Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

Technieken om de activiteit van belangrijke enzymen van glycogeenmetabolisme te meten, worden gepresenteerd, met behulp van een eenvoudige spectrofotometer die in het zichtbare bereik werkt.

Abstract

Glycogeen wordt gesynthetiseerd als een opslagvorm van glucose door een breed scala aan organismen, variërend van bacteriën tot dieren. Het molecuul bestaat uit lineaire ketens van α1,4-gebonden glucoseresiduen met takken die worden geïntroduceerd door de toevoeging van α1,6-verbindingen. Begrijpen hoe de synthese en afbraak van glycogeen worden gereguleerd en hoe glycogeen zijn karakteristieke vertakte structuur bereikt, vereist de studie van de enzymen van glycogeenopslag. De methoden die het meest worden gebruikt om deze enzymactiviteiten te bestuderen, maken echter meestal gebruik van reagentia of technieken die niet voor alle onderzoekers beschikbaar zijn. Hier bespreken we een reeks procedures die technisch eenvoudig, kosteneffectief en toch in staat zijn om waardevol inzicht te geven in de controle van glycogeenopslag. De technieken vereisen toegang tot een spectrofotometer, die werkt in het bereik van 330 tot 800 nm, en worden beschreven ervan uitgaande dat de gebruikers wegwerpbare, plastic cuvetten zullen gebruiken. De procedures zijn echter gemakkelijk schaalbaar en kunnen worden aangepast voor gebruik in een microplaatlezer, waardoor zeer parallelle analyse mogelijk is.

Introduction

Glycogeen is wijd verspreid in de natuur, waarbij de verbinding wordt aangetroffen in bacteriën, vele protisten, schimmels en dieren. In micro-organismen is glycogeen belangrijk voor de overleving van cellen wanneer voedingsstoffen beperkend zijn en in hogere organismen zoals zoogdieren, de synthese en afbraak van glycogeen dienen om de bloedsuikerspiegelte bufferen 1,2,3. De studie van het glycogeenmetabolisme is daarom van belang voor zulke uiteenlopende gebieden als microbiologie en zoogdierfysiologie. Het begrijpen van glycogeenmetabolisme vereist het bestuderen van de belangrijkste enzymen van glycogeensynthese (glycogeensynthase en het vertakkende enzym) en glycogeenafbraak (glycogeenfosforylase en debranching enzym). De gouden standaard assays van glycogeensynthase, fosforylase, vertakking en debranching enzymactiviteiten maken gebruik van radioactieve isotopen. Glycogeensynthase wordt bijvoorbeeld over het algemeen gemeten in een gestopte radiochemische test door de opname van glucose uit UDP-[14C]glucose (in het geval van dierlijke en schimmelenzymen) of ADP-[14C]glucose (in het geval van bacteriële enzymen) in glycogeen 4,5 te volgen. Evenzo wordt glycogeenfosforylase gemeten in de richting van glycogeensynthese, na de opname van glucose uit [14C] glucose-1-fosfaat in glycogeen6. Het vertakkende enzym wordt getest door het vermogen van dit enzym te meten om de opname van [14C]glucose uit glucose-1-fosfaat in α1,4-gekoppelde ketens te stimuleren door glycogeenfosforylase7, en de debranching enzymactiviteit wordt bepaald door het volgen van het vermogen van het enzym om [14C]glucose op te nemen in glycogeen8 . Hoewel zeer gevoelig, waardoor hun gebruik in ruwe celextracten met lage niveaus van enzymactiviteit mogelijk is, zijn de radioactieve substraten duur en onderworpen aan de wettelijke vereisten die gepaard gaan met het gebruik van radio-isotopen. Deze barrières plaatsen het gebruik van bepaalde testen buiten het bereik van veel werknemers. In de loop van vele jaren is echter een indrukwekkende verscheidenheid aan spectrofotometrische benaderingen voor het meten van deze enzymen beschreven. Over het algemeen zijn deze benaderingen uiteindelijk afhankelijk van het meten van de productie of consumptie van NADH / NADPH, of het genereren van gekleurde complexen tussen glycogeen en jodium. Ze zijn dus eenvoudig en kunnen worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige spectrofotometers die zijn uitgerust met alleen wolfraam- of xenonflitslampen.

Spectrofotometrische testen van glycogeensynthase zijn gebaseerd op het meten van het nucleosidedifosfaat dat vrijkomt uit de suikernucleotidedonor als glucose wordt toegevoegd aan de groeiende glycogeenketen 9,10. De procedure voor het meten van glycogeensynthase-activiteit beschreven in sectie 1 van het protocol, hieronder, is een wijziging van die beschreven door Wayllace et al.11, en het koppelingsschema wordt hieronder weergegeven:

(Glucose) n + UPD-glucose → (Glucose)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpyruvaat → pyruvaat + ATP

Pyruvaat + NADH + H+ → Lactaat + NAD+

Glycogeensynthase voegt glucose uit UDP-glucose toe aan glycogeen. De UDP die in dit proces wordt gegenereerd, wordt omgezet in UTP door nucleosidedifosfaatkinase (NDP-kinase), in een reactie die ADP genereert. De ADP dient dan op zijn beurt als substraat voor pyruvaatkinase, dat de ADP fosforyleert met behulp van fosfoenolpyruvaat als fosfaatdonor. Het resulterende pyruvaat wordt door het enzym lactaatdehydrogenase omgezet in lactaat in een reactie die NADH verbruikt. De test kan daarom op een continue manier worden uitgevoerd, waarbij de afname van de absorptie bij 340 nm wordt gevolgd als NADH wordt geconsumeerd. Het is gemakkelijk aangepast voor gebruik met enzymen die ADP-glucose als glucosedonor nodig hebben. Hier zijn de koppelingsstappen eenvoudiger omdat de ADP die vrijkomt door de werking van glycogeensynthase direct wordt beïnvloed door pyruvaatkinase.

Er zijn verschillende spectrofotometrische testen beschikbaar voor de bepaling van glycogeenfosforylase-activiteit. In de klassieke versie wordt het enzym naar achteren gedreven, in de richting van glycogeensynthese, zoals hieronder weergegeven:

(Glucose) n + Glucose-1-fosfaat → (Glucose)n+1 + Pi

Met getimede tussenpozen worden aliquots van het reactiemengsel verwijderd en wordt de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat gekwantificeerd12,13. In onze handen is deze test van beperkt nut geweest vanwege de aanwezigheid van gemakkelijk meetbaar vrij fosfaat in veel commerciële preparaten van glucose-1-fosfaat, gecombineerd met de hoge concentraties glucose-1-fosfaat die nodig zijn voor fosforylasewerking. In plaats daarvan hebben we routinematig een alternatieve test gebruikt die het glucose-1-fosfaat meet dat vrijkomt als glycogeen wordt afgebroken door fosforylase13. Er wordt gebruik gemaakt van een gekoppeld reactieschema, dat hieronder wordt geïllustreerd.

(Glucose) n + Pi → (Glucose)n-1 + Glucose-1-fosfaat

Glucose-1-fosfaat → Glucose-6-fosfaat

Glucose-6-fosfaat + NADP+ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H+

Het glucose-1-fosfaat wordt omgezet in glucose-6-fosfaat door fosfoglucomutase en het glucose-6-fosfaat wordt vervolgens geoxideerd tot 6-fosfogluconolacton, met de gelijktijdige reductie van NADP + tot NADPH. De procedure die in paragraaf 2 van het protocol hieronder wordt beschreven, is afgeleid van methoden beschreven door Mendicino et al.14 en Schreiber & Bowling15. De test kan gemakkelijk op een continue manier worden uitgevoerd, met de toename van de absorptie bij 340 nm in de loop van de tijd, waardoor de reactiesnelheid kan worden bepaald.

Spectrofotometrische bepaling van de debranching enzymactiviteit is afhankelijk van de meting van de glucose die vrijkomt door de werking van het enzym op fosforylaselimiet dextrine16. Deze verbinding wordt gemaakt door glycogeen uitputtend te behandelen met glycogeenfosforylase. Omdat de werking van glycogeenfosforylase 4 glucoseresiduen weg van een α1,6-takkenpunt stopt, bevat de limietdextrine glycogeen, waarvan de buitenste ketens zijn verkort tot ~ 4 glucoseresiduen. De bereiding van fosforylaselimiet dextrine wordt hier beschreven, met behulp van een procedure die is afgeleid van die ontwikkeld door Taylor et al.17 en Makino & Omichi18.

Debranching is een proces in twee stappen. De 4-α-glucanotransferase-activiteit van het bifunctionele debranching-enzym brengt eerst drie glucoseresiduen over van het aftakkingspunt naar het niet-reducerende uiteinde van een nabijgelegen α1,4-gekoppelde glucoseketen. Het enkele, α1,6-gebonden glucoseresidu dat op het vertakkingspunt achterblijft, wordt vervolgens gehydrolyseerd door de α1,6-glucosidase-activiteit19. De test wordt meestal op een gestopte manier uitgevoerd, waarbij de glucose die na een bepaalde tijd (of reeks van tijden) vrijkomt, wordt gemeten in een gekoppelde enzymtest zoals hieronder weergegeven:

(Glucose) n → (Glucose)n-1 + Glucose

Glucose + ATP → Glucose-6-fosfaat + ADP

Glucose-6-fosfaat + NADP+ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H+

De bepaling van de geproduceerde NADPH geeft een maat voor de glucoseproductie. De procedure beschreven in sectie 3 van het protocol, hieronder, is gebaseerd op een procedure beschreven door Nelson et al.16. Net als de andere methoden die afhankelijk zijn van de consumptie of generatie van NADH / NADPH, is de test vrij gevoelig. De aanwezigheid van amylasen of andere glucosidasen, die ook vrije glucose uit fosforylaselimietdextrine kunnen vrijmaken, zal echter aanzienlijke interferentie veroorzaken (zie Discussie).

De colorimetrische bepaling van vertakkende enzymactiviteit is gebaseerd op het feit dat α1,4-gekoppelde glucoseketens spiraalvormige structuren aannemen die binden aan jodium en gekleurde complexen vormen20. De kleur van het gevormde complex hangt af van de lengte van de α1,4-gekoppelde ketens. Zo vormt amylose, dat bestaat uit lange, grotendeels onvertakte ketens van α1,4-gebonden glucose, een diepblauw complex met jodium. Glycogenen daarentegen, waarvan de buitenste ketens over het algemeen in de orde van grootte van slechts 6 tot 8 glucoseresiduen lang zijn, vormen oranjerode complexen. Als een oplossing van amylose wordt geïncubeerd met vertakkend enzym, resulteert de introductie van takken in het amylose in de generatie van kortere α1,4-gekoppelde glucoseketens. Zo verschuift het absorptiemaximum van de amylose/jodiumcomplexen naar kortere golflengten. De hier besproken procedure is afgeleid van die beschreven door Boyer &Preiss21 en vertakkende enzymactiviteit wordt gekwantificeerd als een vermindering van de absorptie van het amylose / jodiumcomplex bij 660 nm in de loop van de tijd.

Zoals duidelijk zou moeten zijn uit de bovenstaande discussie, betekent het feit dat de kleuren van de complexen gevormd tussen jodium- en α1,4-glucoseketens variëren met de ketenlengte dat de absorptiespectra van glycogeen / jodiumcomplexen moeten variëren met de mate van glycogeenvertakking. Dit is inderdaad het geval, en minder vertakte glycogenen/glycogenen met langere buitenste ketens absorberen licht op een langere golflengte dan glycogenen die meer vertakt zijn /kortere buitenste ketens hebben. De jodiumkleuringsreactie kan daarom worden gebruikt om snelle, kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking22. De oranjebruine kleur vormt zich wanneer glycogeencomplexen met jodium niet bijzonder intens zijn. De kleurontwikkeling kan echter worden verbeterd door de toevoeging van verzadigde calciumchlorideoplossing22. Dit verhoogt de gevoeligheid van de methode ongeveer 10-voudig en maakt een kant-en-klare analyse van microgramhoeveelheden glycogeen mogelijk. De in paragraaf 4 van het protocol beschreven test voor de bepaling van vertakkingen is gebaseerd op een procedure ontwikkeld door Krisman22. Het wordt eenvoudig uitgevoerd door het glycogeenmonster te combineren met jodiumoplossing en calciumchloride in een cuvette en het absorptiespectrum van 330 nm tot 800 nm te verzamelen. Het absorptiemaximum verschuift naar langere golflengten naarmate de mate van vertakking afneemt.

Gezamenlijk bieden de hier beschreven methoden eenvoudige, betrouwbare middelen om de activiteiten van de belangrijkste enzymen van het glycogeenmetabolisme te beoordelen en om kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bepaling van de glycogeensynthase-activiteit

  1. Bereid stamoplossingen van vereiste reagentia zoals aangegeven in tabel 1 (vóór de experimentele dag).
Bestanddeel Routebeschrijving
50 mM Tris pH 8,0 Los 0,61 g Tris-base op in ~ 80 ml water.  Koel af tot 4 °C.   Stel de pH in op 8,0 met HCl en maak het volume tot 100 ml met water.
20 mM HEPES buffer Los 0,477 g HEPES op in ~ 80 ml water.  Stel de pH in op 7,0 met NaOH en vul het volume aan tot 100 ml met water.
132 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8 Los 1,94 g Tris base en 0,239 g KCl op in ~90 ml water.  Stel de pH in op 7,8 met HCl en vul het volume aan tot 100 ml met water.
0,8% w/v oesterglycogeen Weeg 80 mg oesterglycogeen af en voeg toe aan water.  Maak het uiteindelijke volume tot 10 ml met water en verwarm voorzichtig / meng om glycogeen volledig op te lossen.
100 mM UDP-glucose Los 0,31 g UDP-glucose op in water en maak het uiteindelijke volume tot 1 ml.  Bewaren in aliquots, bevroren bij -20 °C.   Stabiel voor enkele maanden.
50 mM ATP Los 0,414 g ATP op in ~ 13 ml water.  Stel de pH in op 7,5 met NaOH en vul het volume aan tot 15 ml met water.  Bewaren in bij -20 °C ingevroren aliquots.   Stabiel voor enkele maanden.
100 mM glucose-6-fosfaat pH 7,8 Los 0,282 g glucose-6-fosfaat op in ~ 7 tot 8 ml water.  Stel de pH in op 7,8 met NaOH.  Maak het volume tot 10 ml met water.  Bewaren in aliquots bij -20 °C.   Stabiel voor ten minste zes maanden.
40 mM fosfoenolpyruvaat Los 4 mg fosfoenolpyruvaat op in 0,5 ml 20 mM HEPES-buffer pH 7,0.  Bewaren bij -20 °C.   Stabiel voor minstens 1 week.
0,5 MnCl2 Los 9,90 g MnCl2 op in een laatste volume van 100 ml water.
NDP-kinase Reconstitueer gelyofiliseerd poeder met voldoende water om 1 U/μl oplossing te geven.  Bereid aliquots, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C.   Stabiel voor minstens 1 jaar.

Tabel 1: Voorraadoplossingen die nodig zijn voor de bepaling van glycogeensynthaseactiviteit.

  1. Bereid op de dag van de test een verse werkoplossing van 4 mM NADH door 4,5 mg NADH op te lossen in 1,5 ml tris-hcl, pH 8,0. Bewaren op ijs, beschermd tegen het licht.
  2. Ontdooi voorraadoplossingen van UDP-glucose, ATP, fosfoenolpyruvaat en NDP-kinase op ijs.
  3. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C.
  4. Stel elke glycogeensynthasetest in een buis van 1,5 ml in door de in tabel 2 vermelde reactiemengselreagentia toe te voegen.
Bestanddeel Volume (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8 250
Water 179
100 mM glucose-6-fosfaat, pH 7,8 58
0,8 % m/v oesterglycogeen 67
50 mM ATP 80
4 mM NADH 80
100 mM UDP-glucose 28
40 mM fosfoenolpyruvaat 20
0,5 MnCl2 8
Eindvolume 770

Tabel 2: Samenstelling reactiemengsel voor bepaling van glycogeensynthase activiteit.

OPMERKING: Om de installatie te vergemakkelijken, kan een hoofdmix worden gemaakt die voldoende van elk van de bovengenoemde reagentia bevat om het aantal geplande testen te voltooien.

  1. Bereid een blancoreactie voor, waarbij de NADH in het bovenstaande mengsel wordt vervangen door water. Breng over naar een wegwerpmethacrylaatcuvet en gebruik dit om de nul op de spectrofotometer op 340 nm in te stellen.
  2. Neem één 770 μL van het aliquot reactiemengsel in een buisje van 1,5 ml. Voeg 2 μL NDP-kinase en 2 μL pyruvaatkinase/lactaatdehydrogenasemengsel toe, meng voorzichtig en incubeer bij 30 °C gedurende 3 minuten om het reactiemengsel voor te verwarmen.
  3. Voeg 30 μL van het glycogeensynthase bevattende monster toe in 20 mM Tris-buffer, pH 7,8; meng en breng het reactiemengsel over in een wegwerpmethacrylaatcuvette.
  4. Plaats het cuvet in de spectrofotometer en noteer de absorptie bij 340 nm met getimede intervallen gedurende 10 tot 20 minuten. Zet de verkregen absorpties uit tegen de tijd.
    OPMERKING: Een reactie waarbij het glycogeensynthasemonster wordt vervangen door 20 mM Tris-buffer moet worden uitgevoerd om te controleren op niet-enzymatische oxidatie van NADH. Afhankelijk van de zuiverheid van het monster kunnen andere controlereacties nodig zijn. Zie Discussie voor meer informatie.
  5. Bepaal de reactiesnelheid (zie Resultaten voor meer informatie).

2. Bepaling van de glycogeenfosforylase-activiteit

  1. Bereid voorraadoplossingen zoals aangegeven in tabel 3 (vóór de experimentele dag).
Bestanddeel Routebeschrijving
125 mM BUIZEN pH 6,8 Los 3,78 g PIJPEN op in water.  Stel de pH in op 6,8 met NaOH en vul het volume aan tot 100 ml met water.
8% w/v oesterglycogeen Weeg 0,8 g oesterglycogeen af en voeg toe aan water.  Maak het uiteindelijke volume tot 10 ml met water en verwarm zachtjes / meng om glycogeen op te lossen.  Bewaren bij -20 °C.
200 mM Na fosfaat pH 6,8 Los 2,63 g Na2HPO 4,7H 2O en 1,41 g NaH2PO4 op. H2O in water.  Breng het volume op 100 ml met water.
1 mM glucose-1,6-bisfosfaat Los 2 mg glucose-1,6-bisfosfaat op in 4 ml water.  Aliquot en bevroren bewaren bij -20 °C.   Stabiel voor ten minste enkele maanden.
10 mM NAP Los 23 mg NADP op in 3 ml water.  Aliquot en bevroren bewaren bij -20 °C.   Stabiel voor ten minste enkele maanden.

Tabel 3: Stamoplossingen die nodig zijn voor de bepaling van glycogeenfosforylaseactiviteit.

  1. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C
  2. Plaats elke glycogeenfosforylasetest in een buis van 1,5 ml door de onderstaande reactiemengselreagentia toe te voegen (tabel 4).
Bestanddeel Volume (μl)
125 mM PIJPEN buffer pH 6,8 160
Water 70
8% w/v oesterglycogeen 100
200 mM Nafosfaat 6,8 400
1 mM glucose-1,6-bisfosfaat 20
10 mM NAP 20
Eindvolume 770

Tabel 4: Samenstelling reactiemengsel voor bepaling van glycogeenfosforylase activiteit.

OPMERKING: Om de installatie te vergemakkelijken, kan een hoofdmix worden gemaakt die voldoende van elk van de bovengenoemde reagentia bevat om het aantal geplande testen te voltooien.

  1. Bereid een blancoreactie voor die de in tabel 4 vermelde componenten bevat, maar voeg een extra 30 μL van 25 mM PIJPEN-buffer toe, pH 6,8 (bereid door 125 mM PIJPEN-buffer 1/5 met water te verdunnen). Breng over naar een wegwerpmethacrylaatcuvet en gebruik om de nul op de spectrofotometer op 340 nm in te stellen.
  2. Neem één aliquot reactiemengsel van 770 μL in een buisje van 1,5 ml. Voeg 1 μL glucose-6-fosfaatdehydrogenase en 1 μL fosfoglucomutase toe, meng voorzichtig en incubeer bij 30 °C gedurende 3 minuten om het reactiemengsel voor te verwarmen.
  3. Voeg 30 μL van het glycogeenfosforylase bevattende monster toe aan een PIJP-buffer van 25 mM, pH 6,8. Meng en breng het reactiemengsel over in een wegwerpmethacrylaatcuvet.
  4. Plaats het cuvet in de spectrofotometer en noteer de absorptie bij 340 nm met getimede intervallen gedurende 10 tot 20 minuten. Zet de verkregen absorpties uit tegen de tijd.
    OPMERKING: Een reactie waarbij glycogeenfosforylase wordt vervangen door een PIJPEN-buffer van 25 mM moet worden opgenomen. Afhankelijk van de zuiverheid van het glycogeenfosforylasemonster kunnen ook andere controles nodig zijn (zie Discussie voor meer informatie).
  5. Bepaal de reactiesnelheid (zie Representatieve resultaten voor meer informatie).

3. Bepaling van de glycogeendebranching enzymactiviteit

  1. Bereid stamoplossingen zoals aangegeven in tabel 5 (voorafgaand aan de experimentele dag).
Bestanddeel Routebeschrijving
100 mM maleaatbuffer Los 1,61 g maleïnezuur op in ~ 80 ml water.  Stel de pH in op 6,6 met NaOH en maak het uiteindelijke volume tot 100 ml met water.
300 mM triethanolaminehydrochloride/ 3 mM MgSO4 pH 7,5 Los 27,85 g triethanolaminehydrochloride en 0,370 g MgSO4 op. 7H2O in ~ 400 ml water.  Stel de pH in op 7,5 met NaOH en vul met water aan tot een eindvolume van 500 ml.
150 mM ATP/12 mM NADP Los 1,24 g ATP op in ~ 10 ml water.  Controleer de pH en voeg NaOH toe om een pH van ~ 7,5 te behouden terwijl de ATP oplost.  Voeg 0,138 g NADP toe.  Stel de pH in op ~ 7,5 met NaOH en vul aan tot een eindvolume van 15 ml met water. Bewaren in aliquots bij – 20 °C. Stabiel voor enkele maanden.
50 mM Na fosfaat buffer pH 6,8 Los 32,81 g Na2HPO 4,7H 2O en 17,61 g NaH2PO4 op. H2O in water.  Breng het volume op een eindvolume van 5 L met water.

Tabel 5: Stamoplossingen die nodig zijn voor de bepaling van glycogeendebranching enzymactiviteit.

  1. Bereid fosforylase limiet dextrine
    1. Los 0,3 g oesterglycogeen op in 10 ml natriumfosfaatbuffer van 50 mM, pH 6,8.
    2. Los voldoende gelyofiliseerd fosforylase A-poeder op om 60 E activiteit op te leveren in 50 mM fosfaatbuffer, pH 6,8.
      OPMERKING: Afhankelijk van de partij fosforylase A die wordt gekocht, zal de benodigde massa variëren, maar ligt over het algemeen tussen 5 en 10 mg poeder.
  2. Voeg 60 E fosforylase A toe aan de glycogeenoplossing en breng over in een dialysezak. Dialyseren bij kamertemperatuur tegen 1 L van 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 6,8 gedurende 8 uur. Stap over op de verse dialysebuffer en zet de incubatie 's nachts voort.
  3. Voeg nog eens 10 U fosforylase A toe en verander in verse dialysebuffer. Na 8 uur opnieuw overschakelen op verse dialysebuffer en de incubatie 's nachts voortzetten.
  4. Breng de inhoud van de dialysezak over in een centrifugebuis en kook gedurende 10 minuten. Koel op ijs en centrifugeer vervolgens op 10.000 x g gedurende 15 minuten.
  5. Breng het supernatant over in een dialysezak en dialyseer gedurende 8 uur tegen drie veranderingen van 2 L gedestilleerd water.
  6. Breng de inhoud van de dialysezak over in een centrifugebuis van 50 ml. Meet het volume en voeg twee volumes ijskoude absolute ethanol toe om de limiet dextrine te bespoedigen. Laat de buis 30 min op ijs staan.
    OPMERKING: Een wit neerslag moet onmiddellijk beginnen te vormen na de toevoeging van ethanol, maar als dit niet het geval is, voeg dan een druppel van 3 M NaCl toe.
  7. Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 15 minuten en gooi het supernatant weg. Spoel de witte pellet van limit dextrine tweemaal met 66% v/v ethanol, met ~30 ml voor elke spoeling.
  8. Breng de limietdextrine over in een mortel en laat volledig aan de lucht drogen. Wanneer de limiet dextrine droog is, maalt u tot een poeder met een stamper en brengt u over naar een geschikt vat voor opslag; droog bij 4 °C.
  9. Bereid voor gebruik als debranching enzyme substrate een 1% w/v oplossing in water.
  10. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C.
  11. Verwarm een verwarmingsblok of waterbad voor tot 95 °C.
  12. Bereid vier buisjes van 1,5 ml met elk 100 μL maleaatbuffer, 80 μL fosforylasegrensdextrine en 10 μL water. Deze buizen zullen worden gebruikt om de debranching enzyme assay uit te voeren. Label twee van de buizen Reactie en de andere twee buizen Controle.
  13. Voeg met getimede intervallen 10 μL van het debranching-enzymmonster toe aan de reactiebuizen en 10 μL buffer die werd gebruikt om het vertakkende enzymmonster aan de controlebuizen te bereiden. Incubeer bij 30 °C.
  14. Trek op gedefinieerde tijdstippen (bijv. incubatie van 5, 10 en 20 minuten) 50 μL uit elke reactie- en controlebuis en plaats deze onmiddellijk in het verwarmingsblok of het waterbad bij 95 °C. Verwarm gedurende 3 min.
  15. Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 2 minuten om neergeslagen eiwit te verwijderen.
    OPMERKING: Op dit punt kan de procedure indien nodig worden gestopt. De verwarmde monsters kunnen bevroren bij -20 °C worden bewaard totdat wordt overgegaan tot de meting van de vrijgekomen glucose (stap 17, hieronder).
  16. Meting van vrijgekomen glucose
    1. Breng 40 μL van het supernatant van de verwarmde monsters over naar wegwerpmethacrylaatcuvetten en voeg 833 μL triethanolaminehydrochloride/magnesiumsulfaatbuffer, 67 μL NADP/ATP-mengsel en 60 μL water toe. Meng door voorzichtig op en neer te pipetteren en pas op dat je geen luchtbellen introduceert.
      OPMERKING: Om de installatie te vergemakkelijken, kan een hoofdmix worden gemaakt die voldoende van elk van de bovengenoemde reagentia bevat om het aantal geplande testen te voltooien.
    2. Bereid een blancoreactie voor door 100 μL maleaatbuffer, 80 μL fosforylaselimietdextrine en 20 μL water te combineren. Meng goed en breng 40 μL over in een wegwerpmethacrylaatcuvet. Voeg 833 μL triethanolaminehydrochloride/magnesiumsulfaat, enz. toe zoals beschreven in stap 3.17.1.
    3. Stel de nul op de spectrofotometer in op 340 nm met behulp van de blancoreactie.
    4. Voeg 0,5 μL glucose-6-fosfaatdehydrogenase toe aan elk cuvet. Meng voorzichtig door langzaam op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en noteer vervolgens de absorptie bij 340 nm.
      OPMERKING: De absorptiewaarden moeten laag zijn, wat betekent dat de monsters weinig verontreinigd zijn met glucose-6-fosfaat.
    5. Voeg 0,5 μL hexokinase toe aan elke cuvette. Meng voorzichtig door langzaam op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en noteer vervolgens de absorptie bij 340 nm.
    6. Ga door met de incubatie bij kamertemperatuur gedurende nog eens 5 minuten. Noteer de absorptie bij 340 nm nogmaals. Als de absorptie is toegenomen ten opzichte van de absorptie na 15 minuten, ga dan door met de incubatie gedurende nog eens 5 minuten en controleer de absorptie opnieuw. Noteer de uiteindelijke absorptie bij 340 nm verkregen.
    7. Trek voor elk monster de absorptie bij 340 nm die is geregistreerd na toevoeging van glucose-6-fosfaatdehydrogenase af van de uiteindelijke absorptie verkregen na toevoeging van hexokinase. Zet de verkregen waarden af tegen de tijdsduur dat het overeenkomstige monster was geïncubeerd met debranching-enzym.

4. Bepaling van de glycogeen vertakkende enzymactiviteit

  1. Bereid voorafgaand aan de experimentele dag jodium / KI-oplossing door eerst 2,6 g KI op te lossen in 10 ml water. Weeg in een zuurkast 0,26 g jodium af en voeg toe aan de KI-oplossing.
    LET OP: Jodium is schadelijk bij contact met de huid of bij inademing. Meng om het jodium op te lossen en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen het licht. Bereid ook 125 mM PIJPEN buffer, pH 6,8 (zie tabel 3).
  2. Maak bij het begin van experimenten een werkvoorraad van aangezuurd jodiumreagens.
    1. Neem 45,7 ml water in een buis van 50 ml en voeg 150 μL jodium/KI-oplossing toe, gevolgd door 150 μL 1 M HCl.
    2. Meng goed en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen het licht. De oplossing is stabiel gedurende ten minste 3 dagen onder deze omstandigheden.
  3. Maak op de dag van het experiment een verse 10 mg / ml oplossing van amylose.
    1. Weeg 50 mg amylose af en breng over in een buis van 15 ml.
    2. Voeg 200 μL absolute ethanol toe en schud voorzichtig.
    3. Voeg 500 μL 2 M KOH toe en schud voorzichtig.
      LET OP: KOH veroorzaakt ernstige brandwonden en oogbeschadiging. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    4. Voeg 0,5 ml water toe terwijl je zachtjes schudt. Als het amylose niet volledig oplost, voeg dan nog eens 0,5 ml water toe.
    5. Stel de pH in op ~6,5 tot 7,0 met 1 M HCl.
      LET OP: HCl kan irritatie van ogen, huid en luchtwegen veroorzaken. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    6. Voeg water toe om een eindvolume van 5 ml te bereiken.
    7. Steriliseren door passage door een 0,2 μm spuiteindfilter en bewaren bij kamertemperatuur. Niet koelen of invriezen.
  4. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C.
  5. Bereid twaalf buizen van 1,5 ml, elk met 1 ml aangezuurd jodiumreagens. Zet apart op de bank. Deze zullen worden gebruikt om de vertakkende enzymreactie te stoppen.
  6. Bereid vier buizen van 1,5 ml met elk 150 μL amylose, 150 μL PIPES-buffer en 45 μL water. Deze buizen zullen worden gebruikt om de vertakkende enzymtest uit te voeren. Label twee van de buizen Reactie en de andere twee buizen Controle.
  7. Voeg met getimede intervallen 5 μL vertakkend enzymmonster toe aan de reactiebuizen en 5 μL buffer die werd gebruikt om het vertakkende enzymmonster aan de controlebuizen te bereiden. Incubeer bij 30 °C.
  8. Trek op gedefinieerde tijdstippen (bijv. 5, 10 en 15 minuten incubatie) 10 μL uit elke reactie- en controlebuis en voeg toe aan de buizen van 1,5 ml die 1 ml verzuurd jodiumreagens bevatten. Voeg nog eens 140 μL water toe en meng goed. Overzet op wegwerpcuvetten.
    OPMERKING: De monsters moeten blauw van kleur zijn en de oplossing moet vrij zijn van neerslag. De gevormde kleur is stabiel gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur.
  9. Bereid een monster dat 1 ml verzuurd jodiumreagens en 150 μL water bevat. Meng goed en breng over op een cuvette. Gebruik deze cuvette om de nul op de spectrofotometer in te stellen op 660 nm.
  10. Lees de absorptie van elk van de twaalf monsters bij 660 nm. Bepaal de snelheid van de vertakkende enzymreactie door de absorptie verkregen in aanwezigheid van vertakkend enzym (Reactie) af te trekken van de absorptie wanneer er op elk tijdstip geen vertakkend enzym aanwezig is (Controle). Zie Representatieve resultaten voor meer informatie.

5. Kwalitatieve beoordeling van glycogeenvertakking

  1. Bereid verzadigde calciumchlorideoplossing door 74,5 g watervrij calciumchloride toe te voegen aan ~ 40 ml water en roeren. Voeg nog wat water toe en blijf roeren. Maak het volume tot 100 ml met water en blijf roeren tot de CaCl2 volledig is opgelost.
  2. Bereid een werkvoorraad jodium/CaCl2 kleurreagens door 50 μL KI/jodium stockoplossing (zie stap 4.1 hierboven) te mengen met 13 ml verzadigde CaCl2-oplossing in een buis van 15 ml. Meng goed en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen het licht. De oplossing is onder deze omstandigheden minstens 1 week stabiel.
  3. Bepaling van de vertakking
    1. Combineer in een buis van 1,5 ml 650 μL jodium / CaCl2 kleurreagens met 100 μL water en meng grondig. Breng de oplossing over in een wegwerpmethacrylaatcuvet.
      OPMERKING: De oplossing in de cuvette moet helder en lichtgeel van kleur zijn.
    2. Plaats in de spectrofotometer en verzamel, draaiend in een golflengtescanmodus, een achtergrondspectrum van 330 nm tot 800 nm.
    3. Combineer in een buis van 1,5 ml 650 μL werkend jodium / CaCl2 kleurreagens met 50 μg oesterglycogeen. Breng het uiteindelijke volume met water op 750 μL en meng grondig. Breng de oplossing over in een wegwerpmethacrylaatcuvet.
      OPMERKING: De oplossing in de cuvette moet helder zijn en een diep oranje / bruine kleur.
    4. Plaats in de spectrofotometer en verzamel een absorptiespectrum van 330 nm tot 800 nm.
    5. Herhaal stap 4.4.3 tot en met 4.4.4 met 50 μg amylopectine en 30 μg amylose.
      OPMERKING: Het amylopectinemonster moet geel/groen zijn en het amylosemonster moet groen/blauw zijn. Beide monsters moeten duidelijk zijn. De gevormde gekleurde complexen zijn stabiel, zonder verandering in het absorptiespectrum, gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Om een indicatie te krijgen van de vertakte structuur van een niet-gekarakteriseerd glycogeenmonster, combineert u 25 μg tot 50 μg glycogeen met 650 μL werkend jodium / CaCl2 kleurreagens. Ga verder zoals hierboven, breng het volume op 750 μL met water, meng grondig en breng over op een methacrylaatcuvet.
      OPMERKING: Het glycogeenmonster moet een gele / oranje tot oranje / bruine kleur opleveren, afhankelijk van de mate van vertakking (lengte van de buitenste ketens) van het aanwezige glycogeen. Nogmaals, het monster moet duidelijk zijn. Zie Representatieve resultaten voor meer informatie.
    7. Verzamel het absorptiespectrum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bepaling van glycogeensynthase-activiteit
Figuur 1 toont representatieve resultaten van glycogeensynthase-assays met gezuiverde enzymen. In paneel A was er, na een lichte vertraging, een lineaire afname van de absorptie bij 340 nm in de tijd gedurende een periode van ongeveer 12 minuten. De snelheid van verandering in absorptie in figuur 1A was ~0,12 absorptie-eenheden/min. Een snelheid van verandering in absorptie tussen ~ 0,010 en ~ 0,20 absorptie-eenheden / min is optimaal en de hoeveelheid toegevoegd glycogeensynthase moet worden aangepast aan de opbrengstsnelheden binnen dit bereik. In paneel B wordt het resultaat van het toevoegen van te veel glycogeensynthase aan de test getoond. Hier was de reactie binnen de eerste 2 min compleet. De controlereactie, die in deze gevallen geen glycogeensynthase bevatte, vertoonde geen meetbare afname van de absorptie in de loop van de tijd. Zoals uiteengezet in de discussie, is het gebruik van weefselhomogenaten in deze test perfect haalbaar, hoewel aanvullende controlereacties vereist zijn.

Het hier beschreven protocol gebruikt oesterglycogeen als substraat, dat goed werkt met glycogeensynthases van veel verschillende soorten. Er moet echter worden opgemerkt dat glycogeensynthasen een vrij variabele activiteit kunnen vertonen, afhankelijk van het type glycogeen dat wordt gebruikt. Daarom is het raadzaam om verschillende vormen van glycogeen te onderzoeken voordat u met een gedetailleerde studie begint.

Het gegeven protocol omvat glucose-6-foposfaat in het reactiemengsel, omdat veel glycogeensynthasen allosterisch worden geactiveerd door deze verbinding 9,23,24,25,26. Het uitvoeren van testen in de aan- en afwezigheid van glucose-6-fosfaat (dat het reactievolume met water vormt), maakt de berekening mogelijk van de -/+ glucose-6-fosfaatactiviteitsverhouding, wat een nuttige indicatie is van de fosforyleringstoestand van zoogdier- en schimmelglycogeensynthasen 1,27.

De bepaling van glycogeensynthase-activiteit uit de verandering in absorptie is vrij eenvoudig. De extinctiecoëfficiënt van NADH wordt genomen als 6220 M-1 cm-1, waardoor de snelheid van verandering in de NADH-concentratie aan de hand van de absorptiesnelheid als volgt kan worden berekend:

Een veranderingssnelheid in absorptie van 0,12 eenheden/min komt overeen met 0,12/6220 = 1,93 x 10-5 mol/l/min verandering in de NADH-concentratie . Het volume in de cuvette was 0,8 ml, wat betekent dat de verandering in hoeveelheid NADH was: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 mol / min. Het volume van het toegevoegde enzym was 60 μL, 3,46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5,76 x 10-7 mol NADH verbruikt / min / ml enzym.

Aangezien er een één-op-één relatie is tussen de geconsumeerde NADH en de glucose die in glycogeen is opgenomen, kan de reactiesnelheid worden uitgedrukt als 5,76 x 10-7 mol glucose opgenomen / min / ml.

Wanneer het eiwitgehalte van het enzymmonster bekend is, kan de specifieke enzymactiviteit worden uitgedrukt als μmol glucose opnemen/min/mg eiwit of nmol glucose opgenomen/min/mg eiwit, naargelang het geval.

Zoals vermeld in de inleiding, is het protocol eenvoudig aan te passen om de activiteit van glycogeensynthasen te meten die ADP-glucose als glucosedonor gebruiken. Dit wordt bereikt door de eenvoudige vervanging van UDP-glucose door ADP-glucose in het reactiemengsel. Bovendien worden zowel NDP-kinase als ATP weggelaten uit het reactiemengsel, omdat de ADP die vrijkomt tijdens glycogeensynthasewerking een direct substraat is voor pyruvaatkinase.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve resultaten van testen van glycogeensynthase-activiteit. De spectrofotometer was ingesteld om één meting per minuut te doen voor een totale tijd van 20 minuten. Paneel A toont de verwachte korte vertragingsfase gevolgd door een lineaire afname van de absorptie met de tijd (experimenteel). Er was geen afname van de absorptie die werd opgemerkt in de controlereactie. De reactiesnelheid wordt berekend op basis van de helling van de absorptieverandering in de lineaire fase (van 5 tot 16 min). Paneel B toont het resultaat van het toevoegen van te veel enzym. Hier is de NADH binnen 2 min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Bepaling van glycogeenfosforylase-activiteit
Figuur 2 toont representatieve gegevens van een glycogeenfosforylasetest met gezuiverd enzym. Met het hier gebruikte preparaat was de test gedurende ongeveer 3 minuten lineair. De inzet toont een regressielijn die door de punten is getrokken van tijd 0 tot 2,5 min. De helling van deze lijn geeft aan dat de snelheid van absorptieverandering 0,022 absorptie-eenheden /min is. Een absorptiesnelheid van ongeveer 0,01 tot 0,04 is optimaal, omdat de test vrij snel van de lineariteit zal afwijken als er te veel enzym aanwezig is. De snelheid van NADPH-vorming wordt berekend op basis van de extinctiecoëfficiënt die, net als die van NADH, 6220 M-1 cm-1 is. Voor elke 1 mol NADPH die werd gevormd, was één mol glucose-1-fosfaat geproduceerd door de werking van glycogeenfosforylase. Enzymactiviteit kan daarom worden uitgedrukt als de hoeveelheid glucose-1-fosfaat die vrijkomt uit glycogeen per tijdseenheid, volgens een berekening die vergelijkbaar is met de hierboven beschreven berekening.

De reactieomstandigheden zijn gemakkelijk aan te passen voor die fosforylasen die gevoelig zijn voor allosterische modulatie. De benodigde effectoren worden eenvoudigweg opgenomen in de reactiemastermix, waarbij een deel van het water wordt vervangen. Een belangrijk voorbehoud is dat moet worden aangetoond dat de effector zelf de activiteit van de koppelingsenzymen, fosfoglucomutase en glucose-6-fosfaatdehydrogenase niet beïnvloedt.

Ten slotte kan, net als bij glycogeensynthase zoals hierboven beschreven, het type glycogeen dat als substraat wordt gebruikt, de snelheid van de reactie beïnvloeden. Hoewel oesterglycogeen goed werkt met fosforylasen van veel soorten, is het misschien niet altijd de optimale keuze.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve resultaten van testen van glycogeenfosforylase-activiteit. De spectrofotometer was ingesteld om één meting per 30 s te doen voor een totale tijd van 10 minuten. Er was een gestage toename van de absorptie geregistreerd in de aanwezigheid van glycogeenfosforylase (experimenteel), terwijl de reactie zonder toegevoegd fosforylase bij baseline bleef (Controle). De inzet toont een vergroting van de initiële reactieperiode, wat de lineariteit van de productvorming ten opzichte van de tijd aantoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bepaling van glycogeen debranching enzymactiviteit
De gegevens in figuur 3 zijn representatief voor een glycogeendebranching enzyme assay met behulp van gezuiverd debranching enzym. Op elk tijdstip werd de verandering in absorptie die optrad bij afwezigheid van toegevoegd vertakkend enzym (Controle) afgetrokken van de verandering in absorptie die optrad in de aanwezigheid van vertakkend enzym (Reactie). De resulterende absorptiewaarden werden vervolgens uitgezet. Zoals hierboven beschreven, wordt een snelheid van verandering van NADPH-concentratie berekend op basis van de initiële helling van de curve door regressieanalyse. In dit voorbeeld was de toename van NADPH per tijdseenheid lineair gedurende 10 minuten, met een helling van 0,0079 absorptie-eenheden/min. Hoewel deze gegevens perfect bruikbaar zijn, zou de toevoeging van iets minder enzym een ondiepere helling hebben gegeven en een langere lineaire fase mogelijk hebben gemaakt. Als alternatief kunnen aanvullende metingen worden uitgevoerd door aliquots te verwijderen voor meting bij 2 min en 7 minuten incubatie. Bepaling van de debranching enzymactiviteit is zeer eenvoudig, omdat 1 mol NADPH wordt gevormd voor elke 1 mol glucose die vrijkomt door de α1,6-glucosidase-activiteit van het debranching-enzym. De reactiesnelheid kan dus worden uitgedrukt als hoeveelheid glucose die vrijkomt uit fosforylaselimiet dextrine per tijdseenheid, volgens hetzelfde type berekening als werd gebruikt voor de glycogeensynthase- en fosforylasentests hierboven.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve resultaten van testen van glycogeen debranching enzymactiviteit. Monsters van fosforylaselimiet dextrine werden behandeld met debranching enzym gedurende 5, 10, 20 of 40 minuten. De toename van de absorptie bij 340 nm, geproduceerd als NADP werd gereduceerd tot NADPH in een gekoppelde enzymtest, werd gemeten in monsters die op elk van deze tijdstippen werden genomen. De reactie vertoonde een lineaire fase, die minstens 10 min aanhield. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bepaling van glycogeen vertakkende enzymactiviteit
Figuur 4 toont gegevens van glycogeen vertakkende enzymtesten. Op elk van de aangegeven tijdstippen werd de absorptie van de controle- en reactiemonsters gemeten. De absorptie van het reactiemonster bij 660 nm werd afgetrokken van die van het overeenkomstige controlemonster en het absorptieverschil werd uitgezet tegen de tijd. Vervolgens werd een regressielijn door de punten (paneel A) getrokken. De reactiesnelheid kan eenvoudig worden uitgedrukt als de verandering in absorptie bij 660 nm per tijdseenheid. De maximale verandering in absorptie die in deze test kan optreden, is slechts ~ 0,4 absorptie-eenheden, die de maximale vertakking van het toegevoegde amylose door het vertakkende enzym (paneel B) vertegenwoordigen. Bovendien, wanneer de absorptie van de reactiebuizen meer dan ~0,2 absorptie-eenheden onder die van de controle daalt, bevindt de test zich niet langer binnen het lineaire bereik en kan er geen schatting van de reactiesnelheid worden gemaakt (paneel B).

Het amylose dat als substraat in deze procedure wordt gebruikt, zal de oplossing vrij gemakkelijk verlaten als het wordt gekoeld of bevroren en vervolgens wordt ontdooid. Daarom is het belangrijk om de amylose substraatoplossing vers te maken en ervoor te zorgen dat er zich voorafgaand aan gebruik geen neerslag heeft gevormd.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve resultaten van testen van glycogeen vertakkende enzymactiviteit. Monsters van amylose werden behandeld met vertakkend enzym. Aliquots werden verwijderd op de aangegeven tijdstippen en toegevoegd aan een aangezuurd jodiumreagens. De absorptie van het gevormde amylose/jodiumcomplex werd vervolgens gemeten bij 660 nm. De getoonde gegevens vertegenwoordigen het verschil in absorptie tussen controle-incubaties zonder vertakkend enzym en reacties die vertakkend enzym bevatten. Paneel A toont een afname van de absorptie bij 660 nm als gevolg van debranching enzymactiviteit, die lineair was gedurende ~ 20 minuten. Paneel B illustreert het smalle dynamische bereik van de test, waarbij de maximale verandering in absorptie die kan worden geproduceerd ~ 0,4 absorptie-eenheden is en lineariteit verloren gaat wanneer de verandering in absorptie ~ 0,2 absorptie-eenheden is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kwalitatieve beoordeling van de mate van glycogeenvertakking
Amylose, amylopectine, fosforylaselimiet dextrine, glycogeen geïsoleerd uit gist werden gecombineerd met jodium/verzadigde calciumchlorideoplossing en de absorptiespectra van de resulterende complexen werden verzameld (figuur 5). Met behulp van de massa's glycogeen, amylopectine en amylose in het hierboven beschreven protocol, moet de maximale absorptiewaarde die wordt verkregen ongeveer 0,7 tot 0,8 zijn, zoals hier weergegeven (panelen A en B). De absorptiemaxima voor amylose en amylopectine liggen respectievelijk rond 660 nm en 500 nm en 385 nm. Fosforylaselimiet dextrine werd hier opgenomen, omdat het verzamelen van het absorptiespectrum van fosforylaselimiet dextrine / jodiumcomplexen een snelle controle biedt van de mate van fosforylasevertering die wordt bereikt tijdens de bereiding van dit debranching enzymsubstraat. Glycogeen uit de meeste bronnen produceert twee pieken, één bij ongeveer 400 nm en een tweede piek bij 460 nm (figuur 5B). Linkse verschuivingen in de absorptiespectra van glycogeen wijzen op een verhoogde vertakking / verminderde buitenste ketenlengte. Omgekeerd duiden rechtse verschuivingen op verminderde vertakking/verhoogde buitenste ketenlengte.

De verzadigde calciumchlorideoplossing is dicht en de toegevoegde glycogeenmonsters vormen een laag over de bovenkant wanneer ze worden toegevoegd. Daarom is zorgvuldig mengen nodig om een homogene oplossing te verkrijgen. Bovendien, als de gebruikte koolhydraatmonsters niet volledig zijn opgelost voordat ze met de calciumchlorideoplossing worden gemengd, zullen zich donkere kleuringsaggregaten in het cuvette vormen. Deze aggregaten zullen uiteraard de verzameling van een absorptiespectrum belemmeren en het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de oplossing in de cuvette duidelijk is voordat u doorgaat met metingen.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve resultaten van de kwalitatieve beoordeling van glycogeenvertakkingen. Monsters van gezuiverd fosforylaselimiet dextrine, amylopectine, amylose (panel A) of glycogeen (paneel B) werden gecombineerd met jodium / verzadigde calciumchlorideoplossing en de absorptiespectra van de resulterende complexen werden gemeten van 330 nm tot 800 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Over het algemeen zijn de belangrijkste voordelen van alle gepresenteerde methoden hun lage kosten, gemak, snelheid en gebrek aan afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur. Het grote nadeel dat ze allemaal delen is gevoeligheid in vergelijking met andere beschikbare methoden. De gevoeligheid van de procedures die betrekking hebben op de productie of consumptie van NADH/NADPH zijn gemakkelijk in te schatten. Aangezien de extinctiecoëfficiënt van NADH/NADPH 6,22 M-1 cm-1 is, geeft een eenvoudige rekensom aan dat ~10-20 μM veranderingen in concentratie gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd. Met de testvolumes die in het huidige artikel worden beschreven, komt dit overeen met de mogelijkheid om hoeveelheden te meten in het bereik van ~ 10-20 nmol. Dit ligt misschien redelijk gevoelig. Het is echter mogelijk om de specifieke activiteit van radioactief gelabelde substraten zodanig aan te passen dat de gevoeligheid vrij gemakkelijk kan worden verhoogd tot boven de limiet van de spectrofotometrische testen. Hoewel de vertakkende enzymtest en de kwalitatieve beoordeling van glycogeenvertakking beide afhankelijk zijn van de vorming van complexen tussen jodium en α1,4-gebonden glucosepolymeren, is de output van elke test anders en zijn hun gevoeligheden ook verschillend. Specifieke overwegingen voor elk van de beschreven testen worden hieronder besproken.

Bepaling van glycogeensynthase-activiteit
De hier beschreven gekoppelde enzymtest maakt een continue test van glycogeensynthase-activiteit mogelijk, wat nuttig is bij het bepalen van kinetische parameters. Het is ook gemakkelijk schaalbaar en een zeer vergelijkbare procedure is beschreven voor gebruik in microtiterplaten, waardoor zeer parallelle metingen van enzymactiviteit kunnen worden uitgevoerd28. We gebruiken deze test routinematig met gezuiverde, recombinante glycogeensynthasen29. De beschreven procedures zijn echter oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik in weefselhomogenaten (zie voor voorbeelden Danforth10 en Leloir et al.9). Een kanttekening hierbij is dat het weefselhomogenaat vóór gebruik op de juiste manier moet worden verdund. De verdunning is nodig om de troebelheid van het homogenaat en interferentie van concurrerende enzymen/substraten in het homogenaat te verminderen. Bovendien, om rekening te houden met NADH-consumptie die niet afhankelijk is van glycogeensynthase-activiteit, moeten blanco reacties worden opgenomen die alle reactiecomponenten behalve UDP-glucose bevatten. De glycogeensynthase-activiteit wordt vervolgens bepaald door de snelheid van verandering in NADH-absorptie in afwezigheid van UDP-glucose af te trekken van die verkregen in de aanwezigheid van deze verbinding.

Bepaling van glycogeenfosforylase-activiteit
Net als de glycogeensynthasetest kan de spectrofotometrische meting van fosforylaseactiviteit op een continue manier worden uitgevoerd, terwijl andere fosforylasentests worden gestopt13. Het is ook gemakkelijk aan te passen voor gebruik in microtiterplaten of andere toepassingen met hoge doorvoer15. Nogmaals, het gebruik ervan met weefselhomogenaten vereist een passende verdunning om troebelheid / storende reacties te verminderen. Glucose-6-fosfaat is bijvoorbeeld een vrij overvloedige metaboliet en de aanwezigheid ervan in een weefselhomogenaat zal resulteren in NADPH-productie via het glucose-6-fosfaatdehydrogenasekoppelingsenzym onafhankelijk van fosforylase-activiteit. Bij het werken met weefselhomogenaten moeten controlereacties worden opgenomen die op de juiste manier verdund weefselhomogenaat en alle andere testcomponenten behalve fosfaat en glycogeen bevatten. Fosforylase-activiteit wordt vervolgens berekend door de NADPH-productie in afwezigheid van glycogeen / fosfaat af te trekken van die welke optreedt in de aanwezigheid van deze verbindingen. Specifieke aanbevelingen met betrekking tot de juiste mate van verdunning van verschillende soorten weefselextract van zoogdieren zijn te vinden in Mezl et al.13.

Bepaling van glycogeen debranching enzymactiviteit
Hoewel hier beschreven als een gestopte test, kan deze procedure gemakkelijk worden aangepast en op een continue manier worden uitgevoerd16. Aangezien de test afhankelijk is van de productie van glucose, moet het gebruik ervan in ruwe weefselextracten rekening houden met het vrijkomen van glucose uit fosforylaselimietdextrine door andere enzymen dan debranching enzyme, en de generatie van glucose door de werking van dergelijke enzymen op endogene glycogeen aanwezig in het weefselextract. De kwestie van endogene glycogeen kan gemakkelijk worden aangepakt met een controlereactie waaraan geen fosforylaselimiet dextrine wordt toegevoegd. De aanwezigheid van andere α-glucosidase-activiteiten kan worden geschat in parallelle reacties waarbij maltose, in plaats van fosforylaselimiet dextrine, aanwezig is als substraat.

Bepaling van glycogeen vertakkende enzymactiviteit
Van de verschillende kwantitatieve testen die worden besproken, is de colorimetrische vertakkende enzymtest verreweg het minst gevoelig. Er is inderdaad geschat dat de gevoeligheid ongeveer 50-100 keer minder is dan die bereikt met de radiochemische methode, waarbij stimulatie van de glycogeenfosforylasereactie door toevoeging van vertakkend enzym wordt gemeten21. Net als de debranching enzyme assay, is de vertakkende enzymtest ook gevoelig voor de aanwezigheid van contaminerende glucosidase-activiteiten, omdat de vertering van het amylose de jodiumbinding zal beïnvloeden. Er zijn enkele tijdelijke oplossingen voorgesteld om het gebruik van assays mogelijk te maken die vergelijkbaar zijn met de hier beschreven in aanwezigheid van contaminerende glucosidase-activiteiten30. Naar onze mening is deze test echter het meest geschikt voor de studie van gezuiverde of gedeeltelijk gezuiverde glycogeenvertakkende enzymen, waar dergelijke storende activiteiten minimaal of afwezig zijn.

Kwalitatieve beoordeling van de mate van glycogeenvertakking
De gedetailleerde analyse van glycogeenvertakkingen is nogal arbeidsintensief, meestal met een combinatie van enzymatische spijsvertering, chemische modificatie en een verscheidenheid aan scheidingstechnieken om de gegenereerde producten te analyseren31. Hoewel de hier beschreven colorimetrische test duidelijk geen vergelijkbare informatie kan opleveren over de fijne structuur van glycogeen, biedt het wel een eenvoudige en snelle meting van min of meer vertakking. Bovendien bevatten de verkregen spectra wel wat aanvullende informatie. Bijvoorbeeld, zoals besproken onder Representatieve resultaten, zijn monsters van glycogeen meestal aanwezig met absorptiepieken bij ~ 400 nm en ~ 460 nm. De piek bij ~ 400 nm vertegenwoordigt blijkbaar korte buitenste ketens in glycogeendeeltjes, omdat het wordt versterkt in glycogeen geïsoleerd uit gistmutanten zonder vertakkend enzym ten opzichte van wild type gist32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen belangenconflicten bekend die verband houden met dit werk en er is geen financiële steun voor dit werk geweest die de uitkomst ervan had kunnen beïnvloeden.

Acknowledgments

De auteur wil Karoline Dittmer en Andrew Brittingham bedanken voor hun inzichten en vele nuttige discussies. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van het Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 en 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Tags

Biochemie Nummer 174
Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter