Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Спектрофотометрические методы исследования метаболизма эукариотического гликогена

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

Представлены методики измерения активности ключевых ферментов метаболизма гликогена с использованием простого спектрофотометра, работающего в видимом диапазоне.

Abstract

Гликоген синтезируется в качестве формы хранения глюкозы широким спектром организмов, начиная от бактерий и заканчивая животными. Молекула содержит линейные цепи α1,4-связанных остатков глюкозы с ветвями, вводимыми путем добавления α1,6-связей. Понимание того, как регулируется синтез и деградация гликогена и как гликоген достигает своей характерной разветвленной структуры, требует изучения ферментов хранения гликогена. Однако методы, наиболее часто используемые для изучения этих ферментных активностей, обычно используют реагенты или методы, которые доступны не всем исследователям. Здесь мы обсуждаем ряд процедур, которые технически просты, экономически эффективны и все же способны обеспечить ценную информацию о контроле хранения гликогена. Методы требуют доступа к спектрофотометру, работающему в диапазоне от 330 до 800 нм, и описаны при условии, что пользователи будут использовать одноразовые пластиковые кюветы. Тем не менее, процедуры легко масштабируются и могут быть изменены для использования в считывателе микропластин, что позволяет проводить высокопараллельный анализ.

Introduction

Гликоген широко распространен в природе, причем соединение содержится в бактериях, многих протистах, грибах и животных. В микроорганизмах гликоген важен для выживания клеток, когда питательные вещества ограничиваются, а у высших организмов, таких как млекопитающие, синтез и деградация гликогена служат для буферизации уровня глюкозы в крови 1,2,3. Поэтому изучение метаболизма гликогена имеет важное значение для таких разнообразных областей, как микробиология и физиология млекопитающих. Понимание метаболизма гликогена требует изучения ключевых ферментов синтеза гликогена (гликогенсинтаза и фермент ветвления) и деградации гликогена (фосфорилаза гликогена и фермент деветривания). Анализы золотого стандарта гликогенсинтазы, фосфорилазы, ветвления и деветвирующего фермента используют радиоактивные изотопы. Например, гликогенсинтазу обычно измеряют в остановленном радиохимическом анализе путем включения глюкозы из UDP-[14C]глюкозы (в случае животных и грибковых ферментов) или ADP-[14C]глюкозы (в случае бактериальных ферментов) в гликоген 4,5. Аналогичным образом, гликогенфосфорилазу измеряют в направлении синтеза гликогена после включения глюкозы из [14С]глюкозо-1-фосфата в гликоген6. Ветвящийся фермент анализируют путем измерения способности этого фермента стимулировать включение [14С]глюкозы из глюкозо-1-фосфата в α1,4-связанные цепи гликогенфосфорилазой7, а активность фермента деветривания определяют путем следования способности фермента включать [14С]глюкозу в гликоген8 . Будучи очень чувствительными, что позволяет использовать их в сырых клеточных экстрактах с низким уровнем активности ферментов, радиоактивные субстраты являются дорогостоящими и подчиняются нормативным требованиям, связанным с использованием радиоизотопов. Эти барьеры делают использование определенных анализов недоступным для многих работников. Однако в течение многих лет было описано впечатляющее разнообразие спектрофотометрических подходов к измерению этих ферментов. В целом, эти подходы в конечном итоге основаны на измерении производства или потребления NADH / NADPH или генерации цветных комплексов между гликогеном и йодом. Таким образом, они просты и могут быть выполнены с помощью простых спектрофотометров, оснащенных только вольфрамовыми или ксеноновыми лампами-вспышками.

Спектрофотометрические анализы гликогенсинтазы основаны на измерении нуклеозиндифосфата, высвобождаемого донором нуклеотида сахара, когда глюкоза добавляется к растущей гликогеннойцепи 9,10. Процедура измерения активности гликогенсинтазы, описанная в разделе 1 протокола ниже, является модификацией процедуры, описанной в Wayllace et al.11, и схема связи показана ниже:

(Глюкоза) n + UPD-глюкоза → (глюкоза)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

АДФ + фосфоенолпируват → пируват + АТФ

Пируват + NADH + H+ → лактат + NAD+

Гликогенсинтаза добавляет глюкозу из UDP-глюкозы на гликоген. UDP, генерируемый в этом процессе, превращается в UTP нуклеозиндифосфаткиназой (NDP-киназой) в реакции, которая генерирует ADP. АДФ, в свою очередь, затем служит субстратом для пируваткиназы, которая фосфорилирует АДФ с использованием фосфоэнолпирувата в качестве донора фосфата. Полученный пируват превращается в лактат ферментом лактатдегидрогеназой в реакции, которая потребляет NADH. Таким образом, анализ может быть выполнен непрерывным образом, контролируя снижение поглощения при 340 нм по мере потребления NADH. Он легко адаптирован для использования с ферментами, которые требуют АДФ-глюкозы в качестве донора глюкозы. Здесь этапы связи проще, поскольку АДФ, высвобождаемый под действием гликогенсинтазы, непосредственно воздействует на пируваткиназу.

Существуют различные спектрофотометрические анализы, доступные для определения активности гликогенфосфорилазы. В классическом варианте фермент движется назад, в направлении синтеза гликогена, как показано ниже:

(Глюкоза) n + Глюкозо-1-фосфат → (Глюкоза)n+1 + Pi

Через определенные промежутки времени аликвоты реакционной смеси удаляются, а количество высвобождаемого фосфата количественно определяется12,13. В наших руках этот анализ имеет ограниченное применение из-за наличия легко измеримого свободного фосфата во многих коммерческих препаратах глюкозо-1-фосфата в сочетании с высокими концентрациями глюкозо-1-фосфата, необходимыми для действия фосфорилазы. Скорее, мы обычно используем альтернативный анализ, который измеряет глюкозо-1-фосфат, высвобождаемый при разложении гликогена фосфорилазой13. Используется схема сопряженной реакции, проиллюстрированная ниже.

(Глюкоза) n + Pi → (глюкоза)n-1 + глюкозо-1-фосфат

Глюкозо-1-фосфат → глюкозо-6-фосфат

Глюкозо-6-фосфат + NADP+ → 6-фосфоглюконолактон + NADPH + H+

Глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат фосфоглюкомутазой, а глюкозо-6-фосфат затем окисляется до 6-фосфоглюконолактона с сопутствующим восстановлением NADP+ до NADPH. Процедура, описанная в разделе 2 протокола ниже, получена из методов, описанных Mendicino et al.14 и Schreiber & Bowling15. Анализ может быть легко выполнен непрерывным образом, с увеличением абсорбции на 340 нм с течением времени, что позволяет определить скорость реакции.

Спектрофотометрическое определение активности деветвирующего фермента основывается на измерении глюкозы, высвобождаемой действием фермента на предел фосфорилазы декстрина16. Это соединение производится путем исчерпывающей обработки гликогена гликогенфосфорилазой. Поскольку действие фосфорилазы гликогена останавливает 4 остатка глюкозы от точки α1,6-ветви, предел декстрина содержит гликоген, внешние цепи которого были укорочены до ~4 остатков глюкозы. Получение предельного декстрина фосфорилазы описано здесь с использованием процедуры, полученной из тех, которые были разработаны Taylor et al.17 и Makino & Omichi18.

Дебрафингирование представляет собой двухэтапный процесс. Активность 4-α-глюканотрансферазы бифункционального деветвирующего фермента сначала переносит три остатка глюкозы из точки ветви в неизлучающий конец близлежащей α1,4-связанной глюкозной цепи. Одиночный, α1,6-связанный остаток глюкозы, оставшийся в точке ветвления, затем гидролизуется активностью α1,6-глюкозидазы19. Анализ обычно выполняется остановленным образом, глюкоза, высвобождаемая через определенное время (или серию раз), измеряется в связанном ферментном анализе, как показано ниже:

(Глюкоза) n → (глюкоза)n-1 + глюкоза

Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ

Глюкозо-6-фосфат + NADP+ → 6-фосфоглюконолактон + NADPH + H+

Определение NADPH производится, дает меру производства глюкозы. Процедура, изложенная в разделе 3 протокола ниже, основана на процедуре, описанной Нельсоном и др.16. Как и другие методы, которые полагаются на потребление или генерацию NADH / NADPH, анализ довольно чувствителен. Однако наличие амилаз или других глюкозидаз, которые также могут высвобождать свободную глюкозу из фосфорилазы предельного декстрина, вызовет значительные помехи (см. Обсуждение).

Колориметрическое определение активности ветвящихся ферментов основывается на том, что α1,4-связанные цепи глюкозы принимают спиральные структуры, которые связываются с йодом, образуя цветные комплексы20. Цвет образующегося комплекса зависит от длины α1,4-связанных цепей. Таким образом, амилоза, состоящая из длинных, в значительной степени неразветвленных цепочек α1,4-связанной глюкозы, образует темно-синий комплекс с йодом. Напротив, гликогены, внешние цепи которых, как правило, имеют длину от 6 до 8 остатков глюкозы, образуют оранжево-красные комплексы. Если раствор амилозы инкубируют с ветвящимся ферментом, введение ветвей в амилозу приводит к образованию более коротких α1,4-связанных цепей глюкозы. Таким образом, максимум поглощения комплексов амилоза/йод смещается в сторону более коротких длин волн. Процедура, обсуждаемая здесь, получена из того, что подробно описано в Boyer & Preiss21 , и активность ветвящегося фермента количественно определяется как снижение поглощения комплекса амилозы / йода при 660 нм с течением времени.

Как должно быть ясно из обсуждения выше, тот факт, что цвета комплексов, образующихся между цепями йода и α1,4-глюкозы, изменяются в зависимости от длины цепи, означает, что спектры поглощения комплексов гликоген/йод должны изменяться в зависимости от степени ветвления гликогена. Это действительно так, и менее разветвленные гликогены / гликогены с более длинными внешними цепями поглощают свет на более длинной длине волны, чем гликогены, которые более разветвлены / имеют более короткие внешние цепи. Таким образом, реакция окрашивания йодом может быть использована для получения быстрых качественных данных о степени ветвления гликогена22. Оранжево-коричневый цвет образуется, когда комплексы гликогена с йодом не отличаются особой интенсивностью. Однако развитие цвета может быть усилено включением насыщенного раствора хлорида кальция22. Это повышает чувствительность метода примерно в 10 раз и позволяет проводить готовый анализ микрограммовых количеств гликогена. Анализ для определения ветвления, описанный в разделе 4 протокола ниже, адаптирован из процедуры, разработанной Krisman22. Его проводят просто путем объединения образца гликогена с раствором йода и хлорида кальция в кювете и сбора спектра поглощения от 330 нм до 800 нм. Максимум поглощения смещается в сторону более длинных волн по мере уменьшения степени ветвления.

В совокупности методы, описанные здесь, обеспечивают простые, надежные средства оценки активности ключевых ферментов метаболизма гликогена и получения качественных данных о степени ветвления гликогена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Определение активности гликогенсинтазы

  1. Готовят исходные растворы необходимых реагентов, как указано в таблице 1 (до дня эксперимента).
Компонент Маршруты
50 мМ Трис pH 8.0 Растворить 0,61 г основания Tris в ~ 80 мл воды.  Охладить до 4 °C.   Отрегулируйте pH до 8,0 с HCl и сделайте объем до 100 мл с водой.
20 мМ буфер HEPES Растворить 0,477 г HEPES в ~ 80 мл воды.  Отрегулируйте pH до 7,0 с NaOH и увеличьте объем до 100 мл с водой.
132 мМ Tris/32 мМ KCl буфер pH 7,8 Растворить 1,94 г основания Tris и 0,239 г KCl в ~90 мл воды.  Отрегулируйте pH до 7,8 с HCl и увеличьте объем до 100 мл с водой.
0,8% мас./об.устричного гликогена Взвесьте 80 мг устричного гликогена и добавьте в воду.  Сделайте конечный объем до 10 мл водой и аккуратно согрейте /перемешайте, чтобы полностью растворить гликоген.
100 мМ UDP-глюкозы Растворить 0,31 г UDP-глюкозы в воде и сделать конечный объем до 1 мл.  Хранить в аликвотах, замороженных при -20 °C.   Стабильно в течение нескольких месяцев.
50 мМ АТФ Растворить 0,414 г АТФ в ~ 13 мл воды.  Отрегулируйте рН до 7,5 с NaOH и добавьте объем до 15 мл с водой.  Хранить в аликвотах, замороженных при -20 °C.   Стабильно в течение нескольких месяцев.
100 мМ глюкозо-6-фосфат pH 7,8 Растворить 0,282 г глюкозо-6-фосфата в ~ 7 - 8 мл воды.  Отрегулируйте pH до 7,8 с naOH.  Сделайте объем до 10 мл водой.  Хранить замороженным в аликвотах при -20 °C.   Стабилен не менее шести месяцев.
40 мМ фосфоенолпируват Растворить 4 мг фосфоенолпирувата в 0,5 мл 20 мМ HEPES буфера рН 7,0.  Хранить при -20 °C.   Стабилен не менее 1 недели.
0,5 млн МнКл2 Растворить 9,90 г MnCl2 в конечном объеме воды 100 мл.
NDP-киназа Восстанавливают лиофилизированный порошок достаточным количеством воды для получения 1 Ед/мкл раствора.  Приготовьте аликвоты, заморозьте в жидком азоте и храните при -80 °C.   Стабильно не менее 1 года.

Таблица 1: Исходные растворы, необходимые для анализа активности гликогенсинтазы.

  1. В день анализа готовят свежий рабочий раствор 4 мМ NADH путем растворения 4,5 мг NADH в 1,5 мл 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0. Хранить на льду, защищенном от света.
  2. Размораживайте на льду растворы UDP-глюкозы, АТФ, фосфоэнолпирувата и NDP-киназы.
  3. Предварительно нагрейте водяную баню до 30 °C.
  4. Устанавливают каждый анализ гликогенсинтазы в пробирке объемом 1,5 мл, добавляя реакционную смесь реагентов, перечисленных в таблице 2.
Компонент Объем (мкл)
160 мМ Tris/32 мМ KCl буфер pH 7,8 250
Вода 179
100 мМ глюкозо-6-фосфат, рН 7,8 58
0,8 % мас./v устричного гликогена 67
50 мМ АТФ 80
4 мМ НАДХ 80
100 мМ UDP-глюкозы 28
40 мМ фосфоенолпируват 20
0,5 млн МнКл2 8
Заключительный том 770

Таблица 2: Композиционная реакционная смесь для анализа активности гликогенсинтазы.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения настройки может быть изготовлена мастер-смесь, содержащая достаточное количество каждого из вышеперечисленных реагентов для завершения запланированного количества анализов.

  1. Готовят заготовительную реакцию, где NADH в вышеуказанной смеси заменяют водой. Переведите на одноразовую метакрилатную кювету и используйте ее для установки нуля на спектрофотометре на 340 нм.
  2. Возьмите 770 мкл аликвоты реакционной смеси в пробирке объемом 1,5 мл. Добавьте 2 мкл NDP-киназы и 2 мкл смеси пируваткиназы/лактатдегидрогеназы, аккуратно перемешайте и инкубируйте при 30 °C в течение 3 мин для предварительного нагрева реакционной смеси.
  3. Добавьте 30 мкл образца, содержащего гликогенсинтазу, в буфер Триса 20 мМ, рН 7,8; смешать и перенести реакционную смесь в одноразовую метакрилатную кювету.
  4. Поместите кювету в спектрофотометр и запишите поглощение при 340 нм с временными интервалами в течение 10-20 мин. Постройте график полученных поглощений со временем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля неферментативного окисления NADH следует провести реакцию, в которой образец гликогенсинтазы заменяется буфером Tris 20 мМ. В зависимости от чистоты образца могут потребоваться другие контрольные реакции. Подробности см. в разделе Обсуждение.
  5. Определите скорость реакции (подробнее см. в разделе Результаты ).

2. Определение активности гликогенфосфорилазы

  1. Готовят стоковые растворы, как указано в таблице 3 (до дня эксперимента).
Компонент Маршруты
125 мМ ТРУБы pH 6.8 Растворить 3,78 г труб в воде.  Отрегулируйте pH до 6,8 с NaOH и доведите объем до 100 мл с водой.
8% мас./v устричного гликогена Взвесьте 0,8 г устричного гликогена и добавьте в воду.  Сделайте конечный объем до 10 мл водой и аккуратно согрейте /перемешайте, чтобы растворить гликоген.  Хранить замороженным при -20 °C.
200 мМ Na фосфат pH 6,8 Растворяют 2,63 г Na2HPO4,7H 2Oи 1,41 г2PO4. H2Oв воде.  Доведите объем до 100 мл водой.
1 мМ глюкозо-1,6-бисфосфат Растворить 2 мг глюкозо-1,6-бисфосфата в 4 мл воды.  Аликвот и хранить замороженным при -20 °C.   Стабильно в течение как минимум нескольких месяцев.
10 мМ НАДП Растворить 23 мг NADP в 3 мл воды.  Аликвот и хранить замороженным при -20 °C.   Стабильно в течение как минимум нескольких месяцев.

Таблица 3: Исходные растворы, необходимые для анализа активности гликогенфосфорилазы.

  1. Предварительный нагрев водяной бани до 30 °C
  2. Настройте каждый анализ гликогенфосфорилазы в пробирке объемом 1,5 мл, добавив реакционную смесь реагентов, перечисленных ниже (таблица 4).
Компонент Объем (мкл)
125 мМ Трубы буфер pH 6,8 160
Вода 70
8% мас./v устричного гликогена 100
200 мМ Нафосфат 6,8 400
1 мМ глюкозо-1,6-бисфосфат 20
10 мМ НАДП 20
Заключительный том 770

Таблица 4: Композиционная реакционная смесь для анализа активности гликогенфосфорилазы.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения настройки может быть изготовлена мастер-смесь, содержащая достаточное количество каждого из вышеперечисленных реагентов для завершения запланированного количества анализов.

  1. Подготовьте пустую реакцию, содержащую компоненты, перечисленные в таблице 4 , но добавьте дополнительные 30 мкл буфера PIPES 25 мМ, рН 6,8 (полученного путем разбавления 1/5 буфера PIPES 1/5 мМ). Переложить на одноразовую метакрилатную кювету и использовать для установки нуля на спектрофотометре на 340 нм.
  2. Возьмите одну аликвоту реакционной смеси объемом 770 мкл в пробирке объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мкл глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 1 мкл фосфоглюкомутазы, аккуратно перемешайте и инкубируйте при 30 °C в течение 3 мин для предварительного нагрева реакционной смеси.
  3. Добавьте 30 мкл образца, содержащего гликогенфосфорилазу, в буфер PIPES 25 мМ, рН 6,8. Смешайте и переложите реакционную смесь в одноразовую метакрилатную кювету.
  4. Поместите кювету в спектрофотометр и запишите поглощение при 340 нм с временными интервалами в течение 10-20 мин. Постройте график полученных поглощений со временем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует включить реакцию, в которой гликогенфосфорилаза заменяется буфером PIPES 25 мМ. В зависимости от чистоты образца гликогенфосфорилазы могут также потребоваться другие средства контроля (подробнее см. Обсуждение).
  5. Определите скорость реакции (подробнее см. в разделе Репрезентативные результаты).

3. Определение активности фермента, разветвляющего гликоген

  1. Готовят стоковые растворы, как указано в таблице 5 (до дня эксперимента).
Компонент Маршруты
100 мМ малеатный буфер Растворить 1,61 г малеиновой кислоты в ~ 80 мл воды.  Отрегулируйте pH до 6,6 с NaOH и сделайте конечный объем до 100 мл с водой.
300 мМ триэтаноламина гидрохлорид / 3 мМ MgSO4 рН 7,5 Растворить 27,85 г триэтаноламина гидрохлорида и 0,370 г MgSO4. 7H2Oв ~ 400 мл воды.  Отрегулируйте pH до 7,5 с NaOH и доведите до конечного объема 500 мл с водой.
150 мМ АТФ/12 мМ НАДФ Растворить 1,24 г АТФ в ~ 10 мл воды.  Контролируйте рН и добавляйте NaOH для поддержания рН ~ 7,5 по мере растворения АТФ.  Добавить 0,138 г NADP.  Отрегулируйте pH до ~ 7,5 с NaOH и доведите до конечного объема 15 мл с водой. Хранить в аликвотах при температуре – 20 °C. Стабильно в течение нескольких месяцев.
50 мМ Na фосфатный буфер pH 6,8 Растворяют 32,81 г Na2HPO4,7H 2Oи 17,61 г2PO4. H2Oв воде.  Доведите объем до конечного объема 5 л с водой.

Таблица 5: Исходные растворы, необходимые для анализа активности фермента, разветвляющего гликоген.

  1. Приготовьте предельный декстрин фосфорилазы
    1. Растворить 0,3 г устричного гликогена в 10 мл 50 мМ натриефосфатного буфера, рН 6,8.
    2. Растворить достаточное количество порошка лиофилизированной фосфорилазы А для получения 60 ЕД активности в 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от партии приобретенной фосфорилазы А необходимая масса будет варьироваться, но, как правило, составляет от 5 до 10 мг порошка.
  2. Добавьте 60 ЕД фосфорилазы А в раствор гликогена и переложите в диализный мешок. Диализ при комнатной температуре против 1 л 50 мМ натрийфосфатного буфера, рН 6,8 в течение 8 ч. Перейдите на свежий диализный буфер и продолжайте инкубацию в течение ночи.
  3. Добавьте еще 10 Ед фосфорилазы А и замените на свежий диализный буфер. Через 8 ч снова переходят на свежий диализный буфер и продолжают инкубацию на ночь.
  4. Переложите содержимое диализного мешка в центрифужную трубку и прокипятите в течение 10 мин. Охладить на льду, а затем центрифугу при 10 000 х г в течение 15 мин.
  5. Переложите супернатант в диализный мешок и диализуйте в течение 8 ч против трех изменений по 2 л дистиллированной воды.
  6. Перенесите содержимое диализного мешка в центрифужную трубку объемом 50 мл. Измерьте объем и добавьте два объема ледяного абсолютного этанола, чтобы ускорить предел декстрина. Дайте трубке постоять на льду в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белый осадок должен начать образовываться сразу после добавления этанола, но, если это не так, добавьте каплю 3 M NaCl.
  7. Центрифуга при 15 000 х г в течение 15 мин и выбросьте супернатант. Промыть белую гранулу лимитного декстрина дважды 66% v/v этанолом, используя ~30 мл на каждое ополаскивание.
  8. Переложите лимит декстрина в раствор и дайте полностью высохнуть на воздухе. Когда предел декстрина высохнет, измельчите до порошка с пестиком и переложите в подходящий сосуд для хранения; высохнуть при 4 °C.
  9. Для использования в качестве разветвляющего ферментного субстрата готовят 1% мас./об.раствор в воде.
  10. Предварительно нагрейте водяную баню до 30 °C.
  11. Предварительно нагрейте нагревательный блок или водяную баню до 95 °C.
  12. Подготовьте четыре пробирки по 1,5 мл каждая, содержащая 100 мкл малеатного буфера, 80 мкл предельного декстрина фосфорилазы и 10 мкл воды. Эти трубки будут использоваться для проведения анализа ферментов для дебратирования. Маркировка двух трубок Реакция и две другие трубки Контроль.
  13. Через определенные промежутки времени добавляйте 10 мкл образца деветривающего фермента в реакционные пробирки и 10 мкл буфера, который использовался для подготовки образца разветвляющегося фермента к контрольным пробиркам. Инкубировать при 30 °C.
  14. В определенные моменты времени (например, 5-, 10- и 20-минутная инкубация) вынимайте 50 мкл из каждой реакционной и контрольной трубки и немедленно помещайте в нагревательный блок или водяную баню при 95 °C. Нагревать 3 мин.
  15. Центрифуга по 15 000 х г в течение 2 мин для удаления осажденного белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе процедура может быть остановлена при необходимости. Нагретые образцы можно хранить замороженными при -20 °C до тех пор, пока не будет проведено измерение высвобождаемой глюкозы (этап 17 ниже).
  16. Измерение высвобождения глюкозы
    1. Перенесите 40 мкл супернатанта из нагретых образцов в одноразовые метакрилатные кюветы и добавьте 833 мкл буфера триэтаноламина гидрохлорида/сульфата магния, 67 мкл смеси NADP/АТФ и 60 мкл воды. Мягко перемешайте, испешивая вверх и вниз, стараясь не вводить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения настройки может быть изготовлена мастер-смесь, содержащая достаточное количество каждого из вышеперечисленных реагентов для завершения запланированного количества анализов.
    2. Готовят заготовку реакции, комбинируя 100 мкл малеатного буфера, 80 мкл фосфорилазы предельного декстрина и 20 мкл воды. Хорошо перемешать и переложить 40 мкл в одноразовую метакрилатную кювету. Добавить 833 мкл триэтаноламина гидрохлорида/сульфата магния и т.д., как описано на этапе 3.17.1.
    3. Установите ноль на спектрофотометре на 340 нм с помощью пустой реакции.
    4. Добавьте 0,5 мкл глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы к каждой кювете. Осторожно перемешайте, медленно пипетируя вверх и вниз. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем регистрируют поглощение при 340 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения абсорбции должны быть низкими, что означает незначительное загрязнение образцов глюкозо-6-фосфатом.
    5. Добавьте 0,5 мкл гексокиназы к каждой кювете. Осторожно перемешайте, медленно пипетируя вверх и вниз. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем регистрируют поглощение при 340 нм.
    6. Продолжайте инкубацию при комнатной температуре еще 5 мин. Запишите поглощение при 340 нм еще раз. Если абсорбция увеличилась по сравнению с той, которая была зарегистрирована через 15 мин, продолжайте инкубацию еще 5 мин и снова проверьте абсорбцию. Запишите конечное поглощение при полученном 340 нм.
    7. Для каждого образца вычитают абсорбцию при 340 нм, зарегистрированную после добавления глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, из конечной абсорбции, полученной после добавления гексокиназы. Постройте график полученных значений по продолжительности времени, в течение которого соответствующий образец был инкубирован с ферментом дебратирования.

4. Определение активности фермента ветвления гликогена

  1. Перед днем эксперимента приготовьте раствор йода/КИ, сначала растворив 2,6 г КИ в 10 мл воды. В вытяжке взвесьте 0,26 г йода и добавьте в раствор KI.
    ВНИМАНИЕ: Йод вреден при контакте с кожей или при вдыхании. Смешать, чтобы растворить йод и хранить при 4 °C, защищенный от света. Также готовят 125 мМ буфера PIPES, рН 6,8 (см. табл. 3).
  2. Приступая к экспериментам, сделайте рабочий запас подкисленного йодного реагента.
    1. Возьмите 45,7 мл воды в пробирке объемом 50 мл и добавьте 150 мкл раствора йода/KI, а затем 150 мкл 1 M HCl.
    2. Хорошо перемешать и хранить при температуре 4 °C, защищенной от света. В этих условиях раствор стабилен не менее 3 дней.
  3. В день эксперимента делают свежий раствор амилозы 10 мг/мл.
    1. Взвесьте 50 мг амилозы и переложите в пробирку объемом 15 мл.
    2. Добавьте 200 мкл абсолютного этанола и аккуратно встряхните.
    3. Добавьте 500 мкл 2 М КОН и аккуратно встряхните.
      ВНИМАНИЕ: KOH вызывает сильные ожоги кожи и повреждение глаз. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    4. Добавьте 0,5 мл воды, осторожно встряхивая. Если амилоза не растворяется полностью, добавьте дополнительно 0,5 мл воды.
    5. Отрегулируйте pH до ~6,5-7,0 с 1 M HCl.
      ВНИМАНИЕ: HCl может вызвать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    6. Добавьте воду, чтобы достичь конечного объема 5 мл.
    7. Стерилизуют путем прохождения через торцевой фильтр шприца 0,2 мкм и хранят при комнатной температуре. Не охлаждайте и не замораживайте.
  4. Предварительно нагрейте водяную баню до 30 °C.
  5. Подготовьте двенадцать пробирок по 1,5 мл, каждая из которых содержит 1 мл подкисленного реагента йода. Отложите в сторону на скамейке. Они будут использоваться, чтобы остановить реакцию ветвящегося фермента.
  6. Подготовьте четыре пробирки по 1,5 мл, каждая из которых содержит 150 мкл амилозы, 150 мкл буфера PIPES и 45 мкл воды. Эти трубки будут использоваться для проведения анализа разветвленного фермента. Маркировка двух трубок Реакция и две другие трубки Контроль.
  7. Через определенные промежутки времени добавляйте 5 мкл образца ветвящегося фермента в реакционные пробирки и 5 мкл буфера, который использовался для подготовки образца ветвящегося фермента к контрольным пробиркам. Инкубировать при 30 °C.
  8. В определенные моменты времени (например, 5, 10 и 15 мин инкубации) извлекайте 10 мкл из каждой реакционной и контрольной трубки и добавляйте в пробирки объемом 1,5 мл, которые содержат 1 мл подкисленного реагента йода. Добавьте еще 140 мкл воды и хорошо перемешайте. Переложить на одноразовые кюветы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть синего цвета, а раствор должен быть свободен от какого-либо осадка. Образующийся цвет стабилен не менее 2 ч при комнатной температуре.
  9. Подготовьте образец, который содержит 1 мл подкисленного реагента йода и 150 мкл воды. Хорошо перемешать и переложить в кювету. Используйте эту кювету, чтобы установить ноль на спектрофотометре на 660 нм.
  10. Считайте поглощение каждого из двенадцати образцов при 660 нм. Определяют скорость реакции ветвящегося фермента путем вычитания абсорбции, полученной в присутствии ветвящегося фермента (Реакции), из абсорбции при отсутствии ветвящегося фермента (Контроль) в каждой точке времени. Подробности см. в разделе Репрезентативные результаты.

5. Качественная оценка ветвления гликогена

  1. Готовят насыщенный раствор кальция хлорида, добавляя 74,5 г безводного хлорида кальция в ~40 мл воды и перемешивая. Добавьте еще немного воды и продолжайте помешивать. Заваривайте водой объем до 100 мл и продолжайте помешивать до полного растворения CaCl2 .
  2. Подготовьте рабочий запас цветного реагента йода/CaCl2 путем смешивания 50 мкл раствора KI/йода (см. шаг 4.1 выше) с 13 мл насыщенного раствора CaCl2 в пробирке объемом 15 мл. Хорошо перемешать и хранить при температуре 4 °C, защищенной от света. В этих условиях раствор стабилен не менее 1 недели.
  3. Определение ветвления
    1. В пробирке объемом 1,5 мл смешайте 650 мкл йода/CaCl2 цветного реагента со 100 мкл воды и тщательно перемешайте. Переложите раствор на одноразовый метакрилатный кювет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор в кювете должен быть прозрачным и бледно-желтого цвета.
    2. Поместите в спектрофотометр и, работая в режиме сканирования длины волны, соберите фоновый спектр от 330 нм до 800 нм.
    3. В пробирке объемом 1,5 мл соедините 650 мкл рабочего реагента цвета йода/CaCl2 с 50 мкг устричного гликогена. Доведите конечный объем до 750 мкл с водой и тщательно перемешайте. Переложите раствор на одноразовый метакрилатный кювет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор в кювете должен быть прозрачным и темно-оранжевого/коричневого цвета.
    4. Поместите в спектрофотометр и соберите спектр поглощения от 330 нм до 800 нм.
    5. Повторите шаги с 4.4.3 по 4.4.4 с 50 мкг амилопектина и 30 мкг амилозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец амилопектина должен быть желтым/зеленым, а образец амилозы должен быть зеленым/синим. Оба образца должны быть четкими. Образующиеся цветные комплексы стабильны, без изменения спектра поглощения, в течение не менее 1 ч при комнатной температуре.
    6. Чтобы получить указание на разветвленную структуру неохарактеризованного образца гликогена, соедините от 25 мкг до 50 мкг гликогена с 650 мкл рабочего цветового реагента йода/CaCl2 . Действуйте, как указано выше, доведя объем до 750 мкл с водой, тщательно перемешав и переведя в метакрилатную кювету.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец гликогена должен давать желтый/оранжевый/коричневый цвет в зависимости от степени ветвления (длины внешних цепей) присутствующего гликогена. Опять же, образец должен быть четким. Подробности см. в разделе Репрезентативные результаты .
    7. Соберите спектр поглощения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Определение активности гликогенсинтазы
На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты анализов гликогенсинтазы с использованием очищенных ферментов. На панели А после небольшого отставания наблюдалось линейное снижение поглощения при 340 нм с течением времени в течение примерно 12 мин. Скорость изменения абсорбции на фиг.1А составила ~0,12 единицы поглощения/мин. Скорость изменения абсорбции между ~0,010 и ~0,20 единицы абсорбции/мин является оптимальной, и количество добавленной гликогенсинтазы должно быть скорректировано с учетом скорости выхода в этом диапазоне. На панели B показан результат добавления слишком большого количества гликогенсинтазы в анализ. Здесь реакция была завершена в течение первых 2 минут. Контрольная реакция, которая в этих случаях не содержала гликогенсинтазы, не показала измеримого снижения абсорбции с течением времени. Как подробно описано в обсуждении, использование тканевых гомогенатов в этом анализе вполне осуществимо, хотя требуются дополнительные контрольные реакции.

Протокол, описанный здесь, использует устричный гликоген в качестве субстрата, который хорошо работает с синтезаторами гликогена из многих различных видов. Однако следует отметить, что гликогенсинтазы могут проявлять довольно переменную активность в зависимости от типа используемого гликогена. Поэтому желательно исследовать различные формы гликогена до начала какого-либо детального исследования.

Приведенный протокол включает глюкозо-6-фопосфат в реакционную смесь, так как многие гликогенсинтазы аллостерически активируются этим соединением 9,23,24,25,26. Проведение анализов при наличии и отсутствии глюкозо-6-фосфата (составляющего реакционный объем с водой), позволяет рассчитать коэффициент активности -/+ глюкозо-6-фосфата, что является полезным показателем состояния фосфорилирования синтаз млекопитающего и грибкового гликогена 1,27.

Определение активности гликогенсинтазы по изменению абсорбции довольно простое. Коэффициент вымирания NADH принимается за 6220 М-1 см-1, что позволяет рассчитать скорость изменения концентрации NADH от скорости изменения поглощения следующим образом:

Скорость изменения абсорбции 0,12 ед/мин соответствует 0,12/6220 = 1,93 х 10-5 моль/л/мин изменения концентрации NADH. Объем в кювете составлял 0,8 мл, что означает, что изменение количества NADH составляло: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 моль/мин. Объем добавленного фермента составлял 60 мкл, 3,46 х 10-8 х (1000 / 60) = 5,76 х 10-7 моль NADH потребляемого фермента / мин / мл.

Поскольку существует связь один к одному между потребляемым NADH и глюкозой, включенной в гликоген, скорость реакции может быть выражена как 5,76 х 10-7 моль глюкозы инкорпорированной / мин / мл.

Когда известно содержание белка в образце фермента, специфическая активность фермента может быть выражена в виде мкмоль глюкозы/ мин/мг белка или нмоль глюкозы инкорпорированного/мин/мг белка, в зависимости от обстоятельств.

Как упоминалось во введении, протокол легко адаптируется для измерения активности гликогенсинтаз, которые используют АДФ-глюкозу в качестве донора глюкозы. Это достигается простым замещением UDP-глюкозы НА АДФ-глюкозу в реакционной смеси. Кроме того, как NDP-киназа, так и АТФ исключаются из реакционной смеси, поскольку АДФ, высвобождаемый во время действия гликогенсинтазы, является прямым субстратом для пируваткиназы.

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные результаты анализов активности гликогенсинтазы. Спектрофотометр был настроен на одно считывание в минуту в течение общего времени 20 мин. Панель А показывает ожидаемую фазу короткого отставания, за которой следует линейное снижение поглощения со временем (экспериментально). Не наблюдалось снижения абсорбции, отмеченного в контрольной реакции. Скорость реакции рассчитывается исходя из наклона изменения абсорбции в линейной фазе (от 5 до 16 мин). Панель B показывает результат добавления слишком большого количества фермента. Здесь NADH исчерпан в течение 2 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Определение активности гликогенфосфорилазы
На рисунке 2 показаны репрезентативные данные анализа гликогенфосфорилазы с использованием очищенного фермента. С препаратом, используемым здесь, анализ был линейным в течение примерно 3 минут. Вставка показывает линию регрессии, проведенную через точки от времени от 0 до 2,5 мин. Наклон этой линии показывает скорость изменения поглощения равной 0,022 единицы поглощения/мин. Скорость увеличения абсорбции от 0,01 до 0,04 является оптимальной, поскольку анализ будет довольно быстро отклоняться от линейности, если присутствует слишком много фермента. Скорость образования NADPH рассчитывается из коэффициента вымирания, который, как и у NADH, составляет 6220 M-1 см-1. На каждый 1 моль образовавшегося NADPH один моль глюкозо-1-фосфата был получен действием гликогенфосфорилазы. Таким образом, активность фермента может быть выражена как количество глюкозо-1-фосфата, высвобождаемого из гликогена в единицу времени, после расчета, аналогичного описанному выше.

Условия реакции легко адаптируются для тех фосфорилаз, которые чувствительны к аллостерической модуляции. Необходимые эффекторы просто включаются в реакционную мастер-смесь, заменяя часть воды. Важным предостережением является то, что сам эффектор должен не влиять на активность соединительных ферментов, фосфоглюкомутазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Наконец, как и в случае с гликогенсинтазой, описанной выше, тип гликогена, используемого в качестве субстрата, может влиять на скорость реакции. Хотя устричный гликоген хорошо работает с фосфорилазами многих видов, он не всегда может быть оптимальным выбором.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты анализов активности гликогенфосфорилазы. Спектрофотометр был настроен на получение одного показания каждые 30 с в течение общего времени 10 минут. Наблюдалось устойчивое увеличение абсорбции, зафиксированное в присутствии гликогенфосфорилазы (экспериментальное), в то время как реакция без добавления фосфорилазы оставалась на исходном уровне (Контроль). Вставка показывает увеличение начального периода реакции, демонстрируя линейность образования продукта по отношению ко времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Определение активности фермента, разветвляющего гликоген
Данные, показанные на рисунке 3 , являются репрезентативными для анализа фермента деветривания гликогена с использованием очищенного фермента депарации. В каждый момент времени изменение абсорбции, которое происходило в отсутствие добавленного ветвящегося фермента (Control), вычиталось из изменения абсорбции, которое происходило в присутствии ветвящегося фермента (Reaction). Затем были построены результирующие значения поглощения. Как указано выше, скорость изменения концентрации NADPH рассчитывается из начального наклона кривой методом регрессионного анализа. В этом примере увеличение NADPH за единицу времени было линейным в течение 10 мин с наклоном 0,0079 единиц поглощения/мин. Хотя эти данные вполне пригодны для использования, добавление немного меньшего количества фермента дало бы более мелкий наклон и позволило бы более длинную линейную фазу. Альтернативно, дополнительные показания могут быть получены путем удаления аликвот для измерения через 2 мин и 7 мин инкубации. Определение активности деветвирующего фермента очень простое, так как на каждый 1 моль глюкозы, высвобождаемой α1,6-глюкозидазой деветривающего фермента, образуется 1 моль NADPH. Таким образом, скорость реакции может быть выражена как количество глюкозы, высвобождаемой из предельного декстрина фосфорилазы в единицу времени, следуя тому же типу расчета, который был использован для анализов гликогенсинтазы и фосфорилазы, указанных выше.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные результаты анализов активности фермента, разветвляющего гликоген. Образцы предельного декстрина фосфорилазы обрабатывали ферментом дебранчирования в течение 5, 10, 20 или 40 мин. Увеличение абсорбции при 340 нм, полученное при снижении NADP до NADPH в связанном ферментном анализе, измерялось в образцах, взятых в каждой из этих временных точек. Реакция показала линейную фазу, сохраняющуюся в течение не менее 10 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Определение активности фермента ветвления гликогена
На рисунке 4 показаны данные анализов ферментов ветвления гликогена. В каждой из указанных временных точек измеряли поглощение контрольного и реакционного образцов. Поглощение реакционного образца при 660 нм вычитали из поглощения соответствующего контрольного образца, а разницу поглощений строили по времени. Затем через точки была проведена линия регрессии (панель А). Скорость реакции может быть выражена просто как изменение абсорбции при 660 нм в единицу времени. Максимальное изменение абсорбции, которое может произойти в этом анализе, составляет всего ~ 0,4 единицы поглощения, что представляет собой максимальное ветвление добавленной амилозы ветвящимся ферментом (панель B). Кроме того, когда поглощение реакционных трубок падает более чем на ~0,2 единицы поглощения ниже, чем у Контрольной системы, анализ больше не находится в линейном диапазоне и не может быть произведена оценка скорости реакции (панель B).

Амилоза, используемая в качестве субстрата в этой процедуре, начнет довольно легко покидать раствор, если ее охладить или заморозить, а затем разморозить. Поэтому важно сделать раствор амилозного субстрата свежим и убедиться, что перед использованием не образовался осадок.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты анализов активности фермента, разветвляющего гликоген. Образцы амилозы обрабатывали ветвящимся ферментом. Аликвоты удаляли в указанные моменты времени и добавляли в подкисленный реагент йода. Поглощение образовавшегося комплекса амилоза/йод затем измеряли при 660 нм. Показанные данные представляют собой разницу в абсорбции между контрольными инкубациями, в которых отсутствовал ветвящийся фермент, и реакциями, содержащими ветвящийся фермент. Панель A показывает снижение абсорбции при 660 нм из-за активности разветвляющего фермента, которая была линейной в течение ~ 20 мин. Панель B иллюстрирует узкий динамический диапазон анализа, где максимальное изменение поглощения, которое может быть произведено, составляет ~0,4 единицы поглощения, а линейность теряется, когда изменение поглощения составляет ~0,2 единицы поглощения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Качественная оценка степени ветвления гликогена
Амилозу, амилопектин, предельный декстрин фосфорилазы, гликоген, выделенный из дрожжей, комбинировали с раствором йода/насыщенного кальция хлорида и собирали спектры поглощения полученных комплексов (рис. 5). Используя массы гликогена, амилопектина и амилозы, приведенные в описанном выше протоколе, максимальное показание абсорбции должно составлять от 0,7 до 0,8, как показано здесь (панели A и B). Максимумы поглощения амилозы и амилопектина составляют около 660 нм и 500 нм и 385 нм соответственно. Сюда был включен предел фосфорилазы декстрин, поскольку сбор спектра поглощения предельных комплексов декстрина/йода фосфорилазы обеспечивает быструю проверку степени переваривания фосфорилазы, достигнутой при приготовлении этого разветвляющего ферментного субстрата. Гликоген из большинства источников производит два пика, один при приблизительно 400 нм и второй пик при 460 нм (рисунок 5B). Сдвиги влево в спектрах поглощения гликогена указывают на увеличение ветвления/уменьшение длины наружной цепи. И наоборот, сдвиги вправо указывают на уменьшение ветвления/увеличение длины внешней цепи.

Насыщенный раствор хлорида кальция плотный, и добавленные образцы гликогена образуют слой сверху при добавлении. Поэтому для получения однородного раствора необходимо тщательное перемешивание. Кроме того, если используемые образцы углеводов не полностью растворяются перед смешиванием с раствором хлорида кальция, в кювете образуются темные окрашивающие агрегаты. Эти агрегаты, очевидно, будут препятствовать сбору спектра поглощения, и важно убедиться, что раствор в кювете четкий, прежде чем приступать к каким-либо измерениям.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты качественной оценки ветвления гликогена. Образцы очищенного предельного количества фосфорилазы декстрина, амилопектина, амилозы (панель А) или гликогена (группа В) комбинировали с раствором йода/насыщенного кальция хлорида и измеряли спектры поглощения полученных комплексов от 330 нм до 800 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В целом, ключевыми преимуществами всех представленных методов являются их низкая стоимость, легкость, скорость и отсутствие зависимости от специализированного оборудования. Основным недостатком, который они все разделяют, является чувствительность по сравнению с другими доступными методами. Чувствительность процедур, связанных с производством или потреблением NADH/NADPH, легко оценить. Учитывая, что коэффициент вымирания NADH/NADPH составляет 6,22 М-1 см-1, простая арифметика указывает на то, что изменения концентрации ~10-20 мкМ могут быть легко обнаружены. При объемах анализа, описанных в настоящей статье, это соответствует возможности измерения величин в диапазоне ~10-20 нмоль. Возможно, это довольно чувствительно. Тем не менее, можно скорректировать удельную активность радиомаркированных подложек таким образом, что чувствительность может быть увеличена за пределы спектрофотометрических анализов довольно легко. Хотя анализ ветвящихся ферментов и качественная оценка ветвления гликогена основаны на образовании комплексов между йодом и α1,4-связанными полимерами глюкозы, выход из каждого анализа различен, и их чувствительность также различна. Конкретные соображения для каждого из описанных анализов обсуждаются ниже.

Определение активности гликогенсинтазы
Описанный здесь анализ связанных ферментов позволяет проводить непрерывный анализ активности гликогенсинтазы, что полезно при определении кинетических параметров. Он также легко масштабируется, и очень похожая процедура была описана для использования в микротитерных пластинах, что позволяет проводить высокопараллельные измерения активности ферментов28. Мы обычно используем этот анализ с очищенными, рекомбинантными гликогенсинтазами29. Однако описанные процедуры были первоначально разработаны для использования в тканевых гомогенатах (например, см. Danforth10 и Leloir et al.9). Предостережение здесь заключается в том, что гомогенат ткани должен быть соответствующим образом разбавлен перед использованием. Разбавление необходимо для уменьшения мутности гомогената и вмешательства конкурирующих ферментов/субстратов в гомогенат. Кроме того, чтобы учесть потребление NADH, которое не зависит от активности гликогенсинтазы, следует включить пустые реакции, которые содержат все реакционные компоненты, кроме UDP-глюкозы. Затем активность гликогенсинтазы определяют путем вычитания скорости изменения абсорбции NADH в отсутствие UDP-глюкозы из той, которая получена в присутствии этого соединения.

Определение активности гликогенфосфорилазы
Как и анализ гликогенсинтазы, спектрофотометрическое измерение активности фосфорилазы может быть выполнено непрерывным образом, в то время как другие анализы фосфорилазы являются остановленными анализами13. Он также легко адаптируется для использования в микротитрных пластинах или других высокопроизводительных приложениях15. Опять же, его использование с тканевыми гомогенатами требует соответствующего разбавления для уменьшения мутности / мешающих реакций. Например, глюкозо-6-фосфат является довольно распространенным метаболитом, и его присутствие в тканевом гомогенате приведет к производству NADPH через фермент связи глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, независимый от активности фосфорилазы. При работе с тканевыми гомогенатами следует включать контрольные реакции, которые содержат соответствующим образом разбавленный гомогенат ткани и все другие компоненты анализа, кроме фосфата и гликогена. Затем рассчитывается активность фосфорилазы путем вычитания производства NADPH в отсутствие гликогена/фосфата из того, что происходит в присутствии этих соединений. Конкретные рекомендации, касающиеся соответствующей степени разбавления различных типов экстракта ткани млекопитающих, можно найти в Mezl et al.13.

Определение активности фермента, разветвляющего гликоген
Хотя эта процедура описана здесь как остановленный анализ, она может быть легко адаптирована и выполнена непрерывным образом16. Поскольку анализ опирается на выработку глюкозы, его использование в сырых тканевых экстрактах должно учитывать высвобождение глюкозы из фосфорилазы, ограничивающее декстрин ферментами, отличными от разветвляющего фермента, и генерацию глюкозы действием таких ферментов на эндогенный гликоген, присутствующий в тканевом экстракте. Вопрос об эндогенном гликогене легко решается контрольной реакцией, к которой не добавляется декстрин фосфорилазного предела. Присутствие других α-глюкозидазной активности может быть оценено в параллельных реакциях, где мальтоза, а не фосфорилаза предельного декстрина, присутствует в качестве субстрата.

Определение активности фермента ветвления гликогена
Из различных обсуждаемых количественных анализов колориметрический анализ разветвленных ферментов на сегодняшний день является наименее чувствительным. Действительно, было подсчитано, что чувствительность примерно в 50-100 раз меньше, чем при радиохимическом методе, где измеряется стимуляция реакции гликогенфосфорилазы добавлением ветвящегося фермента21. Подобно анализу деветривающего фермента, анализ разветвляющегося фермента также чувствителен к присутствию загрязняющей глюкозидазной активности, поскольку переваривание амилозы повлияет на связывание йода. Были предложены некоторые обходные пути, позволяющие использовать анализы, аналогичные описанным здесь, в присутствии загрязняющих глюкозидазных активностей30. Однако, на наш взгляд, этот анализ лучше всего подходит для изучения очищенных или частично очищенных ферментов ветвления гликогена, где такие интерферирующие действия минимальны или отсутствуют.

Качественная оценка степени ветвления гликогена
Детальный анализ ветвления гликогена довольно трудоемкий, обычно включающий комбинацию ферментативного пищеварения, химической модификации и различных методов разделения для анализа продуктов, полученных31. Хотя колориметрический анализ, описанный здесь, явно не может дать сопоставимую информацию о тонкой структуре гликогена, он обеспечивает простую и быструю меру более или менее ветвления. Кроме того, полученные спектры содержат некоторую дополнительную информацию. Например, как обсуждалось в разделе Репрезентативные результаты, образцы гликогена обычно присутствуют с пиками поглощения при ~400 нм и ~460 нм. Пик при ~ 400 нм, по-видимому, представляет собой короткие внешние цепи в частицах гликогена, поскольку он усиливается в гликогене, выделенном из дрожжевых мутантов, не имеющих ветвящегося фермента по сравнению с дрожжами дикого типа32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет никаких известных конфликтов интересов, связанных с этой работой, и не было никакой финансовой поддержки для этой работы, которая могла бы повлиять на ее результаты.

Acknowledgments

Автор хотел бы поблагодарить Каролин Диттмер и Эндрю Бриттингема за их идеи и множество полезных дискуссий. Эта работа была частично поддержана грантами Фонда остеопатического образования и исследований Айовы (IOER 03-17-05 и 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Tags

Биохимия выпуск 174
Спектрофотометрические методы исследования метаболизма эукариотического гликогена
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter