Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Spektrofotometriske metoder til undersøgelse af eukaryot glykogenmetabolisme

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

Teknikker til måling af aktiviteten af nøgleenzymer af glykogenmetabolisme præsenteres ved hjælp af et simpelt spektrofotometer, der opererer i det synlige område.

Abstract

Glykogen syntetiseres som en opbevaringsform af glukose af en bred vifte af organismer, lige fra bakterier til dyr. Molekylet består af lineære kæder af α1,4-bundne glucoserester med grene introduceret ved tilsætning af α1,6-bindinger. At forstå, hvordan syntesen og nedbrydningen af glykogen reguleres, og hvordan glykogen opnår sin karakteristiske forgrenede struktur, kræver undersøgelse af enzymerne til glykogenlagring. Imidlertid anvender de metoder, der oftest anvendes til at studere disse enzymaktiviteter, typisk reagenser eller teknikker, der ikke er tilgængelige for alle efterforskere. Her diskuterer vi et batteri af procedurer, der er teknisk enkle, omkostningseffektive og alligevel i stand til at give værdifuld indsigt i kontrollen med glykogenlagring. Teknikkerne kræver adgang til et spektrofotometer, der opererer i området 330 til 800 nm, og er beskrevet under forudsætning af, at brugerne vil anvende engangskuvetter af plast. Procedurerne er dog let skalerbare og kan ændres til brug i en mikropladelæser, hvilket muliggør meget parallel analyse.

Introduction

Glykogen er bredt fordelt i naturen, hvor forbindelsen findes i bakterier, mange protister, svampe og dyr. I mikroorganismer er glykogen vigtig for celleoverlevelse, når næringsstoffer er begrænsende, og i højere organismer som pattedyr tjener syntese og nedbrydning af glykogen til at buffer blodglukoseniveauer 1,2,3. Undersøgelsen af glykogenmetabolisme er derfor af betydning for så forskellige områder som mikrobiologi og pattedyrfysiologi. Forståelse af glykogenmetabolisme kræver undersøgelse af nøgleenzymerne i glykogensyntese (glykogensyntase og forgreningsenzymet) og glykogennedbrydning (glykogenphosphorylase og forgrenet enzym). Guldstandardanalyserne af glykogensyntase, phosphorylase, forgrening og afgrening af enzymaktiviteter anvender radioaktive isotoper. For eksempel måles glykogensyntase generelt i et stoppet radiokemisk assay ved at følge inkorporeringen af glucose fra UDP-[14 C] glucose (i tilfælde af dyre- og svampeenzymer) eller ADP-[14C] glucose (i tilfælde af bakterielle enzymer) i glykogen 4,5. Tilsvarende måles glykogenphosphorylase i retning af glykogensyntese efter inkorporering af glucose fra [14C] glucose-1-phosphat i glykogen6. Forgreningsenzymet analyseres ved at måle dette enzyms evne til at stimulere inkorporeringen af [14 C] glucose fra glucose-1-phosphat i α1,4-bundne kæder ved glykogenphosphorylase7, og afgrenende enzymaktivitet bestemmes ved at følge enzymets evne til at inkorporere [14C] glucose i glykogen8 . Selvom de er meget følsomme, tillader de deres anvendelse i rå celleekstrakter med lave niveauer af enzymaktivitet, er de radioaktive substrater dyre og underlagt de lovgivningsmæssige krav, der følger med radioisotopbrug. Disse barrierer placerer brugen af visse analyser uden for mange arbejdstageres rækkevidde. I løbet af mange år er der imidlertid beskrevet en imponerende række spektrofotometriske tilgange til måling af disse enzymer. Generelt er disse tilgange i sidste ende afhængige af at måle produktionen eller forbruget af NADH / NADPH eller genereringen af farvede komplekser mellem glykogen og jod. Således er de ligetil og kan udføres ved hjælp af enkle spektrofotometre udstyret med kun wolfram- eller xenon-blitzlamper.

Spektrofotometriske assays af glykogensyntase er afhængige af måling af nukleosiddiphosphat frigivet fra sukkernukleotiddonoren, da glucose tilsættes til den voksende glykogenkæde 9,10. Fremgangsmåden til måling af glykogensyntaseaktivitet, der er beskrevet i afsnit 1 i protokollen nedenfor, er en ændring af den, der er skitseret af Wayllace et al.11, og koblingsskemaet er vist nedenfor:

(Glukose) n + UPD-glucose → (glucose)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + phosphoenolpyruvat → pyruvat + ATP

Pyruvat + NADH + H + → laktat + NAD +

Glykogensyntase tilføjer glukose fra UDP-glucose til glykogen. UDP genereret i denne proces omdannes til UTP af nukleosiddiphosphatkinase (NDP-kinase) i en reaktion, der genererer ADP. ADP tjener igen som et substrat for pyruvatkinase, som phosphorylerer ADP ved anvendelse af phosphoenolpyruvat som fosfatdonor. Det resulterende pyruvat omdannes til lactat af enzymet lactat dehydrogenase i en reaktion, der forbruger NADH. Analysen kan derfor udføres kontinuerligt og overvåge faldet i absorbans ved 340 nm, når NADH forbruges. Det er let tilpasset til brug med enzymer, der kræver ADP-glucose som glukosedonor. Her er koblingstrinnene enklere, da ADP frigivet ved virkningen af glykogensyntase påvirkes direkte af pyruvatkinase.

Der er en række spektrofotometriske assays til rådighed til bestemmelse af glykogenphosphorylaseaktivitet. I den klassiske version drives enzymet baglæns i retning af glykogensyntese som vist nedenfor:

(Glukose) n + Glucose-1-phosphat → (glucose)n+1 + Pi

Med tidsbestemte intervaller fjernes alikvoter af reaktionsblandingen, og mængden af frigjort fosfat kvantificeres12,13. I vores hænder har dette assay været af begrænset anvendelse på grund af tilstedeværelsen af let målbart frit fosfat i mange kommercielle præparater af glucose-1-phosphat kombineret med de høje koncentrationer af glucose-1-phosphat, der kræves til phosphorylasevirkning. I stedet har vi rutinemæssigt anvendt et alternativt assay, der måler glukose-1-fosfat, der frigives som glykogen, nedbrydes af phosphorylase13. Der anvendes et koblet reaktionsskema, der er illustreret nedenfor.

(Glukose) n + Pi → (glucose)n-1 + glucose-1-phosphat

Glucose-1-phosphat → glucose-6-phosphat

Glucose-6-phosphat + NADP + → 6-phosphogluconolacton + NADPH + H +

Glucose-1-phosphatet omdannes til glucose-6-phosphat ved phosphoglucomutase, og glucose-6-phosphatet oxideres derefter til 6-phosphogluconolacton med samtidig reduktion af NADP + til NADPH. Proceduren, der er beskrevet i afsnit 2 i protokollen nedenfor, er afledt af metoder beskrevet af Mendicino et al.14 og Schreiber & Bowling 15. Analysen kan let udføres kontinuerligt med stigningen i absorbans ved 340 nm over tid, hvilket muliggør bestemmelse af reaktionshastigheden.

Spektrofotometrisk bestemmelse af forgrenet enzymaktivitet er afhængig af måling af glukosen frigivet ved enzymets virkning på phosphorylase limit dextrin16. Denne forbindelse fremstilles ved at behandle glykogen udtømmende med glykogenphosphorylase. Da glykogenphosphorylasevirkning stopper 4 glucoserester væk fra et α1,6-grenpunkt, indeholder grænsedextrin glykogen, hvis ydre kæder er blevet forkortet til ~ 4 glukoserester. Fremstilling af phosphorylase limit dextrin er beskrevet her ved hjælp af en procedure afledt af dem, der er udviklet af Taylor et al.17 og Makino & Omichi18.

Afgrening er en to-trins proces. 4-α-glucanotransferaseaktiviteten af det bifunktionelle afgreningsenzym overfører først tre glucoserester fra grenpunktet til den ikke-reducerende ende af en nærliggende α1,4-bundet glukosekæde. Den enkelte α1,6-bundne glucoserest, der er tilbage ved grenpunktet, hydrolyseres derefter af α1,6-glucosidaseaktiviteten19. Analysen udføres typisk på en stoppet måde, idet glukosen, der frigives efter en given tid (eller række gange), måles i et koblet enzymassay som vist nedenfor:

(Glukose) n → (glukose)n-1 + glukose

Glucose + ATP → glucose-6-phosphat + ADP

Glucose-6-phosphat + NADP + → 6-phosphogluconolacton + NADPH + H +

Bestemmelsen af produceret NADPH giver et mål for glukoseproduktion. Den procedure, der er beskrevet i afsnit 3 i protokollen nedenfor, er baseret på en beskrevet af Nelson et al.16. Ligesom de andre metoder, der er afhængige af forbruget eller genereringen af NADH / NADPH, er analysen ret følsom. Tilstedeværelsen af amylaser eller andre glucosidaser, som også kan frigøre fri glucose fra phosphorylasegrænsedextrin, vil imidlertid forårsage betydelig interferens (se Diskussion).

Den kolorimetriske bestemmelse af forgrenet enzymaktivitet er afhængig af det faktum, at α1,4-bundne glukosekæder vedtager spiralformede strukturer, der binder til jod og danner farvede komplekser20. Farven på det dannede kompleks afhænger af længden af α1,4-bundne kæder. Således danner amylose, som består af lange, stort set uforgrenede kæder af α1,4-bundet glucose, et dybblåt kompleks med jod. I modsætning hertil danner glykogener, hvis ydre kæder generelt er i størrelsesordenen kun 6 til 8 glucoserester lange, orange-røde komplekser. Hvis en opløsning af amylose inkuberes med forgreningsenzym, resulterer indførelsen af grene i amylose i dannelsen af kortere α1,4-bundne glucosekæder. Således skifter absorptionsmaksimum for amylose / jodkomplekserne mod kortere bølgelængder. Den procedure, der diskuteres her, er afledt af den, der er beskrevet af Boyer & Preiss21 , og forgreningsenzymaktivitet kvantificeres som en reduktion i absorptionen af amylose / jodkomplekset ved 660 nm over tid.

Som det burde være let at se af diskussionen ovenfor, betyder det faktum, at farverne på de komplekser, der dannes mellem jod- og α1,4-glukosekæder, varierer med kædelængden, at absorbansspektrene for glykogen/jodkomplekser bør variere med graden af glykogenforgrening. Dette er faktisk tilfældet, og mindre forgrenede glykogener / glykogener med længere ydre kæder absorberer lys ved en længere bølgelængde end glykogener, der er mere forgrenede / har kortere ydre kæder. Jodfarvningsreaktionen kan derfor bruges til at opnå hurtige, kvalitative data om graden af glykogenforgrening22. Den orangebrune farve dannes, når glykogenkomplekser med jod ikke er særlig intens. Farveudviklingen kan dog forbedres ved inkludering af mættet calciumchloridopløsning22. Dette øger metodens følsomhed ca. 10 gange og muliggør klar analyse af mikrogrammængder af glykogen. Analysen til bestemmelse af forgrening, der er beskrevet i afsnit 4 i protokollen nedenfor, er tilpasset fra en procedure udviklet af Krisman22. Det udføres simpelthen ved at kombinere glykogenprøven med jodopløsning og calciumchlorid i en kuvette og opsamle absorptionsspektret fra 330 nm til 800 nm. Absorbansmaksimumet skifter mod længere bølgelængder, når forgreningsgraden falder.

Samlet set giver de metoder, der er beskrevet her, enkle, pålidelige midler til at vurdere aktiviteterne i de vigtigste enzymer i glykogenmetabolisme og til opnåelse af kvalitative data om omfanget af glykogenforgrening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestemmelse af glykogensyntaseaktivitet

  1. Der fremstilles stamopløsninger af krævede reagenser som angivet i tabel 1 (før forsøgsdagen).
Komponent Rutevejledning
50 mM Tris pH 8,0 Opløs 0,61 g Tris base i ~ 80 ml vand.  Chill til 4 °C.   Juster pH til 8,0 med HCI og gør volumenet op til 100 ml med vand.
20 mM HEPES buffer Opløs 0,477 g HEPES i ~ 80 ml vand.  Juster pH til 7,0 med NaOH og fyld volumen op til 100 ml med vand.
132 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8 Opløs 1,94 g Tris base og 0,239 g KCl i ~ 90 ml vand.  Juster pH til 7,8 med HCI, og fyld volumen op til 100 ml med vand.
0,8% w/v østersglykogen Vej 80 mg østersglykogen og tilsæt til vand.  Lav det endelige volumen op til 10 ml med vand og varm forsigtigt / bland for helt at opløse glykogen.
100 mM UDP-glukose Opløs 0,31 g UDP-glucose i vand og gør det endelige volumen op til 1 ml.  Opbevares i aliquoter, frosset ved -20 °C.   Stabil i flere måneder.
50 mM ATP Opløs 0,414 g ATP i ~ 13 ml vand.  Juster pH til 7,5 med NaOH og fyld volumen op til 15 ml med vand.  Opbevares i aliquoter, frosset ved -20 °C.   Stabil i flere måneder.
100 mM glucose-6-phosphat pH 7,8 Opløs 0,282 g glucose-6-phosphat i ~ 7 til 8 ml vand.  Juster pH-værdien til 7,8 med NaOH.  Gør volumenet op til 10 ml med vand.  Opbevares frosset i alikvoter ved -20 °C.   Stabil i mindst seks måneder.
40 mM phosphoenolpyruvat 4 mg phosphoenolpyruvat opløses i 0,5 ml 20 mM HEPES buffer pH 7,0.  Opbevares ved -20 °C.   Stabil i mindst 1 uge.
0,5 mio. mnCl2 9,90 g MnCl2 opløses i et slutvolumen på 100 ml vand.
NDP kinase Rekonstituere frysetørret pulver med tilstrækkeligt vand til at give 1 U/μl opløsning.  Der fremstilles alikvoter, fryses i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 °C.   Stabil i mindst 1 år.

Tabel 1: Stamopløsninger, der kræves til kvantitativ bestemmelse af glykogensyntaseaktivitet.

  1. På analysedagen fremstilles en frisk arbejdsløsning på 4 mM NADH ved at opløse 4,5 mg NADH i 1,5 ml 50 mM Tris-HCI, pH 8,0. Opbevares på is, beskyttet mod lyset.
  2. Optøningsbestandsopløsninger af UDP-glucose, ATP, phosphoenolpyruvat og NDP-kinase på is.
  3. Forvarm et vandbad til 30 °C.
  4. Hvert glykogensyntaseassay opsættes i et 1,5 ml rør ved at tilsætte reaktionsblandingsreagenserne, der er anført i tabel 2.
Komponent Volumen (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8 250
Vand 179
100 mM glucose-6-phosphat, pH 7,8 58
0,8 % w/v østersglykogen 67
50 mM ATP 80
4 mM NADH 80
100 mM UDP-glukose 28
40 mM phosphoenolpyruvat 20
0,5 mio. mnCl2 8
Sidste bind 770

Tabel 2: Sammensætningsreaktionsblanding til assay af glykogensyntaseaktivitet.

BEMÆRK: For at lette opsætningen kan der laves en masterblanding, der indeholder nok af hvert af de ovennævnte reagenser til at fuldføre antallet af planlagte assays.

  1. Forbered en tom reaktion, hvor NADH i ovennævnte blanding erstattes med vand. Overfør til en engangsmethacrylatkuvette, og brug denne til at indstille nul på spektrofotometeret til 340 nm.
  2. Der tages en 770 μL af reaktionsblandingens alikvote i et 1,5 ml rør. Der tilsættes 2 μL NDP-kinase og 2 μL pyruvatkinase/lactatdehydrogenaseblanding, blandes forsigtigt, og der inkuberes ved 30 °C i 3 minutter for at forvarme reaktionsblandingen.
  3. Der tilsættes 30 μL af prøven indeholdende glykogensyntase i 20 mM Tris-buffer, pH 7,8; bland, og overfør reaktionsblandingen til en engangsmethacrylatkuvette.
  4. Læg kuvetten i spektrofotometeret og registrer absorbansen ved 340 nm med tidsintervaller i 10 til 20 minutter. Plot de opnåede absorbanser mod tiden.
    BEMÆRK: En reaktion, hvor glykogensyntaseprøven erstattes med 20 mM Tris-buffer, skal udføres for at kontrollere for ikke-enzymatisk oxidation af NADH. Afhængigt af prøvens renhed kan der være behov for andre kontrolreaktioner. Se Diskussion for at få flere oplysninger.
  5. Bestem reaktionshastigheden (se Resultater for detaljer).

2. Bestemmelse af glykogenphosphorylaseaktivitet

  1. Stamopløsninger fremstilles som angivet i tabel 3 (før forsøgsdagen).
Komponent Rutevejledning
125 mM PIBER pH 6,8 Opløs 3,78 g RØR i vand.  Juster pH til 6,8 med NaOH og fyld volumen til 100 ml med vand.
8% w/v østersglykogen Vej 0,8 g østersglykogen og tilsæt til vand.  Lav det endelige volumen op til 10 ml med vand og varm forsigtigt / bland for at opløse glykogen.  Opbevares frosset ved -20 °C.
200 mM Na fosfat pH 6,8 Opløs 2,63 g Na 2 HPO4,7H 2 O og 1,41 g NaH2PO4. H2O i vand.  Bring volumenet op til 100 ml med vand.
1 mM glucose-1,6-bisphosphat 2 mg glucose-1,6-bisphosphat opløses i 4 ml vand.  Aliquot og opbevares frosset ved -20 °C.   Stabil i mindst flere måneder.
10 mM NADP Opløs 23 mg NADP i 3 ml vand.  Aliquot og opbevares frosset ved -20 °C.   Stabil i mindst flere måneder.

Tabel 3: Stamopløsninger, der kræves til kvantitativ bestemmelse af glykogenphosphorylaseaktivitet.

  1. Forvarm et vandbad til 30 °C
  2. Hvert glykogenphosphorylaseassay opsættes i et 1,5 ml rør ved at tilsætte nedenstående reaktionsblandingsreagenser (tabel 4).
Komponent Volumen (μl)
125 mM RØR buffer pH 6,8 160
Vand 70
8% w/v østersglykogen 100
200 mM Na-fosfat 6,8 400
1 mM glucose-1,6-bisphosphat 20
10 mM NADP 20
Sidste bind 770

Tabel 4: Sammensætningsreaktionsblanding til assay af glykogenphosphorylaseaktivitet.

BEMÆRK: For at lette opsætningen kan der laves en masterblanding, der indeholder nok af hvert af de ovennævnte reagenser til at fuldføre antallet af planlagte assays.

  1. Der fremstilles en blindreaktion indeholdende de komponenter, der er anført i tabel 4 , men der tilsættes yderligere 30 μL 25 mM PIPES-buffer, pH 6,8 (fremstillet ved fortynding af 125 mM PIPES-buffer 1/5 med vand). Overfør til en engangsmethacrylatkuvette og brug til at indstille nul på spektrofotometeret til 340 nm.
  2. Der tages en 770 μL aliquot reaktionsblanding i et 1,5 ml rør. Tilsæt 1 μL glucose-6-phosphat dehydrogenase og 1 μL phosphoglucomutase, bland forsigtigt og inkuber ved 30 ° C i 3 minutter for at forvarme reaktionsblandingen.
  3. Der tilsættes 30 μL af prøven indeholdende glykogenphosphorylase i 25 mM PIPES-buffer, pH 6,8. Bland og overfør reaktionsblandingen til en engangsmethacrylatkuvette.
  4. Læg kuvetten i spektrofotometeret og registrer absorbansen ved 340 nm med tidsintervaller i 10 til 20 minutter. Plot de opnåede absorbanser mod tiden.
    BEMÆRK: En reaktion, hvor glykogenphosphorylase erstattes med 25 mM PIPES-buffer, skal inkluderes. Afhængigt af renheden af glykogenphosphorylaseprøven kan der også være behov for andre kontroller (se diskussion for detaljer).
  5. Bestem reaktionshastigheden (se Repræsentative resultater for detaljer).

3. Bestemmelse af glykogenforgrenende enzymaktivitet

  1. Stamopløsninger fremstilles som angivet i tabel 5 (før forsøgsdagen).
Komponent Rutevejledning
100 mM maleat buffer Opløs 1,61 g maleinsyre i ~ 80 ml vand.  Juster pH til 6,6 med NaOH og lav det endelige volumen op til 100 ml med vand.
300 mM triethanolaminhydrochlorid/ 3 mM MgSO4 pH 7,5 27,85 g triethanolaminhydrochlorid og 0,370 gMgSO4 opløses. 7H2O i ~ 400 ml vand.  Juster pH til 7,5 med NaOH og fyld op til et endeligt volumen på 500 ml med vand.
150 mM ATP/12 mM NADP Opløs 1,24 g ATP i ~ 10 ml vand.  Overvåg pH, og tilføj NaOH for at opretholde en pH-værdi på ~ 7,5, når ATP'en opløses.  Tilsæt 0,138 g NADP.  Juster pH til ~ 7,5 med NaOH og fyld op til et endeligt volumen på 15 ml med vand. Opbevares i aliquots ved – 20 °C. Stabil i flere måneder.
50 mM Na-fosfatbuffer pH 6,8 Opløs 32,81 g Na 2 HPO4,7H 2 O og 17,61 g NaH2PO4. H2O i vand.  Bring volumenet op til et endeligt volumen på 5 L med vand.

Tabel 5: Stamopløsninger, der kræves til kvantitativ bestemmelse af glykogenforgrenende enzymaktivitet.

  1. Forbered phosphorylase limit dextrin
    1. Opløs 0,3 g østersglykogen i 10 ml 50 mM natriumphosphatbuffer, pH 6,8.
    2. Opløs tilstrækkeligt frysetørret phosphorylase A-pulver til at give 60 U aktivitet i 50 mM phosphatbuffer, pH 6,8.
      BEMÆRK: Afhængigt af partiet phosphorylase A købt, vil den nødvendige masse variere, men er generelt mellem 5 og 10 mg pulver.
  2. Tilsæt 60 U phosphorylase A til glykogenopløsningen og overfør til en dialysepose. Dialysér ved stuetemperatur mod 1 liter 50 mM natriumphosphatbuffer, pH 6,8 i 8 timer. Skift til den friske dialysebuffer og fortsæt inkubationen natten over.
  3. Tilsæt yderligere 10 U phosphorylase A og skift til frisk dialysebuffer. Efter 8 timer ændres igen til frisk dialysebuffer og fortsætter inkubationen natten over.
  4. Overfør indholdet af dialyseposen til et centrifugerør og kog i 10 min. Chill på is, og centrifuge derefter ved 10.000 x g i 15 min.
  5. Overfør supernatanten til en dialysepose og dialysér i 8 timer mod tre skift af 2 liter destilleret vand.
  6. Indholdet af dialyseposen overføres til et 50 ml centrifugerør. Volumenet måles, og der tilsættes to volumener iskold absolut ethanol for at udfælde grænsedextrinen. Lad røret stå på is i 30 min.
    BEMÆRK: Et hvidt bundfald skal begynde at danne sig umiddelbart efter tilsætning af ethanol, men hvis det ikke gør det, tilsættes en dråbe på 3 M NaCl.
  7. Der centrifugeres ved 15.000 x g i 15 minutter, og supernatanten kasseres. Skyl den hvide pille af limit dextrin to gange med 66% v / v ethanol ved hjælp af ~ 30 ml for hver skylning.
  8. Overfør grænsedextrinen til en mørtel og lad lufttørre helt. Når grænsedextrinen er tør, slibes til et pulver med en pistil og overføres til en passende beholder til opbevaring; tør ved 4 °C.
  9. Til brug som afgrenende enzymsubstrat fremstilles en 1% w/v opløsning i vand.
  10. Forvarm et vandbad til 30 °C.
  11. Forvarm en varmeblok eller vandbad til 95 °C.
  12. Der fremstilles fire 1,5 ml rør, der hver indeholder 100 μL maleatbuffer, 80 μL phosphorylasegrænsedextrin og 10 μL vand. Disse rør vil blive brugt til at udføre det forgrenede enzymassay. Mærk to af rørene Reaktion og de to andre rør Kontrol.
  13. Med tidsbestemte intervaller tilsættes 10 μL af den forgrenede enzymprøve til reaktionsrørene og 10 μL buffer, som blev brugt til at forberede forgreningsenzymprøven til kontrolrørene. Inkuberes ved 30 °C.
  14. På bestemte tidspunkter (f.eks. 5-, 10- og 20-minutters inkubation) trækkes 50 μL ud af hvert reaktions- og kontrolrør og anbringes straks i varmeblokken eller vandbadet ved 95 °C. Varm i 3 min.
  15. Der centrifugeres ved 15.000 x g i 2 minutter for at fjerne udfældet protein.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan proceduren stoppes, hvis det er nødvendigt. De opvarmede prøver kan opbevares frosset ved -20 °C, indtil de fortsætter med målingen af frigivet glucose (trin 17 nedenfor).
  16. Måling af frigivet glukose
    1. Overfør 40 μL supernatant fra de opvarmede prøver til engangsmethacrylatkuvetter, og tilsæt 833 μL triethanolaminhydrochlorid/magnesiumsulfatbuffer, 67 μL NADP/ATP-blanding og 60 μL vand. Bland ved at pipettere forsigtigt op og ned, og pas på ikke at indføre luftbobler.
      BEMÆRK: For at lette opsætningen kan der laves en masterblanding, der indeholder nok af hvert af de ovennævnte reagenser til at fuldføre antallet af planlagte assays.
    2. Forbered en blank reaktion ved at kombinere 100 μL maleatbuffer, 80 μL phosphorylase limit dextrin og 20 μL vand. Bland godt, og overfør 40 μL til en engangsmethacrylatkuvette. Der tilsættes 833 μL triethanolaminhydrochlorid/magnesiumsulfat osv. som beskrevet i trin 3.17.1.
    3. Nul på spektrofotometeret indstilles til 340 nm ved hjælp af den tomme reaktion.
    4. Der tilsættes 0,5 μL glucose-6-phosphatdehydrogenase til hver kuvette. Bland forsigtigt ved at pipettere langsomt op og ned. Inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter, og registrer derefter absorbansen ved 340 nm.
      BEMÆRK: Absorptionsværdierne skal være lave, hvilket betyder ringe forurening af prøverne med glucose-6-phosphat.
    5. Der tilsættes 0,5 μL hexokinase til hver kuvette. Bland forsigtigt ved at pipettere langsomt op og ned. Inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter, og registrer derefter absorbansen ved 340 nm.
    6. Fortsæt inkubationen ved stuetemperatur i yderligere 5 minutter. Optag absorbansen ved 340 nm igen. Hvis absorptionen er steget fra den registrerede ved 15 min., fortsættes inkubationen i yderligere 5 minutter og absorberingen kontrolleres igen. Den endelige absorption registreres ved 340 nm opnået.
    7. For hver prøve trækkes absorbansen ved 340 nm registreret efter tilsætning af glucose-6-phosphatdehydrogenase fra den endelige absorbans opnået efter tilsætning af hexokinase. De opnåede værdier afbildes i forhold til den tid, hvor den tilsvarende prøve var blevet inkuberet med debranchingenzym.

4. Bestemmelse af glykogenforgreningsenzymaktivitet

  1. Før forsøgsdagen tilberedes jod/KI-opløsning ved først at opløse 2,6 g KI i 10 ml vand. I en røghætte vejes 0,26 g jod og tilsættes til KI-opløsningen.
    FORSIGTIG: Jod er skadeligt, når det kommer i kontakt med huden eller ved indånding. Bland for at opløse jod og opbevares ved 4 °C, beskyttet mod lyset. Der fremstilles også 125 mM PIPES-buffer, pH 6,8 (se tabel 3).
  2. Når du begynder eksperimenter, lav en arbejdsbestand af forsuret jodreagens.
    1. Tag 45,7 ml vand i et 50 ml rør og tilsæt 150 μL jod/KI-opløsning efterfulgt af 150 μL 1 M HCI.
    2. Bland godt og opbevar ved 4 °C, beskyttet mod lyset. Opløsningen er stabil i mindst 3 dage under disse forhold.
  3. På dagen for eksperimentet fremstilles en frisk 10 mg / ml opløsning af amylose.
    1. Vej 50 mg amylose og overfør til et 15 ml rør.
    2. Tilsæt 200 μL absolut ethanol og ryst forsigtigt.
    3. Tilsæt 500 μL 2 M KOH og ryst forsigtigt.
      FORSIGTIG: KOH forårsager alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Brug passende personlige værnemidler.
    4. Tilsæt 0,5 ml vand, mens du ryster forsigtigt. Hvis amylose ikke opløses helt, tilsættes yderligere 0,5 ml vand.
    5. Juster pH til ~6,5 til 7,0 med 1 M HCI.
      FORSIGTIG: HCI kan forårsage øjen-, hud- og luftvejsirritation. Brug passende personlige værnemidler.
    6. Tilsæt vand for at nå et endeligt volumen på 5 ml.
    7. Steriliser ved passage gennem et 0,2 μm sprøjte endefilter og opbevares ved stuetemperatur. Undlad at køle eller fryse.
  4. Forvarm et vandbad til 30 °C.
  5. Forbered tolv 1,5 ml rør, der hver indeholder 1 ml syrnet jodreagens. Sæt til side på bænken. Disse vil blive brugt til at stoppe forgreningsenzymreaktionen.
  6. Der forberedes fire 1,5 ml rør, der hver indeholder 150 μL amylose, 150 μL PIPES-buffer og 45 μL vand. Disse rør vil blive brugt til at udføre forgreningsenzymanalysen. Mærk to af rørene Reaktion og de to andre rør Kontrol.
  7. Med tidsintervaller tilsættes 5 μL forgreningsenzymprøve til reaktionsrørene og 5 μL buffer, som blev brugt til at forberede forgreningsenzymprøven til kontrolrørene. Inkuberes ved 30 °C.
  8. På bestemte tidspunkter (f.eks. 5, 10 og 15 minutters inkubation) trækkes 10 μL ud af hvert reaktions- og kontrolrør og tilsættes til de 1,5 ml rør, der indeholder 1 ml syrnet jodreagens. Tilsæt yderligere 140 μL vand og bland godt. Overførsel til engangskuvetter.
    BEMÆRK: Prøverne skal være blå i farven, og opløsningen skal være fri for bundfald. Den dannede farve er stabil i mindst 2 timer ved stuetemperatur.
  9. Forbered en prøve, der indeholder 1 ml syrnet jodreagens og 150 μL vand. Bland godt og overfør til en kuvette. Brug denne kuvette til at indstille nul på spektrofotometeret til 660 nm.
  10. Læs absorbansen af hver af de tolv prøver ved 660 nm. Bestem hastigheden af forgreningsenzymreaktionen ved at trække absorbansen opnået i nærværelse af forgreningsenzym (reaktion) fra absorbansen, når der ikke er noget forgreningsenzym til stede (kontrol) på hvert tidspunkt. Se Repræsentative resultater for at få flere oplysninger.

5. Kvalitativ vurdering af glykogenforgrening

  1. Forbered mættet calciumchloridopløsning ved at tilsætte 74,5 g vandfrit calciumchlorid til ~ 40 ml vand og omrøring. Tilsæt lidt mere vand og fortsæt med at røre. Lav volumen op til 100 ml med vand og fortsæt omrøring, indtil CaCl2 er helt opløst.
  2. Der fremstilles et arbejdslager af jod/CaCl 2-farvereagens ved at blande 50 μL KI/jodstamopløsning (se trin 4.1 ovenfor) med 13 ml mættet CaCl2-opløsning i et 15 ml rør. Bland godt og opbevar ved 4 °C, beskyttet mod lyset. Opløsningen er stabil i mindst 1 uge under disse forhold.
  3. Bestemmelse af forgrening
    1. I et 1,5 ml rør kombineres 650 μL jod / CaCl2 farvereagenslager med 100 μL vand og blandes grundigt. Overfør opløsningen til en engangsmethacrylatkuvette.
      BEMÆRK: Opløsningen i kuvetten skal være klar og lysegul i farven.
    2. Placer i spektrofotometeret, og saml et baggrundsspektrum fra 330 nm til 800 nm i bølgelængdescanningstilstand.
    3. I et 1,5 ml rør kombineres 650 μL arbejdsjod/CaCl2 farvereagens med 50 μg østersglykogen. Det endelige volumen bringes til 750 μL med vand og blandes grundigt. Overfør opløsningen til en engangsmethacrylatkuvette.
      BEMÆRK: Opløsningen i kuvetten skal være klar og have en dyb orange/brun farve.
    4. Placer i spektrofotometeret og opsamling et absorptionsspektrum fra 330 nm til 800 nm.
    5. Trin 4.4.3 til 4.4.4 gentages med 50 μg amylopectin og 30 μg amylose.
      BEMÆRK: Amylopectinprøven skal være gul/grøn, og amyloseprøven skal være grøn/blå. Begge prøver skal være klare. De dannede farvede komplekser er stabile uden ændring i absorptionsspektret i mindst 1 time ved stuetemperatur.
    6. For at opnå en indikation af den forgrenede struktur af en ukarakteriseret glykogenprøve kombineres 25 μg til 50 μg glykogen med 650 μL arbejdsjod / CaCl2 farvereagens. Fortsæt som ovenfor, bring volumenet til 750 μL med vand, bland grundigt og overfør til en methacrylatkuvette.
      BEMÆRK: Glykogenprøven skal give en gul / orange til orange / brun farve afhængigt af graden af forgrening (længde af ydre kæder) af det tilstedeværende glykogen. Igen skal prøven være klar. Se Repræsentative resultater for at få flere oplysninger.
    7. Saml absorptionsspektret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestemmelse af glykogensyntaseaktivitet
Figur 1 viser repræsentative resultater fra glykogensyntaseassays ved anvendelse af oprensede enzymer. I panel A var der efter en lille forsinkelse et lineært fald i absorptionen ved 340 nm over tid i en periode på ca. 12 min. Ændringshastigheden i absorptionen i figur 1A var ~0,12 absorbansenheder/min. En ændringshastighed i absorbans mellem ~0,010 og ~0,20 absorbansenheder/min er optimal, og mængden af tilsat glykogensyntase bør justeres til udbyttehastigheder inden for dette interval. I panel B vises resultatet af at tilføje for meget glykogensyntase til analysen. Her var reaktionen komplet inden for de første 2 min. Kontrolreaktionen, som i disse tilfælde ikke indeholdt glykogensyntase, viste intet målbart fald i absorbans over tid. Som uddybet i diskussionen er brugen af vævshomogenater i dette assay fuldt ud mulig, selvom der kræves yderligere kontrolreaktioner.

Protokollen beskrevet her bruger østersglykogen som substrat, hvilket fungerer godt med glykogensyntaser fra mange forskellige arter. Det skal dog bemærkes, at glykogensyntaser kan udvise ret variabel aktivitet afhængigt af den anvendte type glykogen. Derfor er det tilrådeligt at undersøge en række forskellige former for glykogen, inden man begynder en detaljeret undersøgelse.

Den givne protokol inkluderer glucose-6-phoposulfat i reaktionsblandingen, da mange glykogensyntaser aktiveres allosterisk af denne forbindelse 9,23,24,25,26. Gennemførelse af assays i nærvær og fravær af glucose-6-phosphat (der udgør reaktionsvolumenet med vand) muliggør beregning af -/+ glucose-6-phosphataktivitetsforholdet, hvilket er en nyttig indikation af phosphoryleringstilstanden for pattedyr og svampeglykogensyntaser 1,27.

Bestemmelsen af glykogensyntaseaktivitet fra ændringen i absorbans er ret ligetil. Udryddelseskoefficienten for NADH tages som 6220 M-1 cm-1, hvilket gør det muligt at beregne ændringshastigheden i NADH-koncentrationen fra absorbansændringshastigheden som følger:

En ændringshastighed i absorption på 0,12 enheder / min svarer til 0,12 / 6220 = 1,93 x 10-5 mol / l / min ændring i NADH-koncentration. Volumenet i kuvetten var 0,8 ml, hvilket betyder, at ændringen i mængden af NADH var: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 mol/min. Volumenet af tilsat enzym var 60 μL, 3,46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5,76 x 10-7 mol NADH forbrugt / min / ml enzym.

Da der er et en-til-en-forhold mellem den forbrugte NADH og glukosen inkorporeret i glykogen, kan reaktionshastigheden udtrykkes som 5,76 x 10-7 mol glucose inkorporeret / min / ml.

Når proteinindholdet i enzymprøven er kendt, kan den specifikke enzymaktivitet udtrykkes som μmolglucoseinkorporeret/min/mg protein eller nmolglucoseinkorporeret/min/mg protein, alt efter hvad der er relevant.

Som nævnt i indledningen er protokollen let tilpasset til at måle aktiviteten af glykogensyntaser, der bruger ADP-glucose som glukosedonor. Dette opnås ved simpel substitution af UDP-glucose med ADP-glucose i reaktionsblandingen. Desuden udelades både NDP-kinase og ATP fra reaktionsblandingen, da ADP, der frigives under glykogensyntasevirkning, er et direkte substrat for pyruvatkinase.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative resultater fra assays af glykogensyntaseaktivitet. Spektrofotometeret var indstillet til at tage en aflæsning pr. minut i en samlet tid på 20 min. Panel A viser den forventede korte forsinkelsesfase efterfulgt af et lineært fald i absorbans med tiden (eksperimentel). Der var intet fald i absorptionen bemærket i kontrolreaktionen. Reaktionshastigheden beregnes ud fra hældningen af absorbansændringen i den lineære fase (fra 5 til 16 min). Panel B viser resultatet af tilsætning af for meget enzym. Her er NADH opbrugt inden for 2 min. Klik her for at se en større version af denne figur.

Bestemmelse af glykogenphosphorylaseaktivitet
Figur 2 viser repræsentative data fra et glykogenphosphorylaseassay ved anvendelse af oprenset enzym. Med præparatet, der blev brugt her, var analysen lineær i ca. 3 minutter. Indsatsen viser en regressionslinje trukket gennem punkterne fra tid 0 til 2,5 min. Hældningen af denne linje viser, at absorbansændringshastigheden er 0,022 absorbansenheder / min. En absorbansforøgelse på omkring 0,01 til 0,04 er optimal, da analysen vil afvige fra linearitet ganske hurtigt, hvis der er for meget enzym til stede. Hastigheden af NADPH-dannelse beregnes ud fra udryddelseskoefficienten, der ligesom NADH er 6220 M-1 cm-1. For hver 1 mol NADPH, der blev dannet, var der produceret en mol glucose-1-phosphat ved virkningen af glykogenphosphorylase. Enzymaktivitet kan derfor udtrykkes som mængden af glucose-1-phosphat frigivet fra glykogen pr. Tidsenhed efter en beregning svarende til den, der er skitseret ovenfor.

Reaktionsbetingelserne er let tilpasningsdygtige til de fosforylaser, der er følsomme over for allosterisk modulering. De nødvendige effektorer er simpelthen inkluderet i reaktionsmasterblandingen og erstatter noget af vandet. En vigtig advarsel er, at selve effektoren skal påvises ikke at påvirke aktiviteten af koblingsenzymerne, phosphoglucomutas og glucose-6-phosphat dehydrogenase.

Endelig, som med glykogensyntase beskrevet ovenfor, kan den type glykogen, der anvendes som substrat, påvirke reaktionshastigheden. Mens østersglykogen fungerer godt med fosforylaser fra mange arter, er det måske ikke altid det optimale valg.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater fra analyser af glykogenphosphorylaseaktivitet. Spektrofotometeret var indstillet til at tage en aflæsning hver 30. sek. i en samlet tid på 10 min. Der var en støt stigning i absorbansen registreret i nærvær af glykogenphosphorylase (eksperimentel), mens reaktionen uden tilsat phosphorylase forblev ved baseline (kontrol). Indsatsen viser en udvidelse af den indledende reaktionsperiode, hvilket viser lineariteten af produktdannelse med hensyn til tid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Bestemmelse af glykogenforgrenende enzymaktivitet
Dataene vist i figur 3 er repræsentative for et glykogenforgrenende enzymassay ved anvendelse af oprenset forgreningsenzym. På hvert tidspunkt blev ændringen i absorption, der opstod i fravær af tilsat forgreningsenzym (Kontrol), trukket fra ændringen i absorption, der opstod i nærvær af forgreningsenzym (reaktion). De resulterende absorbansværdier blev derefter plottet. Som ovenfor beregnes en ændringshastighed for NADPH-koncentration ud fra kurvens indledende hældning ved regressionsanalyse. I dette eksempel var stigningen i NADPH pr. tidsenhed lineær i 10 minutter med en hældning på 0,0079 absorbansenheder/min. Mens disse data er helt anvendelige, ville tilsætningen af lidt mindre enzym have givet en lavere hældning og tilladt en længere lineær fase. Alternativt kan yderligere aflæsninger foretages ved at fjerne alikvoter til måling ved 2 min og 7 min inkubation. Bestemmelse af afgreningsenzymaktivitet er meget ligetil, da der dannes 1 mol NADPH for hver 1 mol glucose, der frigives af α1,6-glucosidaseaktiviteten af forgreningsenzym. Således kan reaktionshastigheden udtrykkes som mængden af glucose frigivet fra phosphorylasegrænsedextrin pr. Tidsenhed efter samme type beregning som blev anvendt til glykogensyntase og phosphorylases-assays ovenfor.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater fra assays af glykogenforgrenende enzymaktivitet. Prøver af phosphorylase limit dextrin blev behandlet med debranching enzym i 5, 10, 20 eller 40 min. Stigningen i absorbans ved 340 nm, produceret som NADP blev reduceret til NADPH i et koblet enzymassay, blev målt i prøver taget på hvert af disse tidspunkter. Reaktionen viste en lineær fase, der varede i mindst 10 min. Klik her for at se en større version af denne figur.

Bestemmelse af glykogenforgreningsenzymaktivitet
Figur 4 viser data fra glykogenforgreningsenzymassays. På hvert af de angivne tidspunkter blev absorbansen af kontrol- og reaktionsprøverne målt. Absorbansen af reaktionsprøven ved 660 nm blev trukket fra absorbansen for den tilsvarende kontrolprøve, og absorbansforskellen blev plottet mod tiden. En regressionslinje blev derefter trukket gennem punkterne (panel A). Reaktionshastigheden kan udtrykkes som ændringen i absorbans ved 660 nm pr. Tidsenhed. Den maksimale ændring i absorbans, der kan forekomme i dette assay, er kun ~ 0,4 absorbansenheder, der repræsenterer maksimal forgrening af den tilsatte amylose af forgreningsenzymet (panel B). Desuden, når absorbansen af reaktionsrørene falder mere end ~ 0,2 absorbansenheder under kontrollens, er analysen ikke længere inden for det lineære område, og der kan ikke foretages nogen estimering af reaktionshastigheden (panel B).

Amylose, der anvendes som substrat i denne procedure, begynder at forlade opløsningen ganske let, hvis den køles eller fryses og derefter optøes. Derfor er det vigtigt at gøre amylosesubstratopløsningen frisk og sikre, at der ikke er dannet bundfald før brug.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater fra assays af glykogenforgreningsenzymaktivitet. Prøver af amylose blev behandlet med forgreningsenzym. Aliquots blev fjernet på de viste tidspunkter og tilsat til et syrnet jodreagens. Absorbansen af dannet amylose/jodkompleks blev derefter målt til 660 nm. De viste data repræsenterer forskellen i absorbans mellem kontrolinkubationer, der manglede forgreningsenzym og reaktioner, der indeholdt forgreningsenzym. Panel A viser et fald i absorbans ved 660 nm på grund af afgrenende enzymaktivitet, som var lineær i ~ 20 min. Panel B illustrerer det smalle dynamiske område af analysen, hvor den maksimale ændring i absorbans, der kan produceres, er ~ 0,4 absorbansenheder, og linearitet går tabt, når ændringen i absorption er ~ 0,2 absorbansenheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Kvalitativ vurdering af omfanget af glykogenforgrening
Amylose, amylopectin, phosphorylase limit dextrin, glykogen isoleret fra gær blev kombineret med jod/mættet calciumchloridopløsning, og absorptionsspektrene af de resulterende komplekser blev indsamlet (figur 5). Ved anvendelse af masserne af glykogen, amylopectin og amylose givet i protokollen beskrevet ovenfor skal den opnåede maksimale absorbansaflæsning være omkring 0,7 til 0,8, som vist her (panel A og B). Absorbansmaksima for amylose og amylopectin er henholdsvis omkring 660 nm og 500 nm og 385 nm. Phosphorylase limit dextrin blev inkluderet her, da indsamling af absorbansspektret af phosphorylase limit dextrin / jodkomplekser giver en hurtig kontrol af omfanget af phosphorylase fordøjelse opnået under fremstillingen af dette debranching enzymsubstrat. Glykogen fra de fleste kilder producerer to toppe, en ved ca. 400 nm og en anden top ved 460 nm (figur 5B). Skift til venstre i glykogens absorbansspektre indikerer øget forgrening / nedsat ydre kædelængde. Omvendt indikerer højresving nedsat forgrening/øget ydre kædelængde.

Den mættede calciumchloridopløsning er tæt, og de tilsatte glykogenprøver danner et lag på tværs af toppen, når de tilsættes. Derfor er omhyggelig blanding nødvendig for at opnå en homogen opløsning. Hertil kommer, at hvis de anvendte kulhydratprøver ikke er helt opløst, før de blandes med calciumchloridopløsningen, dannes der mørkfarvningsaggregater i kuvetten. Disse aggregater vil naturligvis hindre indsamling af et absorptionsspektrum, og det er vigtigt at sikre, at opløsningen i kuvetten er klar, før man fortsætter med målinger.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater fra den kvalitative vurdering af glykogenforgrening. Prøver af renset phosphorylase limit dextrin, amylopectin, amylose (panel A) eller glykogen (panel B) blev kombineret med jod/mættet calciumchloridopløsning, og absorptionsspektrene for de resulterende komplekser blev målt fra 330 nm til 800 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generelt er de vigtigste fordele ved alle de præsenterede metoder deres lave omkostninger, lethed, hastighed og manglende afhængighed af specialudstyr. Den største ulempe, som de alle deler, er følsomhed sammenlignet med andre tilgængelige metoder. Følsomheden af de procedurer, der involverer produktion eller forbrug af NADH/NADPH, er let at estimere. I betragtning af at udryddelseskoefficienten for NADH / NADPH er 6,22 M-1 cm-1, indikerer simpel aritmetik, at ~ 10-20 μM ændringer i koncentration let kan detekteres. Med de analysemængder, der er beskrevet i den aktuelle artikel, svarer dette til evnen til at måle mængder i intervallet ~10-20 nmol. Det er uden tvivl ret følsomt. Det er imidlertid muligt at justere den specifikke aktivitet af radioaktivt mærkede substrater, således at følsomheden ganske let kan øges ud over grænsen for de spektrofotometriske assays. Selvom forgreningsenzymanalysen og den kvalitative vurdering af glykogenforgrening begge er afhængige af dannelsen af komplekser mellem jod og α1,4-bundne glucosepolymerer, er outputtet fra hvert assay forskelligt, og deres følsomhed er ligeledes forskellig. Specifikke overvejelser for hvert af de beskrevne assays diskuteres nedenfor.

Bestemmelse af glykogensyntaseaktivitet
Det koblede enzymassay, der er beskrevet her, muliggør kontinuerlig assay af glykogensyntaseaktivitet, hvilket er nyttigt til bestemmelse af kinetiske parametre. Det er også let skalerbart, og der er beskrevet en meget lignende procedure til brug i mikrotiterplader, hvilket gør det muligt at foretage meget parallelle målinger af enzymaktivitet28. Vi bruger rutinemæssigt dette assay med rensede, rekombinante glykogensyntaser29. De beskrevne procedurer blev imidlertid oprindeligt udviklet til brug i vævshomogenater (se f.eks. Danforth10 og Leloir et al.9). En advarsel her er, at vævshomogenatet skal fortyndes korrekt inden brug. Fortyndingen er nødvendig for at reducere homogenatets turbiditet og interferens fra konkurrerende enzymer/substrater i homogenatet. For at tage højde for NADH-forbrug, der ikke er afhængig af glykogensyntaseaktivitet, bør blankreaktioner, der indeholder alle reaktionskomponenter undtagen UDP-glucose, medtages. Glykogensyntaseaktiviteten bestemmes derefter ved at trække ændringshastigheden i NADH-absorbans i fravær af UDP-glucose fra den, der opnås i nærvær af denne forbindelse.

Bestemmelse af glykogenphosphorylaseaktivitet
Ligesom glykogensyntaseanalysen kan den spektrofotometriske måling af phosphorylaseaktivitet udføres kontinuerligt, mens andre fosforylasassays stoppes assays13. Den kan også let tilpasses til brug i mikrotiterplader eller andre applikationer med høj kapacitet15. Igen kræver dets anvendelse med vævshomogenater passende fortynding for at reducere turbiditet / interfererende reaktioner. For eksempel er glucose-6-phosphat en ret rigelig metabolit, og dets tilstedeværelse i et vævshomogenat vil resultere i NADPH-produktion via glucose-6-phosphat dehydrogenasekoblingsenzymet uafhængigt af phosphorylaseaktivitet. Ved arbejde med vævshomogenater bør kontrolreaktioner, der indeholder passende fortyndet vævshomogenat og alle andre assaykomponenter undtagen fosfat og glykogen, medtages. Fosforylaseaktivitet beregnes derefter ved at trække NADPH-produktionen i fravær af glykogen/fosfat fra det, der forekommer i nærvær af disse forbindelser. Specifikke anbefalinger vedrørende den passende grad af fortynding af forskellige typer pattedyrvævsekstrakt findes i Mezl et al.13.

Bestemmelse af glykogenforgrenende enzymaktivitet
Selvom det her beskrives som et stoppet assay, kan denne procedure let tilpasses og udføres kontinuerligt16. Da analysen er afhængig af produktion af glucose, skal dets anvendelse i rå vævsekstrakter overveje frigivelse af glucose fra phosphorylase limit dextrin af andre enzymer end forgrenet enzym og generering af glucose ved virkningen af sådanne enzymer på endogent glykogen til stede i vævsekstraktet. Spørgsmålet om endogent glykogen behandles let med en kontrolreaktion, hvortil der ikke tilsættes phosphorylasegrænsedextrin. Tilstedeværelsen af andre α-glucosidase-aktiviteter kan estimeres i parallelle reaktioner, hvor maltose, snarere end phosphorylasegrænsedextrin, er til stede som et substrat.

Bestemmelse af glykogenforgreningsenzymaktivitet
Af de forskellige kvantitative assays, der diskuteres, er det kolorimetriske forgreningsenzymassay langt det mindst følsomme. Faktisk er det blevet anslået, at følsomheden er omkring 50-100 gange mindre end den, der opnås med den radiokemiske metode, hvor stimulering af glykogenphosphorylasereaktionen ved tilsætning af forgreningsenzym måles21. I lighed med det forgrenede enzymassay er forgreningsenzymassayet også følsomt over for tilstedeværelsen af forurenende glucosidaseaktiviteter, da fordøjelsen af amylose vil påvirke jodbindingen. Nogle løsninger er blevet foreslået for at tillade brugen af assays svarende til det, der er beskrevet her i nærvær af forurenende glucosidaseaktiviteter30. Efter vores opfattelse er denne analyse imidlertid bedst egnet til undersøgelse af oprensede eller delvist oprensede glykogenforgreningsenzymer, hvor sådanne interfererende aktiviteter er minimale eller fraværende.

Kvalitativ vurdering af omfanget af glykogenforgrening
Den detaljerede analyse af glykogenforgrening er ret besværlig og involverer typisk en kombination af enzymatisk fordøjelse, kemisk modifikation og en række separationsteknikker til analyse af de genererede produkter31. Mens det kolorimetriske assay, der er beskrevet her, tydeligvis ikke kan give sammenlignelige oplysninger om glykogens fine struktur, giver det et simpelt og hurtigt mål for mere eller mindre forgrening. Desuden indeholder de opnåede spektre nogle yderligere oplysninger. For eksempel, som diskuteret under repræsentative resultater, er prøver af glykogen typisk til stede med absorbanstoppe ved ~ 400 nm og ~ 460 nm. Toppen ved ~ 400 nm repræsenterer tilsyneladende korte ydre kæder i glykogenpartikler, da den er forbedret i glykogen isoleret fra gærmutanter, der mangler forgreningsenzym i forhold til vildtypegær 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er ingen kendte interessekonflikter forbundet med dette arbejde, og der har ikke været nogen økonomisk støtte til dette arbejde, der kunne have påvirket dets resultat.

Acknowledgments

Forfatteren vil gerne takke Karoline Dittmer og Andrew Brittingham for deres indsigt og mange nyttige diskussioner. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 og 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Tags

Biokemi udgave 174
Spektrofotometriske metoder til undersøgelse af eukaryot glykogenmetabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter