Summary
Текущий протокол представляет собой быстрый, эффективный и щадящий метод выделения отдельных клеток, подходящих для одноклеточного анализа РНК-seq из постоянно растущего мышиного резца, мышиного моляра и зубов человека.
Abstract
Мышиные и человеческие зубы представляют собой сложные органы для быстрой и эффективной изоляции клеток для одноклеточных транскриптомных или других применений. Ткань пульпы зуба, богатая внеклеточным матриксом, требует длительного и утомительного процесса диссоциации, который обычно выходит за рамки разумного времени для одноклеточной транскриптомики. Чтобы избежать искусственных изменений в экспрессии генов, время, прошедшее от усыпления животного до анализа отдельных клеток, должно быть сведено к минимуму. Эта работа представляет собой быстрый протокол, позволяющий получить одноклеточную суспензию из зубов мыши и человека в отличном качестве, подходящем для scRNA-seq (одноклеточное секвенирование РНК). Этот протокол основан на ускоренных этапах выделения тканей, ферментативном пищеварении и последующем приготовлении окончательной одноклеточной суспензии. Это обеспечивает быструю и щадящую обработку тканей и позволяет использовать больше образцов животных или людей для получения клеточных суспензий с высокой жизнеспособностью и минимальными транскрипционными изменениями. Предполагается, что этот протокол может помочь исследователям, заинтересованным в выполнении scRNA-seq не только на зубах мыши или человека, но и на других тканях, богатых внеклеточным матриксом, включая хрящ, плотную соединительную ткань и дерму.
Introduction
Секвенирование одноклеточной РНК является мощным инструментом для расшифровки in vivo структуры клеточной популяции, иерархии, взаимодействий и гомеостаза1,2. Однако его результаты сильно зависят от первого шага этого продвинутого анализа – приготовления одноклеточной суспензии идеального качества из сложной, хорошо организованной ткани. Это включает в себя поддержание жизни клеток и предотвращение нежелательных, искусственных изменений в профилях экспрессии генов клеток3,4. Такие изменения могут привести к неточной характеристике структуры населения и неправильному толкованию собранных данных.
Разработаны специальные протоколы выделения из широкого спектра тканей 5,6,7,8. Они обычно используют механическую диссоциацию в сочетании с дальнейшей инкубацией с различными протеолитическими ферментами. К ним обычно относятся трипсин, коллагеназы, диспазы, папаин6,7,8,9 или коммерчески доступные ферментные смеси, такие как Accutase, Tryple и т.д. Наиболее важной частью, влияющей на качество транскриптома, является ферментативное пищеварение. Показано, что длительная инкубация с ферментами при 37 °C влияет на экспрессию генов и вызывает повышение регуляции многих генов, связанных со стрессом10,11,12,13. Другим критическим параметром процесса выделения является его общая длина, так как было показано, что транскриптомы клеток изменяются после ишемии тканей14. Этот протокол представляет собой эффективный протокол для мягкой изоляции одиночных клеток от зубов мыши и человека, быстрее, чем другие, ранее использовавшиеся протоколы для выделения клеток из сложных тканей5,6,9,11,13,15,16.
В этом протоколе представлено, как быстро рассечь мягкие ткани от твердого зуба и подготовить одноклеточную суспензию, подходящую для scRNA-seq. Этот метод использует только одну стадию центрифугирования и сводит к минимуму эффект нежелательных транскрипционных изменений, сокращая время обработки и переваривания тканей и сохраняя ткань и клетки при 4 ° C большую часть времени. Процедура демонстрирует изоляцию клеток от мышиных резцов, моляров и зубов мудрости человека в качестве примера, но в основном должна работать для других зубов в различных организмах. Полный протокол схематически визуализирован на рисунке 1. Этот протокол недавно был использован для создания атласа типа стоматологических клеток, полученного из зубов мыши и человека1.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с международными и местными правилами и были одобрены Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики (MSMT-8360/2019-2; МСМТ-9231/2020-2; МСМТ-272/2020-3). Этот протокол был протестирован как на самцах, так и на самках мышей дикого типа C57BL/6 и CD-1 и на генетически модифицированных мышах Sox10::iCreERT2 (в сочетании с различными репортерными системами) на фоне C57BL/6. Эксперименты с человеческими образцами проводились с одобрения Комитетов по этике медицинского факультета, Университета Масарика в Брно и факультетской больницы Святой Анны в Брно, Чешская Республика.
