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Biochemistry

यूकेरियोटिक ग्लाइकोजन चयापचय के अध्ययन के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधियां

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

ग्लाइकोजन चयापचय के प्रमुख एंजाइमों की गतिविधि को मापने की तकनीक प्रस्तुत की जाती है, दृश्यमान सीमा में संचालित एक सरल स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके।

Abstract

ग्लाइकोजन को जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा ग्लूकोज के भंडारण रूप के रूप में संश्लेषित किया जाता है, जिसमें बैक्टीरिया से लेकर जानवरों तक शामिल हैं। अणु में 1,4-लिंक्ड ग्लूकोज अवशेषों की रैखिक श्रृंखलाएं शामिल हैं, जिनकी शाखाओं को 1,6-लिंकेज के अतिरिक्त के माध्यम से पेश किया गया है। यह समझना कि ग्लाइकोजन के संश्लेषण और क्षरण को कैसे विनियमित किया जाता है और ग्लाइकोजन अपनी विशिष्ट शाखित संरचना को कैसे प्राप्त करता है, ग्लाइकोजन भंडारण के एंजाइमों के अध्ययन की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन एंजाइम गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधियां आमतौर पर अभिकर्मकों या तकनीकों को नियोजित करती हैं जो सभी जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं। यहां, हम प्रक्रियाओं की एक बैटरी पर चर्चा करते हैं जो तकनीकी रूप से सरल, लागत प्रभावी हैं, और फिर भी ग्लाइकोजन भंडारण के नियंत्रण में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम हैं। तकनीकों को 330 से 800 एनएम की सीमा में संचालित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तक पहुंच की आवश्यकता होती है, और यह मानते हुए वर्णित किया जाता है कि उपयोगकर्ता डिस्पोजेबल, प्लास्टिक क्यूवेट को नियोजित करेंगे। हालांकि, प्रक्रियाएं आसानी से स्केलेबल हैं और माइक्रोप्लेट रीडर में उपयोग के लिए संशोधित की जा सकती हैं, जिससे अत्यधिक समानांतर विश्लेषण की अनुमति मिलती है।

Introduction

ग्लाइकोजन प्रकृति में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है, यौगिक बैक्टीरिया, कई प्रोटिस्ट, कवक और जानवरों में पाया जाता है। सूक्ष्मजीवों में, ग्लाइकोजन कोशिका के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है जब पोषक तत्व सीमित होते हैं और स्तनधारियों जैसे उच्च जीवों में, ग्लाइकोजन का संश्लेषण और क्षरण रक्त शर्करा के स्तरको बफर करने के लिए काम करता है 1,2,3। इसलिए, ग्लाइकोजन चयापचय का अध्ययन सूक्ष्म जीव विज्ञान और स्तनधारी शरीर विज्ञान जैसे विविध क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण है। ग्लाइकोजन चयापचय को समझने के लिए ग्लाइकोजन संश्लेषण (ग्लाइकोजन सिंथेज़ और ब्रांचिंग एंजाइम) और ग्लाइकोजन गिरावट (ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज और डीब्रांचिंग एंजाइम) के प्रमुख एंजाइमों का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है। ग्लाइकोजन सिंथेज़, फॉस्फोरिलेज, ब्रांचिंग और डीब्रांचिंग एंजाइम गतिविधियों के स्वर्ण मानक परख रेडियोधर्मी आइसोटोप को नियोजित करते हैं। उदाहरण के लिए, ग्लाइकोजन सिंथेज़ को आम तौर पर यूडीपी-[14 सी] ग्लूकोज (पशु और फंगल एंजाइमों के मामले में) या एडीपी-[14सी] ग्लूकोज (जीवाणु एंजाइमोंके मामले में) से ग्लाइकोजन 4,5 में ग्लूकोज के समावेश का पालन करके एक बंद रेडियोकेमिकल परख में मापा जाता है। इसी तरह, ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज को ग्लाइकोजन संश्लेषण की दिशा में मापा जाता है, ग्लूकोज -1-फॉस्फेटसे ग्लाइकोजन6 में ग्लूकोज के समावेश के बाद। ब्रांचिंग एंजाइम को ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज7 द्वारा ग्लूकोज -1-फॉस्फेट से 1,4-लिंक्डचेन में [14 सी] ग्लूकोज के समावेश को प्रोत्साहित करने के लिए इस एंजाइम की क्षमता को मापकर परख लिया जाता है, और एंजाइम गतिविधि को ग्लाइकोजन8 में ग्लूकोज कोशामिल करने के लिए एंजाइम की क्षमता का पालन करके निर्धारित किया जाता है। . बहुत संवेदनशील होने के बावजूद, एंजाइम गतिविधि के निम्न स्तर के साथ कच्चे सेल अर्क में उनके उपयोग की अनुमति देते हुए, रेडियोधर्मी सब्सट्रेट महंगे होते हैं और रेडियोआइसोटोप उपयोग के लिए नियामक आवश्यकताओं के अधीन होते हैं। ये बाधाएं कई श्रमिकों की पहुंच से कुछ परखों के उपयोग को बाहर रखती हैं। हालांकि, कई वर्षों के दौरान, इन एंजाइमों के माप के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक दृष्टिकोण की एक प्रभावशाली विविधता का वर्णन किया गया है। सामान्य तौर पर, ये दृष्टिकोण अंततः एनएडीएच / एनएडीपीएच के उत्पादन या खपत को मापने, या ग्लाइकोजन और आयोडीन के बीच रंगीन परिसरों की पीढ़ी को मापने पर निर्भर करते हैं। इस प्रकार, वे सीधे हैं और केवल टंगस्टन या क्सीनन फ्लैश लैंप से लैस सरल स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके किए जा सकते हैं।

ग्लाइकोजन सिंथेज़ के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख चीनी न्यूक्लियोटाइड दाता से जारी न्यूक्लियोसाइड डाइफॉस्फेट को मापने पर भरोसा करते हैं क्योंकि ग्लूकोज को बढ़ते ग्लाइकोजन श्रृंखला 9,10 में जोड़ा जाता है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के खंड 1 में वर्णित ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि को मापने की प्रक्रिया, वेलेस एट अल .11 द्वारा उल्लिखित एक संशोधन है, और युग्मन योजना नीचे दिखाई गई है:

(ग्लूकोज) n + UPD-ग्लूकोज → (ग्लूकोज)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + फॉस्फोनोलपाइरूवेट → पाइरूवेट + एटीपी

Pyruvate + NADH + H + → लैक्टेट + NAD +

ग्लाइकोजन सिंथेज़ ग्लाइकोजन पर यूडीपी-ग्लूकोज से ग्लूकोज जोड़ता है। इस प्रक्रिया में उत्पन्न यूडीपी को न्यूक्लियोसाइड डाइफॉस्फेट किनेज (एनडीपी किनेज) द्वारा यूटीपी में परिवर्तित किया जाता है, एक प्रतिक्रिया में जो एडीपी उत्पन्न करता है। एडीपी, बदले में, पाइरूवेट किनेज के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है, जो फॉस्फेट दाता के रूप में फॉस्फोनोलपाइरूवेट का उपयोग करके एडीपी को फॉस्फोराइलेट करता है। परिणामस्वरूप पाइरूवेट को एनएडीएच का उपभोग करने वाली प्रतिक्रिया में एंजाइम लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज द्वारा लैक्टेट में परिवर्तित किया जाता है। इसलिए, परख को निरंतर तरीके से किया जा सकता है, एनएडीएच का उपभोग करने के रूप में 340 एनएम पर अवशोषण में कमी की निगरानी की जा सकती है। यह आसानी से एंजाइमों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित है जिन्हें ग्लूकोज दाता के रूप में एडीपी-ग्लूकोज की आवश्यकता होती है। यहां, युग्मन चरण सरल हैं क्योंकि ग्लाइकोजन सिंथेज़ की कार्रवाई से जारी एडीपी को सीधे पाइरूवेट किनेज द्वारा कार्य किया जाता है।

ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज गतिविधि के निर्धारण के लिए विभिन्न प्रकार के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख उपलब्ध हैं। शास्त्रीय संस्करण में, एंजाइम ग्लाइकोजन संश्लेषण की दिशा में पीछे की ओर संचालित होता है, जैसा कि नीचे दिखाया गया है:

(ग्लूकोज) n + ग्लूकोज -1-फॉस्फेट → (ग्लूकोज) n + 1 + Pi

समय अंतराल पर, प्रतिक्रिया मिश्रण के एलिकोट हटा दिए जाते हैं, और मुक्त फॉस्फेट की मात्रा12,13 निर्धारित की जाती है। हमारे हाथों में, ग्लूकोज -1-फॉस्फेट की कई व्यावसायिक तैयारियों में आसानी से मापने योग्य मुक्त फॉस्फेट की उपस्थिति के कारण यह परख सीमित उपयोग की गई है, जो फॉस्फोरिलेज कार्रवाई के लिए आवश्यक ग्लूकोज -1-फॉस्फेट की उच्च सांद्रता के साथ संयुक्त है। इसके बजाय, हमने नियमित रूप से एक वैकल्पिक परख को नियोजित किया है जो ग्लाइकोजन के रूप में जारी ग्लूकोज -1-फॉस्फेट को फॉस्फोराइलेज13 द्वारा नीचा दिखाया जाता है। एक युग्मित प्रतिक्रिया योजना, जिसे नीचे चित्रित किया गया है, नियोजित है।

(ग्लूकोज) n + Pi → (ग्लूकोज) n-1 + ग्लूकोज-1-फॉस्फेट

ग्लूकोज -1-फॉस्फेट → ग्लूकोज -6-फॉस्फेट

ग्लूकोज -6-फॉस्फेट + एनएडीपी + → 6-फॉस्फोग्लूकोनोलैक्टोन + एनएडीपीएच + एच +

ग्लूकोज -1-फॉस्फेट को फॉस्फोग्लूकोमुटेस द्वारा ग्लूकोज -6-फॉस्फेट में परिवर्तित किया जाता है, और ग्लूकोज -6-फॉस्फेट को तब 6-फॉस्फोग्लूकोनोलैक्टोन में ऑक्सीकरण किया जाता है, जिसमें एनएडीपी + से एनएडीपीएच की सहवर्ती कमी होती है। प्रोटोकॉल के खंड 2 में विस्तृत प्रक्रिया, नीचे दी गई है, मेंडिसिनो एट अल .14 और श्रेइबर एंड बॉलिंग15 द्वारा वर्णित विधियों से ली गई है। परख को समय के साथ 340 एनएम पर अवशोषण में वृद्धि के साथ निरंतर फैशन में आसानी से किया जा सकता है, जिससे प्रतिक्रिया दर का निर्धारण हो सकता है।

डीब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक निर्धारण फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन16 पर एंजाइम की कार्रवाई द्वारा जारी ग्लूकोज के माप पर निर्भर करता है। यह यौगिक ग्लाइकोजन फॉस्फोराइलेज के साथ ग्लाइकोजन का इलाज करके बनाया गया है। चूंकि ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज क्रिया 4 ग्लूकोज अवशेषों को एक 1,6-शाखा बिंदु से दूर रोकती है, इसलिए सीमा डेक्सट्रिन में ग्लाइकोजन होता है, जिसकी बाहरी श्रृंखलाओं को ~ 4 ग्लूकोज अवशेषों तक छोटा कर दिया गया है। टेलर एट अल.17 और माकिनो एंड ओमिची18 द्वारा विकसित प्रक्रिया का उपयोग करके फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन की तैयारी का वर्णन यहां किया गया है।

डीब्रांचिंग एक दो-चरणीय प्रक्रिया है। द्विक्रियाशील डीब्रांचिंग एंजाइम की 4-α-ग्लूकोनोट्रांसफेरेज़ गतिविधि पहले शाखा बिंदु से तीन ग्लूकोज अवशेषों को पास के 1,4-लिंक्ड ग्लूकोज श्रृंखला के गैर-प्रतिक्रियाशील छोर तक स्थानांतरित करती है। शाखा बिंदु पर शेष एकल, 1,6-लिंक्ड ग्लूकोज अवशेषों को तब 1,6-ग्लूकोसिडेस गतिविधि19 द्वारा हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है। परख आमतौर पर एक रुके हुए फैशन में की जाती है, किसी दिए गए समय (या समय की श्रृंखला) के बाद जारी ग्लूकोज को युग्मित एंजाइम परख में मापा जाता है जैसा कि नीचे दिखाया गया है:

(ग्लूकोज) n → (ग्लूकोज) n-1 + ग्लूकोज

ग्लूकोज + एटीपी → ग्लूकोज -6-फॉस्फेट + एडीपी

ग्लूकोज -6-फॉस्फेट + एनएडीपी + → 6-फॉस्फोग्लूकोनोलैक्टोन + एनएडीपीएच + एच +

उत्पादित एनएडीपीएच का निर्धारण ग्लूकोज उत्पादन का एक उपाय देता है। प्रोटोकॉल के खंड 3 में उल्लिखित प्रक्रिया, नीचे, नेल्सन एट अल .16 द्वारा वर्णित एक पर आधारित है। अन्य तरीकों की तरह जो एनएडीएच / एनएडीपीएच की खपत या पीढ़ी पर भरोसा करते हैं, परख काफी संवेदनशील है। हालांकि, एमाइलेज या अन्य ग्लूकोसिडेस की उपस्थिति, जो फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन से मुक्त ग्लूकोज को भी मुक्त कर सकती है, महत्वपूर्ण हस्तक्षेप का कारण बनेगी (चर्चा देखें)।

ब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का वर्णमितीय निर्धारण इस तथ्य पर निर्भर करता है कि ग्लूकोज की 1,4-लिंक्ड चेन पेचदार संरचनाओं को अपनाती हैं जो आयोडीन से बंधती हैं, जिससे रंगीन कॉम्प्लेक्स20 बनते हैं। गठित परिसर का रंग 1,4-लिंक्ड श्रृंखलाओं की लंबाई पर निर्भर करता है। इस प्रकार, एमाइलोज, जिसमें 1,4-लिंक्ड ग्लूकोज की लंबी, बड़े पैमाने पर अनब्रांच्ड चेन होते हैं, आयोडीन के साथ एक गहरा नीला परिसर बनाते हैं। इसके विपरीत, ग्लाइकोजन, जिनमें से बाहरी श्रृंखलाएं आम तौर पर केवल 6 से 8 ग्लूकोज अवशेषों के क्रम में होती हैं, नारंगी-लाल कॉम्प्लेक्स बनाती हैं। यदि एमाइलोज के घोल को ब्रांचिंग एंजाइम के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, तो एमाइलोज में शाखाओं की शुरूआत के परिणामस्वरूप कम 1,4-लिंक्ड ग्लूकोज चेन उत्पन्न होते हैं। इस प्रकार, एमाइलोज / आयोडीन कॉम्प्लेक्स का अवशोषण अधिकतम कम तरंग दैर्ध्य की ओर स्थानांतरित हो जाता है। यहां चर्चा की गई प्रक्रिया बॉयर एंड प्रीस21 द्वारा विस्तृत से ली गई है और ब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि को समय के साथ 660 एनएम पर एमाइलोज / आयोडीन कॉम्प्लेक्स के अवशोषण में कमी के रूप में निर्धारित किया गया है।

जैसा कि ऊपर चर्चा से आसानी से स्पष्ट होना चाहिए, तथ्य यह है कि आयोडीन और 1,4-ग्लूकोज श्रृंखलाओं के बीच गठित परिसरों के रंग श्रृंखला की लंबाई के साथ भिन्न होते हैं, इसका मतलब है कि ग्लाइकोजन / आयोडीन कॉम्प्लेक्स के अवशोषण स्पेक्ट्रा ग्लाइकोजन शाखाओं की डिग्री के साथ भिन्न होना चाहिए। यह वास्तव में मामला है, और लंबी बाहरी श्रृंखलाओं वाले कम-शाखित ग्लाइकोजेन / ग्लाइकोजेन ग्लाइकोजेन ्स की तुलना में लंबी तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को अवशोषित करते हैं जो अधिक शाखित होते हैं / छोटी बाहरी श्रृंखलाएं होती हैं। इसलिए आयोडीन धुंधला प्रतिक्रिया का उपयोग ग्लाइकोजन ब्रांचिंग22 की डिग्री पर तेजी से, गुणात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। नारंगी-भूरे रंग का रंग तब बनता है जब आयोडीन के साथ ग्लाइकोजन कॉम्प्लेक्स विशेष रूप से तीव्र नहीं होता है। हालांकि, संतृप्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान22 को शामिल करके रंग विकास को बढ़ाया जा सकता है। यह विधि की संवेदनशीलता को लगभग 10 गुना बढ़ाता है और ग्लाइकोजन की माइक्रोग्राम मात्रा के तैयार विश्लेषण की अनुमति देता है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के खंड 4 में वर्णित शाखाओं के निर्धारण के लिए परख, क्रिसमैन22 द्वारा विकसित प्रक्रिया से अनुकूलित है। यह एक क्यूवेट में आयोडीन समाधान और कैल्शियम क्लोराइड के साथ ग्लाइकोजन नमूने को जोड़कर और 330 एनएम से 800 एनएम तक अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करके आयोजित किया जाता है। शाखाओं की डिग्री कम होने के साथ अवशोषण अधिकतम लंबी तरंग दैर्ध्य की ओर स्थानांतरित हो जाता है।

सामूहिक रूप से, यहां वर्णित विधियां ग्लाइकोजन चयापचय के प्रमुख एंजाइमों की गतिविधियों का आकलन करने और ग्लाइकोजन शाखाओं की सीमा पर गुणात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए सरल, विश्वसनीय साधन प्रदान करती हैं।

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Protocol

1. ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि का निर्धारण

  1. तालिका 1 (प्रयोगात्मक दिन से पहले) में दर्शाए अनुसार आवश्यक अभिकर्मकों के स्टॉक समाधान तैयार करें।
घटक दिशा-निर्देश
50 mM Tris pH 8.0 ~ 80 एमएल पानी में 0.61 ग्राम ट्राइस बेस घोलें।  4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।   HCl के साथ pH को 8.0 में समायोजित करें और पानी के साथ 100 mL तक की मात्रा बनाएं।
20 mM HEPES बफर ~ 80 एमएल पानी में 0.477 ग्राम एचईपीईएस घोलें।  पीएच को एनएओएच के साथ 7.0 में समायोजित करें और पानी के साथ मात्रा को 100 एमएल तक बनाएं।
132 mM Tris/32 mM KCl बफर pH 7.8 ~ 90 एमएल पानी में 1.94 ग्राम ट्राइस बेस और 0.239 ग्राम केसीएल घोलें।  HCl के साथ pH को 7.8 में समायोजित करें और पानी के साथ मात्रा को 100 mL तक बनाएं।
0.8% डब्ल्यू / वी सीप ग्लाइकोजन 80 मिलीग्राम सीप ग्लाइकोजन का वजन करें और पानी में जोड़ें।  पानी के साथ 10 मिलीलीटर तक अंतिम मात्रा बनाएं और ग्लाइकोजन को पूरी तरह से भंग करने के लिए धीरे से गर्म / मिश्रण करें।
100 mM UDP-ग्लूकोज पानी में 0.31 ग्राम यूडीपी-ग्लूकोज घोलें और 1 एमएल तक अंतिम मात्रा बनाएं।  -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एलिकोट में स्टोर करें।   कई महीनों के लिए स्थिर।
50 mM ATP ~ 13 एमएल पानी में 0.414 ग्राम एटीपी घोलें।  पीएच को एनएओएच के साथ 7.5 में समायोजित करें और पानी के साथ मात्रा को 15 एमएल तक बनाएं।  -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एलिकोट में स्टोर करें।   कई महीनों के लिए स्थिर।
100 mM ग्लूकोज-6-फॉस्फेट pH 7.8 ~ 7 से 8 एमएल पानी में 0.282 ग्राम ग्लूकोज-6-फॉस्फेट घोलें।  पीएच को एनएओएच के साथ 7.8 पर समायोजित करें।  पानी के साथ 10 एमएल तक की मात्रा बनाएं।  -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में जमे हुए स्टोर करें।   कम से कम छह महीने के लिए स्थिर।
40 mM फॉस्फोनोलपाइरूवेट 20 mM HEPES बफर pH 7.0 के 0.5 mL में 4 मिलीग्राम फॉस्फोनोलपाइरूवेट घोलें।  -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।   कम से कम 1 सप्ताह के लिए स्थिर।
0.5 M MnCl2 100 एमएल पानी की अंतिम मात्रा में एमएनसीएल2 के 9.90 ग्राम को भंग करें।
एनडीपी काइनेज 1 यू / μl घोल देने के लिए पर्याप्त पानी के साथ लियोफिलाइज्ड पाउडर का पुनर्गठन करें।  एलिकोट तैयार करें, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।   कम से कम 1 वर्ष के लिए स्थिर।

तालिका 1: ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि की परख के लिए आवश्यक स्टॉक समाधान।

  1. परख के दिन, 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.0 के 1.5 एमएल में 4.5 मिलीग्राम एनएडीएच को भंग करके 4 एमएम एनएडीएच का एक नया कामकाजी समाधान तैयार करें। बर्फ पर स्टोर करें, प्रकाश से सुरक्षित।
  2. बर्फ पर यूडीपी-ग्लूकोज, एटीपी, फॉस्फोनोलिपिरूवेट और एनडीपी किनेज के स्टॉक समाधान पिघलें।
  3. पानी के स्नान को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  4. तालिका 2 में सूचीबद्ध प्रतिक्रिया मिश्रण अभिकर्मकों को जोड़कर प्रत्येक ग्लाइकोजन सिंथेज़ परख को 1.5 एमएल ट्यूब में सेट करें।
घटक Volume (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl बफर pH 7.8 250
पानी 179
100 mM ग्लूकोज -6-फॉस्फेट, pH 7.8 58
0.8% डब्ल्यू / वी सीप ग्लाइकोजन 67
50 mM ATP 80
4 mM NADH 80
100 mM UDP-ग्लूकोज 28
40 mM फॉस्फोनोलपाइरूवेट 20
0.5 M MnCl2 8
अंतिम मात्रा 770

तालिका 2: ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि की परख के लिए संरचना प्रतिक्रिया मिश्रण।

नोट: सेट-अप को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है जिसमें उपरोक्त सूचीबद्ध अभिकर्मकों में से प्रत्येक को नियोजित परखों की संख्या को पूरा करने के लिए पर्याप्त मात्रा में शामिल किया जा सकता है।

  1. एक रिक्त प्रतिक्रिया तैयार करें, जहां उपरोक्त मिश्रण में एनएडीएच को पानी से बदल दिया जाता है। एक डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें और 340 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शून्य सेट करने के लिए इसका उपयोग करें।
  2. 1.5 एमएल ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण के एलिकोट का एक 770 μL लें। लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज मिश्रण के 2 μL और पाइरूवेट काइनेज / लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज मिश्रण के 2 μL जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और प्रतिक्रिया मिश्रण को पूर्व-गर्म करने के लिए 3 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 20 mM Tris बफर, pH 7.8 में ग्लाइकोजन सिंथेज़ युक्त नमूने का 30 μL जोड़ें; मिश्रण को मिलाएं, और प्रतिक्रिया मिश्रण को एक डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
  4. क्यूवेट को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें और 10 से 20 मिनट के लिए समयबद्ध अंतराल पर 340 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें। समय के विरुद्ध प्राप्त अवशोषणों को प्लॉट करें।
    नोट: एक प्रतिक्रिया जिसमें ग्लाइकोजन सिंथेज़ नमूने को 20 एमएम ट्राइस बफर के साथ बदल दिया जाता है, एनएडीएच के गैर-एंजाइमेटिक ऑक्सीकरण को नियंत्रित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए। नमूने की शुद्धता के आधार पर, अन्य नियंत्रण प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता हो सकती है। विवरण के लिए चर्चा देखें.
  5. प्रतिक्रिया दर निर्धारित करें (विवरण के लिए परिणाम देखें)।

2. ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज गतिविधि का निर्धारण

  1. तालिका 3 (प्रयोगात्मक दिन से पहले) में दर्शाए अनुसार स्टॉक समाधान तैयार करें।
घटक दिशा-निर्देश
125 mM पाइप pH 6.8 पानी में 3.78 ग्राम पाइप घोलें।  पीएच को एनएओएच के साथ 6.8 में समायोजित करें और पानी के साथ मात्रा को 100 एमएल तक बनाएं।
8% डब्ल्यू / वी सीप ग्लाइकोजन 0.8 ग्राम सीप ग्लाइकोजन का वजन करें और पानी में जोड़ें।  पानी के साथ 10 मिलीलीटर तक अंतिम मात्रा बनाएं और ग्लाइकोजन को भंग करने के लिए धीरे से गर्म / मिश्रण करें।  -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए स्टोर करें।
200 mM Na फॉस्फेट pH 6.8 Na 2 HPO4.7H 2 O के2.63g और NaH2PO 4 के1.41 ग्राम घोलें। H2O पानी में।  पानी के साथ 100 एमएल तक मात्रा लाएं।
1 एमएम ग्लूकोज -1,6-बिस्फॉस्फेट 4 एमएल पानी में 2 मिलीग्राम ग्लूकोज -1,6-बिस्फॉस्फेट घोलें।  -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एलिकोट और स्टोर करें।   कम से कम कई महीनों के लिए स्थिर।
10 mM NADP 3 एमएल पानी में 23 मिलीग्राम एनएडीपी घोलें।  -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एलिकोट और स्टोर करें।   कम से कम कई महीनों के लिए स्थिर।

तालिका 3: ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज गतिविधि की परख के लिए आवश्यक स्टॉक समाधान।

  1. पानी के स्नान को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें
  2. नीचे सूचीबद्ध प्रतिक्रिया मिश्रण अभिकर्मकों को जोड़कर प्रत्येक ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज परख को 1.5 एमएल ट्यूब में सेट करें (तालिका 4)।
घटक Volume (μl)
125 mM पाइप बफर pH 6.8 160
पानी 70
8% डब्ल्यू / वी सीप ग्लाइकोजन 100
200 mM Na फॉस्फेट 6.8 400
1 एमएम ग्लूकोज -1,6-बिस्फॉस्फेट 20
10 mM NADP 20
अंतिम मात्रा 770

तालिका 4: ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज गतिविधि की परख के लिए संरचना प्रतिक्रिया मिश्रण।

नोट: सेट-अप को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है जिसमें उपरोक्त सूचीबद्ध अभिकर्मकों में से प्रत्येक को नियोजित परखों की संख्या को पूरा करने के लिए पर्याप्त मात्रा में शामिल किया जा सकता है।

  1. तालिका 4 में सूचीबद्ध घटकों से युक्त एक रिक्त प्रतिक्रिया तैयार करें, लेकिन 25 एमएम पाइप बफर, पीएच 6.8 (पानी के साथ 125 एमएम पाइप बफर 1/5 को पतला करके तैयार) का अतिरिक्त 30 μL जोड़ें। एक डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें और 340 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शून्य सेट करने के लिए उपयोग करें।
  2. 1.5 एमएल ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण का एक 770 μL एलिकोट लें। ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज का 1 μL और फॉस्फोग्लूकोमुटेज़ का 1 μL जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और प्रतिक्रिया मिश्रण को पूर्व-गर्म करने के लिए 3 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 25 एमएम पाइप बफर, पीएच 6.8 में ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज युक्त नमूने का 30 μL जोड़ें। प्रतिक्रिया मिश्रण को एक डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में मिलाएं और स्थानांतरित करें।
  4. क्यूवेट को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें और 10 से 20 मिनट के लिए समयबद्ध अंतराल पर 340 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें। समय के विरुद्ध प्राप्त अवशोषणों को प्लॉट करें।
    नोट: एक प्रतिक्रिया जिसमें ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज को 25 एमएम पाइप बफर के साथ बदल दिया जाता है, को शामिल किया जाना चाहिए। ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज नमूने की शुद्धता के आधार पर, अन्य नियंत्रणों की भी आवश्यकता हो सकती है (विवरण के लिए चर्चा देखें)।
  5. प्रतिक्रिया दर निर्धारित करें (विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें)।

3. ग्लाइकोजन डीब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का निर्धारण

  1. तालिका 5 (प्रयोगात्मक दिन से पहले) में दर्शाए अनुसार स्टॉक समाधान तैयार करें।
घटक दिशा-निर्देश
100 mM मैलेट बफर ~ 80 एमएल पानी में 1.61 ग्राम मैलिक एसिड घोलें।  पीएच को एनएओएच के साथ 6.6 में समायोजित करें और पानी के साथ 100 एमएल तक अंतिम मात्रा बनाएं।
300 mM ट्राइएथेनॉलमाइन हाइड्रोक्लोराइड / 3 mM MgSO4 pH 7.5 27.85 ग्राम ट्राइएथेनॉलमाइन हाइड्रोक्लोराइड और 0.370 ग्राम एमजीएसओ 4 को भंग करें। 7H2O ~ 400 mL पानी में।  पीएच को एनएओएच के साथ 7.5 में समायोजित करें और पानी के साथ 500 एमएल की अंतिम मात्रा तक बनाएं।
150 mM ATP/12 mM NADP ~ 10 एमएल पानी में 1.24 ग्राम एटीपी घोलें।  पीएच की निगरानी करें और एटीपी के घुलने पर ~ 7.5 के पीएच को बनाए रखने के लिए एनएओएच जोड़ें।  एनएडीपी के 0.138 ग्राम जोड़ें।  पीएच को एनएओएच के साथ ~ 7.5 में समायोजित करें और पानी के साथ 15 एमएल की अंतिम मात्रा तक बनाएं। - 20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में स्टोर करें। कई महीनों के लिए स्थिर।
50 mM Na फॉस्फेट बफर pH 6.8 Na 2 HPO4.7H 2 O के32.81ग्राम और NaH2PO4 के 17.61 ग्राम को भंग करें। H2O पानी में।  पानी के साथ आयतन को 5 लीटर के अंतिम आयतन तक लाएं।

तालिका 5: ग्लाइकोजन डीब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि की परख के लिए आवश्यक स्टॉक समाधान।

  1. फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन तैयार करें
    1. 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 6.8 के 10 एमएल में 0.3 ग्राम सीप ग्लाइकोजन घोलें।
    2. 50 एमएम फॉस्फेट बफर, पीएच 6.8 में 60 यू गतिविधि उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त लियोफिलाइज्ड फॉस्फोरिलेज ए पाउडर को भंग करें।
      नोट: खरीदे गए फॉस्फोरिलेज ए के बहुत सारे के आधार पर, आवश्यक द्रव्यमान अलग-अलग होगा लेकिन आम तौर पर 5 से 10 मिलीग्राम पाउडर के बीच होता है।
  2. ग्लाइकोजन समाधान में फॉस्फोरिलेज ए के 60 यू जोड़ें और डायलिसिस बैग में स्थानांतरित करें। 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर के 1 एल के खिलाफ कमरे के तापमान पर डायलाइज, 8 घंटे के लिए पीएच 6.8। ताजा डायलिसिस बफर में बदलें और रात भर इनक्यूबेशन जारी रखें।
  3. फॉस्फोरिलेज ए का एक और 10 यू जोड़ें और ताजा डायलिसिस बफर में बदलें। 8 घंटे के बाद, फिर से ताजा डायलिसिस बफर में बदलें और रात भर इनक्यूबेशन जारी रखें।
  4. डायलिसिस बैग की सामग्री को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए उबालें। बर्फ पर ठंडा करें, और फिर 15 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सुपरनैटेंट को डायलिसिस बैग में स्थानांतरित करें और 2 लीटर आसुत जल के तीन परिवर्तनों के खिलाफ 8 घंटे के लिए डायलाइज करें।
  6. डायलिसिस बैग की सामग्री को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। मात्रा को मापें और सीमा डेक्सट्रिन को अवक्षेपित करने के लिए बर्फ-ठंडे पूर्ण इथेनॉल के दो संस्करण जोड़ें। ट्यूब को 30 मिनट के लिए बर्फ पर खड़े रहने दें।
    नोट: इथेनॉल के अलावा एक सफेद अवक्षेप तुरंत बनना शुरू हो जाना चाहिए, लेकिन, यदि ऐसा नहीं होता है, तो 3 एम एनएसीएल की एक बूंद जोड़ें।
  7. सेंट्रीफ्यूज 15 मिनट के लिए 15,000 x g पर और सुपरनैटेंट को त्याग दें। प्रत्येक कुल्ला के लिए ~ 30 एमएल का उपयोग करके, 66% वी / वी इथेनॉल के साथ सीमा डेक्सट्रिन की सफेद गोली को दो बार धोएं।
  8. सीमा डेक्सट्रिन को मोर्टार में स्थानांतरित करें और पूरी तरह से हवा को सूखने दें। जब सीमा डेक्सट्रिन सूख जाती है, तो मूसल के साथ पाउडर में पीस लें और भंडारण के लिए एक उपयुक्त बर्तन में स्थानांतरित करें; 4 डिग्री सेल्सियस पर सूखा।
  9. डीब्रांचिंग एंजाइम सब्सट्रेट के रूप में उपयोग के लिए, पानी में 1% डब्ल्यू / वी समाधान तैयार करें।
  10. पानी के स्नान को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  11. एक हीटिंग ब्लॉक या पानी के स्नान को 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  12. चार 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें जिनमें से प्रत्येक में 100 μL मैलेट बफर, 80 μL फॉस्फोराइलेज सीमा डेक्सट्रिन और 10 μL पानी हो। इन ट्यूबों का उपयोग डीब्रांचिंग एंजाइम परख का संचालन करने के लिए किया जाएगा। ट्यूबों की प्रतिक्रिया और अन्य दो ट्यूबों के नियंत्रण में से दो को लेबल करें।
  13. समय-समय पर, प्रतिक्रिया ट्यूबों में डीब्रांचिंग एंजाइम नमूने के 10 μL और बफर के 10 μL जोड़ें जिसका उपयोग नियंत्रण ट्यूबों में ब्रांचिंग एंजाइम नमूना तैयार करने के लिए किया गया था। 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  14. परिभाषित समय बिंदुओं (जैसे, 5-, 10-, और 20-मिनट इनक्यूबेशन) पर, प्रत्येक प्रतिक्रिया और नियंत्रण ट्यूब से 50 μL निकालें और तुरंत 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक या पानी के स्नान में रखें। 3 मिनट के लिए गर्म करें।
  15. अवक्षेपित प्रोटीन को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 15,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: इस बिंदु पर, यदि आवश्यक हो तो प्रक्रिया को रोका जा सकता है। गर्म नमूने को जारी ग्लूकोज (चरण 17, नीचे) के माप के लिए आगे बढ़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है।
  16. जारी ग्लूकोज का मापन
    1. गर्म नमूनों से सतह पर तैरने वाले 40 μL को डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें और ट्राइएथेनॉलमाइन हाइड्रोक्लोराइड / मैग्नीशियम सल्फेट बफर के 833 μL, NADP / ATP मिश्रण के 67 μL, और 60 μL पानी जोड़ें। हवा के बुलबुले पेश न करने के लिए सावधान रहें, धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
      नोट: सेट-अप को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है जिसमें उपरोक्त सूचीबद्ध अभिकर्मकों में से प्रत्येक को नियोजित परखों की संख्या को पूरा करने के लिए पर्याप्त मात्रा में शामिल किया जा सकता है।
    2. 100 μL मैलेट बफर, 80 μL फॉस्फोराइलेज लिमिट डेक्सट्रिन और 20 μL पानी के संयोजन से एक रिक्त प्रतिक्रिया तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं, और एक डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में 40 μL स्थानांतरित करें। चरण 3.17.1 में वर्णित ट्राइएथेनॉलमाइन हाइड्रोक्लोराइड / मैग्नीशियम सल्फेट आदि के 833 μL जोड़ें।
    3. रिक्त प्रतिक्रिया का उपयोग करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शून्य को 340 एनएम पर सेट करें।
    4. प्रत्येक क्यूवेट में ग्लूकोज -6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज का 0.5 μL जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके धीरे-धीरे मिलाएं। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और फिर 340 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें।
      नोट: अवशोषण मान कम होना चाहिए, ग्लूकोज -6-फॉस्फेट के साथ नमूनों के थोड़े संदूषण को दर्शाता है।
    5. प्रत्येक क्यूवेट में 0.5 μL हेक्सोकाइनेज जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके धीरे-धीरे मिलाएं। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और फिर 340 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें।
    6. अतिरिक्त 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन जारी रखें। एक बार फिर 340 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें। यदि अवशोषण 15 मिनट में दर्ज किए गए से बढ़ गया है, तो इनक्यूबेशन 5 मिनट के लिए जारी रखें और फिर से अवशोषण की जांच करें। प्राप्त 340 एनएम पर अंतिम अवशोषण रिकॉर्ड करें।
    7. प्रत्येक नमूने के लिए, हेक्सोकाइनेज के अतिरिक्त प्राप्त अंतिम अवशोषण से ग्लूकोज -6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज के जोड़ के बाद दर्ज 340 एनएम पर अवशोषण को घटाएं। उस समय की लंबाई के खिलाफ प्राप्त मूल्यों को प्लॉट करें जो संबंधित नमूने को डीब्रांचिंग एंजाइम के साथ इनक्यूबेट किया गया था।

4. ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का निर्धारण

  1. प्रयोगात्मक दिन से पहले, 10 एमएल पानी में 2.6 ग्राम केआई को घोलकर आयोडीन / केआई समाधान तैयार करें। एक फ्यूम हुड में, 0.26 ग्राम आयोडीन का वजन करें और केआई समाधान में जोड़ें।
    सावधानी: त्वचा के संपर्क में आने पर या साँस लेने पर आयोडीन हानिकारक होता है। आयोडीन को भंग करने के लिए मिलाएं और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसके अलावा 125 एमएम पाइप बफर, पीएच 6.8 ( तालिका 3 देखें) तैयार करें।
  2. प्रयोगशुरू करते समय, अम्लीय आयोडीन अभिकर्मक का एक कामकाजी स्टॉक बनाएं।
    1. एक 50 एमएल ट्यूब में 45.7 एमएल पानी लें और 150 μL आयोडीन / KI घोल जोड़ें, इसके बाद 1 M HCl का 150 μL जोड़ें।
    2. अच्छी तरह से मिलाएं और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इन स्थितियों के तहत समाधान कम से कम 3 दिनों के लिए स्थिर है।
  3. प्रयोग के दिन, एमाइलोज का एक ताजा 10 मिलीग्राम / एमएल घोल बनाएं।
    1. एमाइलोज के 50 मिलीग्राम वजन करें और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. पूर्ण इथेनॉल के 200 μL जोड़ें और धीरे से हिलाएं।
    3. 2 M KOH का 500 μL जोड़ें और धीरे से हिलाएं।
      चेतावनी: कोह गंभीर त्वचा जलने और आंखों की क्षति का कारण बनता है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें।
    4. धीरे से हिलाते हुए 0.5 एमएल पानी डालें। यदि एमाइलोज पूरी तरह से भंग नहीं होता है, तो अतिरिक्त 0.5 एमएल पानी जोड़ें।
    5. 1 M HCl के साथ pH को ~ 6.5 से 7.0 में समायोजित करें।
      चेतावनी: एचसीएल आंख, त्वचा और श्वसन पथ में जलन पैदा कर सकता है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें।
    6. 5 एमएल की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए पानी जोड़ें।
    7. 0.2 μm सिरिंज एंड फिल्टर के माध्यम से मार्ग द्वारा निष्फल करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें। ठंडा या फ्रीज न करें।
  4. पानी के स्नान को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  5. बारह 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें, जिनमें से प्रत्येक में 1 एमएल अम्लीय आयोडीन अभिकर्मक होते हैं। बेंच पर अलग रख दें। इनका उपयोग ब्रांचिंग एंजाइम प्रतिक्रिया को रोकने के लिए किया जाएगा।
  6. चार 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें जिनमें से प्रत्येक में 150 μL एमाइलोज, 150 μL पाइप बफर और 45 μL पानी हो। इन ट्यूबों का उपयोग ब्रांचिंग एंजाइम परख का संचालन करने के लिए किया जाएगा। ट्यूबों की प्रतिक्रिया और अन्य दो ट्यूबों के नियंत्रण में से दो को लेबल करें।
  7. समय-समय पर, प्रतिक्रिया ट्यूबों में ब्रांचिंग एंजाइम नमूना के 5 μL और बफर के 5 μL जोड़ें जिसका उपयोग नियंत्रण ट्यूबों में ब्रांचिंग एंजाइम नमूना तैयार करने के लिए किया गया था। 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. परिभाषित समय बिंदुओं (जैसे, 5, 10, और 15 मिनट इनक्यूबेशन) पर, प्रत्येक प्रतिक्रिया और नियंत्रण ट्यूब से 10 μL निकालें और 1.5 एमएल ट्यूबों में जोड़ें जिसमें 1 एमएल अम्लीय आयोडीन अभिकर्मक होता है। अतिरिक्त १४० μL पानी डालें और अच्छी तरह मिलाएँ। डिस्पोजेबल क्यूवेट में स्थानांतरण।
    नोट: नमूने नीले रंग के होने चाहिए और समाधान किसी भी अवक्षेप से मुक्त होना चाहिए। गठित रंग कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए स्थिर होता है।
  9. एक नमूना तैयार करें जिसमें 1 एमएल अम्लीय आयोडीन अभिकर्मक और 150 μL पानी हो। अच्छी तरह मिलाएं और एक क्यूवेट में स्थानांतरित करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शून्य को 660 एनएम पर सेट करने के लिए इस क्यूवेट का उपयोग करें।
  10. 660 एनएम पर बारह नमूनों में से प्रत्येक के अवशोषण को पढ़ें। प्रत्येक समय बिंदु पर कोई ब्रांचिंग एंजाइम मौजूद नहीं होने पर अवशोषण से ब्रांचिंग एंजाइम (प्रतिक्रिया) की उपस्थिति में प्राप्त अवशोषण को घटाकर ब्रांचिंग एंजाइम प्रतिक्रिया की दर निर्धारित करें। विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें।

5. ग्लाइकोजन शाखाओं का गुणात्मक मूल्यांकन

  1. ~ 40 एमएल पानी में 74.5 ग्राम निर्जल कैल्शियम क्लोराइड जोड़कर और हिलाकर संतृप्त कैल्शियम क्लोराइड घोल तैयार करें। थोड़ा और पानी डालें और हिलाना जारी रखें। पानी के साथ 100 एमएल तक की मात्रा बनाएं और सीएसीएल2 के पूरी तरह से घुलने तक हिलाना जारी रखें।
  2. आयोडीन स्टॉक समाधान के 50 μL के KI/Iodine स्टॉक समाधान (ऊपर चरण 4.1, ऊपर देखें) को 15 mL ट्यूब में 13 mL संतृप्त CaCl 2 घोल के साथ मिलाकर आयोडीन/CaCl2 रंग अभिकर्मक का एक कार्यशील स्टॉक तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इन स्थितियों के तहत समाधान कम से कम 1 सप्ताह के लिए स्थिर है।
  3. शाखाओं का निर्धारण
    1. एक 1.5 एमएल ट्यूब में, 650 μL आयोडीन / CaCl 2 रंग अभिकर्मक स्टॉकको 100 μL पानी के साथ मिलाएं और अच्छी तरह से मिलाएं। समाधान को एक डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: क्यूवेट में समाधान स्पष्ट और हल्के पीले रंग का होना चाहिए।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें और, तरंग दैर्ध्य स्कैनिंग मोड में चलते हुए, 330 एनएम से 800 एनएम तक पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम एकत्र करें।
    3. 1.5 एमएल ट्यूब में, 650 μL काम करने वाले आयोडीन / CaCl2 रंग अभिकर्मक को 50 μg सीप ग्लाइकोजन के साथ मिलाएं। अंतिम मात्रा को पानी के साथ 750 μL तक लाएं और अच्छी तरह से मिलाएं। समाधान को एक डिस्पोजेबल मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: क्यूवेट में समाधान स्पष्ट और गहरा नारंगी / भूरा रंग होना चाहिए।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें और 330 एनएम से 800 एनएम तक अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करें।
    5. चरण 4.4.3 से 4.4.4 तक 50 μg एमाइलोपेक्टिन और 30 μg एमाइलोज के साथ दोहराएं।
      नोट: एमाइलोपेक्टिन नमूना पीला / हरा होना चाहिए और एमाइलोज नमूना हरा / नीला होना चाहिए। दोनों नमूने स्पष्ट होने चाहिए। गठित रंगीन परिसर स्थिर होते हैं, कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए अवशोषण स्पेक्ट्रम में कोई बदलाव नहीं होता है।
    6. एक अज्ञात ग्लाइकोजन नमूने की शाखित संरचना का संकेत प्राप्त करने के लिए, 25 μg से 50 μg ग्लाइकोजन को 650 μL काम करने वाले आयोडीन / CaCl2 रंग अभिकर्मक के साथ मिलाएं। ऊपर की तरह आगे बढ़ें, पानी के साथ मात्रा को 750 μL तक लाएं, अच्छी तरह से मिलाएं, और एक मेथैक्रिलेट क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: ग्लाइकोजन नमूने को ग्लाइकोजन मौजूद की शाखाओं (बाहरी श्रृंखलाओं की लंबाई) की डिग्री के आधार पर पीले / नारंगी से नारंगी / भूरे रंग का उत्पादन करना चाहिए। फिर, नमूना स्पष्ट होना चाहिए। विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें।
    7. अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करें।

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Representative Results

ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि का निर्धारण
चित्रा 1 शुद्ध एंजाइमों का उपयोग करके ग्लाइकोजन सिंथेज़ परख से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। पैनल ए में, थोड़े अंतराल के बाद, लगभग 12 मिनट की अवधि के लिए समय के साथ 340 एनएम पर अवशोषण में रैखिक कमी आई थी। चित्रा 1 ए में अवशोषण में परिवर्तन की दर ~ 0.12 अवशोषण इकाइयों / मिनट थी। ~ 0.010 और ~ 0.20 अवशोषण इकाइयों / मिनट के बीच अवशोषण में परिवर्तन की दर इष्टतम है और ग्लाइकोजन सिंथेज़ की मात्रा को इस सीमा के भीतर उपज दरों के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। पैनल बी में, परख में बहुत अधिक ग्लाइकोजन सिंथेज़ जोड़ने का परिणाम दिखाया गया है। यहां, प्रतिक्रिया पहले 2 मिनट के भीतर पूरी हो गई थी। नियंत्रण प्रतिक्रिया, जिसमें इन मामलों में कोई ग्लाइकोजन सिंथेज़ नहीं था, ने समय के साथ अवशोषण में कोई औसत दर्जे की कमी नहीं दिखाई। जैसा कि चर्चा में विस्तार से बताया गया है, इस परख में ऊतक होमोजेनेट्स का उपयोग पूरी तरह से संभव है, हालांकि अतिरिक्त नियंत्रण प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता होती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक सब्सट्रेट के रूप में सीप ग्लाइकोजन का उपयोग करता है, जो कई अलग-अलग प्रजातियों के ग्लाइकोजन सिंथेस के साथ अच्छी तरह से काम करता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ग्लाइकोजन सिंथेस नियोजित ग्लाइकोजन के प्रकार के आधार पर काफी परिवर्तनशील गतिविधि प्रदर्शित कर सकते हैं। इसलिए, किसी भी विस्तृत अध्ययन को शुरू करने से पहले ग्लाइकोजन के विभिन्न रूपों का सर्वेक्षण करना उचित है।

दिए गए प्रोटोकॉल में प्रतिक्रिया मिश्रण में ग्लूकोज -6-फोपोस्फेट शामिल है, क्योंकि कई ग्लाइकोजन सिंथेस इस यौगिक 9,23,24,25,26 द्वारा एलोस्टेरिक रूप से सक्रिय होते हैं। ग्लूकोज -6-फॉस्फेट (पानी के साथ प्रतिक्रिया की मात्रा बनाना) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में परख का संचालन करना, -/ + ग्लूकोज -6-फॉस्फेट गतिविधि अनुपात की गणना की अनुमति देता है, जो स्तनधारी और फंगल ग्लाइकोजन सिंथेस 1,27 की फॉस्फोराइलेशन स्थिति का एक उपयोगी संकेत है।

अवशोषण में परिवर्तन से ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि का निर्धारण सरल है। एनएडीएच के विलोपन गुणांक को 6220 एम -1 सेमी -1 के रूप में लिया जाता है, जिससे अवशोषण परिवर्तन की दर से एनएडीएच एकाग्रता में परिवर्तन की दर की गणना निम्नानुसार होती है:

0.12 इकाइयों/मिनट के अवशोषण में परिवर्तन की दर एनएडीएच सांद्रता में 0.12/6220 = 1.93 x 10-5 मोल/एल/मिनट परिवर्तन से मेल खाती है। क्यूवेट में आयतन 0.8 एमएल था, जिसका अर्थ है कि एनएडीएच की मात्रा में परिवर्तन था: 1.93 x 10-5 x 0.8 x 10-3 = 3.46 x 10-8 मोल/ जोड़े गए एंजाइम की मात्रा 60 μL, 3.46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5.76 x 10-7 mol NADH खपत / min / mL एंजाइम थी।

चूंकि एनएडीएच खपत और ग्लाइकोजन में शामिल ग्लूकोज के बीच एक-से-एक संबंध है, प्रतिक्रिया की दर को 5.76 x 10-7 मोल ग्लूकोज निगमित / मिनट / एमएल के रूप में व्यक्त किया जा सकता है।

जब एंजाइम नमूने की प्रोटीन सामग्री ज्ञात होती है, तो विशिष्ट एंजाइम गतिविधि को उपयुक्त रूप से μmol ग्लूकोज शामिल / min / mg प्रोटीन या nmol ग्लूकोज निगमित / min / mg प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है।

जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, प्रोटोकॉल को ग्लाइकोजन सिंथेस की गतिविधि को मापने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जाता है जो ग्लूकोज दाता के रूप में एडीपी-ग्लूकोज का उपयोग करते हैं। यह प्रतिक्रिया मिश्रण में एडीपी-ग्लूकोज के साथ यूडीपी-ग्लूकोज के सरल प्रतिस्थापन द्वारा प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, एनडीपी किनेज और एटीपी दोनों को प्रतिक्रिया मिश्रण से छोड़ दिया जाता है, क्योंकि ग्लाइकोजन सिंथेज़ कार्रवाई के दौरान जारी एडीपी पाइरूवेट किनेज के लिए एक प्रत्यक्ष सब्सट्रेट है।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि के परख से प्रतिनिधि परिणाम। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को 20 मिनट के कुल समय के लिए प्रति मिनट एक रीडिंग लेने के लिए सेट किया गया था। पैनल ए अपेक्षित लघु अंतराल चरण दिखाता है जिसके बाद समय के साथ अवशोषण में रैखिक कमी होती है (प्रायोगिक)। नियंत्रण प्रतिक्रिया में नोट किए गए अवशोषण में कोई कमी नहीं थी। प्रतिक्रिया दर की गणना रैखिक चरण (5 से 16 मिनट तक) में अवशोषण परिवर्तन के ढलान से की जाती है। पैनल बी बहुत अधिक एंजाइम जोड़ने का परिणाम दिखाता है। यहाँ, NADH 2 मिनट के भीतर समाप्त हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज गतिविधि का निर्धारण
चित्रा 2 शुद्ध एंजाइम का उपयोग करके ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज परख से प्रतिनिधि डेटा दिखाता है। यहां उपयोग की जाने वाली तैयारी के साथ, परख लगभग 3 मिनट के लिए रैखिक थी। इनसेट समय 0 से 2.5 मिनट तक बिंदुओं के माध्यम से खींची गई प्रतिगमन रेखा दिखाता है। इस रेखा का ढलान अवशोषण परिवर्तन की दर को 0.022 अवशोषण इकाइयों/मिनट के रूप में दर्शाता है। लगभग 0.01 से 0.04 की अवशोषण वृद्धि की दर इष्टतम है, क्योंकि यदि बहुत अधिक एंजाइम मौजूद है तो परख रैखिकता से काफी तेजी से विचलित होगी। एनएडीपीएच गठन की दर की गणना विलोपन गुणांक से की जाती है, जो एनएडीएच की तरह, 6220 एम -1 सेमी -1 है। एनएडीपीएच के प्रत्येक 1 मोल के लिए, ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज की कार्रवाई द्वारा ग्लूकोज -1-फॉस्फेट का एक मोल उत्पादित किया गया था। इसलिए एंजाइम गतिविधि को ग्लाइकोजन से प्रति यूनिट समय से जारी ग्लूकोज -1-फॉस्फेट की मात्रा के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, ऊपर उल्लिखित गणना के समान गणना के बाद।

प्रतिक्रिया की स्थिति उन फॉस्फोरिलेज के लिए आसानी से अनुकूलनीय है जो एलोस्टेरिक मॉड्यूलेशन के प्रति संवेदनशील हैं। अपेक्षित प्रभावकों को बस प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण में शामिल किया जाता है, कुछ पानी की जगह। एक महत्वपूर्ण चेतावनी यह है कि प्रभावक को युग्मन एंजाइमों, फॉस्फोग्लूकोमुटेस और ग्लूकोज -6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि को प्रभावित नहीं करने के लिए दिखाया जाना चाहिए।

अंत में, ऊपर वर्णित ग्लाइकोजन सिंथेज़ के साथ, सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकोजन का प्रकार प्रतिक्रिया की दर को प्रभावित कर सकता है। जबकि सीप ग्लाइकोजन कई प्रजातियों से फॉस्फोरिलेज के साथ अच्छी तरह से काम करता है, यह हमेशा इष्टतम विकल्प नहीं हो सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज गतिविधि के परख से प्रतिनिधि परिणाम। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को 10 मिनट के कुल समय के लिए हर 30 सेकंड में एक रीडिंग लेने के लिए सेट किया गया था। ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज (प्रायोगिक) की उपस्थिति में दर्ज अवशोषण में लगातार वृद्धि हुई थी, जबकि अतिरिक्त फॉस्फोरिलेज के बिना प्रतिक्रिया बेसलाइन (नियंत्रण) पर बनी रही। इनसेट प्रारंभिक प्रतिक्रिया अवधि का विस्तार दिखाता है, जो समय के संबंध में उत्पाद गठन की रैखिकता का प्रदर्शन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्लाइकोजन डीब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का निर्धारण
चित्रा 3 में दिखाए गए डेटा शुद्ध डीब्रांचिंग एंजाइम का उपयोग करके ग्लाइकोजन डिब्रांचिंग एंजाइम परख का प्रतिनिधि हैं। प्रत्येक समय बिंदु पर, अतिरिक्त ब्रांचिंग एंजाइम (नियंत्रण) की अनुपस्थिति में होने वाले अवशोषण में परिवर्तन को अवशोषण में परिवर्तन से घटाया गया था जो ब्रांचिंग एंजाइम (प्रतिक्रिया) की उपस्थिति में हुआ था। परिणामी अवशोषण मूल्यों को तब प्लॉट किया गया था। जैसा कि ऊपर बताया गया है, प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा वक्र के प्रारंभिक ढलान से एनएडीपीएच एकाग्रता के परिवर्तन की दर की गणना की जाती है। इस उदाहरण में, प्रति इकाई समय में एनएडीपीएच में वृद्धि 10 मिनट के लिए रैखिक थी, जिसमें 0.0079 अवशोषण इकाइयों / मिनट की ढलान थी। हालांकि ये डेटा पूरी तरह से उपयोग करने योग्य हैं, थोड़ा कम एंजाइम के अतिरिक्त ने उथला ढलान दिया होगा और एक लंबे रैखिक चरण के लिए अनुमति दी होगी। वैकल्पिक रूप से, इनक्यूबेशन 2 मिनट और 7 मिनट पर माप के लिए एलिकोट को हटाकर अतिरिक्त रीडिंग ली जा सकती है। डीब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का निर्धारण बहुत सरल है, क्योंकि एनएडीपीएच का 1 मोल प्रत्येक 1 मोल ग्लूकोज के लिए बनता है जो डीब्रांचिंग एंजाइम की 1,6-ग्लूकोसिडेस गतिविधि द्वारा जारी किया जाता है। इस प्रकार, प्रतिक्रिया दर को फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन प्रति यूनिट समय से जारी ग्लूकोज की मात्रा के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, उसी प्रकार की गणना के बाद जैसा कि ऊपर ग्लाइकोजन सिंथेज़ और फॉस्फोराइलेज परख के लिए उपयोग किया गया था।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लाइकोजन डिब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि के परख से प्रतिनिधि परिणाम। फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन के नमूनों को 5, 10, 20, या 40 मिनट के लिए डीब्रांचिंग एंजाइम के साथ इलाज किया गया था। एनएडीपी के रूप में उत्पादित 340 एनएम पर अवशोषण में वृद्धि को युग्मित एंजाइम परख में एनएडीपीएच तक कम कर दिया गया था, इनमें से प्रत्येक समय बिंदु पर लिए गए नमूनों में मापा गया था। प्रतिक्रिया ने एक रैखिक चरण दिखाया, जो कम से कम 10 मिनट तक बना रहा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का निर्धारण
चित्रा 4 ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम परख से डेटा दिखाता है। संकेतित समय बिंदुओं में से प्रत्येक पर, नियंत्रण और प्रतिक्रिया नमूनों के अवशोषण को मापा गया था। 660 एनएम पर प्रतिक्रिया नमूने के अवशोषण को संबंधित नियंत्रण नमूने से घटाया गया था, और अवशोषण अंतर को समय के खिलाफ प्लॉट किया गया था। फिर बिंदुओं (पैनल ए) के माध्यम से एक प्रतिगमन रेखा खींची गई थी। प्रतिक्रिया दर को 660 एनएम प्रति यूनिट समय पर अवशोषण में परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। इस परख में होने वाले अवशोषण में अधिकतम परिवर्तन केवल ~ 0.4 अवशोषण इकाइयां हैं, जो ब्रांचिंग एंजाइम (पैनल बी) द्वारा जोड़े गए एमाइलोज की अधिकतम शाखाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं। इसके अलावा, जब प्रतिक्रिया ट्यूबों का अवशोषण नियंत्रण से नीचे ~ 0.2 अवशोषण इकाइयों से अधिक गिर जाता है, तो परख अब रैखिक सीमा के भीतर नहीं होती है और प्रतिक्रिया दर का कोई अनुमान नहीं लगाया जा सकता है (पैनल बी)।

इस प्रक्रिया में सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाने वाला एमाइलोज ठंडा या जमे हुए और फिर पिघलने पर काफी आसानी से समाधान छोड़ना शुरू कर देगा। इसलिए, एमाइलोज सब्सट्रेट समाधान को ताजा बनाना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि उपयोग से पहले कोई अवक्षेप नहीं बना है।

Figure 4
चित्रा 4: ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि के परख से प्रतिनिधि परिणाम। एमाइलोज के नमूनों को ब्रांचिंग एंजाइम के साथ इलाज किया गया था। एलिकोट को दिखाए गए समय बिंदुओं पर हटा दिया गया था और एक अम्लीय आयोडीन अभिकर्मक में जोड़ा गया था। आयोडीन कॉम्प्लेक्स का अवशोषण तब 660 एनएम पर मापा गया था। दिखाए गए डेटा नियंत्रण ऊष्मायन के बीच अवशोषण में अंतर का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसमें ब्रांचिंग एंजाइम और प्रतिक्रियाओं की कमी होती है जिसमें ब्रांचिंग एंजाइम होता है। पैनल A एंजाइम गतिविधि को हटाने के कारण 660 nm पर अवशोषण में कमी दिखाता है, जो ~ 20 मिनट के लिए रैखिक था। पैनल B परख की संकीर्ण गतिशील सीमा को दर्शाता है, जहां उत्पादित अवशोषण में अधिकतम परिवर्तन ~ 0.4 अवशोषण इकाइयाँ हैं और अवशोषण में परिवर्तन ~ 0.2 अवशोषण इकाइयों के होने पर रैखिकता खो जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्लाइकोजन शाखाओं की सीमा का गुणात्मक मूल्यांकन
एमाइलोज, एमाइलोपेक्टिन, फॉस्फोराइलेज लिमिट डेक्सट्रिन, खमीर से पृथक ग्लाइकोजन को आयोडीन / संतृप्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान के साथ जोड़ा गया था और परिणामस्वरूप परिसरों के अवशोषण स्पेक्ट्रा एकत्र किए गए थे (चित्रा 5)। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में दिए गए ग्लाइकोजन, एमाइलोपेक्टिन और एमाइलोज के द्रव्यमान का उपयोग करते हुए, प्राप्त अधिकतम अवशोषण रीडिंग लगभग 0.7 से 0.8 होनी चाहिए, जैसा कि यहां दिखाया गया है (पैनल ए और बी)। एमाइलोज और एमाइलोपेक्टिन के लिए अवशोषण मैक्सिमा क्रमशः 660 एनएम और 500 एनएम और 385 एनएम के आसपास है। फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन को यहां शामिल किया गया था, क्योंकि फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन / आयोडीन कॉम्प्लेक्स के अवशोषण स्पेक्ट्रम को इकट्ठा करना इस डीब्रांचिंग एंजाइम सब्सट्रेट की तैयारी के दौरान प्राप्त फॉस्फोरिलेज पाचन की सीमा की त्वरित जांच प्रदान करता है। अधिकांश स्रोतों से ग्लाइकोजन दो चोटियों का उत्पादन करता है, एक लगभग 400 एनएम पर और दूसरा शिखर 460 एनएम (चित्रा 5 बी) पर। ग्लाइकोजन के अवशोषण स्पेक्ट्रा में बाईं ओर बदलाव बाहरी श्रृंखला की लंबाई में वृद्धि / कमी का संकेत देता है। इसके विपरीत, दाईं ओर बदलाव बाहरी श्रृंखला की लंबाई में कमी / वृद्धि का संकेत देते हैं।

संतृप्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान घना है और अतिरिक्त ग्लाइकोजन नमूने जोड़े जाने पर शीर्ष पर एक परत बनाएंगे। इसलिए, एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक मिश्रण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यदि उपयोग किए गए कार्बोहाइड्रेट के नमूने कैल्शियम क्लोराइड समाधान के साथ मिश्रण करने से पहले पूरी तरह से भंग नहीं होते हैं, तो क्यूवेट में गहरे रंग के धब्बे वाले समुच्चय बनेंगे। ये समुच्चय स्पष्ट रूप से अवशोषण स्पेक्ट्रम के संग्रह को बाधित करेंगे और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि किसी भी माप के साथ आगे बढ़ने से पहले क्यूवेट में समाधान स्पष्ट है।

Figure 5
चित्रा 5: ग्लाइकोजन शाखाओं के गुणात्मक मूल्यांकन से प्रतिनिधि परिणाम। शुद्ध फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन, एमाइलोपेक्टिन, एमाइलोज (पैनल ए) या ग्लाइकोजन (पैनल बी) के नमूने आयोडीन / संतृप्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान के साथ संयुक्त किए गए थे और परिणामस्वरूप परिसरों के अवशोषण स्पेक्ट्रा को 330 एनएम से 800 एनएम तक मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सामान्य तौर पर, प्रस्तुत सभी तरीकों के प्रमुख फायदे उनकी कम लागत, आसानी, गति और विशेष उपकरणों पर निर्भरता की कमी है। प्रमुख नुकसान जो वे सभी साझा करते हैं वह अन्य उपलब्ध तरीकों की तुलना में संवेदनशीलता है। एनएडीएच / एनएडीपीएच के उत्पादन या खपत को शामिल करने वाली प्रक्रियाओं की संवेदनशीलता का अनुमान लगाना आसान है। यह देखते हुए कि एनएडीएच / एनएडीपीएच का विलोपन गुणांक 6.22 एम -1 सेमी -1 है, सरल अंकगणित इंगित करता है कि एकाग्रता में ~ 10-20 μM परिवर्तनों का आसानी से पता लगाया जा सकता है। वर्तमान लेख में वर्णित परख वॉल्यूम के साथ, यह ~ 10-20 एनएमओएल की सीमा में मात्राओं को मापने की क्षमता से मेल खाती है। यकीनन, यह काफी संवेदनशील है। हालांकि, रेडियोलेबल सब्सट्रेट्स की विशिष्ट गतिविधि को समायोजित करना संभव है जैसे कि संवेदनशीलता को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख की सीमा से परे काफी आसानी से बढ़ाया जा सकता है। यद्यपि ब्रांचिंग एंजाइम परख और ग्लाइकोजन ब्रांचिंग का गुणात्मक मूल्यांकन दोनों आयोडीन और 1,4-लिंक्ड ग्लूकोज पॉलिमर के बीच कॉम्प्लेक्स के गठन पर निर्भर करते हैं, प्रत्येक परख से आउटपुट अलग होता है और उनकी संवेदनशीलता भी अलग होती है। वर्णित प्रत्येक परख के लिए विशिष्ट विचार नीचे चर्चा की गई है।

ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि का निर्धारण
यहां वर्णित युग्मित एंजाइम परख ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि की निरंतर परख के लिए अनुमति देता है, जो गतिज मापदंडों के निर्धारण में उपयोगी है। यह आसानी से स्केलेबल भी है और माइक्रोटिटर प्लेटों में उपयोग के लिए एक बहुत ही समान प्रक्रिया का वर्णन किया गया है, जिससे एंजाइम गतिविधि के अत्यधिक समानांतर माप किए जा सकतेहैं। हम नियमित रूप से शुद्ध, पुनः संयोजक ग्लाइकोजन सिंथेस29 के साथ इस परख का उपयोग करते हैं। हालांकि, वर्णित प्रक्रियाओं को मूल रूप से ऊतक होमोजेनेट्स में उपयोग के लिए विकसित किया गया था (उदाहरण के लिए, डैनफोर्थ10 और लेलोइर एट अल.9 देखें)। यहां एक चेतावनी यह है कि उपयोग से पहले ऊतक होमोजेनेट को उचित रूप से पतला किया जाना चाहिए। होमोजेनेट की टर्बिडिटी और होमोजेनेट में प्रतिस्पर्धी एंजाइमों / सब्सट्रेट्स से हस्तक्षेप को कम करने के लिए कमजोर पड़ना आवश्यक है। इसके अलावा, एनएडीएच खपत के लिए जो ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि पर निर्भर नहीं है, खाली प्रतिक्रियाएं जिनमें यूडीपी-ग्लूकोज को छोड़कर सभी प्रतिक्रिया घटक होते हैं, उन्हें शामिल किया जाना चाहिए। ग्लाइकोजन सिंथेज़ गतिविधि तब इस यौगिक की उपस्थिति में प्राप्त यूडीपी-ग्लूकोज की अनुपस्थिति में एनएडीएच अवशोषण में परिवर्तन की दर को घटाकर निर्धारित की जाती है।

ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज गतिविधि का निर्धारण
ग्लाइकोजन सिंथेज़ परख की तरह, फॉस्फोरिलेज गतिविधि के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप को निरंतर तरीके से किया जा सकता है, जबकि अन्य फॉस्फोरिलेज परखको रोक दिया जाता है। यह माइक्रोटिटर प्लेटों या अन्य उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलनीय भीहै। फिर, ऊतक होमोजेनेट्स के साथ इसके उपयोग के लिए टर्बिडिटी / हस्तक्षेप प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए उचित कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज -6-फॉस्फेट एक प्रचुर मात्रा में मेटाबोलाइट है और ऊतक होमोजेनेट में इसकी उपस्थिति के परिणामस्वरूप ग्लूकोज -6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज युग्मन एंजाइम के माध्यम से एनएडीपीएच उत्पादन होगा जो फॉस्फोरिलेज गतिविधि से स्वतंत्र है। ऊतक होमोजेनेट्स के साथ काम करते समय, नियंत्रण प्रतिक्रियाएं जिनमें उचित रूप से पतला ऊतक होमोजेनेट और फॉस्फेट और ग्लाइकोजन को छोड़कर अन्य सभी परख घटक शामिल होने चाहिए। फॉस्फोराइलेज गतिविधि की गणना तब ग्लाइकोजन / फॉस्फेट की अनुपस्थिति में एनएडीपीएच उत्पादन को घटाकर की जाती है जो इन यौगिकों की उपस्थिति में होता है। विभिन्न प्रकार के स्तनधारी ऊतक अर्क के कमजोर पड़ने की उचित डिग्री से संबंधित विशिष्ट सिफारिशें Mezl et al.13 में पाई जा सकती हैं।

ग्लाइकोजन डीब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का निर्धारण
यद्यपि यहां एक रोके गए परख के रूप में वर्णित है, इस प्रक्रिया को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और निरंतर फैशन16 में प्रदर्शन किया जा सकता है। चूंकि परख ग्लूकोज के उत्पादन पर निर्भर करती है, कच्चे ऊतक के अर्क में इसके उपयोग को डीब्रांचिंग एंजाइम के अलावा अन्य एंजाइमों द्वारा फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन से ग्लूकोज की रिहाई पर विचार करना चाहिए, और ऊतक अर्क में मौजूद अंतर्जात ग्लाइकोजन पर ऐसे एंजाइमों की कार्रवाई से ग्लूकोज की पीढ़ी पर विचार करना चाहिए। अंतर्जात ग्लाइकोजन के सवाल को आसानी से एक नियंत्रण प्रतिक्रिया के साथ संबोधित किया जाता है जिसमें कोई फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन नहीं जोड़ा जाता है। अन्य α-ग्लूकोसिडेस गतिविधियों की उपस्थिति का अनुमान समानांतर प्रतिक्रियाओं में लगाया जा सकता है जहां फॉस्फोरिलेज सीमा डेक्सट्रिन के बजाय माल्टोज एक सब्सट्रेट के रूप में मौजूद है।

ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम गतिविधि का निर्धारण
चर्चा की गई विभिन्न मात्रात्मक परखों में से, कलरमेट्रिक ब्रांचिंग एंजाइम परख अब तक सबसे कम संवेदनशील है। दरअसल, यह अनुमान लगाया गया है कि संवेदनशीलता रेडियोकेमिकल विधि के साथ प्राप्त की तुलना में लगभग 50-100 गुना कम है, जहां ब्रांचिंग एंजाइम के अलावा ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज प्रतिक्रिया की उत्तेजना21 मापी जाती है। डीब्रांचिंग एंजाइम परख के समान, ब्रांचिंग एंजाइम परख भी दूषित ग्लूकोसिडेस गतिविधियों की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील है, क्योंकि एमाइलोज का पाचन आयोडीन बंधन को प्रभावित करेगा। दूषित ग्लूकोसिडेस गतिविधियों की उपस्थिति में यहां वर्णित परख के समान परखके उपयोग की अनुमति देने के लिए कुछ वर्कअराउंड प्रस्तावित किए गए हैं। हालांकि, हमारे विचार में यह परख शुद्ध या आंशिक रूप से शुद्ध ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइमों के अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त है, जहां ऐसी हस्तक्षेप गतिविधियां न्यूनतम या अनुपस्थित हैं।

ग्लाइकोजन शाखाओं की सीमा का गुणात्मक मूल्यांकन
ग्लाइकोजन शाखाओं का विस्तृत विश्लेषण श्रमसाध्य है, जिसमें आमतौर पर उत्पन्न उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए एंजाइमेटिक पाचन, रासायनिक संशोधन और विभिन्न प्रकार की पृथक्करण तकनीकों का संयोजन शामिल होताहै। जबकि यहां वर्णित वर्णित वर्णमिति परख स्पष्ट रूप से ग्लाइकोजन की ठीक संरचना पर तुलनीय जानकारी नहीं दे सकती है, यह अधिक या कम शाखाओं का एक सरल और तेज़ माप प्रदान करती है। इसके अलावा, प्राप्त स्पेक्ट्रा में कुछ अतिरिक्त जानकारी होती है। उदाहरण के लिए, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों के तहत चर्चा की गई है, ग्लाइकोजन के नमूने आमतौर पर ~ 400 एनएम और ~ 460 एनएम पर अवशोषण चोटियों के साथ मौजूद होते हैं। ~ 400 एनएम पर शिखर स्पष्ट रूप से ग्लाइकोजन कणों में छोटी बाहरी श्रृंखलाओं का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि यह जंगली प्रकारके खमीर 32 के सापेक्ष ब्रांचिंग एंजाइम की कमी वाले खमीर उत्परिवर्ती से पृथक ग्लाइकोजन में बढ़ाया जाता है।

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Disclosures

इस काम से जुड़े हितों का कोई ज्ञात टकराव नहीं है और इस काम के लिए कोई वित्तीय सहायता नहीं है जो इसके परिणाम को प्रभावित कर सकती थी।

Acknowledgments

लेखक अपनी अंतर्दृष्टि और कई उपयोगी चर्चाओं के लिए कैरोलिन डिटमर और एंड्रयू ब्रिटिंघम को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को आयोवा ओस्टियोपैथिक एजुकेशन एंड रिसर्च फंड (आईओईआर 03-17-05 और 03-20-04) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

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References

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जैव रसायन अंक 174
यूकेरियोटिक ग्लाइकोजन चयापचय के अध्ययन के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधियां
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Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

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