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Neuroscience

क्रायो-अनुभाग सटीक और गहरी मात्रात्मक Proteome विश्लेषण के लिए वयस्क Subependymal क्षेत्र के विच्छेदन

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/63047
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4
1Division of Physiological Genomics, Biomedical Center, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, 3SYNERGY, Excellence Cluster Systems Neurology, University of Munich, 4Department of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन गहरी मात्रात्मक proteome विश्लेषण के लिए मुरीन मस्तिष्क में सबसे बड़े न्यूरोजेनिक आला की ताजा, जमे हुए तैयारी की अनुमति देता है। विधि सटीक, कुशल है, और न्यूनतम ऊतक गड़बड़ी का कारण बनती है। इसलिए, यह आदर्श रूप से इस आला के आणविक माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ-साथ अन्य अंगों, क्षेत्रों और प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

Abstract

Subependymal neurogenic आला पार्श्व वेंट्रिकल के पार्श्व वेंट्रिकुलर दीवार के एक पैरावेंट्रिकुलर रिबन के होते हैं। Subependymal क्षेत्र (SEZ) एक पतला और अलग क्षेत्र है जो निलय और मस्तिष्कमेरु द्रव के संपर्क में है। इस आला का अलगाव एक न्यूरोजेनिक स्टेम सेल माइक्रोएन्वायरमेंट के विश्लेषण की अनुमति देता है। हालांकि, proteome विश्लेषण के लिए छोटे ऊतकों का निष्कर्षण चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से काफी माप गहराई के रखरखाव और विश्वसनीय मजबूती की उपलब्धि के लिए। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए न्यूनतम ऊतक गड़बड़ी के साथ उच्च परिशुद्धता का संयोजन करते हुए क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन (सीएसडी) नामक एक नई विधि विकसित की गई थी। यह विधि अत्याधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विधियों के साथ संगत है जो कम प्रचुर मात्रा में आला नियामकों का पता लगाने की अनुमति देती है। इस अध्ययन ने सीएसडी और इसके प्रोटिओम डेटा की तुलना लेजर-कैप्चर-माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) और एक मानक होलमाउंट विच्छेदन द्वारा प्राप्त विधि और डेटा से की। सीएसडी विधि के परिणामस्वरूप एलसीएम की तुलना में आधे से भी कम तैयारी के समय में दो बार परिमाणीकरण गहराई हुई और साथ ही साथ स्पष्ट रूप से पूरेमाउंट विच्छेदन के विच्छेदन परिशुद्धता को बेहतर बनाया गया। इसलिए, सीएसडी प्रोटिओम विश्लेषण के लिए एसईजेड एकत्र करने के लिए एक बेहतर तरीका है।

Introduction

जैसा कि न्यूरोजेनेसिस वयस्क मस्तिष्क में प्रतिबंधित है, विभिन्न केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की मरम्मत रणनीतियों को वयस्क तंत्रिका प्रतिस्थापन के आधार की बढ़ती समझ से बहुत लाभ होगा। कृन्तकों ने हमें प्रसवोत्तर न्यूरोजेनेसिस के बुनियादी तंत्र को समझने में मदद की है, हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वयस्क न्यूरोजेनेसिस बहुत अधिक प्रजातियों पर निर्भर है। चूहों में, तीन वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) niches हैं। हाइपोथैलेमस न्यूरोजेनिक क्षमता 1,2 के साथ एक वयस्क एनएससी आला है, जबकि निरंतर वयस्क न्यूरोजेनेसिस मुख्य रूप से हिप्पोकैम्पस 3 और पार्श्व वेंट्रिकल्स 4,5,6 की पार्श्व दीवारों के एसईजेड तक सीमित है। SEZ सबसे बड़ा जर्मिनल क्षेत्र है जिसमें NSC (प्रकार बी कोशिकाएं) शामिल हैं जो पारगमन-प्रवर्धित पूर्वज कोशिकाओं (प्रकार सी कोशिकाओं) के माध्यम से न्यूरोब्लास्ट्स (प्रकार ए कोशिकाओं) में विकसित होते हैं। एसईजेड में टाइप बी कोशिकाओं का 20-35%, टाइप सी कोशिकाओं का 1-15%, टाइप ए कोशिकाओं का 1-30% और एपेंडिमल कोशिकाओं का 25-50% होता है। एसईजेड में एंडोथेलियल कोशिकाओं, माइक्रोग्लियल कोशिकाओं और एपिंडिमल कोशिकाओं के साथ एक जटिल माइक्रोआर्किटेक्चर होता है, जो स्टेम सेल niche8,9,10 में रहते हैं और प्रभावित करते हैं। यद्यपि सेज में न्यूरॉन्स दुर्लभ हैं, फिर भी दूर के स्रोतों से निकलने वाले अक्षतंतु जैसे स्ट्रिएटम, वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र, या हाइपोथैलेमस टाइप बी कोशिकाओं तक पहुंचते हैं और प्रभावित करते हैं। इस स्टेम सेल आला की एक अनूठी विशेषता प्रसार की साइट और भेदभाव की साइट के बीच अलगाव है। प्रसार के बाद, न्यूरोनल पूर्वज एसईजेड से घ्राण बल्ब में कई मिलीमीटर स्थानांतरित करते हैं, जहां वे न्यूरॉन्स में अंतर करते हैं और पहले से मौजूद तंत्रिका सर्किट में एकीकृत होते हैं। न्यूरोजेनेसिस से जुड़े सेल-आंतरिक कार्यक्रमों की जांच ने पहले से ही प्रयोगात्मक चिकित्सीय सेल रीप्रोग्रामिंग और प्रत्यारोपण रणनीतियों के लिए महत्वपूर्ण ज्ञान प्रदान किया है15,16,17,18,19,20। हालांकि, सेल-बाह्य संकेत न्यूरोजेनेसिस को भी विनियमित करते हैं, और ऊतक वातावरण स्टेम कोशिकाओं के न्यूरोजेनिक भाग्य को निर्धारित कर सकते हैं11,12,14,21,22,23। नतीजतन, न्यूरोजेनिक niches के माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच और स्टेम कोशिकाओं के साथ इसकी बातचीत महत्वपूर्ण महत्व की है।

बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) और अन्य स्रावित प्रोटीन माइक्रोएन्वायरमेंट का एक बड़ा हिस्सा हैं। सटीक पहचान और परिमाणीकरण के लिए, ईसीएम 24,25 के लिए ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीन के स्तर के बीच कम सहसंबंध के कारण ईसीएम संरचना निर्धारित करने के लिए एक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण एक ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोण की तुलना में बेहतर अनुकूल है। इसके अलावा, इस बात के पर्याप्त सबूत हैं कि एसईजेड में आला नियामकों को विशेष रूप से आला को पॉप्युलेट करने वाली कोशिकाओं द्वारा उत्पादित नहीं किया जाता है। अधिक दूर के स्थान, जैसे कि कोरॉइड प्लेक्सस, मस्तिष्कमेरु द्रव 22,23 के माध्यम से स्टेम कोशिकाओं को प्रेषित मॉड्यूलेटरी संकेतों को स्रावित करते हैं। आला proteome की जांच करने से उनके उत्पादन स्थल से स्वतंत्र आला में मौजूद आला नियामकों की पहचान करने में मदद मिल सकती है, यह देखते हुए कि बाह्य कोशिकीय माइक्रोएन्वायरमेंट का एक बड़ा हिस्सा प्रोटीन द्वारा इकट्ठा किया जाता है।

निष्पक्ष प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए मुरीन वेंट्रिकुलर ज़ोन को इकट्ठा करने के लिए, उच्च परिशुद्धता के साथ एक विधि की आवश्यकता होती है, जो आसन्न स्ट्रिएटम के ऊतक को छोड़कर स्टेम कोशिकाओं वाले सीए 50 μm पतले पैरावेंट्रिकुलर रिबन को कैप्चर करती है। इसके अलावा, विच्छेदन के दौरान ऊतक की गड़बड़ी को बाह्य कोशिकीय माइक्रोएन्वायरमेंट का विश्लेषण करने के लिए न्यूनतम किया जाना चाहिए क्योंकि घुलनशील प्रोटीन, विकास कारकों या साइटोकिन्स सहित, आसानी से धोया जा सकता है। यद्यपि निश्चित ऊतक के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करना संभव है, आवश्यक एजेंट, जैसे कि पैराफॉर्मेल्डिहाइड, प्रोटीन पहचान की गहराई को कम कर देगा और पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को पेश कर सकता है। एक आम wholemount SEZ विच्छेदन, उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के संग्रह के लिए, कैंची 26 के साथ पूरे एसईजेड को हटा देता है। यह मानक विच्छेदन न्यूनतम ऊतक गड़बड़ी के साथ तेजी से होता है। हालांकि, नमूनों के स्ट्रिएटल संदूषण से बचा नहीं जा सकता है। इसके विपरीत, एलसीएम में बेहतर विच्छेदन परिशुद्धता का उत्कृष्ट लाभ है। हालांकि, एलसीएम ऊतक की गड़बड़ी का परिचय दे सकता है, उदाहरण के लिए, पृष्ठभूमि धुंधला या लेजर के कारण प्रोटीन विकृतीकरण के कारण। होलमाउंट विच्छेदन और एलसीएम की ताकत को संयोजित करने के लिए, एक उपन्यास विधि जो एमएस के साथ संगत है, जिसे क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन (सीएसडी) कहा जाता है, विकसित किया गया था (चित्रा 1 ए-डी)। सीएसडी सेज के निष्कर्षण और पार्श्व वेंट्रिकल्स (एमईजेड) की औसत दर्जे की दीवारों के एसईजेड के विच्छेदन की अनुमति देता है, जो एसईजेड के लिए एक आदर्श, ज्यादातर गैर-न्यूरोजेनिक नियंत्रण क्षेत्र है (प्रोटोकॉल देखें)। सीएसडी और अत्याधुनिक एमएस विधियों के संयोजन से प्राप्त आला proteome इस वयस्क NSC niche25 में उपन्यास नियामकों के लक्षण वर्णन और पहचान के लिए उपयोगी साबित हुआ। इसलिए, यह विधि एसईजेड ऊतक प्रोटीन संरचना के निर्धारण के लिए उपयोगी होगी।

Protocol

इस अध्ययन में सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को जर्मन और यूरोपीय संघ के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और संस्थागत पशु देखभाल समिति और ऊपरी बवेरिया (Regierung von Oberbayern) की सरकार द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगों के लिए 8-10 सप्ताह की उम्र के बीच केवल पुरुष C57Bl6 चूहों का उपयोग किया गया था।

1. माउस मस्तिष्क की तैयारी (~ माउस प्रति 15 मिनट)

  1. 1 M HEPES (अंतिम सांद्रता 10 mM) के 5 mL को 1x हैंक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 500 mL को जोड़कर विच्छेदन माध्यम तैयार करें।
    नोट:: विच्छेदन माध्यम (+4 °C) का संग्रहण समय 2 सप्ताह से अधिक नहीं होना चाहिए.
  2. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा चूहों का बलिदान करें और मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें।
    नोट: ईसीएम की जांच करते समय, ऊतक को अधिमानतः असंशोधित किया जाना चाहिए। सर्वाइकल अव्यवस्था विच्छेदन समय को यथासंभव कम रखती है, जिससे जितना संभव हो सके पोस्ट-नश्वर एंजाइमेटिक ऑटोडाइजेशन को रोका जा सकता है। यदि रक्त को हटाना अनुसंधान प्रश्न के लिए महत्वपूर्ण है, तो मस्तिष्क को हटाने से पहले माउस को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ ट्रांसकार्डियल रूप से पारफ्यूज करें।
  3. मैन्युअल विच्छेदन द्वारा मस्तिष्क को निकालें और इसे बर्फ-ठंडे विच्छेदन माध्यम वाले एक संस्कृति पकवान में रखें (चित्रा 1 बी - 1)।
    नोट: विच्छेदन के दौरान बर्फ पर विच्छेदन माध्यम में दिमाग रखें।
  4. ओबी और कॉर्टेक्स के पूर्वकाल ध्रुव के बीच एक सीधे कोरोनल कट द्वारा एक स्केलपेल (चित्रा 1 बी - 2) के साथ घ्राण बल्ब (ओबी) को हटा दें।
  5. कोरोनल विमान में पार्श्व वेंट्रिकल्स को दिखाई देने के लिए कोरोनल कट का उपयोग करके स्केलपेल के साथ कॉर्टेक्स के पूर्वकाल ध्रुव को हटा दें (चित्रा 1 बी - 3)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कोरोनल कट ऑप्टिक चियास्म से ~ 5 मिमी rostrally बनाया गया है; अन्यथा, एसईजेड / एमईजेड का रोस्ट्रल हिस्सा खो जाएगा।
  6. कैंची का उपयोग करते हुए, शीर्ष से दोनों पार्श्व वेंट्रिकल्स खोलें, कॉर्टिकल सतह से वेंट्रिकुलर लुमेन तक एक सैगिटल सेक्शन से शुरू करें, और वेंट्रिकुलर फ्लेक्सियन (चित्रा 1 बी - 4) के बाद सी-आकार के तरीके से इस कटौती को लंबा करें।
  7. कैंची के साथ एक अतिरिक्त कोरोनल कट के माध्यम से बाएं और दाएं सैगिटल चीरा के पुच्छल सिरों को कनेक्ट करें।
    नोट: तीन कटौती अब एक trapezoid फार्म और अगले कदम में प्रांतस्था और कॉर्पस callosum को हटाने की सुविधा होगी.
  8. संदंश का उपयोग करके पार्श्व वेंट्रिकल्स को कवर करने वाले कॉर्टेक्स और कॉर्पस कॉलोसम को हटा दें (चित्रा 1 बी - 5)। फिर, कॉर्टेक्स और कॉर्पस कैलोसम को हटा दें जो औसत दर्जे के वेंट्रिकुलर दीवारों को कवर करते हैं। यहां, अतिरिक्त कटौती करें यदि ऊतक औसत दर्जे के वेंट्रिकुलर दीवारों से जुड़ा हुआ है, या ऊतक को हटाने के लिए कैंची के साथ कॉर्टेक्स और कॉर्पस कैलोसम को बस उठाता है।
  9. संदंश के साथ वेंट्रिकुलर दीवारों को सावधानीपूर्वक फैलाएं (चित्रा 1 बी - 6)। संदंश के साथ choroid जाल निकालें.
    नोट: कोरॉइड प्लेक्सस का पूर्ण निष्कासन निम्नलिखित विच्छेदन चरणों के साथ हस्तक्षेप से बचने और एसईजेड / एमईजेड नमूनों के संभावित संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  10. मस्तिष्क को कांच की स्लाइड पर रखें और मस्तिष्क को फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ के शीर्ष पर ग्लास स्लाइड रखें। खुले विन्यास में वेंट्रिकुलर दीवारों को बनाए रखें।
    नोट: सेज और एमईजेड के सटीक और अनन्य विच्छेदन की सुविधा के लिए वेंट्रिकल की पार्श्व और औसत दर्जे की दीवारों के बीच पर्याप्त दूरी सुनिश्चित करें। यदि ऊतक एक बंद विन्यास में वापस अनुबंध करता है, तो ठंड के दौरान वांछित स्थिति में दीवारों को ठीक करने के लिए संदंश का उपयोग करें। SEZ/MEZ को किसी भी नुकसान से बचें। न्यूनतम बल लागू करने का प्रयास करें, मुख्य रूप से खुले वेंट्रिकल के शीर्ष किनारे पर।

2. तैयार मस्तिष्क के सेक्शनिंग (~ माउस प्रति 15 मिनट)

  1. क्रायोस्टेट का उपयोग करके पार्श्व वेंट्रिकल के अंत तक मस्तिष्क के 50-100 μm मोटे कोरोनल वर्गों को काटें और ग्लास स्लाइड पर वर्गों को माउंट करें। सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क ओसीटी माध्यम के साथ हिंदब्रेन पर क्रायोस्टेट अनुलग्नक प्लेट से जुड़ा हुआ है और यह कि कोई भी ओसीटी फोरब्रेन के संपर्क में नहीं आता है, विशेष रूप से वेंट्रिकल्स में।
    नोट: OCT माध्यम एमएस माप के साथ हस्तक्षेप करेगा। हालांकि, अगर ऊतक का उपयोग एंटीबॉडी परख के लिए किया जाएगा, तो ओसीटी माध्यम को बाहर करना अनावश्यक है। लेपित कांच स्लाइड के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है। लेपित स्लाइड ऊतक पर बहुत अधिक चिपकने वाला बल लागू करते हैं, जिससे निम्नलिखित चरणों में स्लाइड से ऊतक नमूने के स्थानांतरण को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में बाधित किया जाता है।

3. मस्तिष्क स्लाइस के नि: शुल्क हाथ विच्छेदन (~ माउस प्रति 30 मिनट)

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 C - 1) के तहत सूखी बर्फ पर मस्तिष्क वर्गों के साथ ग्लास स्लाइड रखें।
  2. सूखी बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें, और सुनिश्चित करें कि ट्यूब नमूना हस्तांतरण से पहले पर्याप्त रूप से ठंडा होने के लिए कम से कम 1 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर रहें।
    नोट: उच्च गुणवत्ता के microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें, के रूप में कुछ कम गुणवत्ता ट्यूबों एमएस माप के साथ जुड़े बाद के ऊतक पाचन चरणों में प्लास्टिक शेड कर सकते हैं.
  3. 15-30 s के लिए सूखी बर्फ से स्लाइस उठाएं ताकि एक संक्षिप्त, अपूर्ण पिघलने को प्राप्त किया जा सके ताकि स्ट्रिएटम के कॉम्पैक्ट माइलिन को घने सफेद डॉट्स के रूप में देखा जा सके।
    नोट: SEZ और striatum के बीच की सीमा का पता लगाना संभव हो जाता है (चित्रा 1C - 2, माइलिन के बहिष्करण के लिए चित्रा 2A देखें और wholemount विधि के साथ तुलना)। यदि पिघलने में बहुत लंबा समय लगता है, तो ग्लास स्लाइड के विपरीत तरफ एक दस्ताने से ढकी उंगली को दबाकर प्रक्रिया को तेज किया जा सकता है। हालांकि, इस पैंतरेबाज़ी का अभ्यास किया जाना चाहिए क्योंकि अत्यधिक पिघलना आसानी से होता है।
  4. आसन्न striatum (चित्रा 1C, D) से एक precooled scalpel के साथ SEZ को अलग करें।
  5. SEZ को या तो एक पूरे टुकड़े के रूप में स्थानांतरित करें या ठंडा scalpel के कुंद किनारे का उपयोग करके एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 2-4 भागों में विभाजित करें। यदि ऊतक का उपयोग एमएस के अलावा किसी अन्य प्रकार के विश्लेषण के लिए किया जाना है, तो ऊतक के नमूने को इसके बजाय उपयुक्त कंटेनर में स्थानांतरित करें (उदाहरण के लिए, एक 96-अच्छी तरह से प्लेट)।
    नोट: पूरी तरह से जमे हुए ऊतक को काटने से ऊतक तेजी से टूट सकता है और स्लाइड से गिर सकता है। पूरी तरह से पिघले हुए ऊतक को काटने से ऊतक का विघटन होता है। सुनिश्चित करें कि ऊतक न तो पूरी तरह से जमे हुए है और न ही पूरी तरह से पिघला हुआ है।

Representative Results

उपर्युक्त चरणों का पालन करते समय, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ऊतक के नमूने एमएस नमूना तैयारी के लिए तैयार और संगत होते हैं। नमूना तैयारी के बाद, हमने प्रति माउस सेज या एमईजेड के प्रति नमूने पेप्टाइड्स के ~ 5-7 μg प्राप्त किए। हालांकि, पेप्टाइड्स की अंतिम मात्रा एमएस तैयारी विधि पर निर्भर हो सकती है। नीचे दिए गए प्रोटिओम तुलनाओं में, प्रोटीन की पहचान और परिमाणीकरण गहराई (प्रति नमूना 500-1,000 प्रोटीन) को प्रत्येक ऊतक क्षेत्र 25,27 के लिए बनाए गए पेप्टाइड स्पेक्ट्रा पुस्तकालयों के लिए कम्प्यूटेशनल रूप से मिलान करके बढ़ाया गया था। विशेष रूप से, पेप्टाइड स्पेक्ट्रा पुस्तकालयों के निर्माण के लिए यहां उपयोग की जाने वाली हानि-कम नैनो फ्रैक्शनेशन विधि वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है। कच्चे एमएस डेटा का विश्लेषण MaxQuant software28 का उपयोग करके किया गया था, जो प्रति अरब रेंज 29 भागों में बड़े पैमाने पर सटीकता प्राप्त करता है। अधिकतम क्वांट वातावरण MS रन के बीच मिलान की अनुमति देता है। प्रोटीन बहुतायत को एक लेबल-मुक्त परिमाणीकरण एल्गोरिथ्म 30 का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग ताजा जमे हुए ऊतकों पर किया गया था और जैसा कि पहले बताया गया था25 (सामग्री की तालिका देखें)।

क्रायो-अनुभाग-विच्छेदन
वयस्क चूहों (एन = 4) के पूर्ण एसईजेड और एमईजेड को सीएसडी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था ( चित्रा 1 और प्रोटोकॉल देखें)। somatosensory प्रांतस्था (Cx) सर्जिकल कैंची के साथ विच्छेदित किया गया था। अतिरिक्त 4 चूहों को उसी तरह से विच्छेदित किया गया था; हालांकि, विच्छेदित ऊतक को प्रति क्षेत्र एक नमूने में पूल किया गया था ताकि व्यक्तिगत नमूनों में प्रोटीन की पहचान और परिमाणीकरण में वृद्धि के लिए प्रोटिओम लाइब्रेरी (10,923 की पहचान की गई प्रोटीन) बनाई जा सके। चार अलग-अलग नमूनों में, (एसडी ± मतलब) 6,673 ± 317.4 प्रोटीन को एसईजेड में और 6,747 ± एमईजेड में 37.7 प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई थी। सभी एमएस प्रोटिओमिक्स डेटा प्राइड 31 पार्टनर रिपॉजिटरी के माध्यम से ProteomeXchange कंसोर्टियम में जमा किए गए थे, और यहां रिपोर्ट किए गए proteomes के लिए परिग्रहण संख्या प्रोटिओमएक्सचेंज है: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org)।

Wholemount विच्छेदन की तुलना
होलमाउंट विच्छेदन एक मानक प्रोटोकॉल 26 के अनुसार किया गया था। होलमाउंट विच्छेदन ने सीएसडी 25 की तुलना में समान संख्या में प्रोटीन (एसईजेड के लिए लगभग 6,000 और सीएक्स के लिए 6,000, एन = 4 प्रति समूह) का खुलासा किया। सेज के लिए सीएसडी का उपयोग करने के इच्छित सुधारों में से एक, एक संपूर्ण विच्छेदन प्रोटोकॉल के बजाय, संभावित स्ट्रिएटल संदूषण में कमी है। किसी अन्य क्षेत्र से ऊतक से दूषित एसईजेड नमूनों में, पता लगाए गए उम्मीदवार प्रोटीन को किसी क्षेत्र में आवंटित नहीं किया जा सकता है क्योंकि महत्वपूर्ण संवर्धन ब्याज के क्षेत्र और दूषित के परिणामस्वरूप हो सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से, माइलिन से जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन (एमएजी) सकारात्मक माइलिन-समृद्ध आंतरिक कैप्सूल को स्ट्रिएटम के होलमाउंट नमूनों में पहचाना गया था, लेकिन शायद ही कभी सीएसडी नमूनों में (चित्रा 2 ए)। होलमाउंट नमूनों में स्ट्रिएटल संदूषण की पुष्टि सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स (सीएक्स) ग्रे मैटर (जीएम) नमूनों (चित्रा 2 बी) की तुलना में एसईजेड में माइलिन प्रोटीन के संवर्धन की पहचान करके की जा सकती है। ध्यान दें कि Cx GM के बड़े हिस्से, विशेष रूप से ऊपरी Cx परतें, unmyelinated32 हैं।

जैसा कि बड़े फाइबर बंडल स्ट्रिएटम से गुजरते हैं, इस क्षेत्र द्वारा संदूषण के परिणामस्वरूप सीएक्स की तुलना में माइलिन प्रोटीन का संवर्धन हुआ। एसईजेड नमूनों में स्ट्रिएटल संदूषण के लिए मार्कर के रूप में उपयोग किए जाने वाले माइलिन प्रोटीन माइलिन मूल प्रोटीन (एमबीपी), माइलिन से जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन (एमएजी), प्रोटिओलिपिड-प्रोटीन 1 (पीएलपी 1), और 2', 3'-चक्रीय-न्यूक्लियोटाइड 3'-फॉस्फोडिएस्टेरेज़ (सीएनपी) थे। Cx की तुलना में SEZ में सभी माइलिन-मार्कर प्रोटीन काफी समृद्ध थे। इसके विपरीत, CSD डेटासेट में चार माइलिन मार्कर प्रोटीन की तुलना में Cx (चित्रा 2B) से SEZ की तुलना करते समय कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला। striatum33 के प्रोटिओमिक डेटा इस परिकल्पना का समर्थन करता है कि होलमाउंट विच्छेदन के एसईजेड नमूनों में माइलिन प्रोटीन का संवर्धन स्ट्रिएटल ऊतक के साथ संदूषण के कारण हुआ था। इसलिए, सीएसडी ने बड़े पैमाने पर एक होलमाउंट विच्छेदन की तुलना में स्ट्रिएटल ऊतक (कॉम्पैक्ट माइलिन में समृद्ध) द्वारा संदूषण को रोका।

गैर-विघटित ऊतक का निष्पक्ष प्रोटिओम विश्लेषण दिलचस्प बाह्य कोशिकीय प्रोटीन को प्रकट कर सकता है। सीएसडी का उपयोग करके बेहतर विच्छेदन के साथ, होलमाउंट नमूनों (चित्रा 2 सी, एनोटेशन संवर्धन परीक्षण) की तुलना में नमूनों में एक्स्ट्रासेल्युलर-संबद्ध प्रोटीन काफी समृद्ध थे। सीएसडी और होलमाउंट विच्छेदन जीन आंटोलॉजी (जीओ) शब्दों "एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकुलर एक्सोसोम" और "एक्स्ट्रासेल्युलर क्षेत्र भाग" का एक तुलनीय संवर्धन प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, गो शब्द "Matrisome-associated" सीएसडी में होलमाउंट विच्छेदन की तुलना में थोड़ा अधिक समृद्ध है। तदनुसार, ईसीएम क्रॉस-बाइंडिंग एंजाइम और हाल ही में खोजे गए न्यूरोजेनेसिस नियामक ट्रांसग्लूटामिनेस -2 (टीजीएम 2) को सीएसडी 25 का उपयोग करके सीएक्स की तुलना में एसईजेड में समृद्ध पाया गया था। इसके विपरीत, सेज और सीएक्स नमूनों के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया था जो पूरेमाउंट विच्छेदन (चित्रा 2 डी) द्वारा प्राप्त किया गया था। striatum33 के प्रोटिओमिक डेटा इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि पूरेमाउंट विच्छेदन द्वारा न्यूरोजेनेसिस नियामक Tgm2 का पता लगाना स्ट्रिएटल ऊतक के साथ संदूषण से बाधित था। इसलिए, कुल मिलाकर, क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन आला-विशिष्ट प्रोटिओम विश्लेषण के लिए मानक विच्छेदन के लिए एक सफल लेकिन आवश्यक सुधार भी है।

लेजर-कैप्चर-माइक्रोस्कोपी की तुलना
SEZ के सामने का आधा हिस्सा और 3 वयस्क चूहों के MEZ को LCM (चित्रा 3A) के लिए प्राप्त किया गया था। कुल मिलाकर, एलसीएम विधि कुछ नुकसान प्रदर्शित करती है, विशेष रूप से ऊतक की गड़बड़ी और दक्षता के बारे में। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत ब्याज के क्षेत्र की कल्पना करने के लिए, पृष्ठभूमि धुंधला होना आवश्यक है, संभावित रूप से ब्याज के छोटे या घुलनशील प्रोटीन को धोना, उदाहरण के लिए, विकास कारक, साइटोकिन्स, या ईसीएम नियामक जैसे एंजाइम। इसके अलावा, स्लाइड लेजर हटाने के दौरान कमरे के तापमान पर अलग-अलग समय बिताते हैं। इसके अलावा, लेजर स्वयं ब्याज के प्रोटीन को डीनेचर कर सकता है।

विच्छेदन करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास के बारे में एलसीएम पर सीएसडी का काफी लाभ है: प्रोटोकॉल के चरण 1 को सीएसडी और एलसीएम दोनों के लिए समान रूप से किया जाना चाहिए; इस कदम के बिना, वेंट्रिकुलर दीवारें अनुयायी बनी रहती हैं, जिससे एमईजेड और एसईजेड नमूनों का पृथक्करण मुश्किल हो जाता है। यह देखते हुए कि सीएसडी अनुभाग (100 μm) LCM वर्गों (15 μm), चरण 2 (मस्तिष्क के अनुभाग) और चरण 3 (प्रत्येक कोरोनल अनुभाग से MEZ और SEZ को हटाने) की अधिकतम मोटाई 34 की तुलना में 6-7 गुना मोटे हैं, LCM के लिए कम से कम 6-7 गुना अधिक समय लगेगा। आवश्यक पृष्ठभूमि धुंधला और लेजर माइक्रोस्कोप की स्थापना अतिरिक्त समय की खपत होगी. यहां, सीएसडी द्वारा 4 जानवरों के एसईजेड और एमईजेड के 100% की तुलना में एलसीएम द्वारा 3 जानवरों के एसईजेड और एमईजेड के 50% की कटाई करने में तीन गुना अधिक समय लगा, जो सीएसडी के आठ गुना गति लाभ का गठन करता है। संक्षेप में, एलसीएम को न केवल अतिरिक्त प्रयास की एक उल्लेखनीय राशि की आवश्यकता होती है, बल्कि ऊतक को हेरफेर और तापमान परिवर्तनों की काफी लंबी अवधि के अधीन भी किया जाता है जो बाद के विश्लेषण द्वारा उत्पन्न डेटा की गतिशीलता और विश्वसनीयता से समझौता कर सकते हैं।

सीएसडी के एमएस परिणामों की तुलना लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) के परिणामों से की गई थी। दोनों डेटासेट को सीएसडी नमूनों को पूल करके उत्पन्न प्रोटिओमिक लाइब्रेरी से मिलान किया गया था। औसतन, एलसीएम ने 3,441 ± 270.0 और 3,613 ± एसईजेड और औसत दर्जे के वेंट्रिकुलर क्षेत्र में क्रमशः 238.7 व्यक्तिगत प्रोटीन प्राप्त किए (चित्रा 3 बी)। प्रोटीन की पहचान में उल्लेखनीय अंतर को देखते हुए, मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) ने विच्छेदन विधि (घटक 1: 62.7%, नहीं दिखाया गया है) के अनुसार अलग-अलग अलगाव प्रदर्शित किया। घटक 2 ने LCM नमूनों (8.5%, चित्रा 3C) के बीच SEZ और MEZ के लिए सबसे बड़ा पृथक्करण प्रदर्शित किया। घटक 3 भी एलसीएम और सीएसडी को अलग करने के लिए लगता है; हालांकि, यह अंतर पहचाने गए प्रोटीन (6.4%) की संख्या के बजाय विधि-आधारित अंतर के परिणामस्वरूप हो सकता है। फिर भी, समग्र क्षेत्रीय अलगाव क्रायो-विच्छेदन डेटा के लिए आश्चर्यजनक रूप से अलग रहा और एलसीएम की तुलना में काफी बेहतर रहा। डेटा गतिशीलता में यह विसंगति लेजर विच्छेदन के दौरान कमरे के तापमान पर नमूनों द्वारा बिताए गए अलग-अलग समय या बाद के प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल और मास स्पेक्ट्रोमेट्री माप में परिवर्तनशीलता के लिए छोटे ऊतक की उच्च संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप हो सकती है।

ईसीएम के प्रोटिओम प्रोफ़ाइल में अंतर की खोज करने के लिए, सीएसडी और एलसीएम के बीच एक 2 डी एनोटेशन संवर्धन परीक्षण एसईजेड और एमईजेड (चित्रा 3 डी) के लिए किया गया था। एलसीएम और सीएसडी नमूनों के बीच जीओ शब्दों के सापेक्ष संवर्धन की गणना करने से ऊतक की असमान मात्रा और विच्छेदन प्रोटोकॉल में अंतर के बावजूद दो तरीकों के बीच ईसीएम प्रोटीन क्लस्टर के सापेक्ष प्रोटिओम गतिशीलता की तुलना की जा सकती है। भूखंडों से एलसीएम और सीएसडी के बीच एक अच्छा संबंध प्रकट होता है। एनोटेशन "एक्स्ट्रासेल्युलर रीजन पार्ट" और "एक्स्ट्रासेल्युलर मेम्ब्रेन-बाउंड ऑर्गेनेल" समान रूप से दोनों तरीकों और क्षेत्रों में समृद्ध होते हैं। इसलिए, एलसीएम की बढ़ी हुई समय की मांग को ईसीएम से जुड़े प्रोटीन के लिए अपेक्षाकृत उच्च संवेदनशीलता द्वारा मुआवजा नहीं दिया जाता है। इसके बजाय, सीएसडी न्यूरोजेनेसिस और एसईजेड से जुड़े ईसीएम प्रोटीन Tgm2, Thrombospondin-4 (Thbs4), S100a6, और Tenacin-C (Tnc) (चित्रा 3E) के लिए नमूना डेटा की तुलना करते समय अधिक मजबूत पहचान / परिमाणीकरण प्रदान करता है। टीएनसी के मामले में, हालांकि सभी नमूनों में परिमाणित किया गया है, केवल सीएसडी ने एमईजेड की तुलना में एसईजेड के लिए संवर्धन प्रदर्शित किया। फिर भी, SEZ से जुड़े बेसल झिल्ली प्रोटीन Nidogen-1 (Nid1), Laminin सबयूनिट बीटा -2 (Lamb2), और तहखाने झिल्ली-विशिष्ट हेपरन सल्फेट proteoglycan कोर प्रोटीन (Hspg2)35 ने सीएसडी नमूनों की तुलना में एलसीएम नमूनों में एसईजेड (एमईजेड की तुलना में) में और भी अधिक मजबूत संवर्धन प्रदर्शित किया (नहीं दिखाया गया है)। इसलिए, सीएसडी ऊतक के नमूने प्रदान कर सकता है जो एक उचित समय सीमा में एसईजेड लक्षण वर्णन के लिए एक सटीक और गहरा मात्रात्मक प्रोटिओम प्रदान करता है, समझौता किए गए ऊतक अखंडता या प्रोटीन हानि के बारे में चिंता किए बिना।

सांख्यिकी
सांख्यिकीय परीक्षण, 2 डी एनोटेशन संवर्धन परीक्षण, और पीसीए पर्सियस वातावरण में किए गए थे। प्रोटीन को विश्लेषण में शामिल किया गया था यदि कम से कम एक नमूने में प्रत्येक विधि के लिए एक वैध मूल्य का पता लगाया गया था। प्रोटीन बहुतायत और संख्या तुलना डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कल्पना की गई थी ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटीन तुलना के लिए झूठी खोज दर (FDR) (FDR को 0.05, 250 randomizations पर सेट किया गया था) का एक क्रमपरिवर्तन-आधारित नियंत्रण नियोजित किया गया था। 2D-एनोटेशन संवर्धन परीक्षण36 के लिए, प्रदर्शित GO शर्तों को काफी समृद्ध किया जाता है (FDR को Benjamini-Hochberg FDR-नियंत्रण विधि का उपयोग करके 0.02 पर सेट किया गया था)।

Figure 1
चित्रा 1: क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन विधि( ए) ब्याज के क्षेत्र का अवलोकन: न्यूरोजेनिक एसईजेड और गैर-न्यूरोजेनिक एमईजेड के साथ पार्श्व वेंट्रिकल। Dcx के साथ Neuroblasts immunostained. (B) OB, पूर्वकाल ध्रुव, प्रांतस्था, और निलय और choroid प्लेक्सस के ऊपर कॉर्पस callosum के stepwise हटाने: 1. विच्छेदन माध्यम में प्लेसमेंट, 2. OB को हटाने, 3. कॉर्टेक्स के पूर्वकाल ध्रुव को हटाने, 4. वेंट्रिकुलर शीर्ष के sagittal चीरों, 5. वेंट्रिकुलर शीर्ष के sagittal चीरों, 5. वेंट्रिकुलर शीर्ष को हटाने, 6. वेंट्रिकुलर दीवारों का प्रसार। (सी) ताजा जमे हुए माउस मस्तिष्क के 100 μm कोरोनल स्लाइस, (1.) से पहले और (2.) एक बर्फ-ठंडे स्केलपेल के साथ वेंट्रिकुलर दीवारों को हटाने के बाद। स्केल सलाखों = 4 मिमी (डी) एक पार्श्व वेंट्रिकल (GFAP: हरे) के एक कोरोनल अनुभाग का धुंधला; DAPI: नीला), सीएसडी के साथ विच्छेदित SEZ और MEZ दिखा रहा है। स्केल सलाखों = 300 μm (A), 200 μm (D). संक्षिप्त रूप: सीएसडी = क्रायो-सेक्शन विच्छेदन; SEZ = subependymal क्षेत्र; MEZ = औसत दर्जे का ependymal क्षेत्र; Dcx = Doublecortin; OB = घ्राण बल्ब; GFAP = glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूरेमाउंट विच्छेदन की तुलना में क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन के साथ सुपीरियर विच्छेदन-परिशुद्धता। (ए) होलमाउंट विच्छेदन (बाएं) द्वारा प्राप्त एक एसईजेड नमूने की इम्यूनोहिस्टोकेमिकल छवि। माइलिन-समृद्ध स्ट्रिएटल ऊतक को शामिल करने की कल्पना एमएजी (हरे) के खिलाफ धुंधला करके की जाती है। सीएसडी (दाएं) के साथ विच्छेदित एक एसईजेड का धुंधला होना। सीएसडी में, लगभग सभी स्ट्रिएटल माइलिन (एमएजी, हरे रंग के खिलाफ धुंधला) को नमूना रिबन से बाहर रखा गया है। नाभिक को DAPI (नीले) का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ किया गया था। (बी) सेज बनाम सीएक्स में माइलिन मार्कर संवर्धन की तुलना होलमाउंट से (एमबीपी: पी = 0.0074; MAG: p = 0.0016; Plp1: p = 0.0011; CNP: p = 0.0029) और CSD (MBP: p = 0.0667; MAG: p = 0.0236; Plp1: p = 0.3420; सीएनपी: पी = 0.1842)। (सी) 2 डी-एनोटेशन संवर्धन परीक्षण सीएसडी-एसईजेड नमूनों के साथ होलमाउंट-एसईजेड की तुलना में। GO शब्द extracellular space और Matrisome-associated cSD डेटा में wholemount डेटा की तुलना में अधिक समृद्ध होते हैं। (घ) एनएससी विनियामक Tgm225 की प्रोटीन बहुतायत पूरे माउंट विच्छेदन और सीएसडी के लिए प्लॉट की गई है। Tgm2 CSD में Cx की तुलना में SEZ में काफी समृद्ध है (CSD: p = 0.0029; Wholemount: p = 0.1775)। बी और डी के लिए: संदर्भ के रूप में, शर्मा एट अल.33 से प्रोटिओम डेटा स्ट्रिएटम और कॉर्टेक्स के माप के साथ होलमाउंट और सीएसडी नमूनों में प्रदर्शित संबंधित प्रोटीन के लिए प्लॉट किया गया था। स्केल सलाखों = 200 μm (ए). संक्षिप्त रूप: सीएसडी = क्रायो-सेक्शन विच्छेदन; SEZ = subependymal क्षेत्र; MAG = माइलिन से जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन; Cx = somatosensory प्रांतस्था; MBP = माइलिन मूल प्रोटीन; Plp1 = proteolipid-प्रोटीन 1; CNP = 2',3'-चक्रीय-न्यूक्लियोटाइड 3'-फॉस्फोडिएस्टेरेस; GO = जीन आंटोलॉजी; एनएससी = तंत्रिका स्टेम सेल; Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LFQ = लेबल मुक्त मात्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: LCM की तुलना में क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन के साथ बेहतर बाह्य कोशिकीय प्रोटीन परिमाणीकरण(A) SEZ और MEZ (बाएं) के लेजर कैप्चर से पहले और बाद में एक पार्श्व वेंट्रिकल का क्रेसिल बैंगनी धुंधला होना। तुलना के लिए, एसईजेड और एमईजेड (दाएं) का सीएसडी चीरा। स्केल बार = 150 μm. (B) CSD और LCM से SEZ और MEZ नमूनों में पता लगाए गए प्रोटीन की संख्या की तुलना। डेटा को औसत ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (सी) सीएसडी और एलसीएम की तुलना में एसईजेड और एमईजेड नमूनों का प्रमुख घटक विश्लेषण (घटक 2: विचरण का 8.5%; घटक 3: 6.4%)। (डी) क्रायो-सेक्शन- और लेजर-विच्छेदित एमईजेड (शीर्ष) और एसईजेड (नीचे) का 2 डी एनोटेशन संवर्धन। GO शब्द बाह्य कोशिकीय ऑर्गेनेल और एक्स्ट्रासेल्युलर क्षेत्र भाग काफी समृद्ध हैं (लाल डॉट्स)। (ई) एलसीएम (टीएनसी: पी = 0.3789) और सीएसडी नमूनों (टीजीएम 2: पी = 0.2940) के लिए एसईजेड और एमईजेड में एक्स्ट्रासेल्युलर एसईजेड-संबद्ध मार्कर प्रोटीन की बहुतायत; S100a6: p = 0.0218; THBS4: p = 0.3941; Tnc: p = 0.0004). संक्षिप्त रूप: सीएसडी = क्रायो-सेक्शन विच्छेदन; LCM = लेजर-कैप्चर-माइक्रोडिसेक्शन; SEZ = subependymal क्षेत्र; MEZ = औसत दर्जे का ependymal क्षेत्र; GO = जीन आंटोलॉजी; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = S100 कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन A6; THBS4 = घनास्त्रता -4; LFQ = लेबल मुक्त मात्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सीएसडी विधि ने एसईजेड ऊतक को ठीक से निकालना और एमएस का उपयोग करके महत्वपूर्ण गहराई के साथ एक विश्वसनीय प्रोटिओम उत्पन्न करना संभव बना दिया सीएसडी एसईजेड नमूनों और बाह्य कोशिकीय प्रोटीन संवर्धन के बहुत कम स्ट्रिएटल संदूषण के संदर्भ में होलमाउंट विच्छेदन की तुलना में एक स्पष्ट लाभ प्रदर्शित करता है। जैसा कि सीएसडी और होलमाउंट विच्छेदन के साथ व्यक्तिगत नमूनों (~ 6,500 प्रोटीन प्रति नमूना) में प्रोटीन की एक समान संख्या का पता लगाना भी संभव है, सीएसडी के लिए अतिरिक्त समय अच्छी तरह से प्रयास के लायक है। एलसीएम अधिक सटीक एसईजेड विच्छेदन प्रदान करता है, लेकिन सीएसडी (पुस्तकालय मिलान और लेबल-मुक्त परिमाणीकरण) के रूप में एक ही एमएस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के बावजूद प्रति नमूना केवल 3,500 प्रोटीन के साथ एक कम प्रोटिओम गहराई तक पहुंच गया। महत्वपूर्ण रूप से, परिवर्तनशीलता बहुत अधिक थी, शायद प्रति नमूना आठ गुना लंबे समय तक तैयारी के समय के कारण। एलसीएम और सीएसडी द्वारा प्राप्त नमूनों के पीसीए से तंग क्षेत्र-विशिष्ट समूहों के साथ दोनों तरीकों के स्पष्ट अलगाव का पता चलता है जो एक-दूसरे से मजबूती से अलग होते हैं। इसके विपरीत, एलसीएम नमूनों ने एक अधिक बिखरे हुए वितरण को प्रदर्शित किया, जो शायद तैयारी की लंबाई के कारण भाग में है। यह स्पष्ट नहीं है कि क्या लंबी अवधि में कहीं अधिक नमूने एकत्र करने से एलसीएम के साथ समान मजबूती और गहराई का एक प्रोटिओम प्राप्त होगा। एक अनुमान की गणना करते हुए, सीएसडी के लिए किए गए समान नमूना मात्रा को इकट्ठा करने में एलसीएम के साथ 5-8 गुना अधिक समय लगेगा, यहां तक कि 15 गुना अधिक समय तक अगर पेप्टाइड स्पेक्ट्रा पुस्तकालयों के लिए प्रदान किए गए नमूनों को शामिल किया गया था, और इसमें से अधिकांश पिघलने वाली स्थितियों के तहत। इसके अलावा, एलसीएम (पृष्ठभूमि धुंधला, लेजर विच्छेदन) के लिए आवश्यक ऊतक के अतिरिक्त व्यवधानों को ध्यान में रखते हुए, एलसीएम ने सीएसडी पर थोड़ा, यदि कोई हो, तो लाभ प्रदान किया। इसलिए, सीएसडी को एक्स्ट्रासेल्युलर प्रोटिओम अनुसंधान के लिए अधिक उपयुक्त माना जा सकता है, विशेष रूप से एसईजेड के लिए।

विशेष रूप से, यदि ब्याज का क्षेत्र एसईजेड की तुलना में छोटा है (उदाहरण के लिए, केवल एपेंडिमल सेल परत की जांच करना), तो एक फ्री-हैंड दृष्टिकोण एलसीएम की सटीकता के पीछे पड़ता है। उदाहरण के लिए, सीएसडी का उपयोग करके एपेंडिमल को सबपेंडीमल परत से अलग करना मुश्किल है क्योंकि एपेंडिमल परत केवल एक सेल व्यास चौड़ा है, और सबपेंडीमल परत की ओर सीमांकन ताजा जमे हुए ऊतक में नग्न आंखों के लिए दिखाई नहीं देता है। इसलिए, एलसीएम सीएसडी की तुलना में एक बेहतर विकल्प होगा यदि 50 μm से नीचे के पैमाने पर एक सटीक विच्छेदन अबाधित ऊतक की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है या विच्छेदन समय को कम रखता है। 50 μm और अधिक की चौड़ाई वाले क्षेत्रों के लिए, हालांकि, CSD की सटीकता ECM प्रोटीन विश्लेषण के लिए LCM की तुलना में तुलनीय है।

सीएसडी पहले से ही न्यूरोजेनिक niche25 में ईसीएम की कार्यात्मक भूमिका की जांच में योगदान देकर उपयोगी साबित हुआ है। इसलिए, विभिन्न प्रोटीन और proteome जांच (या यहां तक कि एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण) के लिए एसईजेड में सीएसडी के निरंतर अनुप्रयोग से आगे न्यूरोजेनेसिस नियामकों, स्टेम सेल सक्रियण मार्करों और एसईजेड स्टेम सेल आला फिजियोलॉजी की गहरी समझ का पता लगाया जा सकता है। उम्र बढ़ने SEZ37 में न्यूरोजेनेसिस की गिरावट को ध्यान में रखते हुए, वृद्ध बनाम युवा चूहों के एसईजेड के ईसीएम परिवर्तनों का एक संक्षिप्त विश्लेषण एनएससी विकास और रखरखाव को बढ़ावा देने वाले सटीक आला तंत्र की समझ को बढ़ावा दे सकता है38,39। इसके अलावा, सेज न्यूरोजेनेसिस पर सूजन और चोट का प्रभाव अच्छी तरह से स्थापित है40,41,42,43। कॉर्टिकल मस्तिष्क की चोट के बाद एसईजेड में रक्त-व्युत्पन्न फाइब्रिनोजेन का संवर्धन और एसईजेड एस्ट्रोग्लियोजेनेसिस और निशान गठन पर इसका प्रभाव 44 एसईजेड स्टेम सेल फिजियोलॉजी पर आघात-प्रेरित माइक्रोएन्वायरमेंट परिवर्तनों के संभावित प्रभाव पर प्रकाश डालता है। इसलिए, सीएसडी का उपयोग करके मस्तिष्क की चोट के सहयोग से एसईजेड-ईसीएम प्रोटिओम की जांच करने से उन तंत्रों को स्पष्ट करने में मदद मिल सकती है जिनके द्वारा चोट और सूजन न्यूरोजेनेसिस को प्रभावित करती है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि स्वास्थ्य और बीमारी में मानव मस्तिष्क न्यूरोजेनिक niches पर भी लागू हो सकती है क्योंकि ताजा जमे हुए ऊतक अक्सर सर्जरी से प्राप्त किए जा सकते हैं। इसके अलावा, वयस्क न्यूरोजेनेसिस में प्रजातियों के अंतर को देखते हुए, सीएसडी विधि को अन्य प्रजातियों पर लागू करना भी आकर्षक होगा, उदाहरण के लिए, स्ट्रिएटल न्यूरोजेनेसिस के सहयोग से। इसके अलावा, अन्य प्रोटीन का पता लगाने के तरीकों के साथ, स्थानीय रूप से उत्पादित विकास कारकों में अंतर की जांच एसईजेड और एमईजेड (जैसे, एलिसा) के लिए सीएसडी का उपयोग करके सटीक और कुशलता से की जा सकती है।

अंत में, विच्छेदन प्रक्रिया को संभावित रूप से अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के सटीक निष्कर्षण के लिए संशोधित किया जा सकता है, न्यूरोजेनेसिस से संबंधित नहीं शोध प्रश्नों के लिए भी। उदाहरण के लिए, सीएसडी में एक संक्षिप्त अर्ध-पिघलने वाला चरण शामिल है, जिसके दौरान कॉम्पैक्ट माइलिन अधिक पारभासी अवशिष्ट मस्तिष्क ऊतक से अलग सफेद क्षेत्रों के रूप में दिखाई देता है। विधि के एक सरल संशोधन के साथ, यह सुविधा केवल कॉर्पस कैलोसम कॉम्पैक्ट माइलिन ऊतक के सटीक विच्छेदन की अनुमति देगी, जिसे चोट से संबंधित परिवर्तनों के प्रोटिओमिक विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। एक प्रोटोकॉल संशोधन का एक सुझाव जो कॉर्पस कठोर विच्छेदन की अनुमति देगा, प्रोटोकॉल के चरणों 1.5-1.9 को छोड़ना है और एसईजेड और एमईजेड को सुलभ बनाने के लिए वेंट्रिकल्स खोलने के बजाय कोरोनल वर्गों को तैयार करने के लिए सीधे आगे बढ़ना है। फिर, सूखी बर्फ पर वर्गों को रखें, संक्षेप में स्लाइस को उठाएं और अर्ध-पिघलाएं, और बस एक स्केलपेल के साथ कॉर्पस कॉलोसम को हटा दें। यह तैयारी अब किसी भी विश्लेषण के लिए तैयार होनी चाहिए, जिसमें देशी कॉर्पस कैलोसम ऊतक के कुशल विच्छेदन की आवश्यकता होती है।

संक्षेप में, यह अध्ययन एक सूक्ष्म-विच्छेदन विधि प्रस्तुत करता है जिसका उपयोग विश्वसनीय वेंट्रिकुलर न्यूरोजेनिक आला प्रोटिओम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। डेटा एसईजेड माइक्रोएन्वायरमेंट के एमएस-आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ-साथ सीएसडी विधि की संगतता और उपयोगिता को रेखांकित करता है। परिशुद्धता, दक्षता, और न्यूनतम ऊतक क्षोभ का संयोजन सीएसडी को मौजूदा तरीकों का एक मूल्यवान विस्तार प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की

Acknowledgments

हम ईमानदारी से Mathias मान हमें अपनी प्रयोगशाला में प्रयोगों के बड़े हिस्से का प्रदर्शन करने की अनुमति देने के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं, LCM और proteome विश्लेषण के साथ मदद के लिए फैबियन Coscia, पूरेमाउंट विच्छेदन के लिए Tatiana साइमन-Ebert, और Korbinian Mayr और इगोर पारोन उनकी तकनीकी मदद के लिए। हम कृतज्ञतापूर्वक जर्मन रिसर्च काउंसिल से एमजी (SFB870, TFR274), यूरोपीय संघ (एरानेट S-700982-5008-001), ERC (aERC "NeuroCentro" से MG), स्वीडिश सोसाइटी फॉर मेडिकल रिसर्च (SSMF, JK) पोस्टडॉक्टरल अनुदान, और KI नींव और फंड (2020-01351, JK के लिए) के लिए धन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat CM3050S Leica
Dissecting microscope Leica
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip Fine Science Tools cat. no. 11252-00
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 Invitrogen cat. no. 24020
HEPES buffer solution (1 M) Invitrogen cat. no. 15630
Microscope slides RS France cat. no. BPB018
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL Eppendorf cat. no. 0030123344
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm Fine Science Tools cat. no. 15003-08
Surgical disposable scalpels B. Braun cat. no. 5518083
Tissue culture dishes 60 mm Greiner Bio-One cat. no. 633180
Antibodies
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) ThermoFisher Scientific cat. no. A-11001
DAPI Sigma cat. no. D9542
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 Millipore cat. no. AB2253,
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 Sigma cat. no. G3893
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 Millipore cat. no. MAB1567
Software
GraphPad Prism version 9 GraphPad Software, San Diego California USA www.graphpad.com
Perseus Version 1.6.10.50 Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany https://maxquant.net/perseus/
ZEN imaging software Carl Zeiss

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References

  1. Goodman, T., Hajihosseini, M. K. Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions. Frontiers in Neuroscience. 9, 387 (2015).
  2. Chaker, Z., et al. Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway. Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).
  3. Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story. Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).
  4. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  5. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  6. Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain. PloS One. 9 (11), 111453 (2014).
  7. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).
  8. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820 (2016).
  9. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63 (8), 1394-1405 (2015).
  10. Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
  11. Sirko, S., et al. Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny. Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).
  12. Mercier, F. Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).
  13. Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).
  14. Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone. Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).
  15. Chen, G., et al. In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair. eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).
  16. Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).
  17. Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail. Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).
  18. Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair. Methods. 133, 3-20 (2018).
  19. Heinrich, C., et al. Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex. Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).
  20. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  21. Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).
  22. Lepko, T., et al. Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain. EMBO Journal. 38 (17), 100481 (2019).
  23. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  24. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nature Communications. 10 (1), 963 (2019).
  25. Kjell, J., et al. Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).
  26. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938 (2010).
  27. Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).
  28. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  29. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  30. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  31. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).
  32. Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344 (6181), 319-324 (2014).
  33. Sharma, K., et al. Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome. Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).
  34. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  35. Kerever, A., et al. Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu. Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).
  36. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  37. Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells. Scientific Reports. 6, 21505 (2016).
  38. Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches. Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).
  39. Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis. Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).
  40. Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility. Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).
  41. Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26 (2020).
  42. Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis. Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).
  43. Kernie, S. G., Parent, J. M. Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).
  44. Pous, L., et al. Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling. Nature Communications. 11 (1), 630 (2020).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 176
क्रायो-अनुभाग सटीक और गहरी मात्रात्मक Proteome विश्लेषण के लिए वयस्क Subependymal क्षेत्र के विच्छेदन
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Friess, C., Götz, M., Kjell, J. … More

Friess, C., Götz, M., Kjell, J. Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63047, doi:10.3791/63047 (2021).

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