवीय euthanizing के लिए नियम स्थानीय रूप से भिन्न होते हैं। हमेशा वैध स्थानीय नियमों का पालन करें।
    2. तुरंत ऊतक विच्छेदन चरण (चरण 3) के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: यदि प्रयोगात्मक जानवरों से ऊतक को तुरंत विच्छेदित नहीं किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, पशु आवास सुविधा से स्थानांतरण के कारण), प्रयोगात्मक जानवरों को बर्फ पर रखें और जितनी जल्दी हो सके ऊतक विच्छेदन करें। माउस दाढ़ लुगदी से अधिक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, छोटे (6 सप्ताह और उससे कम) जानवरों का उपयोग करें। बढ़ती उम्र के साथ, दंत लुगदी का आकार कम हो जाता है। माउस incisors ज्यादातर बढ़ती उम्र के साथ अपनी संरचना रखते हैं ताकि विभिन्न उम्र के जानवरों को ऊतक विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सके।
  2. मानव दांत तैयार करें
    नोट: मानव दांतों को नैदानिक रूप से प्रासंगिक कारण के लिए निकाला गया था। प्रत्येक निदान का व्यक्तिगत रूप से इलाज किया गया था, और एक अनुभवी दंत सर्जन ने हमेशा दांत निष्कर्षण किया।
    1. ताजा निकाले गए दांत को तुरंत बर्फ-ठंडे एचबीएसएस के साथ 50 एमएल ट्यूब में डालें और ट्यूब को आगे के प्रसंस्करण तक बर्फ पर रखें।
      नोट: 25-30 वर्ष की आयु तक रोगियों से बनाए रखे गए ज्ञान दांतों का उपयोग करना उच्चतम सेल उपज के लिए अनुशंसित है।

3. ऊतक विच्छेदन

  1. प्रयोगात्मक जानवर को अपने सिर के पीछे पकड़ो, अपने सिर के वेंट्रल पहलू को देख रहे हैं ताकि पूंछ दूर हो जाए।
  2. छोटे, तेज कैंची का उपयोग करके, मैंडिबुलर आर्क को उजागर करने के लिए मैंडिबल से त्वचा को जल्दी से हटा दें, मैंडिबल्स के प्रत्येक आधे हिस्से के बीच नरम ऊतक, और आसन्न चेहरे की मांसपेशियों।
    1. मैंडिबल के प्रत्येक तरफ से एक गहरी कटौती करें; सबसे पहले, टेम्पोरोमैंडिबुलर संयुक्त तक मैंडिबल के बुक्कल पक्ष के साथ एम. मैसेटर के माध्यम से, और फिर मौखिक गुहा के आधार के माध्यम से मैंडिबल के प्रत्येक आधे हिस्से के आंतरिक भाग के साथ ( अनुपूरक चित्रा 1 देखें)।
  3. मौखिक गुहा के बाहर और अंदर दोनों से temporomandibular संयुक्त तक मैंडिबल के साथ सभी मांसपेशियों और स्नायुबंधन में कटौती।
    नोट: हड्डियों को काटने से बचें। यह incisor के सबसे एपिकल भाग को नुकसान पहुंचा सकता है।
  4. मुड़ी हुई टिप चिमटी का उपयोग करके मैंडिबल को समझें और इसे हटा दें। फिर, मैंडिबुलर सिम्फिसिस के माध्यम से काटकर कैंची के साथ दो हिस्सों में विच्छेदित मैंडिबल को विभाजित करें ( अनुपूरक चित्र1 देखें)।
  5. मैंडिबल के प्रत्येक आधे हिस्से से शेष नरम ऊतक को चाफ करने के लिए एक औद्योगिक कम लिंट वाइप का उपयोग करें। मैंडिबल के दोनों हिस्सों को साफ करने के बाद, उन्हें बर्फ-ठंडे एचबीएसएस के साथ एक पूर्व-तैयार पेट्री डिश में रखें।
    नोट: इस बिंदु से आगे, बर्फ पर काम करें। माउस incisors और दाढ़ के आगे विच्छेदन एक काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ एक stereomicroscope के तहत किया जाता है।
  6. माउस मैंडिबुलर कृन्तक
    1. मैंडिबुलर इनसिजर के विच्छेदन के लिए, सभी तीन दाढ़ों के साथ वायुकोशीय रिज को हटा दें और पहली और दूसरी दाढ़ के बीच की स्थिति के अनुरूप जगह में मैंडिबुलर आर्क को पार कर दें।
      नोट: एक तेज scalpel ब्लेड नंबर 11 और चिमटी इस चरण को करने के लिए उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. ध्यान से दंत सॉकेट के बाकी हिस्सों से incisor बाहर खींचें।
      नोट: यदि सफल होता है, तो निकाले गए इनसीजर में पूर्ण गर्भाशय ग्रीवा छोरों के साथ उपकला ऊतक सहित बरकरार एपिकल भाग होंगे।
    3. यदि आवश्यक हो, तो हड्डी के शेष टुकड़ों को अभी भी चिमटी और एक स्केलपेल के साथ कृन्तक से जुड़े हुए हटा दें।
    4. विच्छेदित incisors को ताजा, बर्फ-ठंडे HBSS में रखें और ब्याज के ऊतकों को विच्छेदित करें: गर्भाशय ग्रीवा लूप, दंत लुगदी, या दांत के अन्य हिस्से।
    5. विच्छेदित नरम ऊतक को 10 सेमी पेट्री डिश के बीच में ताजा, बर्फ-ठंडे एचबीएसएस की एक बूंद में रखें। बर्फ पर रहो।
  7. माउस मैंडिबुलर दाढ़
    1. मैंडिबुलर दाढ़ को विच्छेदित करने के लिए, एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके बाकी मैंडिबल से वायुकोशीय रिज को पूरी तरह से हटा दें।
    2. एक पेट्री डिश में ताजा, बर्फ-ठंडे एचबीएसएस में विच्छेदित वायुकोशीय शिखा को स्थानांतरित करें और जड़ों से जुड़ी वायुकोशीय हड्डियों के सभी शेष टुकड़ों को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    3. वायुकोशीय हड्डी के बिना विच्छेदित दाढ़ को ताजा, बर्फ-ठंडा एचबीएसएस में रखें। लुगदी को उजागर करने के लिए, जब तक आप लुगदी गुहा तक नहीं पहुंच जाते तब तक ठीक, तेज टिप चिमटी का उपयोग करके एपिकल साइड से डेंटिन के कुछ हिस्सों को हटाना शुरू करें।
    4. एक बार लुगदी गुहा तक पहुंचने के बाद, तेज टिप चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके दंत लुगदी को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें और बर्फ पर रखे गए 10 सेमी पेट्री डिश के बीच में ताजा, बर्फ-ठंडे एचबीएसएस की एक बूंद में दंत लुगदी के नरम ऊतक को रखें।
      नोट: चूंकि माउस दाढ़ लुगदी बेहद छोटे होते हैं, इसलिए तदनुसार स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर आवर्धन को अनुकूलित करें।
  8. मानव दाँत
    1. शेष रक्त को हटाने के लिए बर्फ-ठंडे एचबीएसएस में एक बार फिर मानव दांत धोएं।
    2. दांत को तीन मोटी दीवारों वाले बाँझ प्लास्टिक बैग में रखें और दांत को क्रैक करने के लिए कास्ट आयरन बेंचटॉप इंजीनियर के विज़ का उपयोग करें। बैग में प्रवेश करने से बचने के लिए एक सपाट सतह के साथ विज़ जबड़े का उपयोग करें।
    3. धीरे-धीरे विज़ को कसें जब तक कि आप दांत क्रैकिंग नहीं सुनते; इसे बैग से निकालें और इसे पेट्री डिश में ताजा, बर्फ-ठंडा एचबीएसएस में रखें।
    4. दो चिमटी का उपयोग करके, दंत लुगदी को बाहर निकालें, इसे कठोर ऊतक के सभी अवशेषों से साफ करें और इसे बर्फ पर रखे गए 10 सेमी पेट्री डिश के बीच में बर्फ-ठंडे एचबीएसएस की एक बूंद में रखें।
      सावधानी: मानव ऊतक संभावित रूप से संक्रामक हो सकता है। मानव ऊतक के साथ काम करते समय, ऊतक के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करें।

4. एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. एचबीएसएस में पूरी तरह से भंग कोलेजनेज पी (3 यू / एमएल) से बने पाचन मिश्रण के 2.5 मिलीलीटर के साथ एक 15 एमएल ट्यूब तैयार करें। उपयोग करने तक समाधान को बर्फ पर रखें।
    नोट: हमेशा ताजा तैयार कोलेजनेस पी का उपयोग करें; ऐलीकोट को फ्रीज न करें। कोलेजेनेस पी गतिविधि बैच-टू-बैच से भिन्न होती है। पतला करने से पहले अपने बैच की गतिविधि की जाँच करें। कोलेजेनेस पी कैल्शियम द्वारा सक्रिय होता है, जिसकी मात्रा पहले से ही लायोफिलाइज्ड पाउडर में पर्याप्त होती है। इसलिए, कैल्शियम के साथ एंजाइम मिश्रण को समृद्ध करना अनावश्यक है। कोलेजेनेस पी एफबीएस द्वारा निष्क्रिय नहीं है, लेकिन चेलेटिंग एजेंटों द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एथिलेनेडियामिनटेट्राएसिटिक - ईडीटीए)। पृथक्करण प्रक्रिया को रोकना वॉश समाधान में कोलेजेनेस पी (एचबीएसएस में 2% एफबीएस) को पतला करके सुनिश्चित किया जाता है। यह दिखाया गया है कि FBS जोड़ने से सेल व्यवहार्यता बढ़ जाती है और सॉर्टिंग 18 के बाद कोशिकाओं की अंतिम संख्या बढ़ जाती है।
  2. एक गोल आकार के स्केलपेल ब्लेड नंबर 10 का उपयोग करके, ऊतक को सभी दिशाओं में सबसे छोटे संभव टुकड़ों में काट लें। बूंद के बीच में ऊतक के टुकड़ों को फिर से इकट्ठा करें और बार-बार एक गोल आकार (नंबर 10) स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके ऊतक समुच्चय में कटौती करें। इस प्रक्रिया को कई बार दोहराएं जब तक कि सामग्री पर्याप्त रूप से कीमा न हो जाए।
  3. तैयार पाचन मिश्रण में एक 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके कटा हुआ ऊतक टुकड़ों को स्थानांतरित करें।
    नोट: एक बार में संसाधित होने वाले जानवरों की एक बड़ी संख्या के मामले में, ऊतक को कोलेजेनेस पी के साथ कई ट्यूबों में विभाजित करें। प्रति ट्यूब अधिकतम राशि लगभग 10 माउस incisors से प्राप्त लुगदी हैं। दाढ़ के मामले में, जहां लुगदी बहुत कम होती है, संसाधित लुगदी की संख्या को पर्याप्त रूप से बढ़ाया जा सकता है। मानव दांतों का उपयोग करते समय, लुगदी के आकार के आधार पर प्रति ट्यूब अधिकतम 2-3 लुगदी का उपयोग करें।
  4. एक शेकर के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस preheated इनक्यूबेटर में ट्यूब जगह. शेकर के अंदर ट्यूब को 60 डिग्री के कोण पर झुकाएं और ट्यूब के अंदर निरंतर निलंबन आंदोलनों को सुनिश्चित करने के लिए गति को 150-200 आरपीएम पर सेट करें।
  5. सभी clumps विघटित करने के लिए एक 1 mL पिपेट टिप के साथ हर 3-4 मिनट में निलंबन को सख्ती से triturate।
    नोट: समय के साथ, clumps छोटे और नरम हो जाएगा जब तक कि वे लगभग गायब हो जाते हैं।
  6. कुल मिलाकर, 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अंतिम बार के लिए triturate, और फिर धीरे-धीरे 12 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में बर्फ ठंडा धोने का समाधान जोड़ें।
  7. एक 50 μm सेल छलनी का उपयोग कर निलंबन फ़िल्टरिंग द्वारा शेष clumps या कैल्सीफाइड ऊतक के टुकड़े निकालें।
  8. फ़िल्टर किए गए सेल निलंबन के 10-20 μL लें और सेल गिनती कक्ष (हेमोसाइटोमीटर) का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान कोशिकाओं की गिनती करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। एक 10 mL सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें.
    नोट:: यदि कक्षों की संख्या सीमित है जो पतला निलंबन में नहीं गिना जा सकता है, तो कक्ष गणना छोड़ दें और आगे की प्रक्रिया के लिए सभी कक्षों का उपयोग करें।
  9. वैकल्पिक: निर्धारण और भंडारण के लिए आगे बढ़ें21.
    1. HBSS + BSA (0.04%) के 100 uL में छर्रों (107 कोशिकाओं तक) को फिर से निलंबित करें।
    2. ठंडा मेथनॉल के 400 μL जोड़ें और धीरे-धीरे मिश्रण।
    3. बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेल निलंबन इनक्यूबेट करें।
    4. संसाधित होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (1 महीने से अधिक नहीं)।
  10. धोने के समाधान में गोली resuspend. धोने के समाधान के 700-1200 कोशिकाओं / μL के लिए लक्ष्य।
  11. ट्यूब को आगे की प्रक्रिया तक बर्फ पर रखें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो -80 °C पर निर्धारण और संग्रहण करें। हालांकि, scRNA-seq के लिए सेल निलंबन के तत्काल प्रसंस्करण की सिफारिश की जाती है। आगे के कदम एकल-सेल आरएनए सेक प्रोटोकॉल के आधार पर निर्भर करेंगे। जब scRNA-seq प्रोटोकॉल एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम (कुछ sc-RNA-seq कंपनियां करती हैं) का उपयोग करती हैं, तो निर्माता के दिशानिर्देशों के आधार पर कोशिकाओं को सीधे या सेल सॉर्टिंग के बाद लोड करें।
  12. FACS के लिए, चरण 5 पर आगे बढ़ें।

5. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS)

  1. छँटाई करने से पहले, सेल सॉर्टिंग उपकरण तैयार करें।
    1. पूरे सिस्टम को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, उपकरण गुणवत्ता नियंत्रण करें, ड्रॉप देरी और विक्षेपण प्लेटों के वोल्टेज को सेट करें। संग्रह ट्यूब धारक में संग्रह ट्यूब रखो.
      नोट: एक अपरिहार्य सेल हानि के परिणामस्वरूप अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों से बचने के लिए, वॉश समाधान की एक छोटी राशि (25-50 μL) के साथ एक माइक्रोट्यूब (1.5 mL) में कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
  2. वैकल्पिक: FACS से पहले व्यवहार्यता धुंधला प्रदर्शन.
    1. एक अंतिम एकाग्रता 0.5 μg / mL करने के लिए FACS से पहले सेल निलंबन में Propidium आयोडाइड जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. नमूना को सेल सॉर्टर में लोड करें. सेल मलबे, डबल्स और मृत कोशिकाओं को निकालने के लिए एक सख्त गेटिंग रणनीति सेट करें। कोशिकाओं को एक तैयार ट्यूब या बहु-अच्छी तरह से प्लेटों में सॉर्ट करें। एक गेटिंग रणनीति का एक उदाहरण चित्र 2 में दिखाया गया है।
    नोट: हेरफेर चरणों को कम करने और प्रोटोकॉल में तेजी लाने के लिए, एक सख्त गेटिंग रणनीति लागू करने की सिफारिश की जाती है ( चित्रा 2 में सुझाया गया है) एक व्यवहार्यता धुंधला का उपयोग करने के बजाय। पृथक आबादी से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए, CD45 एंटीबॉडी धुंधला प्रदर्शन किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, धुंधला समाधान के 100 μL में सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें (PBS + 2% FBS + एंटी-CD45-APC संयुग्मित एंटीबॉडी 1/100 कमजोर पड़ने)। प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और सीधे FACS करें।

Representative Results

एकल कोशिकाओं का अनुकरणीय अलगाव एक 6 सप्ताह पुराने C57BL / 6 माउस पुरुष से दो मैंडिबुलर इनसीजर से किया गया था। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एक एकल-सेल निलंबन तैयार किया गया था, और बाद में, एकल-सेल अनुक्रमण किया गया था। तैयार किए गए एकल-सेल निलंबन का विश्लेषण किया गया था और FACS (चित्रा 2) का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था। सबसे पहले, एफएससी-ए (आगे स्कैटर, क्षेत्र) और एसएससी-ए (साइड स्कैटर, क्षेत्र) प्लॉटिंग लागू की गई थी, और हमारे सेल मलबे और सेल डबल्स या समुच्चय (चित्रा 2 ए) को फ़िल्टर करने के लिए अपेक्षित आकार और ग्रैन्युलैरिटी के साथ आबादी का चयन करने के लिए एक उपयुक्त गेटिंग रणनीति का उपयोग किया गया था। यह चयनित जनसंख्या (P1), सभी घटनाओं के 38% की गिनती, आगे उपयोग किया गया था, और FSC-A और FSC-H (आगे तितर बितर, ऊंचाई) पैरामीटर शेष सेल डबल्स (चित्रा 2B) को हटाने के लिए लागू किए गए थे। सेल डबल्स (पी 2) के बिना जनसंख्या पी 1 के 95% की गिनती बाद में एससीआरएनए-सेक के लिए उपयोग की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, ब्याज की आबादी का चयन करने के लिए अतिरिक्त गेटिंग का उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति या जीवित / मृत धुंधला)। अंतिम निलंबन में जीवित / मृत कोशिकाओं की संख्या की जांच करने के लिए, पीआई (प्रोपिडियम आयोडाइड) धुंधला प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 2 सी)। पीआई- (जीवित) कोशिकाओं वाली पी 3 आबादी मूल पी 2 आबादी में से 98.4% और कुल घटनाओं में से 35.5% थी। फ़िल्टर किए गए, मृत (पीआई +) कोशिकाओं की कुल संख्या 1887 थी।

आरएनए-सेक (पी 2) के लिए उपयुक्त व्यवहार्यता के बिना प्राप्त कोशिकाओं की अंतिम संख्या ने दो माउस इनसीजर लुगदी से 118,199 कोशिकाओं की गणना की। इसका मतलब है कि एक मैंडिबुलर कृंतक से लगभग 60,000 जीवित कोशिकाओं की संख्या।

अंतिम एकल-सेल निलंबन में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या को स्पष्ट करने के लिए, दो दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया था। सबसे पहले, CD45 एंटीबॉडी धुंधला और बाद में FACS विश्लेषण का उपयोग किया गया था। एक पूरक विधि के रूप में, scRNA-seq डेटा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45+) की कुल संख्या का विश्लेषण किया गया था। FACS विश्लेषण से पता चला है कि CD45+ कोशिकाओं का 14.44% (13.20% जीवित और 1.24% मृत) (चित्रा 3A)। SCRNA-seq डेटा के विश्लेषण से CD45-व्यक्त कोशिकाओं का 10.90% दिखाया गया (चित्रा 3B)। SCRNA-seq डेटा में CD45+ कोशिकाओं की कमी scRNA-seq विश्लेषण के दौरान अतिरिक्त थ्रेशोल्डिंग के कारण हो सकती है।

माउस incisor के उदाहरण पर इन प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है कि सख्त गेटिंग रणनीति के साथ संयोजन में दिया गया प्रोटोकॉल व्यवहार्यता धुंधला के अतिरिक्त उपयोग की आवश्यकता के बिना एक माउस दांत से कोशिकाओं की एक उच्च संख्या प्राप्त करने में कुशल है। प्रतिरक्षा (CD45+) कोशिकाओं का अनुपात मामूली (13.2%) था। इसके अलावा, यह पहले दिखाया गया था कि प्रतिरक्षा कोशिकाएं दांत होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में आवश्यक हैं, इसलिए एफएसीएस के दौरान एससीआरएनए-सेक विश्लेषण से उन्हें हटाना कुछ अनुप्रयोगों में प्रतिकूल होगा।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। तापमान की स्थिति और अपेक्षित समय सहित विभिन्न चरणों को माउस और मानव दांतों से एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गेटिंग रणनीति का उदाहरण। एफएससी-ए और एसएससी-ए गेटिंग का उपयोग पी 1 गेट का उत्पादन करने के लिए किया गया था, जो अपेक्षित आकार और ग्रैन्युलैरिटी के साथ सेल आबादी को दर्शाता है और सेल और एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स मलबे और सबसे बड़ी घटनाओं (ए) को फ़िल्टर करता है। इसके बाद, पी 1 आबादी को एफएससी-एच और एफसीएस-ए प्लॉट में प्लॉट किया गया था, जिसने सेल डबल्स (बी) को फ़िल्टर किया था। इस पी 2 आबादी को तब प्रोपिडियम आयोडाइड (सी) द्वारा मृत कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया था। प्रति गेट ईवेंट/कक्षों की संख्या (D) में दर्शाई गई है। (एफएससी-ए - आगे तितर बितर, क्षेत्र; एसएससी-ए - साइड स्कैटर, क्षेत्र; FSC-H - आगे तितर बितर, ऊंचाई; पीआई - प्रोपिडियम आयोडाइड)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिरक्षा कोशिकाओं का परिमाणीकरण। प्रतिरक्षा कोशिकाओं का परिमाणीकरण एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी के साथ सना हुआ कोशिकाओं के एफएसीएस विश्लेषण और प्रोपिडियम आयोडाइड स्टेनिंग (ए) का उपयोग करके लाइव / डेड विश्लेषण द्वारा किया गया था। एससीआरएनए-सेक विश्लेषण (बी) के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं का आगे का परिमाणीकरण किया गया था। (CD45-APC - विरोधी CD45 allophycocyanin संयुग्मित एंटीबॉडी; पीआई - प्रोपिडियम आयोडाइड; टी-एसएनई - टी-वितरित स्टोकेस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: मैंडिबल विच्छेदन प्रक्रिया का अवलोकन। डैश्ड लाइनें सुझाए गए कटौती को दर्शाती हैं। TMJ - temporomandibular संयुक्त, m. masseter - musculus masseter. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए गए समाधानों की रचनाएं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सेलुलर या आणविक स्तर पर दांतों और हड्डियों का अध्ययन करना आम तौर पर चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि इन ऊतकों को बनाने वाली कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के कठोर आव्यूहों से घिरी होती हैं। दंत ऊतक पर एकल-सेल आरएनए-सेक करने के लिए मुख्य लक्ष्यों में से एक तेजी से और उनके ट्रांसक्रिप्टोम में किसी भी कृत्रिम परिवर्तन के बिना ब्याज की कोशिकाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता है। इसे पूरा करने के लिए, माउस और मानव दांत लुगदी से कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त एक अत्यधिक कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जो सभी ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुप्रयोगों के लिए एकल-सेल निलंबन की त्वरित पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यह तेजी से ऊतक अलगाव द्वारा सुनिश्चित किया गया था, ऊतक और सेल जोड़तोड़ के चरणों को कम से कम करने, और यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन को सुव्यवस्थित करने के लिए।

इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरण तेजी से ऊतक प्रसंस्करण और पर्याप्त एकल-सेल निलंबन तैयारी 8,9 हैं। एक मैनुअल दृष्टिकोण का उपयोग दंत ड्रिल या अन्य गर्मी पैदा करने वाले उपकरणों का उपयोग किए बिना दंत लुगदी प्राप्त करने के लिए किया जाता है। ओवरहीटिंग गर्मी सदमे प्रोटीन और अन्य जीनों की कृत्रिम अभिव्यक्ति का कारण बन सकती है, अंततः विश्लेषण किए गए जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को मूल ऊतक 20 के गैर-प्रतिनिधि होने के लिए अग्रणी। मैनुअल ऊतक कटाई एक चुनौतीपूर्ण कदम हो सकता है जिसे संभवतः पहले से कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी। लुगदी को फिर छोटे टुकड़ों में काटा जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है। एंजाइमेटिक पाचन के 15-20 मिनट को छोड़कर, पूरे प्रोटोकॉल को 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है। ऊतक प्रसंस्करण और विशेष रूप से एंजाइमेटिक पाचन को कम से कम संभव समय तक कम से कम किया गया था क्योंकि 37 डिग्री सेल्सियस पर अधिक लंबे समय तक इनक्यूबेशन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन का कारण बन सकता है। एंजाइमेटिक पाचन से पहले डेंटिन के यांत्रिक हटाने की सिफारिश की जाती है। डेंटिन और लुगदी से जुड़े प्रीडेंटिन में बड़ी मात्रा में कोलेजन होता है, और इसकी अत्यधिक उपस्थिति पाचन समाधान की प्रभावशीलता को कम कर सकती है। शरीर से हटाए जाने के बाद (या जीवों की मृत्यु), यह दिखाया गया था कि कोशिकाएं अपने जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को जल्दी से संशोधित करना शुरू कर देती हैं। इसलिए, सेल अलगाव और प्रसंस्करण जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। वर्तमान प्रोटोकॉल एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए ऊतक (euthanizing पशु) को अलग करने से प्रसंस्करण समय को 35-45 मिनट तक कम कर देता है।

इस तकनीक का एक वैकल्पिक संशोधन बाद में उपयोग के लिए सेल संरक्षण है। यह मेथनॉल निर्धारण द्वारा प्राप्त किया जाता है। मेथनॉल-फिक्स्ड सेल निलंबन को -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है, जैसा कि प्रोटोकॉल 21 में वर्णित है। हालांकि, जब भी संभव हो, सीधे scRNA-seq करें, क्योंकि यह दिखाया गया था कि मेथनॉल-फिक्स्ड सिंगल-सेल निलंबन से एकल-सेल डेटा तनाव से संबंधित जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और परिवेश आरएनए 22 के साथ संदूषण से पीड़ित हो सकता है। इस चरण को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अतिरिक्त संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल के पहले आवेदन से पहले, तकनीक का परीक्षण करने के लिए कई सत्यापन चरणों का प्रदर्शन करने की सिफारिश की जाती है। हमारे अनुभव से, हम प्रोटोकॉल के उपर्युक्त महत्वपूर्ण चरणों का परीक्षण करने का सुझाव देते हैं। इसके अतिरिक्त, हम कोलेजनेस पी समाधान की प्रभावशीलता का परीक्षण करने और ऊतक पृथक्करण चरण की हैंडलिंग का परीक्षण करने का सुझाव देते हैं। विशेष रूप से, कोलेजेनेस पी इनक्यूबेशन की दीक्षा के बाद पहले 5 मिनट के आसपास, ऊतक के टुकड़ों को एक साथ इकट्ठा होना चाहिए। यह एक सामान्य स्थिति है। समुच्चय को 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके हर 3-4 मिनट में विघटित किया जाता है, और बढ़ते समय के साथ, उन्हें मुश्किल से दिखाई देने तक छोटा हो जाना चाहिए।

इसके अलावा, यह एक सेल गिनती कक्ष में कोशिका गिनती करने के लिए centrifugation से पहले और पहले और फ़िल्टरिंग के बाद करने के लिए suboptimal supernatant हटाने के कारण संभावित सेल नुकसान का पता लगाने के लिए करने की सिफारिश की है। यदि अंतिम एकल-सेल निलंबन को शुद्ध करने की आवश्यकता है, तो FACS का उपयोग किया जा सकता है। सेल सॉर्टिंग न केवल मलबे या मृत कोशिकाओं को हटाने में सक्षम बनाता है, बल्कि महत्वपूर्ण रूप से फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोशिकाओं 13,19 के साथ अंतिम निलंबन को समृद्ध करने में सक्षम बनाता है। कतरनी तनाव या सेल सॉर्टर के क्लॉगिंग से बचने के लिए, एक विस्तृत नोजल (85 μm या 100 μm) का उपयोग किया जाता है। यह आगे क्रमबद्ध कोशिकाओं की व्यवहार्यता में सुधार होगा।

इस तकनीक को माउस और मानव दांतदोनों पर डिजाइन और परीक्षण किया गया था। प्रमुख सीमित कारक पुराने चूहों (दाढ़) और मनुष्यों के दांतों के कम दंत लुगदी में कोशिकाओं की छोटी संख्या है। मान लीजिए कि बड़ी संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता है या पुराने रोगियों के दांतों से कोशिकाओं का अधिग्रहण किया जाना है। एक संभावित समाधान दांतों की एक उच्च संख्या को संसाधित करना और उन्हें एक एकल बैच में विलय करना है, जिसे बाद में एक नमूने के रूप में संसाधित किया जाता है।

मानव दंत लुगदी की जीवित कोशिकाओं को सबसे पहले बीस साल पहले कोलेजेनेस I और dispase23 के एंजाइम मिश्रण का उपयोग करके अलग किया गया था। तब से, दंत लुगदी कोशिकाओं के अलगाव का व्यापक रूप से उपयोग किया जाने लगा, और कई तकनीकों का उपयोग किया गया है5,6,7,8। यहां प्रस्तुत विधि का महत्वपूर्ण महत्व एससीआरएनए-सेक के लिए अंतिम सेल निलंबन की उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए अलगाव को तेज और कोमल बनाने के लिए सभी अलगाव चरणों का अनुकूलन है। उच्च कोशिका उपज एंजाइमों के साथ अधिक लंबे समय तक इनक्यूबेशन द्वारा प्राप्त की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण के लिए उपयुक्त गुणवत्ता के माउस और मानव दांतों से एकल कोशिकाओं को जल्दी से प्राप्त करने के लिए एक कुशल समाधान प्रदान करता है। इस तकनीक को केवल मामूली तकनीकी संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों या जीवों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने की उम्मीद है।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

जे.के. Masaryk University (MUNI / H / 1615/ 2018) की अनुदान एजेंसी द्वारा और जूनियर शोधकर्ता को चिकित्सा एमयू के संकाय से धन द्वारा समर्थित किया गया था। जेएल Masaryk University की अनुदान एजेंसी द्वारा समर्थित था, (MUNI / IGA / 1532/2020) और एक Brno पीएचडी प्रतिभा छात्रवृत्ति धारक है - Brno सिटी नगरपालिका द्वारा वित्त पोषित। टी.B ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (Lise Meitner अनुदान: M2688-B28) द्वारा समर्थित था। हम मानव दांतों को प्राप्त करने में उनकी मदद के लिए लिडी इजाकोविचोवा होला और वेरोनिका कोवर माटेजोवा को धन्यवाद देते हैं। अंत में, हम RADEK Fedr और Karel Soucek FACS छँटाई के साथ अपनी तरह की सहायता के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD45 Antibody BioLegend 103112
Bovine Serum Albumin Fraction V Roche 10735078001
CellTrics 50 µm, sterile Sysmex 04-004-2327
Collagenase P (COLLP-PRO) Roche 11213857001
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 AESCULAP 16600495
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 AESCULAP 16600509
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin Biosera FB-1101/500
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ SIGMA H6648
Industrial low lint wipes, MAX60 Dirteeze MAX60B176
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm Value-Tec 50-014366
Methyl alcohol A.G. Penta 21210-11000
Propidium Iodide Solution BioLegend 421301
Scalpel handle CM Instrumente AG-013-10
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. CAPP SP-10-C
Stereo microscope Leica EZ4
Surgical scissors (9cm) CM Instrumente AI-430-09Y
Tissue culture dish Ø 100 mm TPP 93100

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References

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Krivanek, J., Lavicky, J., Bouderlique, T., Adameyko, I. Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth. J. Vis. Exp. (176), e63043, doi:10.3791/63043 (2021).

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