Summary
Hier wird ein Protokoll für das effiziente und genaue Screening von Tabakgenotypen auf Phytophthora nicotianae-Resistenz in Sämlingen vorgestellt. Dies ist ein praktischer Ansatz für die Präzisionszüchtung sowie die Erforschung molekularer Mechanismen.
Abstract
Schwarzer Schaft, verursacht durch die Oomycetes Phytophthora nicotianae, ist zerstörerisch für Tabak, und dieser Erreger ist für viele Nachtschattengewächse hoch pathogen. P. nicotianae ist gut an hohe Temperaturen angepasst; Daher gewinnt die Erforschung dieses Erregers in der Landwirtschaft weltweit aufgrund der globalen Erwärmung an Bedeutung. P. nicotianae-resistente Sorten von Tabakpflanzen werden üblicherweise durch Beimpfung mit Haferkörnern, die von P. nicotianae besiedelt sind, und Überwachung auf die Krankheitssymptome untersucht. Es ist jedoch schwierig, die Impfintensität zu quantifizieren, da in diesem Fall eine genaue Impfung entscheidend ist. Diese Studie zielte darauf ab, eine effiziente und zuverlässige Methode zur Bewertung der Resistenz von Tabak gegen eine Infektion mit P. nicotianae zu entwickeln. Diese Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung resistenter Sorten eingesetzt, und die Impfeffizienz wurde durch die real-time PCR bestätigt. Die in dieser Studie vorgestellte Methode zur Bewertung der Resistenz ist effizient und praktisch für die Präzisionszüchtung sowie die Erforschung molekularer Mechanismen.
Introduction
P. nicotianae ist zerstörerisch für viele Nachtschattengewächse. Es kann Tabak "schwarzer Schaft"1, Kartoffelblatt und Knollenrot2, Tomaten- und Paprikakrone und Wurzelfäule3 und Goji-Kragen und Wurzelrot4 verursachen. P. nicotianae kann alle Teile von Tabakpflanzen angreifen, einschließlich der Wurzeln, Stängel und Blätter in jedem Wachstumsstadium5. Das häufigste Symptom der Krankheit ist die schwarze Basis des Stiels. Die Wurzeln sind zunächst als wassergetränkt sichtbar und werden dann nekrotisch, und die Blätter zeigen große kreisförmige Läsionen5. Diese Krankheit kann für eine Tabakpflanze sowohl im Gewächshaus als auch auf dem Feld verheerend sein6. Die praktischste und wirtschaftlichste Methode zur Bekämpfung von P. nicotianae ist die Verwendung resistenter Sorten7. Für die Identifizierung von P. nicotianae-resistenten Akzessionen aus Tabakkeimplasma-Sammlungen ist jedoch ein wirksames Screening-Protokoll erforderlich.
Zur Beurteilung der P. nicotianae-Resistenz in Tabak wurden verschiedene Identifizierungsmethoden beschrieben7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Im Allgemeinen wurden drei Hauptansätze zur Identifizierung von P. nicotianae-resistenten Tabakgenotypen verwendet. Die erste beinhaltet das Mischen von Myzelien mit Agarmedium auf Petriplatten, die P. nicotianae enthalten. Die Myzelien werden dann im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 Wochen kultiviert. 1 L deionisiertes Wasser wird der Myzelie zugesetzt und für 30 s homogenisiert. Das Inokulum wird bis zum Bedarf auf Eis gehalten. Zwei Löcher (1 cm Durchmesser und 4-5 cm tief) werden auf jeder Seite der Pflanze gemacht, und 10 ml des Inokulums werden in jedes Loch gegossen. Die Löcher werden dann mit dem umgebenden Boden gefüllt, und die Krankheitsentwicklung wird täglich für 2 Wochen überwacht8,10.
Bei der zweiten Methode werden die Pflanzen mit pathogenverseuchten Zahnstochern beimpft. Für diesen Ansatz sollten die Pflanzen ca. 6 Wochen nach dem Umpflanzen verwendet werden und eine Mindesthöhe von 30 cm haben. Autoklavierte Zahnstocher werden auf die Oberfläche von Kulturen gelegt, die P. nicotianae mycelia enthalten. Die Kulturschalen werden dann 7 Tage lang unter dem Licht bei Raumtemperatur gelagert. Dann werden kolonisierte Zahnstocher verwendet, um die Pflanzen zu impfen. Zahnstocher werden in die Tabakstiele zwischen dem vierten und fünften Knoten eingeführt. Die Pflanzen werden täglich für 5 Tage überwacht9,15. Diese Methode ist nicht für kleine Sämlinge anwendbar. Da es sich bei dem Inokulum um pathogenverseuchte Zahnstocher handelt, kann die Impfintensität nicht genau gesteuert werden.
Der am häufigsten verwendete Ansatz beinhaltet Haferkörner zur Impfung. In diesem Fall werden Haferkörner hergestellt, indem 500 ml Hafer und 300 ml deionisiertes Wasser bei 121 ° C für 1 h einmal täglich für 3 Tage autoklaviert werden. Dann werden Haferkörner dem pathogen-besiedelten Kulturmedium hinzugefügt. Das Geschirr wird mit Paraffinfolie verschlossen und bei 25 °C bei Licht für 7-12 Tage inkubiert. Vier separate 5 cm tiefe Löcher werden auf der Blumenerde gemacht, 4 cm von jeder Pflanze, und ein pathogenbefallenes Haferkorn wird in jedes Loch gegeben. Die Inkubationszeit wird basierend darauf bestimmt, wann das erste oberirdische Symptom auftritt7,11,12,13,14,15,16. Diese Methode ist effizient und anwendbar für das großflächige Widerstandsscreening. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass das Inokulum aus pathogenverseuchten Haferkörnern besteht, so dass die Impfintensität nicht genau gesteuert werden kann.
Hier wird jedoch eine genauere Methode vorgestellt, die auf die Bewertung der Wachstumskammerresistenz anwendbar ist. Im Vergleich zu den anderen Ansätzen ist das Inokulum Zoosporensuspension, daher ist die Impfintensität kontrollierbar und einstellbar. Da die Tabakpflanzen in dieser Studie ohne Erde angebaut werden, sind die Ergebnisse leichter zu beobachten. Darüber hinaus verursacht die Probenahme von Pflanzenwurzeln aus dem Boden immer Schäden an den Wurzeln, was eine Reihe von physiologischen Reaktionen hervorruft17. Da bei dieser Methode Pflanzen ohne Erde angebaut werden, kann der Eingriff in Wurzelschäden beseitigt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode für die Erforschung molekularer Mechanismen und die Präzisionszüchtung praktischer ist. Mit diesem Protokoll werden die Daten in der Regel innerhalb von 5 Tagen gewonnen, wobei mehr als 200 Pflanzen in einem einzigen Experiment bewertet werden.
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Protocol
1. Materialien
- Erhalten Sie Tabaksorten.
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden "Beinhart1000-1" (eine Auswahl von Beinhart 1000) (BH) und "Xiaohuangjin1025" (XHJ) von der National Medium-term Genbank of the Tobacco Germplasm Resource of China erhalten. BH ist resistent, während XHJ anfällig für eine P. nicotianae-Infektion ist16. Ein Feldisolat der P. nicotianae-Rasse 0, das im Tabakforschungsinstitut der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften konserviert wurde, wurde während der gesamten Studie für alle Impfungen verwendet.
2. Anpflanzung von Tabakgenotypen zur Bewertung der P. nicotianae-Resistenz
- Mischen Sie Tabaksamen mit Vermiculit und verteilen Sie die Samen sanft auf die sterilisierte Blumenerde. Stellen Sie die Töpfe in die Wachstumskammer. Halten Sie eine konstante Temperatur von 25 ° C unter einer 16 h hellen / 8 h dunklen Photoperiode aufrecht.
- Bereiten Sie hydroponische Geräte mit Tabletts und Schaumstoffplatten vor. Nachdem die Samen gekeimt sind, stechen Sie die Sämlinge aus der Blumenerde heraus, waschen Sie die Wurzeln vorsichtig mit sterilem entionisiertem Wasser und pflanzen Sie sie in die hydroponischen Geräte um.
- Stellen Sie die Geräte in Klimakammern bei 25 °C unter einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode für 24 h auf.
- Bereiten Sie die Hoagland-Nährlösung vorher vor (Tabelle 1). Umpflanzen Sie die Sämlinge in hydroponische Geräte mit Hoagland-Nährlösung (ca. 125 ml pro Pflanze).
- Stellen Sie die Geräte 2 Wochen lang in eine Klimakammer bei 25 °C unter einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode.
3. Herstellung von P. nicotianae Zoosporensuspension
- Bereiten Sie Haferflocken-Agar-Medium zu.
- Wiegen Sie 33 g Haferflocken und geben Sie sie auf Glaswaren und fügen Sie 1.000 ml steriles Wasser hinzu. Auf einem elektromagnetischen Herdofen kochen.
- Nachdem die Haferflocken klebrig geworden sind, belasten Sie die flüssige Lösung durch ein Stück sterile Gaze.
- Gießen Sie die flüssige Lösung in einen 1.000 mL Messkolben und stellen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 1.000 mL ein.
- Gießen Sie die flüssige Lösung in eine Glasreagenzflasche und fügen Sie 18 g Agar hinzu. Die Mischung (Haferflocken-Agar-Medium) bei 121 °C 15 min gut schütteln und autoklavieren. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 30 min.
- Gießen Sie etwa 20 ml des sterilisierten Haferflocken-Agar-Mediums in jede Petrischale. Lassen Sie die Petrischalen vor der Myzelzucht bei Raumtemperatur gründlich abkühlen.
- Führen Sie Myzelkultivierung durch.
- Bereiten Sie Stempel und Zahnstocher mit einem Durchmesser von 1 cm vorher vor, indem Sie sie bei 121 °C für 15 min autoklavieren.
- Stanzen Sie Löcher in die Myzelagarkulturen von P. nicotianae , um runde Myzelmatten herzustellen.
- Wählen Sie die Myzelmatten heraus, legen Sie die Myzelseite nach unten auf das Haferflocken-Agarmedium und inkubieren Sie das Myzel 14 Tage lang bei 25 ° C im Dunkeln.
- Bereiten Sie P. nicotianae zoospore suspension vor.
- Geben Sie 0,1% KNO3-Lösung zu jeder Myzelkultivierung (15 ml/Schale), gefolgt von einer Kultivierung bei 4 °C für 20 Minuten, um Sporangium zu induzieren.
- Halten Sie das Geschirr bei 25 ° C für 25 Minuten, um Zoosporen freizusetzen.
- Sammeln Sie die Zoosporensuspension in einem Becherglas und messen Sie die Zoosporenkonzentration mit einem Mikroskop und einem Hämozytometer.
- Stellen Sie die Zoosporenkonzentration mit sterilem Wasser auf 1 x 104 Zoosporen/ml ein.
4. Identifizierung seuchenresistenter Tabaksorten
- Nehmen Sie die Sämlinge aus der Hoagland-Nährlösung und impfen Sie sie, indem Sie die Wurzeln in 20 ml P. nicotianae Zoosporensuspension in einer Petrischale (90 mm) bei 25 ° C für 3 h im Dunkeln tauchen.
- Nach der Impfung die Tabaksämlinge in neue Petrischalen geben, wobei 10 ml steriles Wasser die Wurzeln eintauchen. Halten Sie die Wurzeln feucht, indem Sie sie mit zwei Blättern Filterpapier abdecken. Halten Sie das Geschirr bei 25 °C mit einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode.
- Beobachten Sie nach 2-3 Tagen die Schwere der Erkrankung.
- Für die Kontrollbehandlung legen Sie die Tabaksämlinge direkt in die Petrischalen mit 10 ml sterilem Wasser, das die Wurzeln eintaucht, und bedecken Sie die Wurzeln mit zwei Exemplaren Filterpapier.
HINWEIS: Jede Behandlung hatte drei Replikationen mit 8 Pflanzen pro Experiment.
- Für die Kontrollbehandlung legen Sie die Tabaksämlinge direkt in die Petrischalen mit 10 ml sterilem Wasser, das die Wurzeln eintaucht, und bedecken Sie die Wurzeln mit zwei Exemplaren Filterpapier.
5. Beurteilung der P. nicotianae-Infektion
- Bewerten Sie die Schwere der Erkrankung 4-5 Tage nach der Impfung. Basierend auf dem chinesischen nationalen Standard18 können Sie den Schweregrad der einzelnen Pflanzenkrankheiten auf einer Skala von 0 bis 9 bewerten (Tabelle 2, Abbildung 1).
- Berechnen Sie den Krankheitsindex mit der folgenden Formel18:
Krankheitsindex =
wobei A, B, C, D, E und F die Anzahl der Pflanzen in jedem Schweregrad der Krankheit sind.
ANMERKUNG: Der Schweregrad der Erkrankung wurde in 6 Grade unterteilt18 (Tabelle 3).
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Representative Results
4 Wochen alte Pflanzen der resistenten Sorte BH und der anfälligen Sorte XHJ wurden mit P. nicotianae unter Verwendung der in diesem Artikel vorgestellten Methode herausgefordert. Das Experiment wurde mit drei Replikaten mit jeweils 8 Pflanzen pro Gruppe konzipiert. Eine P. nicotianae-Infektion der beiden Tabaksorten BH und XHJ ist in Abbildung 2 dargestellt. 3 Tage nach der Impfung bedeckten für XHJ die Stängelläsionen etwa die Hälfte des Stammumfangs und die Hälfte der Blätter waren leicht verwelkt; bei der resistenten Variante BH wurden keine Symptome beobachtet. 4 Tage nach der Impfung traten bei XHJ Blattwelken und schwere Stängelläsionen auf, während diese Symptome bei BH nicht auftraten.
5 Tage nach der Impfung wurde der Schweregrad der einzelnen Pflanzenkrankheiten auf der Grundlage des chinesischen nationalen Standards für die "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests"18 (Tabelle 4) erfasst und berechnet. Der mittlere Krankheitsindex von BH betrug 6,48, was gemäß dem Standard als resistent (R) angesehen wurde, und der mittlere Krankheitsindex von XHJ betrug 76,85, was gemäß dem Standard als anfällig (S) angesehen wurde.
Um die Impfeffizienz zu bestätigen, wurde die relative pathogene Biomasse mittels real-time PCR quantifiziert (Abbildung 3). Genomische DNA von Pflanzen und Krankheitserregern wurde aus infizierten BH und XHJ isoliert und bei 24 h, 72 h und 168 h nach der Infektion unter Verwendung des CTAB-Protokolls gesammelt19. Die relative pathogene Biomasse wurde mit den Primerpaaren Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3') quantifiziert, wobei das ribosomale 40S-Protein S3A (WS21) von P. nicotianae20 und Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3') amplifiziert wurde, wodurch das Tabakreferenzgen 26S rRNA-Gen21 amplifiziert wurde. Expressionsfaltenveränderungen zwischen pathogener und Tabak-gDNA wurden mit der 2-ΔΔCT-Ct-Methode berechnet. Die Ergebnisse der real-time PCR bestätigten die phänotypischen Beobachtungen.
Fünf Nachkommen aus der BC4F2-Population einer Kreuzung zwischen BH und XHJ und zwei Sorten mit mittlerer Resistenz, K326 und Yunyan87, wurden mit der Zoosporen-Suspensionsimpfmethode und der Haferkorn-Impfmethode bewertet (Tabelle 5). Die Zoosporen-Suspensionsmethode wurde an kleinen Sämlingen durchgeführt, und die Haferkorn-Impfmethode wurde an erwachsenen Pflanzen durchgeführt. Für die fünf Nachkommen aus der BC4F2-Population lag der Krankheitsindex zwischen 16,49 und 77,60 für die Zoosporensuspensionsmethode und von 10,33 bis 83,08 für die Haferkornmethode. Die Resistenzklassifikationen zwischen den beiden Infektionsmethoden stimmten weitgehend überein. Bei den beiden Intermediate-Resistenz-Sorten K326 und Yunyan87 zeigte die Auswertung bei beiden Methoden "resistent". Diese Daten veranschaulichen die Korrelation zwischen den beiden Impfmethoden, obwohl sie an Tabakpflanzen in unterschiedlichen Wachstumsperioden durchgeführt werden.
| Original Likör | Verhältnis | Original Spirituosenvolumen (mL) | Nährstoffe | Inhalt (g) |
| OL 1 | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| OL 3 | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | 1000× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| OL 5 | 1000× | 500 | (NH4) arabische Ziffer SO4 | 123.75 |
| OL 6 | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tabelle 1: Hoagland-Nährlösung.
| Grad | Aussehen des Phänotyps |
| Klasse 0 | Keine Symptome auf der ganzen Pflanze |
| Klasse 1 | Stängelläsionen < 1/3 des Stängelumfangs oder <1/3 der welken Blätter |
| Klasse 3 | Stammläsionen zwischen 1/3 und 1/2 des Stängelumfangs oder zwischen 1/3 und 1/2 der leicht welkenden Blätter |
| Klasse 5 | Stängelläsionen >1/2 des Stängelumfangs, aber nicht vollständig um den Umfang oder zwischen 1/2 und 2/3 welken Blättern |
| Klasse 7 | Stängelläsionen um den gesamten Stammumfang oder >2/3 welke Blätter |
| Klasse 9 | Pflanzen sehen tot aus |
Tabelle 2: Rangfolge des Schweregrads der Black-Shank-Krankheit. Basierend auf dem chinesischen nationalen Standard für die "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests" (GB/T 23222-2008) wurde die Schwere der einzelnen Pflanzenkrankheiten auf einer Skala von 0 bis 9 bewertet.
| Krankheitsindex | Bewertung der Resistenz |
| 0 | Hochresistent oder immun (I) |
| 0,1 bis 20 | Widerstandsfähig (R) |
| 20,1 bis 40 | Mäßig resistent (MR) |
| 40,1 bis 60 | Mäßig anfällig (MS) |
| 60,1 bis 80 | Anfällig (S) |
| 80,1 bis 100 | Sehr anfällig (HS) |
Tabelle 3: Bewertung der Resistenz nach Krankheitsindex. Die Schwere der Erkrankung wurde entsprechend dem Krankheitsindex in 6 Grade unterteilt. 0 bedeutet hochresistent oder immun (I), 0,1 bis 20 bedeutet resistent (Beleg), 20,1 bis 40 bedeutet mäßig resistent (MR), 40,1 bis 60 bedeutet mäßig empfindlich (MS), 60,1 bis 80 bedeutet anfällig (S), 80,1 bis 100 bedeutet hochempfindlich (HS).
| Sorte | Wiederholen | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Krankheitsindex | Bedeuten | Bewertung der Resistenz | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tabelle 4: Krankheitsindex und Resistenz bei BH und XHJ. Der mittlere Krankheitsindex von BH betrug 6,48, was Resistenz (R) gemäß dem Standard zeigt, und der mittlere Krankheitsindex von XHJ betrug 76,85, was die Anfälligkeit (S) gemäß dem Standard zeigt.
| Genotyp | Zoosporen-Suspension | Haferkornmethode | ||||||
| Versuch 1 | Versuch 2 | Bedeuten | Klassifikation | Versuch 1 | Versuch 2 | Bedeuten | Klassifikation | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Ich |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | HERR | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | HERR |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | FRAU | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tabelle 5: Infektionsreaktion von P. nicotianae bei verschiedenen Genotypen mit der Zoosporen-Suspensions-Impfmethode und der Haferkorn-Impfmethode. Die Zoosporen-Suspensions-Impfmethode wurde an kleinen Sämlingen durchgeführt, und die Haferkorn-Impfmethode wurde an erwachsenen Pflanzen durchgeführt. Diese Daten veranschaulichen den Zusammenhang zwischen der Zoosporensuspensions-Impfmethode und der Haferkorn-Impfmethode. K326 und Yunyan87 haben einen mittleren Widerstand, und C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 sind Nachkommen aus der BC4F2-Population einer Kreuzung zwischen BH und XHJ. Die Pflanzen wurden als immun, resistent, mäßig resistent, mäßig anfällig, anfällig oder hoch anfällig eingestuft.
Abbildung 1: Symptom jeder Klasse . (A) Grad 0, ganzpflanzlich symptomfrei. (B) Grad 1, Stängelläsion <1/3 des Stängelumfangs oder welke <1/3 Blätter. (C) Grad 3, Stängelläsionen zwischen 1/3 und 1/2 des Stammumfangs oder zwischen 1/3 und 1/2 der leicht welkenden Blätter. (D) Grad 5, Stängelläsionen >1/2 des Stammumfangs, aber nicht vollständig um den Umfang oder zwischen 1/2 und 2/3 welkender Blätter. (E) Grad 7, Stängelläsionen um den ganzen Stammumfang oder >2/3 welkender Blätter. (F) Klasse 9, Pflanzen sehen tot aus. Rote Pfeile zeigen die Stammläsionen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beobachtete Variation bei zwei Tabakgenotypen. (A) Ganze Pflanze symptomfrei in resistenter Sorte BH 3 Tage nach der Impfung. (B) Stängelläsionen sind etwa 1/2 des Stängelumfangs und 1/2 der Blätter, die 3 Tage nach der Impfung leicht welken. (C) Ganze Pflanze symptomfrei in resistenter Sorte BH 4 Tage nach der Impfung. (D) Stammläsionen >1/2 des Stängelumfangs, aber nicht vollständig um den Umfang und zwischen 1/2 und 2/3 der Blätter, die in der anfälligen Sorte XHJ 4 Tage nach der Impfung welken. Rote Pfeile zeigen die Stammläsionen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Relative Quantifizierung der P. nicotianae-Biomasse in infizierten BH und XHJ bei 24 h, 72 h und 168 h nach der Impfung. Dies wird als Verhältnis der P. nicotianae WS21-Genamplifikation im Vergleich zum Tabak-26S-rRNA-Gen berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Mehrere Resistenzquellen wurden verwendet, um die Resistenz von P. nicotianae in Kulturtabak zu verbessern. Einzelne dominante R-Gene, Php und Phl, wurden von Nicotiana plumbaginifolia bzw. Nicotiana longiflora introgressiert10. Die Zigarrentabaksorte Beinhart 1000 weist die höchste berichtete quantitative Resistenz gegen P. nicotianae13 auf. Mehrere Intervallkartierungsexperimente haben gezeigt, dass mindestens sechs quantitative Merkmalsorte (QTLs) zum Widerstand in dieser Linie beitragen können13,22. Zusätzlich zu den oben genannten resistenten Quellen wurde auch festgestellt, dass ein anderes außerirdisches Gen, Wz, ein hohes Maß an Widerstand gegen Rasse 0 und Rasse 123,24 verleiht. Unter Berücksichtigung der vielfältigen resistenten Quellen und des komplizierten genetischen Hintergrunds resistenter Sorten ist eine präzise und zuverlässige Methode zur Resistenzbewertung für 1) die Identifizierung von P. nicotianae-resistenten Tabakgenotypen, 2) die Züchtung resistenter Sorten und 3) molekulare Mechanismusstudien von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen erforderlich. Die bisherigen Methoden zur Beurteilung der Schwere der P. nicotianae-Infektion waren zeitaufwendig oder die Impfintensitäten waren schwer zu kontrollieren. Daher ist es dringend erforderlich, eine neue Methode zur Bewertung der P. nicotianae-Resistenz festzulegen.
Die Nachahmung natürlicher Infektionsprozesse ist der Schlüsselpunkt in unserer neuen Methode. Erstens sind Zoosporen während des typischen Lebenszyklus von P. nicotianae die wichtigsten Infektionserreger, die Pflanzenkrankheiten auslösen. Sobald die Zoosporen die Pflanzenoberfläche erreichen, werden sie zu unbeweglichen Zysten, keimen anschließend und bilden Keimröhren. Dann werden Appressorien an der Spitze der Keimröhren produziert25. In unserem Protokoll wurde Zoosporensuspension als Inokulum verwendet, das die natürliche Infektionssituation nachahmt. Zweitens keimten und besiedelten die Zysten auf den Blättern von Nicotiana benthamiana bei 3 h26 epidermale Zellen. In Arabidopsis-Wurzeln drangen alle enzysierten Zoosporen 6 h nach der Impfung erfolgreich in die Wurzeln ein27. Bei unserem Ansatz beinhaltete der Impfprozess das Eintauchen der Wurzeln in eine P. nicotianae Zoosporensuspension für 3 h im Dunkeln, die die natürliche Umgebung imitiert und die Besiedlung des Erregers fördert, was zu einer stabilen und effektiven Infektion führt.
Der am häufigsten verwendete Ansatz zur Beurteilung der P. nicotianae-Resistenz im Tabak, die Haferkornmethode, ist effizient und einfach für die Impfung einer großen Anzahl von Pflanzen7,11,12,13,14,15,16. Es hat jedoch einige Nachteile. Der Hauptnachteil ist die unkontrollierte Impfintensität, die ihre Anwendung in der Präzisionszucht einschränkt. Im Vergleich zur Haferkornmethode und den beiden anderen bestehenden Ansätzen wird bei diesem neuen Ansatz die Zoosporensuspension als Inokulum verwendet, so dass die Impfintensität kontrollierbar und einstellbar ist. Da die Pflanzen in einer hydroponischen Umgebung kultiviert werden, wird die Störung des Bodens eliminiert, was die Auswertegenauigkeit erhöht. Für diese Methode gibt es jedoch eine Einschränkung, nämlich dass sie nicht bei erwachsenen Pflanzen angewendet werden kann. Die Haferkornmethode hingegen ist für das großflächige Resistenzscreening von erwachsenen Pflanzen anwendbar7,13. Daher können sich diese Methode und die Haferkornmethode für verschiedene Wachstumsperioden der Tabakpflanze und in verschiedenen Situationen ergänzen.
Das hier beschriebene Protokoll ist eine effiziente und zuverlässige Methode zur Bewertung der Resistenz von Tabak gegen Infektionen durch P. nicotianae im Sämlingsstadium. Dieses Protokoll kann für die Züchtung und für die Erforschung molekularer Mechanismen verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (31571738) und dem Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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