1. Экспериментальная настройка и подготовка растворов
- Настройка приборов
- Охладите центрифугу до 4 °C.
- Нагрейте инкубационную камеру до 37 °C.
- Запустите машину для сортировки ячеек с активацией флуоресценции (FACS) и установите все температуры сортировщика (включая держатель коллекторной трубки) на 4 °C. Выполните контроль качества прибора, установите задержку падения.
- Задайте предварительную стратегию гатинга и выполните тестовую сортировку.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании FACS используйте сопло 100 мкм.
- Подготовьте растворы (этапы 1.2.1-1.2.3).
- Раствор для мытья: Приготовьте свежую 2% FBS (фетальную бычью сыворотку) в HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса).
- Смесь для пищеварения: Приготовьте свежую коллагеназу P (3 Ед/мл), полностью растворенную в HBSS.
- Дополнительно: Приготовьте свежий HBSS + BSA (0,04%) и охладите аналитический метанол в морозильной камере с температурой -20 °C для хранения одноэлементной суспензии при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1 необходимо выполнить до начала эксперимента. Состав используемых растворов обобщен в дополнительной таблице 1.
2. Подготовка подопытных животных и зубов человека
- Готовят подопытных животных (мышей).
- Усыпить мышь в соответствии с местными правилами; например, при передозировке анестетиков, как описано выше1.
ВНИМАНИЕ: Правила гуманной эвтаназии экспериментальных животных варьируются локально. Всегда следуйте действующим местным правилам. - Немедленно приступайте к этапу рассечения тканей (шаг 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань подопытных животных не может быть вскрыта немедленно (например, из-за переноса из животного фонда), поместите экспериментальных животных на лед и выполните рассечение тканей как можно скорее. Чтобы получить больше клеток из молярных пульп мышей, используйте более молодых (6 недель и менее) животных. С возрастом размер пульпы зуба уменьшается. Мышиные резцы в основном сохраняют свою структуру с увеличением возраста, поэтому животные разного возраста могут быть использованы для рассечения тканей.
- Усыпить мышь в соответствии с местными правилами; например, при передозировке анестетиков, как описано выше1.
- Подготовьте человеческий зуб
ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие зубы были удалены по клинически значимой причине. Каждый диагноз лечился индивидуально, и опытный хирург-стоматолог всегда выполнял удаление зуба.- Поместите свежеубранный зуб сразу же в трубку объемом 50 мл с ледяным HBSS и держите трубку на льду до дальнейшей обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование сохраненных зубов мудрости у пациентов в возрасте до 25-30 лет рекомендуется для получения самого высокого выхода клеток.
- Поместите свежеубранный зуб сразу же в трубку объемом 50 мл с ледяным HBSS и держите трубку на льду до дальнейшей обработки.
3. Рассечение тканей
- Держите подопытное животное за головой, глядя на вентральный аспект его головы так, чтобы хвост указывал в сторону.
- Используя небольшие острые ножницы, быстро удалите кожу из нижней челюсти, чтобы обнажить нижнюю челюстную дугу, мягкие ткани между каждой половиной нижней челюсти и прилегающие лицевые мышцы.
- Сделайте глубокий разрез с каждой стороны нижней челюсти; во-первых, через m. masseter вдоль щечной стороны нижней челюсти до височно-нижнечелюстного сустава, а затем вдоль внутренней части каждой половины нижней челюсти через основание ротовой полости (см. Дополнительный рисунок 1).
- Разрежьте все мышцы и связки вдоль нижней челюсти до височно-нижнечелюстного сустава как снаружи, так и изнутри ротовой полости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разрезания костей. Это может повредить самую верхушечную часть резца. - Схватите нижнюю челюсть с помощью изогнутого пинцета и извлеките ее. Затем разделите рассеченную нижнюю челюсть на две половины ножницами, разрезав нижнечелюстной симфиз (см. Дополнительный рисунок 1).
- Используйте промышленную салфетку с низким содержанием ворса, чтобы раздавить оставшиеся мягкие ткани с каждой половины нижней челюсти. После того, как обе части нижней челюсти очищены, поместите их в заранее приготовленную чашку Петри с ледяным HBSS.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента работайте на льду. Дальнейшее рассечение мышиных резцов и коренных зубов выполняется под стереомикроскопом с черным фоном. - Мышиные нижнечелюстные резцы
- Для рассечения нижнечелюстных резцов удаляют альвеолярный гребень со всеми тремя молярами и поперечно растрескивают нижнечелюстную дугу в месте, соответствующем положению между первым и вторым моляром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения этого шага используется острое лезвие скальпеля No 11 и пинцет (см. Таблицу материалов). - Осторожно вытащите резец из остальной части зубной лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае успеха извлеченный резец будет содержать неповрежденные апикальные части, включая эпителиальную ткань с полными шейными петлями. - При необходимости удалите оставшиеся фрагменты кости, еще прикрепленные к резцу, пинцетом и скальпелем.
- Поместите рассеченные резцы в свежий, ледяной HBSS и рассекните интересующую ткань: шейную петлю, пульпу зуба или другие части зуба.
- Поместите рассеченные мягкие ткани в каплю свежего ледяного HBSS в середине чашки Петри размером 10 см. Держитесь на льду.
- Для рассечения нижнечелюстных резцов удаляют альвеолярный гребень со всеми тремя молярами и поперечно растрескивают нижнечелюстную дугу в месте, соответствующем положению между первым и вторым моляром.
- Мышиные нижнечелюстные коренные зубы
- Для рассечения нижнечелюстных коренных зубов полностью удалите альвеолярный гребень с остальной части нижней челюсти с помощью лезвия скальпеля.
- Переместите рассеченный альвеолярный гребень в свежий, ледяной HBSS в чашке Петри и аккуратно удалите все оставшиеся фрагменты альвеолярных костей, прикрепленных к корням.
- Поместите рассеченные коренные зубы без альвеолярной кости в свежий, ледяной HBSS. Чтобы обнажить пульпу, начните удалять части дентина с апикальной стороны с помощью тонкого, острого пинцета, пока не достигнете полости пульпы.
- Как только полость пульпы будет достигнута, тщательно рассекните пульпу зуба с помощью пары острых пинцетов и поместите мягкие ткани пульпы зуба в каплю свежего, ледяного HBSS в середине чашки Петри размером 10 см, хранящейся на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку молярные пульпы мышей чрезвычайно малы, соответствующим образом адаптируйте увеличение на стереомикроскопе.
- Человеческий зуб
- Промыть человеческий зуб еще раз в ледяном HBSS, чтобы удалить оставшуюся кровь.
- Поместите зуб в три толстостенных стерильных пластиковых пакета и используйте чугунные настольные тиски инженера, чтобы взломать зуб. Используйте тиски челюстей с плоской поверхностью, чтобы избежать проникновения в мешки.
- Медленно затягивайте тиски, пока не услышите треск зуба; достаньте его из пакетов и поместите в свежий, ледяной HBSS в чашку Петри.
- С помощью двух пинцетов выньте пульпу зуба, очистите ее от всех остатков твердой ткани и поместите в одну каплю ледяного HBSS в середине 10 см чашки Петри, хранящейся на льду.
ВНИМАНИЕ: Человеческая ткань потенциально может быть инфекционной. При работе с тканями человека используйте защитные средства, чтобы избежать прямого контакта с тканями.
4. Приготовление одноклеточной суспензии
- Приготовьте пробирку объемом 15 мл с 2,5 мл смеси для пищеварения, состоящей из коллагеназы Р (3 ЕД/мл), полностью растворенной в HBSS. Держите раствор на льду до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленную коллагеназу P; не замораживайте аликвоты. Активность коллагеназы P варьируется от партии к партии. Проверьте активность вашей партии перед разбавлением. Коллагеназа Р активируется кальцием, количество которого уже достаточно в лиофилизированном порошке. Поэтому нет необходимости обогащать ферментную смесь кальцием. Коллагеназа P не инактивируется FBS, но может быть инактивирована хелатирующими агентами (например, этилендиаминететрауксустик - ЭДТА). Остановка процесса диссоциации обеспечивается разбавлением коллагеназы Р в растворе Wash (2% FBS в HBSS). Было показано, что добавление FBS повышает жизнеспособность клеток и конечное количество клеток после сортировки18. - Используя лезвие скальпеля круглой формы No10, разрежьте ткань во всех направлениях на мельчайшие кусочки. Реагрегируйте кусочки ткани в середине капли и многократно разрезайте тканевые агрегаты с помощью лезвия скальпеля круглой формы (No 10). Повторяйте этот процесс несколько раз, пока материал не будет достаточно измельчен.
- Переложите измельченные кусочки ткани с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл в приготовленную смесь для пищеварения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае обработки большего количества животных одновременно, разделите ткань на несколько трубок коллагеназой P. Максимальное количество на тюбик представляют собой пульпы, полученные примерно из 10 мышиных резцов. В случае моляров, где пульпы намного меньше, количество обработанных мякотей может быть адекватно увеличено. При использовании человеческих зубов используйте максимум 2-3 пульпы на тюбик, в зависимости от размера пульпы. - Поместите трубку в предварительно нагретый при 37 °C инкубатор с шейкером. Наклоните трубку внутри шейкера под углом 60° и установите скорость на 150-200 об/мин, чтобы обеспечить постоянные движения подвески внутри трубки.
- Энергично протирайте суспензию каждые 3-4 мин кончиком пипетки объемом 1 мл, чтобы разрушить все комочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Со временем скопления станут меньше и мягче, пока они почти не исчезнут. - В общей сложности инкубировать в течение 15-20 мин. В конце инкубации тритурировать в последний раз, а затем медленно добавить холодный раствор для промывки до конечного объема 12 мл.
- Удалите оставшиеся сгустки или кусочки кальцинированной ткани, фильтруя суспензию с помощью клеточного ситечка 50 мкм.
- Возьмите 10-20 мкл отфильтрованной клеточной суспензии и подсчитайте ячейки во время центрифугирования с помощью камеры подсчета клеток (гемоцитометра). Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г при 4 °C. Удалите супернатант с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество ячеек ограничено, что не может быть подсчитано в разбавленной суспензии, пропустите подсчет ячеек и используйте все ячейки для дальнейшей обработки. - Необязательно: Приступайте к фиксации и хранению21.
- Повторно суспендировать гранулы (до 107 клеток) в 100 ул HBSS + BSA (0,04%).
- Добавьте 400 мкл охлажденного метанола и медленно перемешайте.
- Инкубировать клеточную суспензию в течение 15 мин на льду.
- Хранить при -80 °C до обработки (не дольше 1 месяца).
- Повторно суспендировать гранулы в растворе для промывки. Стремитесь к 700-1200 клеткам/мкл раствора для мытья.
- Держите трубку на льду до дальнейшей обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости выполните фиксацию и хранение при -80 °C. Однако рекомендуется немедленная обработка клеточной суспензии для scRNA-seq. Дальнейшие шаги будут зависеть от одноклеточного протокола RNA seq. Когда протокол scRNA-seq использует микрофлюидную систему (это делают некоторые компании sc-RNA-seq), нагрузите клетки на основе рекомендаций производителя либо непосредственно, либо после сортировки клеток. - Что касается СУИМ, то перейдите к шагу 5.
5. Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)
- Перед сортировкой подготовьте инструмент сортировки ячеек.
- Охладите всю систему до 4 °C, выполните контроль качества прибора, установите задержку падения и напряжение прогибных пластин. Поместите коллекционные трубки в держатель для сборных трубок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать дополнительных этапов центрифугирования, приводящих к неизбежной потере клеток, отсортируйте клетки в микропробирку (1,5 мл) с небольшим количеством (25-50 мкл) раствора wash.
- Охладите всю систему до 4 °C, выполните контроль качества прибора, установите задержку падения и напряжение прогибных пластин. Поместите коллекционные трубки в держатель для сборных трубок.
- Дополнительно: выполнить окрашивание жизнеспособности перед FACS.
- Добавьте йодид пропидия в клеточную суспензию перед FACS до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и инкубируйте в течение 15 мин при 4°C.
- Загрузите образец в сортировщик ячеек. Установите строгую стратегию уничтожения для удаления клеточного мусора, дублетов и мертвых клеток. Отсортируйте ячейки в подготовленную трубку или многоскважинные пластины. Пример стратегии гатинга показан на рисунке 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму этапы манипуляции и ускорить протокол, рекомендуется применять строгую стратегию гаширования (предлагается на рисунке 2), а не использовать окрашивание жизнеспособности. Чтобы отделить иммунные клетки от изолированной популяции, может быть выполнено окрашивание антителом CD45. Для этого повторно суспендируют клеточную суспензию в 100 мкл окрашивающего раствора (PBS + 2% FBS + анти-CD45-APC конъюгированное антитело 1/100 разведения). Инкубируйте в течение 15 минут на льду, защищенном от света, и выполняйте FACS напрямую.
Representative Results
Образцовую изоляцию одиночных клеток проводили из двух нижнечелюстных резцов одного 6-недельного самца мыши C57BL/6. Следуя этому протоколу, готовили одноклеточную суспензию, а впоследствии проводили одноклеточное секвенирование. Подготовленную одноэлементную суспензию анализировали и сортировали с помощью FACS (рисунок 2). Во-первых, были применены графики FSC-A (прямое рассеяние, площадь) и SSC-A (боковое рассеяние, площадь), и соответствующая стратегия захвата была использована для выбора популяции с ожидаемым размером и гранулярностью для фильтрации нашего клеточного мусора и дублетов или агрегатов клеток (рисунок 2A). Эта выбранная популяция (P1), насчитывающая 38% всех событий, была дополнительно использована, и параметры FSC-A и FSC-H (прямое рассеяние, высота) были применены для удаления оставшихся дублетов клеток (рисунок 2B). Популяция без клеточных дублетов (P2), насчитывающая 95% P1, может быть впоследствии использована для scRNA-seq. Альтернативно, дополнительный забор может быть использован для отбора интересующей популяции (например, экспрессия флуоресцентных белков или живое/мертвое окрашивание). Чтобы проверить количество живых/мертвых клеток в конечной суспензии, проводили окрашивание PI (йодида пропидия) (рисунок 2C). Популяция P3, содержащая PI- (живые) клетки, составляла 98,4% от родительской популяции P2 и 35,5% от общего числа событий. Общее количество отфильтрованных, мертвых (PI+) клеток составило 1887.
Конечное число клеток, полученных без окрашивания жизнеспособности, пригодных для РНК-seq (P2), исчислялось 118 199 клетками из двух пульпок резцов мыши. Это означает количество почти 60 000 живых клеток из одного нижнечелюстного резца.
Для уточнения количества иммунных клеток в конечной одноклеточной суспензии использовались два подхода. Во-первых, было использовано окрашивание антителом CD45 и последующий анализ FACS. В качестве дополнительного метода было проанализировано общее количество иммунных клеток (CD45+) в данных scRNA-seq. Анализ FACS показал 14,44% клеток CD45+ (13,20% живых и 1,24% мертвых) (Рисунок 3A). Анализ данных scRNA-seq показал 10,90% CD45-экспрессирующих клеток (рисунок 3B). Снижение CD45+ клеток в данных scRNA-seq может быть вызвано дополнительным пороговым значением при анализе scRNA-seq.
Эти репрезентативные данные на примере мышиного резца показывают, что данный протокол в сочетании со строгой стратегией гастинга эффективен в получении большого количества клеток из одного зуба мыши без необходимости дополнительного использования окрашивания жизнеспособности. Соотношение иммунных (CD45+) клеток было незначительным (13,2%). Более того, ранее было показано, что иммунные клетки необходимы для поддержания гомеостаза зубов, поэтому удаление их из анализа scRNA-seq во время FACS было бы контрпродуктивным в некоторых приложениях.
Рисунок 1: Схематическое представление протокола. Различные этапы, включая температурные условия и ожидаемое время, представлены для приготовления одноклеточной суспензии из зубов мыши и человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример стратегии гаширования. FSC-A и SSC-A были использованы для получения затвора P1, отражающего клеточную популяцию с ожидаемым размером и гранулярностью и отфильтровывающего клеточный и внеклеточный матриксный мусор и большинство крупных событий (A). Впоследствии популяция P1 была построена на графике FSC-H и FCS-A, который отфильтровывал дублеты клеток (B). Затем эта популяция P2 была проанализирована на наличие мертвых клеток йодидом пропидия (C). Количество событий/ячеек на ворота представлено в (D). (FSC-A - прямой разброс, площадь; SSC-A - боковой разброс, площадь; FSC-H - прямой разброс, высота; PI - пропидия йодида). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка иммунных клеток. Количественная оценка иммунных клеток проводилась путем facS-анализа клеток, окрашенных антителами против CD45, и анализа Live/Dead с использованием окрашивания йодида пропидия (A). Дальнейшая количественная оценка иммунных клеток проводилась во время scRNA-seq анализа (B). (CD45-APC - анти-CD45 аллофикоцианин конъюгированное антитело; PI - пропидия йодида; t-SNE - t-распределенное стохастическое соседское встраивание). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Обзор процесса рассечения нижней челюсти. Пунктирные линии иллюстрируют предлагаемые сокращения. ВНЧС - височно-нижнечелюстной сустав, м. массетер - мускулусный массетер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Составы растворов, используемых в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Discussion
Изучение зубов и костей на клеточном или молекулярном уровне, как правило, является сложной задачей, поскольку клетки, образующие эти ткани, окружены различными видами твердых матриц19. Одной из основных целей выполнения одноклеточной РНК-сек на зубной ткани является необходимость получения интересующих клеток быстро и без каких-либо искусственных изменений в их транскриптомах. Для достижения этой цели был разработан высокоэффективный протокол, подходящий для выделения клеток из пульп мышей и зубов человека, который позволяет быстро генерировать одноклеточные суспензии для всех транскриптомных применений. Это было обеспечено быстрой изоляцией тканей, минимизацией этапов тканевых и клеточных манипуляций и оптимизацией механического и ферментативного пищеварения.
Наиболее важными этапами этого протокола являются быстрая обработка тканей и адекватная подготовка одноклеточной суспензии8,9. Ручной подход используется для получения зубных пульп без использования бормашины или других теплогенерирующих устройств. Перегрев может вызвать искусственную экспрессию белков теплового шока и других генов, что в конечном итоге приводит к тому, что проанализированные паттерны экспрессии генов не являются репрезентативными для исходной ткани20. Ручной сбор тканей может быть сложным шагом, который, вероятно, потребует предварительной подготовки. Затем мякоть разрезают на мелкие кусочки и ферментативно переваривают при 37 °C. За исключением 15-20 мин ферментативного пищеварения, весь протокол выполняется при 4 °C. Обработка тканей и особенно ферментативное пищеварение были сведены к минимуму в кратчайшие сроки, поскольку более длительная инкубация при 37 °C может вызвать изменения в паттернах экспрессии генов10. Механическое удаление дентина рекомендуется перед ферментативным пищеварением. Дентин и присоединенный к пульпе предентин содержат большое количество коллагена, и его чрезмерное присутствие может снизить эффективность пищеварительного раствора. После удаления из организма (или гибели организмов) было показано, что клетки начинают быстро модифицировать свои паттерны экспрессии генов12. Поэтому изоляция и обработка клеток должны осуществляться как можно быстрее. Текущий протокол сокращает время обработки до 35-45 мин от выделения ткани (эвтаназии животного) до приготовления одноклеточной суспензии.
Одной из альтернативных модификаций этого метода является сохранение клеток для последующего использования. Это достигается фиксацией метанола. Фиксированная клеточная суспензия метанола может храниться до 1 месяца при -80 °C, как описано в протоколе21. Однако, когда это возможно, выполняйте scRNA-seq напрямую, поскольку было показано, что одноклеточные данные из фиксированных метанолом одноклеточных суспензий могут страдать от повышенной экспрессии генов, связанных со стрессом, и загрязнения окружающей РНК22. Этот шаг может потребовать дополнительной модификации в соответствии с протоколами производителя.
Перед первым применением этого протокола рекомендуется выполнить несколько шагов проверки для тестирования метода. Исходя из нашего опыта, мы предлагаем протестировать вышеупомянутые критические шаги протокола. Кроме того, мы предлагаем проверить эффективность раствора коллагеназы Р и проверить обработку стадии диссоциации тканей. В частности, примерно в первые 5 минут после начала инкубации коллагеназы P кусочки ткани должны объединиться вместе. Это обычная ситуация. Агрегаты распадаются каждые 3-4 мин с помощью пипетки объемом 1 мл, и с увеличением времени они должны становиться меньше, пока не станут едва заметными.
Кроме того, рекомендуется выполнять подсчет клеток в камере подсчета клеток до центрифугирования и до и после фильтрации для обнаружения возможных потерь клеток из-за субоптимального удаления супернатанта. Если окончательная одноэлементная суспензия нуждается в очистке, можно использовать FACS. Сортировка клеток позволяет не только удалять мусор или мертвые клетки, но, что важно, обогащает конечную суспензию флуоресцентно мечеными клетками13,19. Чтобы избежать напряжения сдвига или засорения сортировщика ячеек, используется широкое сопло (85 мкм или 100 мкм). Это еще больше улучшит жизнеспособность отсортированных клеток.
Эта техника была разработана и протестирована как на мышах, так и на человеческих зубах. Основным ограничивающим фактором является небольшое количество клеток в уменьшенных зубных пульпах зубов старых мышей (коренных зубов) и человека. Предположим, что необходимо получить большее количество клеток или приобрести клетки из зубов пожилых пациентов. Одним из возможных решений является обработка большего количества зубьев и объединение их в одну партию, впоследствии обработанную как один образец.
Живые клетки пульпы зубов человека были впервые выделены более двадцати лет назад с использованием ферментной смеси коллагеназы I и диспазы23. С тех пор изоляция клеток пульпы зубов стала широко использоваться, и было использовано несколько методов5,6,7,8. Критическое значение метода, представленного здесь, заключается в адаптации всех этапов изоляции, чтобы сделать изоляцию быстрой и щадящей для обеспечения высокого качества конечной клеточной суспензии для scRNA-seq. Более высокий выход клеток может быть получен при более длительной инкубации с ферментами. Этот протокол обеспечивает эффективное решение для быстрого получения одиночных клеток из зубов мыши и человека подходящего качества для секвенирования одноклеточной РНК. Ожидается, что этот метод будет широко использоваться для других тканей или организмов с небольшими техническими изменениями.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
J.K. был поддержан Грантовым агентством Университета Масарика (MUNI/H/1615/2018) и средствами медицинского факультета MU младшему научному сотруднику. J.L. был поддержан Грантовым агентством Университета Масарика (MUNI/IGA/1532/2020) и является стипендиатом Брно Ph.D. Talent Scholarship Holder - финансируется муниципалитетом города Брно. T.B. был поддержан Австрийским научным фондом (грант Лизы Мейтнер: M2688-B28). Благодарим Лиди изакову Холлу и Веронику Ковар Матееву за помощь в получении человеческих зубов. Наконец, мы благодарим Радека Федра и Карела Соучека за их любезную помощь в сортировке FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
