Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

يتم تقديم تقنيات لقياس نشاط الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، باستخدام مقياس طيف ضوئي بسيط يعمل في النطاق المرئي.

Abstract

يتم تصنيع الجليكوجين كشكل من أشكال تخزين الجلوكوز بواسطة مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بدءا من البكتيريا إلى الحيوانات. يتكون الجزيء من سلاسل خطية من بقايا الجلوكوز المرتبطة α1,4 مع فروع يتم إدخالها من خلال إضافة روابط α1,6. يتطلب فهم كيفية تنظيم تخليق الجليكوجين وتدهوره وكيف يصل الجليكوجين إلى تركيبته المتفرعة المميزة دراسة إنزيمات تخزين الجليكوجين. ومع ذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما لدراسة أنشطة الإنزيم هذه تستخدم عادة الكواشف أو التقنيات غير المتاحة لجميع الباحثين. هنا ، نناقش مجموعة من الإجراءات البسيطة تقنيا والفعالة من حيث التكلفة ، ومع ذلك لا تزال قادرة على توفير نظرة ثاقبة قيمة للتحكم في تخزين الجليكوجين. تتطلب التقنيات الوصول إلى مقياس الطيف الضوئي ، الذي يعمل في نطاق 330 إلى 800 نانومتر ، ويتم وصفها على افتراض أن المستخدمين سيستخدمون مطبات بلاستيكية يمكن التخلص منها. ومع ذلك ، فإن الإجراءات قابلة للتطوير بسهولة ويمكن تعديلها للاستخدام في قارئ الصفائح الدقيقة ، مما يسمح بتحليل متوازي للغاية.

Introduction

ينتشر الجليكوجين على نطاق واسع في الطبيعة ، حيث يوجد المركب في البكتيريا والعديد من الطلائعيات والفطريات والحيوانات. في الكائنات الحية الدقيقة ، يكون الجليكوجين مهما لبقاء الخلية عندما تكون العناصر الغذائية محدودة ، وفي الكائنات الحية العليا مثل الثدييات ، يعمل تخليق وتدهور الجليكوجين على تخزين مستويات الجلوكوز في الدم1،2،3. وبالتالي ، فإن دراسة استقلاب الجليكوجين لها أهمية في مجالات متنوعة مثل علم الأحياء الدقيقة وعلم وظائف الأعضاء في الثدييات. يتطلب فهم استقلاب الجليكوجين دراسة الإنزيمات الرئيسية لتخليق الجليكوجين (سينسيز الجليكوجين والإنزيم المتفرع) وتدهور الجليكوجين (فسفوريلاز الجليكوجين وإنزيم debranching). تستخدم المقايسات القياسية الذهبية لأنشطة إنزيم الجليكوجين سينسيز ، والفوسفوريلاز ، والتفرع ، وأنشطة الإنزيم المتفرعة نظائر مشعة. على سبيل المثال ، يتم قياس سينسيز الجليكوجين بشكل عام في مقايسة كيميائية إشعاعية متوقفة باتباع دمج الجلوكوز من UDP- [14 C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات الحيوانية والفطرية) أو ADP- [14C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات البكتيرية) في الجليكوجين 4,5. وبالمثل ، يتم قياس فسفوريلاز الجليكوجين في اتجاه تخليق الجليكوجين ، بعد دمج الجلوكوز من [14C] الجلوكوز -1-فوسفات في الجليكوجين6. يتم فحص الإنزيم المتفرع عن طريق قياس قدرة هذا الإنزيم على تحفيز دمج [14 C] الجلوكوز من الجلوكوز -1-فوسفات في سلاسل مرتبطة α1،4 بواسطة الجليكوجين فسفوريلاز7 ، ويتم تحديد نشاط إنزيم إزالة التفرع باتباع قدرة الإنزيم على دمج [14C] الجلوكوز في الجليكوجين8 . في حين أن الركائز المشعة حساسة للغاية ، مما يسمح باستخدامها في مستخلصات الخلايا الخام ذات المستويات المنخفضة من نشاط الإنزيم ، إلا أنها باهظة الثمن وتخضع للمتطلبات التنظيمية المصاحبة لاستخدام النظائر المشعة. هذه الحواجز تضع استخدام بعض المقايسات بعيدا عن متناول العديد من العمال. ومع ذلك ، على مدار سنوات عديدة ، تم وصف مجموعة متنوعة رائعة من الأساليب الطيفية لقياس هذه الإنزيمات. بشكل عام ، تعتمد هذه الأساليب في نهاية المطاف على قياس إنتاج أو استهلاك NADH / NADPH ، أو توليد مجمعات ملونة بين الجليكوجين واليود. وبالتالي ، فهي واضحة ويمكن تنفيذها باستخدام مقاييس الطيف الضوئي البسيطة المجهزة بمصابيح فلاش التنغستن أو الزينون فقط.

تعتمد المقايسات الطيفية لسينسيز الجليكوجين على قياس ثنائي فوسفات النيوكليوزيد المنطلق من مانح نيوكليوتيدات السكر حيث يضاف الجلوكوز إلى سلسلة الجليكوجينالمتنامية 9,10. الإجراء الخاص بقياس نشاط سينسيز الجليكوجين الموصوف في القسم 1 من البروتوكول ، أدناه ، هو تعديل لذلك الذي حدده Wayllace et al.11 ، ويظهر مخطط الاقتران أدناه:

(الجلوكوز) n + UPD-الجلوكوز → (الجلوكوز) ن + 1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + فوسفوينول بيروفات → بيروفات + ATP

بيروفات + NADH + H + → لاكتات + NAD+

يضيف سينثيز الجليكوجين الجلوكوز من UDP-glucose إلى الجليكوجين. يتم تحويل UDP المتولد في هذه العملية إلى UTP بواسطة كيناز ثنائي فوسفات النوكليوزيد (NDP kinase) ، في تفاعل يولد ADP. يعمل جزيء ADP بدوره كركيزة لكيناز البيروفات، الذي يفسفر جزيء ADP باستخدام فوسفوينول بيروفات كمتبرع بالفوسفات. يتم تحويل البيروفات الناتجة إلى لاكتات بواسطة إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات في تفاعل يستهلك NADH. وبالتالي ، يمكن إجراء الفحص بطريقة مستمرة ، ومراقبة انخفاض الامتصاص عند 340 نانومتر عند استهلاك NADH. يتم تكييفه بسهولة للاستخدام مع الإنزيمات التي تتطلب ADP-glucose كمتبرع بالجلوكوز. هنا ، تكون خطوات الاقتران أبسط لأن ADP الصادر عن عمل سينثيز الجليكوجين يعمل عليه مباشرة بواسطة كيناز البيروفات.

هناك مجموعة متنوعة من المقايسات الطيفية المتاحة لتحديد نشاط فسفوريلاز الجليكوجين. في الإصدار الكلاسيكي ، يتم دفع الإنزيم للخلف ، في اتجاه تخليق الجليكوجين ، كما هو موضح أدناه:

(الجلوكوز) n + الجلوكوز -1-فوسفات → (الجلوكوز) ن + 1 + Pi

على فترات زمنية محددة ، تتم إزالة حصص خليط التفاعل ، ويتم تحديد كمية الفوسفات المحررة12,13. في أيدينا ، كان هذا الفحص ذا فائدة محدودة بسبب وجود فوسفات حر قابل للقياس بسهولة في العديد من المستحضرات التجارية للجلوكوز -1 فوسفات ، جنبا إلى جنب مع التركيزات العالية من الجلوكوز -1 فوسفات اللازمة لعمل الفوسفوريلاز. بدلا من ذلك ، استخدمنا بشكل روتيني مقايسة بديلة تقيس الجلوكوز 1-فوسفات المنطلق عندما يتحلل الجليكوجين بواسطة فسفوريلاز13. يتم استخدام مخطط تفاعل مقترن ، موضح أدناه.

(الجلوكوز) n + Pi → (جلوكوز) n-1 + جلوكوز -1-فوسفات

جلوكوز-1-فوسفات → جلوكوز-6-فوسفات

جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H+

يتم تحويل الجلوكوز-1-فوسفات إلى جلوكوز-6-فوسفات بواسطة فوسفوغلوكوموتاز ، ثم يتأكسد الجلوكوز-6-فوسفات إلى 6-فوسفوغلوكونولاكتون ، مع ما يصاحب ذلك من اختزال NADP + إلى NADPH. الإجراء المفصل في القسم 2 من البروتوكول ، أدناه ، مشتق من الطرق التي وصفها Mendicino et al.14 و Schreiber & Bowling15. يمكن إجراء الفحص بسهولة بطريقة مستمرة ، مع زيادة الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت ، مما يسمح بتحديد معدل التفاعل.

يعتمد التحديد الطيفي لنشاط إنزيم debranching على قياس الجلوكوز المنبعث من عمل الإنزيم على حد الفوسفوريلاز دكسترين16. يتكون هذا المركب عن طريق معالجة الجليكوجين بشكل شامل مع فسفوريلاز الجليكوجين. نظرا لأن عمل فسفوريلاز الجليكوجين يوقف 4 بقايا جلوكوز بعيدا عن نقطة α1,6 ، فإن الدكسترين الحد يحتوي على الجليكوجين ، وقد تم تقصير السلاسل الخارجية إلى ~ 4 بقايا جلوكوز. يوصف هنا تحضير دكسترين حد الفوسفوريلاز ، باستخدام إجراء مشتق من تلك التي طورها Taylor et al.17 و Makino & Omichi18.

التفكيك هو عملية من خطوتين. ينقل نشاط 4-α-glucanotransferase لإنزيم debranching ثنائي الوظيفة أولا ثلاثة بقايا جلوكوز من نقطة الفرع إلى الطرف غير المختزل لسلسلة جلوكوز α1,4 مرتبطة قريبة. ثم يتم تحلل بقايا الجلوكوز المرتبطة α1,6 المتبقية عند نقطة الفرع بواسطة نشاط α1,6-glucosidase19. عادة ما يتم إجراء الفحص بطريقة متوقفة ، حيث يتم قياس الجلوكوز المنطلق بعد وقت معين (أو سلسلة من الأوقات) في مقايسة إنزيم مقترنة كما هو موضح أدناه:

(الجلوكوز) ن → (جلوكوز) ن-1 + جلوكوز

الجلوكوز + ATP → الجلوكوز-6-فوسفات + ADP

جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H+

يعطي تحديد NADPH المنتج مقياسا لإنتاج الجلوكوز. ويستند الإجراء المبين في القسم 3 من البروتوكول أدناه إلى إجراء وصفه نيلسون وآخرون.16. مثل الطرق الأخرى التي تعتمد على استهلاك أو توليد NADH / NADPH ، فإن الفحص حساس للغاية. ومع ذلك ، فإن وجود الأميليز أو الجلوكوزيداز الأخرى ، والتي يمكن أن تحرر أيضا الجلوكوز الحر من دكسترين حد الفوسفوريلاز ، سوف يسبب تداخلا كبيرا (انظر المناقشة).

يعتمد التحديد اللوني لنشاط الإنزيم المتفرع على حقيقة أن سلاسل الجلوكوز المرتبطة ب α1,4 تتبنى هياكل حلزونية ترتبط باليود ، وتشكل مجمعات ملونة20. يعتمد لون المجمع المتشكل على طول السلاسل المرتبطة α1,4. وبالتالي ، فإن الأميلوز ، الذي يتكون من سلاسل طويلة غير متفرعة إلى حد كبير من الجلوكوز المرتبط ب α1,4 ، يشكل مركبا أزرق عميقا مع اليود. في المقابل ، تشكل الجليكوجينات ، التي تكون سلاسلها الخارجية بشكل عام في حدود 6 إلى 8 بقايا جلوكوز فقط ، مجمعات برتقالية حمراء. إذا تم تحضين محلول الأميلوز بإنزيم متفرع ، فإن إدخال الفروع في الأميلوز يؤدي إلى توليد سلاسل جلوكوز مرتبطة α1,4 أقصر. وبالتالي ، فإن الحد الأقصى لامتصاص مجمعات الأميلوز / اليود يتحول نحو أطوال موجية أقصر. الإجراء الذي تمت مناقشته هنا مشتق من الإجراء المفصل بواسطة Boyer & Preiss21 ويتم تحديد نشاط الإنزيم المتفرع كميا على أنه انخفاض في امتصاص مركب الأميلوز / اليود عند 660 نانومتر بمرور الوقت.

كما ينبغي أن يكون واضحا بسهولة من المناقشة أعلاه ، فإن حقيقة أن ألوان المعقدات التي تشكلت بين سلاسل اليود والجلوكوز α1,4 تختلف باختلاف طول السلسلة تعني أن أطياف الامتصاص لمجمعات الجليكوجين / اليود يجب أن تختلف مع درجة تفرع الجليكوجين. هذا هو الحال بالفعل ، وتمتص الجليكوجينات / الجليكوجينات الأقل تشعبا ذات السلاسل الخارجية الأطول الضوء بطول موجي أطول من الجليكوجينات الأكثر تشعبا / لها سلاسل خارجية أقصر. لذلك يمكن استخدام تفاعل تلطيخ اليود للحصول على بيانات نوعية سريعة عن درجة تفرع الجليكوجين22. يتشكل اللون البرتقالي والبني عندما لا تكون مجمعات الجليكوجين مع اليود شديدة بشكل خاص. ومع ذلك ، يمكن تعزيز تطوير اللون من خلال إدراج محلول كلوريد الكالسيوم المشبع22. هذا يعزز حساسية الطريقة حوالي 10 أضعاف ويسمح بتحليل جاهز لكميات ميكروغرام من الجليكوجين. تم تكييف مقايسة تحديد التفرع الموصوفة في القسم 4 من البروتوكول أدناه من إجراء طوره Krisman22. يتم إجراؤه ببساطة عن طريق الجمع بين عينة الجليكوجين ومحلول اليود وكلوريد الكالسيوم في كوفيت وجمع طيف الامتصاص من 330 نانومتر إلى 800 نانومتر. يتحول الحد الأقصى للامتصاص نحو أطوال موجية أطول مع انخفاض درجة التفرع.

بشكل جماعي ، توفر الطرق الموضحة هنا وسائل بسيطة وموثوقة لتقييم أنشطة الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، وللحصول على بيانات نوعية عن مدى تفرع الجليكوجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين

  1. تحضير محاليل المخزون من الكواشف المطلوبة كما هو موضح في الجدول 1 (قبل اليوم التجريبي).
مكون اتجاهات
50 مللي متر تريس درجة الحموضة 8.0 قم بإذابة 0.61 جم من قاعدة Tris في ~ 80 مل من الماء.  تبرد إلى 4 درجات مئوية.   اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك واجعل الحجم يصل إلى 100 مل بالماء.
20 مللي متر HEPES عازلة حل 0.477 غرام من HEPES في ~ 80 مل من الماء.  اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 باستخدام NaOH وقم بتكوين الحجم إلى 100 مل بالماء.
132 مللي متر تريس / 32 مللي متر KCl العازلة درجة الحموضة 7.8 قم بإذابة 1.94 جم من قاعدة Tris و 0.239 جم من KCl في ~ 90 مل من الماء.  اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 مع حمض الهيدروكلوريك وقم بتكوين الحجم إلى 100 مل بالماء.
0.8٪ وزن / فولت الجليكوجين المحار تزن 80 ملغ من الجليكوجين المحار وتضاف إلى الماء.  اجعل الحجم النهائي يصل إلى 10 مل بالماء وقم بتسخينه برفق / اخلطه لإذابة الجليكوجين تماما.
100 مليمتر UDP-جلوكوز قم بإذابة 0.31 جم من الجلوكوز UDP في الماء واجعل الحجم النهائي يصل إلى 1 مل.  يحفظ في قنصة مجمدة على حرارة -20 درجة مئوية.   مستقر لعدة أشهر.
50 مللي متر ATP حل 0.414 غرام من ATP في ~ 13 مل من الماء.  اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 باستخدام NaOH وقم بتكوين الحجم إلى 15 مل بالماء.  يخزن في حصص مجمدة عند -20 درجة مئوية.   مستقر لعدة أشهر.
100 مللي مول جلوكوز-6-فوسفات درجة الحموضة 7.8 قم بإذابة 0.282 جم من الجلوكوز 6 فوسفات في ~ 7 إلى 8 مل من الماء.  اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام NaOH.  اجعل الحجم يصل إلى 10 مل بالماء.  يحفظ مجمدا في القسمة عند -20 درجة مئوية.   مستقر لمدة ستة أشهر على الأقل.
40 مللي متر فوسفوينول بيروفات قم بإذابة 4 مجم من فسفوينول بيروفات في 0.5 مل من 20 ملي مول من محلول HEPES 7.0.  يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.   مستقر لمدة 1 أسبوع على الأقل.
0.5 م MnCl2 قم بإذابة 9.90 جم من MnCl2 في الحجم النهائي 100 مل من الماء.
NDP كيناز أعد تكوين المسحوق المجفف بالتجميد بالماء الكافي لإعطاء محلول 1 وحدة / ميكرولتر.  تحضير القسمة ، وتجميدها في النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.   مستقرة لمدة 1 سنة على الأقل.

الجدول 1: حلول المخزون المطلوبة لفحص نشاط سينسيز الجليكوجين.

  1. في يوم الفحص ، قم بإعداد محلول عمل جديد من 4 mM NADH عن طريق إذابة 4.5 ملغ من NADH في 1.5 مل من 50 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0. تخزينها على الجليد ، محمية من الضوء.
  2. ذوبان محاليل مخزون UDP-الجلوكوز ، ATP ، فوسفوينول بيروفات ، وكيناز NDP على الجليد.
  3. سخني حمام مائي مسبقا إلى 30 درجة مئوية.
  4. قم بإعداد كل مقايسة سينسيز الجليكوجين في أنبوب سعة 1.5 مل عن طريق إضافة كواشف خليط التفاعل المدرجة في الجدول 2.
مكون الحجم (ميكرولتر)
160 مللي أمبير Tris/32 mM KCl العازلة درجة الحموضة 7.8 250
الماء 179
100 مللي مول جلوكوز 6 فوسفات ، درجة حموضة 7.8 58
0.8٪ وزن / حجم المحار الجليكوجين 67
50 مللي متر ATP 80
4 مللي متر NADH 80
100 مليمتر UDP-جلوكوز 28
40 مللي متر فوسفوينول بيروفات 20
0.5 م MnCl2 8
الحجم النهائي 770

الجدول 2: خليط تفاعل التركيب لفحص نشاط سينسيز الجليكوجين.

ملاحظة: لتسهيل الإعداد ، يمكن عمل مزيج رئيسي يحتوي على ما يكفي من كل من الكواشف المذكورة أعلاه لإكمال عدد المقايسات المخطط لها.

  1. تحضير تفاعل فارغ ، حيث يتم استبدال NADH في الخليط أعلاه بالماء. انقله إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه واستخدمه لضبط الصفر على مقياس الطيف الضوئي عند 340 نانومتر.
  2. خذ 770 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 2 ميكرولتر من كيناز NDP و 2 ميكرولتر من خليط هيدروجيناز البيروفات كيناز / اللاكتات ، واخلطه برفق ، واحتضنه عند 30 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتسخين خليط التفاعل مسبقا.
  3. أضف 30 ميكرولتر من العينة التي تحتوي على سينسيز الجليكوجين في محلول تريس 20 mM ، درجة الحموضة 7.8 ؛ امزج ، وانقل خليط التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت يمكن التخلص منه.
  4. ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي وسجل الامتصاص عند 340 نانومتر على فترات زمنية محددة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ارسم الامتصاص الذي تم الحصول عليه مع مرور الوقت.
    ملاحظة: يجب إجراء تفاعل يتم فيه استبدال عينة سينسيز الجليكوجين بمخزن مؤقت 20 mM Tris للتحكم في الأكسدة غير الأنزيمية ل NADH. اعتمادا على نقاء العينة ، قد تكون هناك حاجة إلى تفاعلات تحكم أخرى. راجع المناقشة للحصول على التفاصيل.
  5. حدد معدل التفاعل (انظر النتائج للحصول على التفاصيل).

2. تحديد نشاط الجليكوجين فسفوريلاز

  1. قم بإعداد حلول المخزون كما هو موضح في الجدول 3 (قبل يوم التجربة).
مكون اتجاهات
125 مللي متر أنابيب درجة الحموضة 6.8 قم بإذابة 3.78 جم من الأنابيب في الماء.  اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.8 باستخدام NaOH وقم بتكوين الحجم إلى 100 مل بالماء.
8٪ وزن / فولت المحار الجليكوجين تزن 0.8 غرام من الجليكوجين المحار وتضاف إلى الماء.  اجعل الحجم النهائي يصل إلى 10 مل بالماء ودافئ برفق / اخلطه لإذابة الجليكوجين.  يحفظ مجمدا في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
200 mM Na فوسفات درجة الحموضة 6.8 قم بإذابة 2.63 جم من Na 2 HPO 4.7H 2 Oو 1.41 جم من NaH2PO4. H2O في الماء.  ارفع الحجم إلى 100 مل بالماء.
1 مليمتر جلوكوز-1،6-ثنائي الفوسفات قم بإذابة 2 مجم من الجلوكوز-1،6-ثنائي الفوسفات في 4 مل من الماء.  القسمة وتخزينها مجمدة في -20 درجة مئوية.   مستقر لعدة أشهر على الأقل.
10 مللي متر NADP قم بإذابة 23 مجم من NADP في 3 مل من الماء.  القسمة وتخزينها مجمدة في -20 درجة مئوية.   مستقر لعدة أشهر على الأقل.

الجدول 3: حلول المخزون اللازمة لفحص نشاط فسفوريلاز الجليكوجين.

  1. سخني حمام مائي مسبقا إلى 30 درجة مئوية
  2. قم بإعداد كل مقايسة فسفوريلاز الجليكوجين في أنبوب سعة 1.5 مل عن طريق إضافة كواشف خليط التفاعل المدرجة أدناه (الجدول 4).
مكون الحجم (ميكرولتر)
125 مللي متر أنابيب عازلة درجة الحموضة 6.8 160
الماء 70
8٪ وزن / فولت المحار الجليكوجين 100
200 مللي مول Na فوسفات 6.8 400
1 مليمتر جلوكوز-1،6-ثنائي الفوسفات 20
10 مللي متر NADP 20
الحجم النهائي 770

الجدول 4: خليط تفاعل التركيب لفحص نشاط فسفوريلاز الجليكوجين.

ملاحظة: لتسهيل الإعداد ، يمكن عمل مزيج رئيسي يحتوي على ما يكفي من كل من الكواشف المذكورة أعلاه لإكمال عدد المقايسات المخطط لها.

  1. قم بإعداد تفاعل فارغ يحتوي على المكونات المدرجة في الجدول 4 ولكن أضف 30 ميكرولتر إضافية من 25 mM PIPES buffer ، الرقم الهيدروجيني 6.8 (تم تحضيره عن طريق تخفيف 125 mM PIPES buffer 1/5 بالماء). انقله إلى كوفيت ميثاكريليت القابل للتصرف واستخدمه لضبط الصفر على مقياس الطيف الضوئي عند 340 نانومتر.
  2. خذ حصة واحدة مقدارها 770 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 1 ميكرولتر من نازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات و 1 ميكرولتر من فسفوغلوكوموتاز ، واخلطه برفق ، واحتضنه عند 30 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتسخين خليط التفاعل مسبقا.
  3. أضف 30 ميكرولتر من العينة التي تحتوي على فسفوريلاز الجليكوجين في محلول أنابيب 25 mM ، درجة الحموضة 6.8. امزج وانقل خليط التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت يمكن التخلص منه.
  4. ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي وسجل الامتصاص عند 340 نانومتر على فترات زمنية محددة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ارسم الامتصاص الذي تم الحصول عليه مع مرور الوقت.
    ملاحظة: يجب تضمين تفاعل يتم فيه استبدال فسفوريلاز الجليكوجين بمخزن مؤقت 25 mM PIPES. اعتمادا على نقاء عينة فسفوريلاز الجليكوجين ، قد تكون هناك حاجة أيضا إلى ضوابط أخرى (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل).
  5. تحديد معدل التفاعل (انظر النتائج التمثيلية للحصول على التفاصيل).

3. تحديد نشاط إنزيم إزالة الجليكوجين

  1. قم بإعداد حلول المخزون كما هو موضح في الجدول 5 (قبل اليوم التجريبي).
مكون اتجاهات
100 مللي متر ماليات عازلة حل 1.61 غرام من حمض الماليك في ~ 80 مل من الماء.  اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.6 باستخدام NaOH واجعل الحجم النهائي يصل إلى 100 مل بالماء.
300 مليمتر ثلاثي إيثانولامين هيدروكلوريد / 3 مليمتر MgSO4 درجة حموضة 7.5 حل 27.85 غرام من هيدروكلوريد ثلاثي إيثانولامين و 0.370 غرام من MgSO4. 7H2O في ~ 400 مل من الماء.  اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 باستخدام NaOH واصنع حجما نهائيا يبلغ 500 مل بالماء.
150 مللي أمبير ATP / 12 مللي متر NADP حل 1.24 غرام من ATP في ~ 10 مل من الماء.  راقب الرقم الهيدروجيني وأضف هيدروكسيد الصوديوم للحفاظ على درجة حموضة ~ 7.5 عندما يذوب ATP.  أضف 0.138 g من NADP.  اضبط الرقم الهيدروجيني على ~ 7.5 باستخدام NaOH وقم بتكوين حجم نهائي يبلغ 15 مل بالماء. يخزن في القسمة عند – 20 درجة مئوية. مستقر لعدة أشهر.
50 mM Na الفوسفات العازلة درجة الحموضة 6.8 قم بإذابة 32.81 جم من Na 2 HPO 4.7H 2 Oو 17.61 جم من NaH2PO4. H2O في الماء.  ارفع الحجم إلى الحجم النهائي البالغ 5 لتر بالماء.

الجدول 5: محاليل المخزون اللازمة لفحص نشاط إنزيم إزالة التفرع الجليكوجين.

  1. إعداد الفوسفوريلاز الحد الدكسترين
    1. إذابة 0.3 غرام من الجليكوجين المحار في 10 مل من 50 مليمتر فوسفات الصوديوم العازلة ، درجة الحموضة 6.8.
    2. قم بإذابة مسحوق فوسفوريلاز A المجفف بالتجميد الكافي لإنتاج 60 وحدة من النشاط في محلول فوسفات 50 ملي مول ، درجة الحموضة 6.8.
      ملاحظة: اعتمادا على كمية الفوسفوريلاز A المشتراة ، ستختلف الكتلة المطلوبة ولكنها تتراوح بشكل عام بين 5 و 10 مجم من المسحوق.
  2. أضف 60 وحدة من فسفوريلاز A إلى محلول الجليكوجين وانقله إلى كيس غسيل الكلى. غسيل الكلى في درجة حرارة الغرفة مقابل 1 لتر من محلول فوسفات الصوديوم 50 مليمول ، درجة الحموضة 6.8 لمدة 8 ساعات. قم بالتغيير إلى مخزن غسيل الكلى الجديد واستمر في الحضانة طوال الليل.
  3. أضف 10 وحدات أخرى من فسفوريلاز A وقم بالتغيير إلى محلول غسيل الكلى الجديد. بعد 8 ساعات ، قم بالتغيير مرة أخرى إلى محلول غسيل الكلى الطازج واستمر في الحضانة طوال الليل.
  4. انقل محتويات كيس غسيل الكلى إلى أنبوب طرد مركزي واغلي لمدة 10 دقائق. تبرد على الجليد ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة.
  5. انقل المادة الطافية إلى كيس غسيل الكلى وقم بغسيل الكلى لمدة 8 ساعات مقابل ثلاثة تغييرات من 2 لتر من الماء المقطر.
  6. انقل محتويات كيس غسيل الكلى إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. قم بقياس الحجم وأضف مجلدين من الإيثانول المطلق المثلج البارد لترسيب حد الدكسترين. دع الأنبوب يقف على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن يبدأ الراسب الأبيض في التكون فور إضافة الإيثانول ، ولكن إذا لم يحدث ذلك ، أضف قطرة مقدارها 3 M NaCl.
  7. جهاز طرد مركزي بسرعة 15000 × جم لمدة 15 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. شطف بيليه الأبيض من الحد من الدكسترين مرتين مع 66٪ الخامس / الخامس الإيثانول, باستخدام ~ 30 مل لكل شطف.
  8. انقل الدكسترين المحدد إلى ملاط واتركه يجف تماما في الهواء. عندما يجف الدكسترين الحد ، قم بطحنه إلى مسحوق مع مدقة وانقله إلى وعاء مناسب للتخزين ؛ يجف عند 4 درجات مئوية.
  9. للاستخدام كركيزة إنزيم debranching ، قم بإعداد محلول 1٪ w / v في الماء.
  10. سخني حمام مائي مسبقا إلى 30 درجة مئوية.
  11. سخني مسبقا كتلة تسخين أو حمام مائي إلى 95 درجة مئوية.
  12. قم بإعداد أربعة أنابيب سعة 1.5 مل يحتوي كل منها على 100 ميكرولتر من محلول ماليات ، و 80 ميكرولتر من دكسترين حد الفوسفوريلاز ، و 10 ميكرولتر من الماء. سيتم استخدام هذه الأنابيب لإجراء مقايسة إنزيم debranching. قم بتسمية اثنين من الأنابيب التفاعل والأنبوبين الآخرين التحكم.
  13. على فترات زمنية محددة ، أضف 10 ميكرولتر من عينة الإنزيم debranching إلى أنابيب التفاعل و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي تم استخدامه لتحضير عينة الإنزيم المتفرع إلى أنابيب التحكم. احتضان عند 30 درجة مئوية.
  14. في نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال ، حضانة 5 و 10 و 20 دقيقة) ، اسحب 50 ميكرولتر من كل أنبوب تفاعل وتحكم وضعه على الفور في كتلة التسخين أو حمام الماء عند 95 درجة مئوية. يسخن لمدة 3 دقائق.
  15. جهاز طرد مركزي عند 15000 × جم لمدة 2 دقيقة لإزالة البروتين المترسب.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف الإجراء إذا لزم الأمر. يمكن تخزين العينات الساخنة مجمدة عند -20 درجة مئوية حتى يتم الشروع في قياس الجلوكوز المنطلق (الخطوة 17 أدناه).
  16. قياس الجلوكوز المفرج عنه
    1. انقل 40 ميكرولتر من المادة الطافية من العينات الساخنة إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منها وأضف 833 ميكرولتر من محلول ثلاثي إيثانولامين هيدروكلوريد / كبريتات المغنيسيوم ، و 67 ميكرولتر من مزيج NADP / ATP ، و 60 ميكرولتر من الماء. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل برفق ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء.
      ملاحظة: لتسهيل الإعداد ، يمكن عمل مزيج رئيسي يحتوي على ما يكفي من كل من الكواشف المذكورة أعلاه لإكمال عدد المقايسات المخطط لها.
    2. تحضير تفاعل فارغ عن طريق الجمع بين 100 ميكرولتر من محلول ماليات، و80 ميكرولتر من دكسترين حد فسفوريلاز، و20 ميكرولتر من الماء. تخلط جيدا ، ونقل 40 ميكرولتر إلى كوفيت ميثاكريليت القابل للتصرف. أضف 833 ميكرولتر من ثلاثي إيثانولامين هيدروكلوريد / كبريتات المغنيسيوم ، وما إلى ذلك كما هو موضح في الخطوة 3.17.1.
    3. اضبط الصفر على مقياس الطيف الضوئي عند 340 نانومتر باستخدام التفاعل الفارغ.
    4. أضف 0.5 ميكرولتر من نازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات إلى كل كوفيت. امزج برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ببطء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم سجل الامتصاص عند 340 نانومتر.
      ملاحظة: يجب أن تكون قيم الامتصاص منخفضة ، مما يدل على تلوث قليل للعينات بالجلوكوز 6 فوسفات.
    5. أضف 0.5 ميكرولتر من هيكسوكيناز إلى كل كوفيت. امزج برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ببطء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، ثم سجل الامتصاص عند 340 نانومتر.
    6. استمر في الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق إضافية. سجل الامتصاص عند 340 نانومتر مرة أخرى. إذا زاد الامتصاص عن ذلك المسجل في 15 دقيقة ، استمر في الحضانة لمدة 5 دقائق أخرى وتحقق مرة أخرى من الامتصاص. سجل الامتصاص النهائي عند 340 نانومتر تم الحصول عليها.
    7. لكل عينة ، اطرح الامتصاص عند 340 نانومتر المسجل بعد إضافة نازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات من الامتصاص النهائي الذي تم الحصول عليه بعد إضافة هيكسوكيناز. ارسم القيم التي تم الحصول عليها مقابل طول الفترة الزمنية التي تم فيها تحضين العينة المقابلة بإنزيم debranching.

4. تحديد نشاط إنزيم الجليكوجين المتفرع

  1. قبل اليوم التجريبي ، قم بإعداد محلول اليود / KI عن طريق إذابة 2.6 جم من KI أولا في 10 مل من الماء. في غطاء الدخان ، تزن 0.26 غرام من اليود وتضاف إلى محلول KI.
    تنبيه: اليود ضار عند ملامسته للجلد أو عند استنشاقه. يخلط لإذابة اليود ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محمي من الضوء. قم أيضا بإعداد 125 mM PIPES buffer ، درجة الحموضة 6.8 (انظر الجدول 3).
  2. عند بدء التجارب ، قم بعمل مخزون عامل من كاشف اليود المحمض.
    1. خذ 45.7 مل من الماء في أنبوب سعة 50 مل وأضف 150 ميكرولتر من محلول اليود/كي متبوعا ب 150 ميكرولتر من 1 م حمض الهيدروكلوريك.
    2. تخلط جيدا وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء. الحل مستقر لمدة 3 أيام على الأقل في ظل هذه الظروف.
  3. في يوم التجربة، اصنع محلولا جديدا من الأميلوز مقداره 10 ملغم/مل.
    1. تزن 50 ملغ من الأميلوز ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول المطلق ورجه برفق.
    3. أضف 500 ميكرولتر من 2 M KOH ورجها برفق.
      تحذير: يسبب KOH حروقا شديدة في الجلد وتلفا في العين. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    4. أضف 0.5 مل من الماء مع الرج برفق. إذا لم يذوب الأميلوز تماما ، أضف 0.5 مل إضافية من الماء.
    5. اضبط الرقم الهيدروجيني على ~ 6.5 إلى 7.0 مع 1 M HCl.
      تنبيه: حمض الهيدروكلوريك قد يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    6. أضف الماء للوصول إلى الحجم النهائي 5 مل.
    7. تعقيم عن طريق المرور من خلال مرشح نهاية حقنة 0.2 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. لا تبرد أو تجمد.
  4. سخني حمام مائي مسبقا إلى 30 درجة مئوية.
  5. تحضير اثني عشر أنبوبا سعة 1.5 مل، يحتوي كل منها على 1 مل من كاشف اليود المحمض. توضع جانبا على مقاعد البدلاء. وستستخدم هذه لإيقاف تفاعل الإنزيم المتفرع.
  6. قم بإعداد أربعة أنابيب سعة 1.5 مل يحتوي كل منها على 150 ميكرولتر من الأميلوز ، و 150 ميكرولتر من عازلة الأنابيب ، و 45 ميكرولتر من الماء. سيتم استخدام هذه الأنابيب لإجراء فحص الإنزيم المتفرع. قم بتسمية اثنين من الأنابيب التفاعل والأنبوبين الآخرين التحكم.
  7. على فترات زمنية محددة ، أضف 5 ميكرولتر من عينة الإنزيم المتفرعة إلى أنابيب التفاعل و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي تم استخدامه لتحضير عينة الإنزيم المتفرع إلى أنابيب التحكم. احتضان عند 30 درجة مئوية.
  8. في نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال ، حضانة 5 و 10 و 15 دقيقة) ، اسحب 10 ميكرولتر من كل أنبوب تفاعل وتحكم وأضفه إلى أنابيب 1.5 مل التي تحتوي على 1 مل من كاشف اليود المحمض. أضف 140 ميكرولتر إضافية من الماء واخلطها جيدا. نقل إلى cuvettes المتاح.
    ملاحظة: يجب أن تكون العينات زرقاء اللون ويجب أن يكون المحلول خاليا من أي راسب. اللون المتشكل مستقر لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
  9. تحضير عينة تحتوي على 1 مل من كاشف اليود المحمض و150 ميكرولتر من الماء. تخلط جيدا ونقل إلى كوفيت. استخدم هذا الكوفيت لضبط الصفر على مقياس الطيف الضوئي عند 660 نانومتر.
  10. اقرأ امتصاص كل عينة من العينات الاثنتي عشرة عند 660 نانومتر. أوجد معدل تفاعل الإنزيم المتفرع عن طريق طرح الامتصاص الناتج في وجود الإنزيم المتفرع (التفاعل) من الامتصاص في حالة عدم وجود إنزيم متفرع (تحكم) في كل نقطة زمنية. راجع نتائج الممثل للحصول على التفاصيل.

5. التقييم النوعي لتفرع الجليكوجين

  1. تحضير محلول كلوريد الكالسيوم المشبع بإضافة 74.5 جم من كلوريد الكالسيوم اللامائي إلى ~ 40 مل من الماء مع التحريك. أضف القليل من الماء واستمر في التحريك. اجعل الحجم يصل إلى 100 مل بالماء واستمر في التقليب حتى يذوب CaCl2 تماما.
  2. قم بإعداد مخزون عامل من كاشف اللون اليود / CaCl 2 عن طريق خلط 50 ميكرولتر من محلول مخزون KI / اليود (انظر الخطوة 4.1 أعلاه) مع 13 مل من محلول CaCl2 المشبع في أنبوب سعة 15 مل. تخلط جيدا وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء. الحل مستقر لمدة 1 أسبوع على الأقل في ظل هذه الظروف.
  3. تحديد المتفرعة
    1. في أنبوب سعة 1.5 مل ، امزج 650 ميكرولتر من مخزون كاشف اللون اليود / CaCl2 مع 100 ميكرولتر من الماء واخلطه جيدا. نقل الحل إلى كوفيت ميثاكريليت القابل للتصرف.
      ملاحظة: يجب أن يكون المحلول الموجود في الكوفيت واضحا ولونه أصفر باهت.
    2. ضع في مقياس الطيف الضوئي ، وتشغيل في وضع مسح الطول الموجي ، وجمع طيف الخلفية من 330 نانومتر إلى 800 نانومتر.
    3. في أنبوب سعة 1.5 مل ، ادمج 650 ميكرولتر من كاشف لون اليود / CaCl2 العامل مع 50 ميكروغرام من جليكوجين المحار. ارفع الحجم النهائي إلى 750 ميكرولتر بالماء واخلطه جيدا. نقل الحل إلى كوفيت ميثاكريليت القابل للتصرف.
      ملاحظة: يجب أن يكون المحلول في الكوفيت واضحا ولونا برتقاليا / بنيا عميقا.
    4. ضع في مقياس الطيف الضوئي وجمع طيف امتصاص من 330 نانومتر إلى 800 نانومتر.
    5. كرر الخطوات من 4.4.3 إلى 4.4.4 مع 50 ميكروغرام من الأميلوبكتين و 30 ميكروغرام من الأميلوز.
      ملاحظة: يجب أن تكون عينة الأميلوبكتين صفراء / خضراء ويجب أن تكون عينة الأميلوز خضراء / زرقاء. يجب أن تكون كلتا العينتين واضحة. المجمعات الملونة المتكونة مستقرة ، مع عدم وجود تغيير في طيف الامتصاص ، لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    6. للحصول على إشارة إلى البنية المتفرعة لعينة جليكوجين غير مميزة ، اجمع بين 25 ميكروغرام إلى 50 ميكروغرام من الجليكوجين مع 650 ميكرولتر من كاشف لون اليود / CaCl2 . تابع على النحو الوارد أعلاه ، وبذلك يصل الحجم إلى 750 ميكرولتر بالماء ، ويخلط جيدا ، وينقل إلى كوفيت ميثاكريليت.
      ملاحظة: يجب أن تعطي عينة الجليكوجين لونا أصفر / برتقاليا إلى برتقالي / بني اعتمادا على درجة التفرع (طول السلاسل الخارجية) للجليكوجين الموجود. مرة أخرى ، يجب أن تكون العينة واضحة. راجع نتائج الممثل للحصول على التفاصيل.
    7. جمع طيف الامتصاص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين
يوضح الشكل 1 نتائج تمثيلية من مقايسات سينثيز الجليكوجين باستخدام إنزيمات منقاة. في اللوحة A ، بعد تأخر طفيف ، كان هناك انخفاض خطي في الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت لمدة حوالي 12 دقيقة. كان معدل التغير في الامتصاص في الشكل 1 أ ~ 0.12 وحدة امتصاص / دقيقة. معدل التغير في الامتصاص بين ~ 0.010 و ~ 0.20 وحدة امتصاص / دقيقة هو الأمثل ويجب تعديل كمية الجليكوجين سينسيز المضافة لمعدلات العائد ضمن هذا النطاق. في اللوحة (ب)، تظهر نتيجة إضافة الكثير من إنزيم سينثيز الجليكوجين إلى الفحص. هنا ، كان رد الفعل كاملا خلال أول 2 دقيقة. لم يظهر تفاعل التحكم ، الذي لا يحتوي في هذه الحالات على سينسيز الجليكوجين ، أي انخفاض ملموس في الامتصاص بمرور الوقت. كما هو موضح في المناقشة ، فإن استخدام تجانس الأنسجة في هذا الفحص ممكن تماما ، على الرغم من الحاجة إلى تفاعلات تحكم إضافية.

يستخدم البروتوكول الموصوف هنا جليكوجين المحار كركيزة ، والتي تعمل بشكل جيد مع سينسيز الجليكوجين من العديد من الأنواع المختلفة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن سينسيز الجليكوجين قد يظهر نشاطا متغيرا تماما اعتمادا على نوع الجليكوجين المستخدم. لذلك ، ينصح بمسح مجموعة متنوعة من أشكال الجليكوجين قبل البدء في أي دراسة مفصلة.

يتضمن البروتوكول المعطى الجلوكوز 6-فوبوسفات في خليط التفاعل ، حيث يتم تنشيط العديد من سينسيز الجليكوجين بواسطة هذا المركب9،23،24،25،26. إجراء المقايسات في وجود وغياب الجلوكوز 6 فوسفات (الذي يشكل حجم التفاعل بالماء) ، يسمح بحساب نسبة نشاط الجلوكوز -6-فوسفات - / + ، وهو مؤشر مفيد على حالة الفسفرة لسينسيز الجليكوجين في الثدييات والفطريات 1,27.

تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين من التغير في الامتصاص واضح إلى حد ما. يؤخذ معامل انقراض NADH على أنه 6220 M-1 cm-1 ، مما يسمح بحساب معدل التغير في تركيز NADH من معدل تغير الامتصاص على النحو التالي:

معدل التغير في الامتصاص 0.12 وحدة / دقيقة يتوافق مع 0.12 / 6220 = 1.93 × 10-5 مول / لتر / دقيقة تغير في تركيز NADH. كان الحجم في الكوفيت 0.8 مل ، مما يعني أن التغيير في كمية NADH كان: 1.93 × 10-5 × 0.8 × 10-3 = 3.46 × 10-8 مول / دقيقة. كان حجم الإنزيم المضاف 60 ميكرولتر ، 3.46 × 10-8 × (1000 / 60) = 5.76 × 10-7 مول NADH مستهلك / دقيقة / مل إنزيم.

نظرا لوجود علاقة فردية بين NADH المستهلك والجلوكوز المدمج في الجليكوجين ، يمكن التعبير عن معدل التفاعل على أنه 5.76 × 10-7 مول جلوكوز مدمج / دقيقة / مل.

عندما يكون محتوى البروتين في عينة الإنزيم معروفا ، يمكن التعبير عن نشاط الإنزيم المحدد على أنه μmol glucose inincorporate / min / mg protein أو nmol glucose incorporated / min / mg protein ، حسب الاقتضاء.

كما هو مذكور في المقدمة ، يتم تكييف البروتوكول بسهولة لقياس نشاط سينسيز الجليكوجين الذي يستخدم ADP-glucose كمتبرع بالجلوكوز. يتم تحقيق ذلك عن طريق الاستبدال البسيط لجلوكوز UDP بجلوكوز ADP في خليط التفاعل. علاوة على ذلك ، تم حذف كل من كيناز NDP و ATP من خليط التفاعل ، لأن ADP الذي يتم إطلاقه أثناء عمل سينسيز الجليكوجين هو ركيزة مباشرة لكيناز البيروفات.

Figure 1
الشكل 1: النتائج التمثيلية لمقايسات نشاط سينسيز الجليكوجين. تم ضبط مقياس الطيف الضوئي لأخذ قراءة واحدة في الدقيقة لمدة إجمالية قدرها 20 دقيقة. توضح اللوحة A مرحلة التأخر القصير المتوقعة متبوعة بانخفاض خطي في الامتصاص مع مرور الوقت (تجريبي). لم يكن هناك انخفاض في الامتصاص الملاحظ في تفاعل التحكم. يتم حساب معدل التفاعل من منحدر تغير الامتصاص في الطور الخطي (من 5 إلى 16 دقيقة). توضح اللوحة (ب) نتيجة إضافة الكثير من الإنزيم. هنا ، يتم استنفاد NADH في غضون 2 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحديد نشاط الجليكوجين فسفوريلاز
يوضح الشكل 2 بيانات تمثيلية من مقايسة فسفوريلاز الجليكوجين باستخدام الإنزيم المنقى. مع التحضير المستخدم هنا ، كان الفحص خطيا لمدة 3 دقائق تقريبا. يظهر الجزء الداخلي خط انحدار مرسوما عبر النقاط من الوقت 0 إلى 2.5 دقيقة. يوضح ميل هذا الخط أن معدل تغير الامتصاص يساوي 0.022 وحدة امتصاص/دقيقة. معدل زيادة الامتصاص من حوالي 0.01 إلى 0.04 هو الأمثل ، لأن الفحص سوف ينحرف عن الخطية بسرعة كبيرة إذا كان هناك الكثير من الإنزيم. يتم حساب معدل تكوين NADPH من معامل الانقراض الذي ، مثل معامل NADH ، هو 6220 M-1 cm-1. لكل 1 مول من NADPH المتكونة ، تم إنتاج مول واحد من الجلوكوز 1 فوسفات بفعل فوسفوريلاز الجليكوجين. ومن ثم، يمكن التعبير عن نشاط الإنزيم على أنه كمية الجلوكوز-1-فوسفات المنبعثة من الجليكوجين لكل وحدة زمنية، باتباع عملية حسابية مماثلة لتلك الموضحة أعلاه.

ظروف التفاعل قابلة للتكيف بسهولة مع تلك الفوسفوريلاز الحساسة للتعديل الخيفي. يتم تضمين المستجيبات المطلوبة ببساطة في مزيج التفاعل الرئيسي ، لتحل محل بعض الماء. تحذير مهم هو أنه يجب إظهار أن المستجيب نفسه لا يؤثر على نشاط إنزيمات الاقتران ، فسفوغلوكوموتاز ، ونازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات.

وأخيرا، كما هو الحال مع سينثيز الجليكوجين الموصوف أعلاه، قد يؤثر نوع الجليكوجين المستخدم كركيزة على معدل التفاعل. في حين أن الجليكوجين المحاري يعمل بشكل جيد مع فسفوريلاز من العديد من الأنواع ، فقد لا يكون دائما الخيار الأمثل.

Figure 2
الشكل 2: نتائج تمثيلية من مقايسات نشاط فسفوريلاز الجليكوجين. تم ضبط مقياس الطيف الضوئي على قراءة واحدة كل 30 ثانية لمدة إجمالية قدرها 10 دقائق. كانت هناك زيادة مطردة في الامتصاص المسجل في وجود فسفوريلاز الجليكوجين (تجريبي) ، بينما ظل التفاعل بدون إضافة فسفوريلاز عند خط الأساس (التحكم). يظهر الجزء الداخلي تكبيرا في فترة التفاعل الأولية ، مما يدل على خطية تكوين المنتج فيما يتعلق بالوقت. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحديد نشاط إنزيم إزالة الجليكوجين
تمثل البيانات الموضحة في الشكل 3 مقايسة إنزيم إزالة التفرع الجليكوجين باستخدام إنزيم نزع التفرع المنقى. في كل نقطة زمنية ، تم طرح التغيير في الامتصاص الذي حدث في غياب إنزيم متفرع مضاف (التحكم) من التغيير في الامتصاص الذي حدث في وجود إنزيم متفرع (تفاعل). ثم تم رسم قيم الامتصاص الناتجة. كما هو مذكور أعلاه ، يتم حساب معدل تغير تركيز NADPH من المنحدر الأولي للمنحنى عن طريق تحليل الانحدار. في هذا المثال ، كانت الزيادة في NADPH لكل وحدة زمنية خطية لمدة 10 دقائق ، مع ميل 0.0079 وحدة امتصاص / دقيقة. في حين أن هذه البيانات قابلة للاستخدام بشكل مثالي ، فإن إضافة إنزيم أقل قليلا كان سيعطي منحدرا ضحلا ويسمح بمرحلة خطية أطول. بدلا من ذلك ، يمكن أخذ قراءات إضافية عن طريق إزالة القسمة للقياس في 2 دقيقة و 7 دقائق حضانة. يعد تحديد نشاط إنزيم debranching أمرا بسيطا للغاية ، حيث يتم تكوين 1 مول من NADPH لكل 1 مول من الجلوكوز الذي يطلقه نشاط α1,6-glucosidase لإنزيم debranching. وبالتالي ، يمكن التعبير عن معدل التفاعل ككمية الجلوكوز المنبعثة من دكسترين حد الفوسفوريلاز لكل وحدة زمنية ، باتباع نفس نوع الحساب الذي تم استخدامه لمقايسات سينسيز الجليكوجين وفسفوريلاز ، أعلاه.

Figure 3
الشكل 3: النتائج التمثيلية لمقايسات نشاط إنزيم إزالة تفرع الجليكوجين. تمت معالجة عينات من دكسترين حد الفوسفوريلاز بإنزيم debranching لمدة 5 أو 10 أو 20 أو 40 دقيقة. تم قياس الزيادة في الامتصاص عند 340 نانومتر ، والتي تم إنتاجها عندما تم تقليل NADP إلى NADPH في مقايسة إنزيم مقترنة ، في العينات المأخوذة في كل نقطة من هذه النقاط الزمنية. أظهر التفاعل طورا خطيا استمر لمدة 10 دقائق على الأقل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحديد نشاط إنزيم الجليكوجين المتفرع
يوضح الشكل 4 بيانات من مقايسات الإنزيم المتفرع للجليكوجين. في كل نقطة من النقاط الزمنية المشار إليها ، تم قياس امتصاص عينات التحكم والتفاعل. تم طرح امتصاص عينة التفاعل عند 660 نانومتر من عينة التحكم المقابلة ، وتم رسم فرق الامتصاص مقابل الوقت. ثم تم رسم خط الانحدار عبر النقاط (اللوحة A). يمكن التعبير عن معدل التفاعل ببساطة على أنه التغير في الامتصاص عند 660 نانومتر لكل وحدة زمنية. الحد الأقصى للتغيير في الامتصاص الذي يمكن أن يحدث في هذا الفحص هو فقط ~ 0.4 وحدة امتصاص ، تمثل أقصى تفرع للأميلوز المضاف بواسطة الإنزيم المتفرع (اللوحة B). علاوة على ذلك ، عندما ينخفض امتصاص أنابيب التفاعل بأكثر من ~ 0.2 وحدة امتصاص أقل من وحدة التحكم ، لم يعد الفحص ضمن النطاق الخطي ولا يمكن إجراء تقدير لمعدل التفاعل (اللوحة B).

سيبدأ الأميلوز المستخدم كركيزة في هذا الإجراء في ترك المحلول بسهولة تامة إذا تم تبريده أو تجميده ثم إذابته. لذلك ، من المهم جعل محلول ركيزة الأميلوز طازجا والتأكد من عدم تكوين أي راسب قبل الاستخدام.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية لمقايسات نشاط الإنزيم المتفرع للجليكوجين. تم التعامل مع عينات من الأميلوز مع انزيم المتفرعة. تمت إزالة القسمة في النقاط الزمنية الموضحة وأضيفت إلى كاشف اليود المحمض. ثم تم قياس امتصاص مركب الأميلوز / اليود المتكون عند 660 نانومتر. تمثل البيانات الموضحة الفرق في الامتصاص بين حضانات التحكم التي تفتقر إلى الإنزيم المتفرع والتفاعلات التي تحتوي على إنزيم متفرع. تظهر اللوحة A انخفاضا في الامتصاص عند 660 نانومتر بسبب نشاط إنزيم debranching ، والذي كان خطيا لمدة ~ 20 دقيقة. توضح اللوحة B النطاق الديناميكي الضيق للفحص ، حيث يكون الحد الأقصى للتغيير في الامتصاص الذي يمكن إنتاجه ~ 0.4 وحدة امتصاص ويتم فقدان الخطية عندما يكون التغيير في الامتصاص ~ 0.2 وحدة امتصاص. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التقييم النوعي لمدى تفرع الجليكوجين
تم دمج الأميلوز والأميلوبكتين والفوسفوريلاز والحد من الدكسترين والجليكوجين المعزول من الخميرة مع محلول كلوريد الكالسيوم / اليود المشبع وتم جمع أطياف الامتصاص للمجمعات الناتجة (الشكل 5). باستخدام كتل الجليكوجين والأميلوبكتين والأميلوز الواردة في البروتوكول الموصوف أعلاه ، يجب أن تكون قراءة الامتصاص القصوى التي تم الحصول عليها حوالي 0.7 إلى 0.8 ، كما هو موضح هنا (اللوحتان A و B). يبلغ الحد الأقصى للامتصاص للأميلوز والأميلوبكتين حوالي 660 نانومتر و 500 نانومتر و 385 نانومتر على التوالي. تم تضمين دكسترين حد الفوسفوريلاز هنا ، نظرا لأن جمع طيف الامتصاص لمركبات دكسترين / اليود للحد من الفوسفوريلاز يوفر فحصا سريعا لمدى هضم الفوسفوريلاز الذي تم تحقيقه أثناء تحضير ركيزة إنزيم debranching. ينتج الجليكوجين من معظم المصادر قمتين ، واحدة عند حوالي 400 نانومتر والثانية عند 460 نانومتر (الشكل 5 ب). تشير التحولات إلى اليسار في أطياف امتصاص الجليكوجين إلى زيادة التفرع / انخفاض طول السلسلة الخارجية. على العكس من ذلك ، تشير التحولات إلى اليمين إلى انخفاض التفرع / زيادة طول السلسلة الخارجية.

محلول كلوريد الكالسيوم المشبع كثيف وستشكل عينات الجليكوجين المضافة طبقة عبر الجزء العلوي عند إضافتها. لذلك ، هناك حاجة إلى خلط دقيق للحصول على حل متجانس. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لم يتم إذابة عينات الكربوهيدرات المستخدمة بالكامل قبل الخلط مع محلول كلوريد الكالسيوم ، فسوف تتشكل مجاميع تلطيخ داكنة في كوفيت. من الواضح أن هذه الركام ستعيق جمع طيف الامتصاص ومن المهم التأكد من أن المحلول الموجود في الكوفيت واضح قبل الشروع في أي قياسات.

Figure 5
الشكل 5: النتائج التمثيلية من التقييم النوعي لتفرع الجليكوجين. تم دمج عينات من دكسترين حد الفوسفوريلاز المنقى أو الأميلوبكتين أو الأميلوز (اللوحة أ) أو الجليكوجين (اللوحة ب) مع محلول كلوريد الكالسيوم المشبع باليود وتم قياس أطياف الامتصاص للمعقدات الناتجة من 330 نانومتر إلى 800 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بشكل عام ، تتمثل المزايا الرئيسية لجميع الطرق المقدمة في تكلفتها المنخفضة وسهولتها وسرعتها وعدم الاعتماد على المعدات المتخصصة. العيب الرئيسي الذي يشتركون فيه جميعا هو الحساسية مقارنة بالطرق الأخرى المتاحة. من السهل تقدير حساسية الإجراءات التي تنطوي على إنتاج أو استهلاك NADH / NADPH. بالنظر إلى أن معامل الانقراض ل NADH / NADPH هو 6.22 M-1 cm-1 ، يشير الحساب البسيط إلى أنه يمكن اكتشاف ~ 10-20 μM من التغيرات في التركيز بسهولة. مع أحجام الفحص الموضحة في المقالة الحالية ، يتوافق هذا مع القدرة على قياس الكميات في حدود ~ 10-20 نانومول. يمكن القول إن هذا حساس إلى حد ما. ومع ذلك ، من الممكن ضبط النشاط المحدد للركائز المشعة بحيث يمكن زيادة الحساسية إلى ما بعد حد المقايسات الطيفية بسهولة تامة. على الرغم من أن مقايسة الإنزيم المتفرع والتقييم النوعي لتفرع الجليكوجين يعتمدان على تكوين مجمعات بين اليود وبوليمرات الجلوكوز المرتبطة ب α1,4 ، إلا أن الناتج من كل اختبار مختلف وحساسياتها مختلفة بالمثل. وتناقش أدناه اعتبارات محددة لكل من المقايسات الموصوفة.

تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين
يسمح اختبار الإنزيم المقترن الموصوف هنا بالفحص المستمر لنشاط سينسيز الجليكوجين ، وهو أمر مفيد في تحديد المعلمات الحركية. كما أنه قابل للتطوير بسهولة وقد تم وصف إجراء مشابه جدا للاستخدام في ألواح المعايرة الدقيقة ، مما يسمح بإجراء قياسات متوازية للغاية لنشاط الإنزيم28. نستخدم هذا الفحص بشكل روتيني مع سينسيز الجليكوجين المنقى المؤتلف29. ومع ذلك ، تم تطوير الإجراءات الموصوفة في الأصل للاستخدام في تجانس الأنسجة (على سبيل المثال ، انظر Danforth10 و Leloir et al.9). التحذير هنا هو أنه يجب تخفيف تجانس الأنسجة بشكل مناسب قبل الاستخدام. التخفيف ضروري لتقليل تعكر التجانس والتداخل من الإنزيمات / الركائز المتنافسة في التجانس. علاوة على ذلك ، لحساب استهلاك NADH الذي لا يعتمد على نشاط سينسيز الجليكوجين ، يجب تضمين التفاعلات الفارغة التي تحتوي على جميع مكونات التفاعل باستثناء UDP-glucose. ثم يتم تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين عن طريق طرح معدل التغير في امتصاص NADH في غياب UDP-glucose من ذلك الذي تم الحصول عليه في وجود هذا المركب.

تحديد نشاط الجليكوجين فسفوريلاز
مثل مقايسة سينسيز الجليكوجين ، يمكن إجراء القياس الطيفي لنشاط فسفوريلاز بطريقة مستمرة ، بينما يتم إيقاف مقايسات الفوسفوريلاز الأخرى13. كما أنه قابل للتكيف بسهولة للاستخدام في ألواح المعايرة الدقيقة أو غيرها من التطبيقات عالية الإنتاجية15. مرة أخرى ، يتطلب استخدامه مع تجانس الأنسجة تخفيفا مناسبا لتقليل تفاعلات التعكر / التداخل. على سبيل المثال ، الجلوكوز 6 فوسفات هو مستقلب وفير إلى حد ما ووجوده في تجانس الأنسجة سيؤدي إلى إنتاج NADPH عبر إنزيم اقتران الجلوكوز 6 فوسفات ديهيدروجينيز مستقل عن نشاط الفوسفوريلاز. عند العمل مع تجانس الأنسجة ، يجب تضمين تفاعلات التحكم التي تحتوي على تجانس الأنسجة المخفف بشكل مناسب وجميع مكونات الفحص الأخرى باستثناء الفوسفات والجليكوجين. ثم يتم حساب نشاط الفوسفوريلاز عن طريق طرح إنتاج NADPH في غياب الجليكوجين / الفوسفات من ذلك الذي يحدث في وجود هذه المركبات. يمكن العثور على توصيات محددة تتعلق بالدرجة المناسبة من التخفيف لأنواع مختلفة من مستخلص أنسجة الثدييات في Mezl et al.13.

تحديد نشاط إنزيم إزالة الجليكوجين
على الرغم من وصفه هنا بأنه اختبار متوقف ، إلا أنه يمكن تكييف هذا الإجراء بسهولة وتنفيذه بطريقة مستمرة16. نظرا لأن الفحص يعتمد على إنتاج الجلوكوز ، فإن استخدامه في مستخلصات الأنسجة الخام يجب أن يأخذ في الاعتبار إطلاق الجلوكوز من فسفوريلاز الحد من الدكسترين بواسطة إنزيمات أخرى غير إنزيم debranching ، وتوليد الجلوكوز عن طريق عمل هذه الإنزيمات على الجليكوجين الداخلي الموجود في مستخلص الأنسجة. يتم التعامل بسهولة مع مسألة الجليكوجين الداخلي من خلال تفاعل التحكم الذي لا يضاف إليه دكسترين حد الفوسفوريلاز. يمكن تقدير وجود أنشطة α-glucosidase الأخرى في تفاعلات متوازية حيث يوجد المالتوز ، بدلا من الفوسفوريلاز الحد من الدكسترين ، كركيزة.

تحديد نشاط إنزيم الجليكوجين المتفرع
من بين المقايسات الكمية المختلفة التي تمت مناقشتها ، فإن مقايسة الإنزيم المتفرع اللوني هي الأقل حساسية إلى حد بعيد. في الواقع ، تشير التقديرات إلى أن الحساسية أقل بحوالي 50-100 مرة من تلك التي تحققت بالطريقة الكيميائية الإشعاعية ، حيث يتم قياس تحفيز تفاعل فسفوريلاز الجليكوجين عن طريق إضافة إنزيم متفرع21. على غرار مقايسة إنزيم debranching ، فإن مقايسة الإنزيم المتفرعة حساسة أيضا لوجود أنشطة الجلوكوزيداز الملوثة ، لأن هضم الأميلوز سيؤثر على ربط اليود. تم اقتراح بعض الحلول للسماح باستخدام مقايسات مماثلة لتلك الموصوفة هنا في وجود أنشطة الجلوكوزيداز الملوثة30. ومع ذلك ، في رأينا ، فإن هذا الفحص هو الأنسب لدراسة إنزيمات تفرع الجليكوجين المنقى أو المنقى جزئيا ، حيث تكون هذه الأنشطة المتداخلة ضئيلة أو غائبة.

التقييم النوعي لمدى تفرع الجليكوجين
التحليل التفصيلي لتفرع الجليكوجين شاق إلى حد ما ، وعادة ما يتضمن مزيجا من الهضم الأنزيمي ، والتعديل الكيميائي ، ومجموعة متنوعة من تقنيات الفصل لتحليل المنتجات المتولدة31. في حين أن الفحص اللوني الموصوف هنا لا يمكن أن ينتج بوضوح معلومات قابلة للمقارنة حول البنية الدقيقة للجليكوجين ، إلا أنه يوفر مقياسا بسيطا وسريعا للتفرع أكثر أو أقل. علاوة على ذلك ، تحتوي الأطياف التي تم الحصول عليها على بعض المعلومات الإضافية. على سبيل المثال ، كما تمت مناقشته في النتائج التمثيلية ، توجد عينات من الجليكوجين عادة مع قمم امتصاص عند ~ 400 نانومتر و ~ 460 نانومتر. يبدو أن الذروة عند ~ 400 نانومتر تمثل سلاسل خارجية قصيرة في جزيئات الجليكوجين ، حيث يتم تعزيزها في الجليكوجين المعزول من طفرات الخميرة التي تفتقر إلى الإنزيم المتفرع بالنسبة إلى الخميرة البرية32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد تضارب معروف في المصالح مرتبط بهذا العمل ولم يكن هناك دعم مالي لهذا العمل يمكن أن يؤثر على نتائجه.

Acknowledgments

يود المؤلف أن يشكر كارولين ديتمر وأندرو بريتنغهام على رؤيتهما والعديد من المناقشات المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من صندوق أيوا للتعليم والبحث في تقويم العظام (IOER 03-17-05 و 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 174 ،
الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter