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Biology

Phytophthora nicotianae प्रतिरोध के लिए तम्बाकू जीनोटाइप की स्क्रीनिंग

Published: April 15, 2022 doi: 10.3791/63054
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2Institute of Rural Development, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences

Summary

यहां, रोपाई में फाइटोफ्थोरा निकोटियाने प्रतिरोध के लिए तम्बाकू जीनोटाइप की कुशल और सटीक स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह सटीक प्रजनन के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है, साथ ही आणविक तंत्र अनुसंधान भी है।

Abstract

काले शैंक, oomycetes Phytophthora nicotianae के कारण होता है, तम्बाकू के लिए विनाशकारी है, और यह रोगज़नक़ कई solanaceous फसलों के लिए अत्यधिक रोगजनक है। P. nicotianae अच्छी तरह से उच्च तापमान के लिए अनुकूलित है; इसलिए, इस रोगज़नक़ पर शोध ग्लोबल वार्मिंग के कारण दुनिया भर में कृषि में महत्व प्राप्त कर रहा है। तम्बाकू के पौधों की पी. निकोटियाने-प्रतिरोधी किस्मों की जांच आमतौर पर पी. निकोटियाने द्वारा उपनिवेशित जई के अनाज के साथ टीका लगाने और रोग के लक्षणों की निगरानी करके की जाती है। हालांकि, टीकाकरण की तीव्रता को मापना मुश्किल है क्योंकि इस मामले में सटीक टीकाकरण महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन का उद्देश्य पी. निकोटियाने के साथ संक्रमण के लिए तम्बाकू के प्रतिरोध का मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि विकसित करना है। प्रतिरोधी किस्मों की पहचान करने के लिए इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, और टीकाकरण दक्षता की पुष्टि वास्तविक समय पीसीआर द्वारा की गई थी। इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रतिरोध मूल्यांकन विधि सटीक प्रजनन के लिए कुशल और व्यावहारिक है, साथ ही आणविक तंत्र अनुसंधान भी है।

Introduction

P. nicotianae कई solanaceous फसलों के लिए विनाशकारी है। यह तम्बाकू "काले शंक" 1, आलू के पत्ते और कंद सड़न 2, टमाटर और मीठी मिर्च मुकुट और जड़ सड़ांध 3, और Goji कॉलर और जड़ rot4 का कारण बन सकता है। पी nicotianae किसी भी बढ़ते चरण में जड़ों, तनों, और पत्तियों सहित तम्बाकू पौधों के सभी भागों पर हमला कर सकते हैं5. रोग का सबसे आम लक्षण डंठल का काला आधार है। जड़ें शुरू में पानी से लथपथ के रूप में दिखाई देती हैं और फिर परिगलित हो जाती हैं, और पत्तियां बड़े परिपत्र घावों को दिखाती हैं5। यह बीमारी ग्रीनहाउस में एक तंबाकू के पौधे के साथ-साथ फील्ड 6 में विनाशकारी हो सकती है। पी nicotianae को नियंत्रित करने के लिए सबसे व्यावहारिक और किफायती तरीका प्रतिरोधी किस्मों का उपयोग है7. तथापि, तम्बाकू जर्मप्लाज्म संग्रहों से पी निकोटियाने-प्रतिरोधी परिग्रहणों की पहचान के लिए एक प्रभावी स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

तम्बाकू में पी. निकोटियाने प्रतिरोध का आकलन करने के लिए विभिन्न पहचान विधियों का वर्णन किया गया है7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. सामान्य तौर पर, पी. निकोटियाना-प्रतिरोधी तम्बाकू जीनोटाइप की पहचान के लिए तीन प्रमुख दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है। पहले पेट्री प्लेटों पर आगर माध्यम के साथ mycelia मिश्रण पी nicotianae युक्त शामिल हैं. माइसेलिया को तब 2 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में खेती की जाती है। विआयनीकृत पानी के 1 एल को माइसेलिया में जोड़ा जाता है और 30 सेकंड के लिए homogenized किया जाता है। इनोकुलम को जरूरत पड़ने तक बर्फ पर रखा जाता है। पौधे के प्रत्येक पक्ष पर दो छेद (व्यास में 1 सेमी और 4-5 सेमी गहरा) बनाए जाते हैं, और प्रत्येक छेद में 10 मिलीलीटर इनोकुलम डाला जाता है। छेद तब आसपास की मिट्टी से भरे होते हैं, और रोग के विकास की निगरानी 2 सप्ताह 8,10 के लिए दैनिक रूप से की जाती है।

दूसरी विधि में, पौधों को रोगज़नक़-प्रभावित टूथपिक्स के साथ संक्रमित किया जाता है। इस दृष्टिकोण के लिए, पौधों को प्रत्यारोपण के लगभग 6 सप्ताह बाद उपयोग किया जाना चाहिए और इसकी न्यूनतम ऊंचाई 30 सेमी होनी चाहिए। Autoclaved toothpicks P. nicotianae mycelia युक्त संस्कृतियों की सतह पर रखा जाता है। संस्कृति व्यंजन तब 7 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर प्रकाश के नीचे संग्रहीत किए जाते हैं। फिर, पौधों को टीका लगाने के लिए उपनिवेशित टूथपिक्स का उपयोग किया जाता है। टूथपिक्स चौथे और पांचवें नोड्स के बीच तम्बाकू के तनों में डाले जाते हैं। पौधों की दैनिक निगरानी 5 दिनों के लिए की जाती है9,15। यह विधि छोटे रोपाई के लिए लागू नहीं है। चूंकि इनोकुलम रोगज़नक़-प्रभावित टूथपिक्स है, इसलिए टीकाकरण की तीव्रता को ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है।

सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण में टीकाकरण के लिए जई के दाने शामिल हैं। इस मामले में, जई के अनाज को 500 मिलीलीटर जई और 300 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी को 121 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए प्रति दिन एक बार 1 घंटे के लिए ऑटोक्लेव करके तैयार किया जाता है। फिर, जई के अनाज को रोगज़नक़-उपनिवेशित संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है। व्यंजनों को पैराफिन फिल्म के साथ सील कर दिया जाता है और 7-12 दिनों के लिए प्रकाश में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। पॉटिंग मिट्टी पर चार अलग-अलग 5 सेमी गहरे छेद बनाए जाते हैं, प्रत्येक पौधे से 4 सेमी, और प्रत्येक छेद में एक रोगज़नक़-प्रभावित जई अनाज रखा जाता है। इनक्यूबेशन अवधि इस आधार पर निर्धारित की जाती है कि पहला उपर्युक्त लक्षण 7,11,12,13,14,15,16 होता है। यह विधि कुशल है और बड़े पैमाने पर प्रतिरोध स्क्रीनिंग के लिए लागू होती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि इनोकुलम रोगज़नक़-प्रभावित जई के दाने हैं, इसलिए टीकाकरण तीव्रता को ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है।

हालांकि, यहां प्रस्तुत एक अधिक सटीक विधि है जो विकास कक्ष प्रतिरोध मूल्यांकन पर लागू होती है। अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, इनोकुलम ज़ूस्पोर निलंबन है, इसलिए इनोक्यूलेशन तीव्रता नियंत्रणीय और समायोज्य है। चूंकि इस अध्ययन में तम्बाकू के पौधों की खेती मिट्टी के बिना की जाती है, इसलिए परिणामों का निरीक्षण करना आसान होता है। इसके अलावा, मिट्टी से पौधे की जड़ों का नमूना हमेशा जड़ों को नुकसान पहुंचाता है, जो शारीरिक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला को प्रेरित करता है। इस विधि में, चूंकि पौधों की खेती मिट्टी के बिना की जाती है, इसलिए जड़ क्षति में हस्तक्षेप को समाप्त किया जा सकता है। अंत में, यह विधि आणविक तंत्र अनुसंधान और सटीक प्रजनन के लिए अधिक व्यावहारिक है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, डेटा आमतौर पर 5 दिनों के भीतर प्राप्त किया जाता है, जिसमें एक ही प्रयोग में 200 से अधिक पौधों का मूल्यांकन किया जाता है।

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Protocol

1. सामग्री

  1. तम्बाकू की किस्में प्राप्त करें।
    नोट: इस प्रयोग के लिए "Beinhart1000-1" (Beinhart 1000 का एक चयन) (BH) और "Xiaohuangjin1025" (XHJ) चीन के तम्बाकू जर्मप्लाज्म संसाधन के राष्ट्रीय मध्यम अवधि के जेनबैंक से प्राप्त किए गए थे। बीएच प्रतिरोधी है, जबकि एक्सएचजे पी. निकोटियाने संक्रमण 16 के लिए अतिसंवेदनशील है। पी nicotianae दौड़ 0 के एक क्षेत्र को अलग करना, जिसे चीनी कृषि विज्ञान अकादमी के तम्बाकू अनुसंधान संस्थान में संरक्षित किया गया था, का उपयोग पूरे अध्ययन में सभी टीकाकरण के लिए किया गया था।

2. पी nicotianae प्रतिरोध मूल्यांकन के लिए तम्बाकू जीनोटाइप रोपण

  1. वर्मीक्यूलाइट के साथ तम्बाकू के बीजों को मिलाएं और बीजों को धीरे से निष्फल पॉटिंग मिट्टी पर प्रसारित करें। बर्तनों को विकास कक्ष में रखें। 25 डिग्री सेल्सियस का एक स्थिर तापमान बनाए रखें, एक 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे photoperiod के तहत।
  2. ट्रे और फोम शीट के साथ हाइड्रोपोनिक उपकरणों को तैयार करें। बीज अंकुरित होने के बाद, पोटिंग मिट्टी से चुभन रोपाई करती है, जड़ों को धीरे से बाँझ विआयनीकृत पानी से धोती है, और उन्हें हाइड्रोपोनिक उपकरणों में प्रत्यारोपित करती है।
  3. 24 घंटे के लिए 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे फोटोपीरियड के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर जलवायु कक्षों में उपकरणों को रखें।
  4. होगलैंड पोषक तत्व समाधान पहले से तैयार करें (तालिका 1)। होगलैंड पोषक तत्व समाधान (प्रति पौधे लगभग 125 मिलीलीटर) के साथ हाइड्रोपोनिक उपकरणों के लिए रोपाई प्रत्यारोपण करें।
  5. 2 सप्ताह के लिए 16 घंटे के प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे फोटोपीरियड के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर एक जलवायु कक्ष में उपकरणों को रखें।

3. पी nicotianae zoospore निलंबन की तैयारी

  1. दलिया अगर माध्यम तैयार करें।
    1. दलिया के 33 ग्राम वजन और कांच के बर्तन में स्थानांतरण और बाँझ पानी के 1,000 मिलीलीटर जोड़ें। एक विद्युत चुम्बकीय स्टोवटॉप ओवन पर उबालें।
    2. दलिया चिपचिपा हो जाने के बाद, बाँझ धुंध के एक टुकड़े के माध्यम से तरल समाधान को तनाव दें।
    3. तरल समाधान को 1,000 एमएल स्नातक सिलेंडर में डालें और बाँझ पानी के साथ 1,000 मिलीलीटर की मात्रा को समायोजित करें।
    4. तरल घोल को कांच की अभिकर्मक बोतल में डालें और 18 ग्राम आगर जोड़ें। अच्छी तरह से हिलाएं और मिश्रण (दलिया अगर माध्यम) को 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव करें। इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    5. प्रत्येक पेट्री डिश में स्टरलाइज्ड ओटमील अगर माध्यम के लगभग 20 मिलीलीटर डालें। Mycelial खेती से पहले अच्छी तरह से ठंडा करने के लिए कमरे के तापमान पर पेट्री व्यंजन छोड़ दें।
  2. मायसेलियल खेती करें।
    1. 1 सेमी व्यास के घूंसे और टूथपिक्स को पहले से तैयार करें, उन्हें 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव करके।
    2. पंच छेद P. nicotianae mycelial आगर संस्कृतियों में गोल mycelial मैट बनाने के लिए.
    3. Mycelial मैट बाहर उठाओ, दलिया आगर माध्यम पर mycelial पक्ष नीचे जगह है, और 14 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर mycelium incubate.
  3. पी nicotianae zoospore निलंबन तैयार करें.
    1. प्रत्येक माइसेलियल खेती (15 एमएल / डिश) में 0.1% KNO3 समाधान जोड़ें, इसके बाद स्पोरैंगियम को प्रेरित करने के लिए 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर खेती की जाती है।
    2. Zoospores जारी करने के लिए 25 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन रखें।
    3. एक बीकर में zoospore निलंबन ले लीजिए और एक माइक्रोस्कोप andhemocytometer का उपयोग कर zoospore एकाग्रता को मापने.
    4. बाँझ पानी के साथ 1 x 104 zoospores / mL करने के लिए zoospore एकाग्रता समायोजित करें।

4. रोग प्रतिरोधी तम्बाकू किस्मों की पहचान

  1. Hoagland पोषक तत्व समाधान से रोपाई ले लो और उन्हें एक पेट्री डिश (90 मिमी) में पी nicotianae zoospore निलंबन के 20 मिलीलीटर में जड़ों को विसर्जित करके उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 3 घंटे के लिए टीका लगाएं।
  2. टीका लगाने के बाद, तम्बाकू के अंकुरों को जड़ों को विसर्जित करने वाले बाँझ पानी के 10 मिलीलीटर के साथ नए पेट्री व्यंजनों में डालें। फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों के साथ कवर करके जड़ों को नम रखें। व्यंजनों को 25 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के प्रकाश / 8 घंटे के अंधेरे फोटोपीरियड के साथ रखें।
  3. 2-3 दिनों के बाद, बीमारी की गंभीरता का निरीक्षण करें।
    1. नियंत्रण उपचार के लिए, तम्बाकू रोपाई को सीधे पेट्री व्यंजनों में 10 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ जड़ों को डुबोने के साथ रखें, और फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों के साथ जड़ों को कवर करें।
      नोट: प्रत्येक उपचार में तीन प्रतिकृतियां थीं, प्रति प्रयोग 8 पौधों के साथ।

5. पी nicotianae संक्रमण का मूल्यांकन

  1. टीकाकरण के 4-5 दिनों के बाद बीमारी की गंभीरता का मूल्यांकन करें। चीनी राष्ट्रीय मानक 18 के आधार पर, 0 से 9 तक के पैमाने पर व्यक्तिगत पौधे की बीमारी की गंभीरता को स्कोर करें (तालिका 2, चित्रा 1)।
  2. निम्न सूत्र 18 का उपयोग करके रोग अनुक्रमणिका की गणना करें:
    रोग सूचकांक = Equation 1
    जहां ए, बी, सी, डी, ई, और एफ प्रत्येक रोग गंभीरता ग्रेड में पौधों की संख्या हैं।
    नोट: रोग की गंभीरता को 6 ग्रेड 18 (तालिका 3) में विभाजित किया गया था।

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Representative Results

प्रतिरोधी किस्म बीएच और अतिसंवेदनशील किस्म XHJ के 4 सप्ताह पुराने पौधों को इस लेख में प्रस्तुत विधि का उपयोग करके पी. निकोटियाने के साथ चुनौती दी गई थी। प्रयोग को तीन प्रतिकृतियों के साथ डिज़ाइन किया गया था, प्रत्येक में प्रति समूह 8 पौधे थे। तम्बाकू की दो किस्मों, बीएच और एक्सएचजे के पी. निकोटियाने संक्रमण को चित्र 2 में प्रस्तुत किया गया है। 3 दिनों के बाद टीकाकरण में, एक्सएचजे के लिए, स्टेम घावों ने तने के परिधि के लगभग आधे हिस्से को कवर किया, और पत्तियों का आधा हिस्सा थोड़ा मुरझाया गया; प्रतिरोधी किस्म बीएच में, कोई लक्षण नहीं देखा गया था। टीकाकरण के बाद 4 दिनों में, एक्सएचजे में पत्ती मुरझाने और गंभीर तने के घाव हुए, जबकि ये लक्षण बीएच में दिखाई नहीं दिए।

टीकाकरण के बाद 5 दिनों में, व्यक्तिगत पौधे की बीमारी की गंभीरता को "तम्बाकू रोगों और कीट कीटों की ग्रेड और जांच विधि" के लिए चीनी राष्ट्रीय मानक के आधार पर दर्ज किया गया था और गणना की गई थी (तालिका 4)। बीएच का औसत रोग सूचकांक 6.48 था, जिसे मानक के अनुसार प्रतिरोधी (आर) के रूप में माना जाता था, और एक्सएचजे का औसत रोग सूचकांक 76.85 था, जिसे मानक के अनुसार अतिसंवेदनशील (एस) माना जाता था।

टीकाकरण दक्षता की पुष्टि करने के लिए, सापेक्ष रोगज़नक़ बायोमास को वास्तविक समय पीसीआर (चित्रा 3) द्वारा परिमाणित किया गया था। पौधे और रोगज़नक़ जीनोमिक डीएनए को संक्रमित बीएच और एक्सएचजे से अलग किया गया था और सीटीएबी प्रोटोकॉल 19 का उपयोग करके 24 घंटे, 72 एच और 168 एच पोस्ट संक्रमण पर एकत्र किया गया था। सापेक्ष रोगज़नक़ बायोमास को प्राइमर जोड़े Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCCTCAG-3') का उपयोग करके परिमाणित किया गया था, जो P. nicotianae20 के 40S राइबोसोमल प्रोटीन S3A (WS21) को बढ़ाता है, और Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCCTTTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGAGGGA-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGGGA)-3') रोगज़नक़ और तम्बाकू gDNA के बीच अभिव्यक्ति गुना परिवर्तन की गणना 2-ΠCT Ct विधि का उपयोग करके की गई थी। वास्तविक समय पीसीआर के परिणामों ने फेनोटाइपिक टिप्पणियों की पुष्टि की।

बीएच और एक्सएचजे और दो मध्यवर्ती प्रतिरोध किस्मों, K326 और Yunyan87 के बीच एक क्रॉस की BC4F2 आबादी से पांच संतानों का मूल्यांकन zoospore निलंबन टीकाकरण विधि और जई के अनाज टीकाकरण विधि (तालिका 5) का उपयोग करके किया गया था। Zoospore निलंबन विधि छोटे रोपाई पर किया गया था, और जई अनाज टीकाकरण विधि वयस्क पौधों पर किया गया था। BC4F2 आबादी से पांच संतानों के लिए, रोग सूचकांक zoospore निलंबन विधि के लिए 16.49 से 77.60 और जई अनाज विधि के लिए 10.33 से 83.08 तक था। दो संक्रमण विधियों के बीच प्रतिरोध वर्गीकरण ज्यादातर एक दूसरे के अनुरूप थे। दो मध्यवर्ती प्रतिरोध किस्मों, K326 और Yunyan87 के साथ, मूल्यांकन ने दोनों तरीकों में "प्रतिरोधी" दिखाया। ये डेटा दो टीकाकरण विधियों के बीच सहसंबंध को दर्शाते हैं, उनके बावजूद उन्हें विभिन्न विकास अवधियों में तम्बाकू के पौधों पर प्रदर्शन किया जा रहा है।

मूल शराब अनुपात मूल शराब की मात्रा (एमएल) पोषक तत्व सामग्री (g)
OL 1 1000× 500 MgSO4•7 H2O 30.81
OL 2 1000× 500 Ca(NO3)2•4 H2O 221.39
OL 3 1000× 500 NaH2PO4•2 H2O 19.5
OL 4 1000× 500 NH4NO3 75.04
OL 5 1000× 500 (NH4) 2 SO4 123.75
OL 6 1000× 500 CaCl2 104.06
OL 7 1000× 500 FeSO4•7 H2O 2.78
Na2-EDTA 3.73
OL 8 1000× 500 K2SO4 87.1
OL 9 4000× 1000 MnCl2•4 H2O 7.24
H3BO3 11.44
ZnSO4•7 H2O 0.88
CuSO4•5 H2O 0.32
(NH4) 6 Mo7O24•2 H2O 0.36

तालिका 1: Hoagland पोषक तत्व समाधान.

श्रेणी फेनोटाइप की उपस्थिति
ग्रेड 0 पूरे पौधे पर कोई लक्षण नहीं
ग्रेड 1 तने के घावों < तने की परिधि के 1/3 या पत्तियों के <1/3 मुरझाने के
ग्रेड 3 तने की परिधि के 1/3 और 1/2 के बीच या पत्तियों के 1/3 और 1/2 के बीच या पत्तियों के 1/3 और 1/2 के बीच स्टेम घावों को थोड़ा मुरझाना
ग्रेड 5 स्टेम घावों को तने की परिधि के >1/2, लेकिन पूरी तरह से परिधि के आसपास नहीं, या पत्तियों के 1/2 और 2/3 के बीच नहीं।
ग्रेड 7 पूरे तने परिधि के चारों ओर स्टेम घाव या पत्तियों के >2/3 मुरझाने के लिए
ग्रेड 9 मृत दिखते हैं पौधे

तालिका 2: काले शैंक रोग गंभीरता रैंकिंग. "तंबाकू रोगों और कीट कीटों की ग्रेड और जांच विधि" (जीबी / टी 23222-2008) के लिए चीनी राष्ट्रीय मानक के आधार पर, व्यक्तिगत पौधे की बीमारी की गंभीरता को 0 से 9 तक के पैमाने पर स्कोर किया गया था।

रोग सूचकांक प्रतिरोध का मूल्यांकन
0 अत्यधिक प्रतिरोधी या प्रतिरक्षा (I)
0.1 से 20 प्रतिरोधी (R)
20.1 से 40 मध्यम प्रतिरोधी (MR)
40.1 से 60 मध्यम रूप से अतिसंवेदनशील (एमएस)
60.1 से 80 अतिसंवेदनशील (S)
80.1 से 100 अतिसंवेदनशील (HS)

तालिका 3: रोग सूचकांक के अनुसार प्रतिरोध का मूल्यांकन। रोग की गंभीरता को रोग सूचकांक के अनुसार 6 ग्रेड में विभाजित किया गया था। 0 का अर्थ है अत्यधिक प्रतिरोधी या प्रतिरक्षा (I), 0.1 से 20 का अर्थ है प्रतिरोधी (R), 20.1 से 40 का अर्थ है मध्यम प्रतिरोधी (MR), 40.1 से 60 का अर्थ है मध्यम रूप से अतिसंवेदनशील (MS), 60.1 से 80 का अर्थ अतिसंवेदनशील (S), 80.1 से 100 का अर्थ है अत्यधिक अतिसंवेदनशील (HS)।

Cultivar दोहराना 1 2 3 4 5 6 7 8 रोग सूचकांक औसत प्रतिरोध का मूल्यांकन
BH 1 0 1 0 0 1 0 1 0 4.17 6.48
2 1 0 0 0 3 1 0 1 8.33 R
3 1 0 0 0 0 0 3 1 6.94
XHJ 1 7 5 7 7 9 7 7 7 77.78 76.85
2 9 7 9 7 5 9 7 5 80.56 S
3 7 5 7 9 5 9 5 5 72.22

तालिका 4: रोग सूचकांक और बीएच और एक्सएचजे में प्रतिरोध। बीएच का औसत रोग सूचकांक 6.48 था, जो मानक के अनुसार प्रतिरोध (आर) दिखाता है, और एक्सएचजे का औसत रोग सूचकांक 76.85 था, जो मानक के अनुसार संवेदनशीलता (एस) दिखाता है।

जीनोटाइप Zoospore निलंबन ओट अनाज विधि
प्रयोग 1 प्रयोग 2 औसत वर्गीकरण प्रयोग 1 प्रयोग 2 औसत वर्गीकरण
BH 4.17 8.33 6.94 R 0 0 0 मैं
XHJ 77.78 80.56 72.22 S 84.89 90 87.45 एच एस
K326 12.5 12.5 12.5 R 5.39 15.67 10.53 R
Yunyan87 19.45 8.33 13.89 R 4.7 28.89 16.8 R
C42-4 21.28 21.89 21.59 श्री 7.56 13.11 10.33 R
C13-4 18.16 14.81 16.49 R 38.89 19.66 29.27 श्री
C9-5 77.41 77.78 77.6 S 79.83 82.86 81.34 एच एस
C46-8 55.56 51.11 53.34 सुश्री 62.91 72.65 67.78 S
C66-9 79.88 74.07 76.98 S 93.94 72.22 83.08 एच एस

तालिका 5: पी nicotianae zoospore निलंबन टीकाकरण विधि और जई अनाज टीकाकरण विधि के साथ विभिन्न जीनोटाइप में संक्रमण प्रतिक्रिया. Zoospore निलंबन टीकाकरण विधि छोटे रोपाई पर किया गया था, और जई अनाज टीकाकरण विधि वयस्क पौधों पर किया गया था। ये डेटा zoospore निलंबन टीकाकरण विधि और जई अनाज इनोक्यूलेशन विधि के बीच सहसंबंध को दर्शाते हैं। K326 और Yunyan87 में प्रतिरोध के मध्यवर्ती स्तर हैं, और C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 BH और XHJ के बीच एक क्रॉस की BC4F2 आबादी से संतान हैं। पौधों को प्रतिरक्षा, प्रतिरोधी, मध्यम प्रतिरोधी, मध्यम रूप से अतिसंवेदनशील, अतिसंवेदनशील, या उच्च अतिसंवेदनशील के रूप में वर्गीकृत किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रत्येक ग्रेड के लक्षण( ए) ग्रेड 0, पूरे पौधे के लक्षण मुक्त। (बी) ग्रेड 1, स्टेम घाव < 1/3 स्टेम परिधि या <1/3 पत्तियां मुरझाना। (ग) ग्रेड 3, तने की परिधि के 1/3 और 1/2 के बीच या पत्तियों के 1/3 और 1/2 के बीच स्टेम घाव थोड़ा मुरझाते हैं। (डी) ग्रेड 5, स्टेम घावों > तना परिधि के 1/2, लेकिन पूरी तरह से परिधि के आसपास नहीं, या पत्तियों के 1/2 और 2/3 के बीच नहीं। (ई) ग्रेड 7, पूरे तने परिधि के आसपास स्टेम घाव या पत्तियों के >2/3 मुरझाने के आसपास। (च) ग्रेड 9, पौधे मृत दिखते हैं। लाल तीर स्टेम घावों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: दो तम्बाकू जीनोटाइप में देखी गई भिन्नता। (A) प्रतिरोधी किस्म BH में पूरे पौधे के लक्षण मुक्त 3 दिन बाद टीका लगाने के बाद। (बी) स्टेम घाव तने की परिधि के लगभग 1/2 और पत्तियों के 1/2 हिस्से में एक्सएचजे में टीका लगाने के 3 दिनों के बाद थोड़ा मुरझाते हैं। (ग) पूरे पौधे के लक्षण प्रतिरोधी किस्म बीएच में मुक्त 4 दिन बाद टीकाकरण। (डी) स्टेम घावों को तने की परिधि के >1/2, लेकिन पूरी तरह से परिधि के आसपास नहीं, और 1/2 और 2/3 पत्तियों के बीच अतिसंवेदनशील किस्म एक्सएचजे में 4 दिन बाद टीकाकरण के बाद मुरझाते हैं। लाल तीर स्टेम घावों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: संक्रमित बीएच और एक्सएचजे में सापेक्ष पी. निकोटियाने बायोमास परिमाणीकरण 24 घंटे, 72 ज, और 168 एच पोस्ट इनोक्यूलेशन पर। इसकी गणना तम्बाकू 26S rRNA जीन की तुलना में P. nicotianae WS21 जीन प्रवर्धन के अनुपात के रूप में की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

खेती किए गए तम्बाकू में पी. निकोटियाने प्रतिरोध में सुधार करने के लिए कई प्रतिरोध स्रोतों का उपयोग किया गया है। एकल प्रमुख आर जीन, Php और Phl, Nicotiana plumbaginifolia और Nicotiana longiflora, क्रमशः 10 से introgressed किया गया है। सिगार तम्बाकू किस्म Beinhart 1000 P. nicotianae13 के लिए मात्रात्मक प्रतिरोध का उच्चतम स्तर है। एकाधिक अंतराल मानचित्रण प्रयोगों ने सुझाव दिया है कि कम से कम छह मात्रात्मक विशेषता लोकी (क्यूटीएल) इस लाइन 13,22 में प्रतिरोध में योगदान कर सकते हैं। ऊपर उल्लिखित प्रतिरोधी स्रोतों के अलावा, एक अन्य विदेशी जीन, Wz, को भी रेस 0 और रेस 123,24 के लिए प्रतिरोध के उच्च स्तर को प्रदान करने के लिए पाया गया है। कई प्रतिरोधी स्रोतों और प्रतिरोधी किस्मों की जटिल आनुवंशिक पृष्ठभूमि को ध्यान में रखते हुए, प्रतिरोध मूल्यांकन के लिए एक सटीक और विश्वसनीय विधि की आवश्यकता होती है 1) पी. निकोटियाना-प्रतिरोधी तंबाकू जीनोटाइप की पहचान, 2) प्रजनन प्रतिरोधी किस्में, और 3) पौधे-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के आणविक तंत्र अध्ययन। पी. निकोटियाने संक्रमण के निदान का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पिछले तरीके समय लेने वाले थे या टीकाकरण तीव्रता को नियंत्रित करना मुश्किल था। इसलिए, P. nicotianae प्रतिरोध मूल्यांकन के लिए एक नई विधि सेट करना आवश्यक है।

प्राकृतिक संक्रमण प्रक्रियाओं की नकल करना हमारी नई विधि में महत्वपूर्ण बिंदु है। सबसे पहले, पी. निकोटियाने के विशिष्ट जीवन चक्र के दौरान, zoospores प्रमुख संक्रामक एजेंट हैं जो पौधों की बीमारियों को शुरू करते हैं। एक बार जब zoospores पौधे की सतह तक पहुंच जाते हैं, तो वे स्थिर अल्सर बन जाते हैं, बाद में अंकुरित होते हैं, और रोगाणु ट्यूब बनाते हैं। फिर, एप्रेसोरिया रोगाणु ट्यूब25 की नोक पर उत्पादित होते हैं। हमारे प्रोटोकॉल में, zoospore निलंबन इनोकुलम के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जो प्राकृतिक संक्रमण की स्थिति की नकल करता है। दूसरे, Nicotiana benthamiana पत्तियों पर, अल्सर अंकुरित और 3 h26 पर epidermal कोशिकाओं उपनिवेशित. Arabidopsis जड़ों में, सभी encysted zoospores सफलतापूर्वक 6 ज पोस्ट इनोक्यूलेशन 27 पर जड़ों में प्रवेश किया। हमारे दृष्टिकोण में, टीकाकरण प्रक्रिया में अंधेरे में 3 घंटे के लिए पी. निकोटियाना ज़ूस्पोर निलंबन में जड़ों को डुबोना शामिल था, जो प्राकृतिक वातावरण की नकल करता है और रोगज़नक़ के उपनिवेशीकरण को बढ़ावा देता है, इसलिए स्थिर और प्रभावी संक्रमण के लिए अग्रणी है।

तम्बाकू में पी. निकोटियाना प्रतिरोध का आकलन करने के लिए सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया जाने वाला दृष्टिकोण, जई के अनाज की विधि, बड़ी संख्या में पौधों को टीका लगाने के लिए कुशल और आसान है7,11,12,13,14,15,16। हालांकि, इसमें कुछ कमियां हैं। मुख्य नुकसान अनियंत्रित टीका तीव्रता है, जो सटीक प्रजनन में इसके आवेदन को सीमित करता है। जई के अनाज विधि और अन्य दो मौजूदा दृष्टिकोणों की तुलना में, इस नए दृष्टिकोण में, ज़ूस्पोर निलंबन का उपयोग इनोकुलम के रूप में किया जाता है, इसलिए टीका लगाने की तीव्रता नियंत्रणीय और समायोज्य है। चूंकि पौधों को हाइड्रोपोनिक वातावरण में सुसंस्कृत किया जाता है, इसलिए मिट्टी का हस्तक्षेप समाप्त हो जाता है, जो मूल्यांकन सटीकता को बढ़ाता है। हालांकि, इस विधि के लिए एक सीमा मौजूद है, जो यह है कि इसका उपयोग वयस्क पौधों पर नहीं किया जा सकता है। दूसरी ओर, जई अनाज विधि, वयस्क पौधों की बड़े पैमाने पर प्रतिरोध स्क्रीनिंग के लिए लागू होती है7,13। इसलिए, यह विधि और जई अनाज विधि तम्बाकू के पौधे की विभिन्न विकास अवधियों के लिए और विभिन्न स्थितियों में एक-दूसरे के पूरक हो सकते हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल अंकुर चरण में पी. निकोटियाने द्वारा संक्रमण के लिए तम्बाकू के प्रतिरोध का मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रजनन के लिए और आणविक तंत्र अनुसंधान के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31571738) और चीन के कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार कार्यक्रम (ASTIP-TRIC01) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)2SO4 Sinopharm 10002917 Analytical Reagent
(NH4)6 Mo7O24•2 H2O Sinopharm XW131067681 Analytical Reagent
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30120086 Used for Sample Extarction
2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30120094 Used for Sample Extarction
Agar MDBio, Inc 9002-18-0 Materials of Culture Medium
Analytical Balance AOHAOSI AX2202ZH Equipment
Autoclave Yamatuo SQ510C Equipment
Autoclave YAMATUO SQ510C Equipment
Beaker Bio Best DHSB-2L Materials of Culture Medium
Biological Incubator JINGHONG SHP-250 Equipment
Ca(NO3)2•4 H2O Sinopharm 80029062 Analytical Reagent
CaCl2 Sinopharm 10005817 Analytical Reagent
CuSO4•5 H2O Sinopharm 10008218 Analytical Reagent
Electromagnetic Oven Bio Best DHDCL Equipment
FeSO4•7 H2O Sinopharm 10002918 Analytical Reagent
Filter Paper Bio Best DHLZ-9CM Material
Fluorescence Ration PCR Instrument Roche LightCycler96 Equipment
Gauze Bio Best 17071202 Materials of Culture Medium
H3BO3 Phytotechnology B210-500G Analytical Reagent
Hemocytometer Solarbio 17072801 Material for disease-resistant  identification
K2SO4 Sinopharm 10017918 Analytical Reagent
KNO3 Sinopharm 10017218 Analytical Reagent
KT Foam Sheet Bio Best DHKTB Material for Seedling
Low Constant Incubator Jinghong SHP-250 Equipment
Measuring Cylinder Bio Best DHBLLT-1000ML Materials of Culture Medium
MgSO4•7 H2O Sinopharm 10013080 Analytical Reagent
Microscope ECHO RVL-100-G Equipment
MnCl2•4 H2O Sinopharm G5468154 Analytical Reagent
Na2-EDTA Sinopharm G21410-250 Analytical Reagent
NaH2PO4•2 H2O Sinopharm 20040717 Analytical Reagent
NH4NO3 Sinopharm B64586-100g Analytical Reagent
Oatmeal Bio Best DHYMP-1.5KG Materials of Culture Medium
Petri Dish Bio Best DHPYM-9CM Material for disease-resistant  identification
Pipettor THERMO S1 Equipment
Potting Bio Best DHYCXHP-12CM Material for Seedling
Potting Soil Bio Best DHYMJZ-50L Seedling Material
Punch Bio Best DHDKW Material
qRT-PCR Plate Monad MQ50401S qRT-PCR Plate
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit Accurate Biology AG11718 PCR Reagent
Toothpick Bio Best DHYQ-900 Material
Total RNA Kit II Omega R6934-01 PCR Reagent
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Transgen AH311-02 PCR Reagent
Trays Bio Best DHYMTP-90G Material for Seedling
Vermiculite Bio Best DHZS Seedling Material
Water Purification System HEAL FORCE HSE68-2 Equipment
ZnSO4•7 H2O Sinopharm 10024018 Analytical Reagent

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References

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जीव विज्ञान अंक 182 Phytophthora nicotianae काले शैंक जर्मप्लाज्म संयंत्र प्रतिरोध अतिसंवेदनशील हाइड्रोपोनिक खेती zoospore निलंबन
<em>Phytophthora nicotianae</em> प्रतिरोध के लिए तम्बाकू जीनोटाइप की स्क्रीनिंग
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Liu, Y., Sun, M., Jiang, Z., Wang,… More

Liu, Y., Sun, M., Jiang, Z., Wang, X., Xiao, B., Yang, A., Meng, H., Cheng, L. Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance. J. Vis. Exp. (182), e63054, doi:10.3791/63054 (2022).

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