Summary
Aquí, se presenta un protocolo para la detección eficiente y precisa de genotipos de tabaco para la resistencia a Phytophthora nicotianae en plántulas. Este es un enfoque práctico para la cría de precisión, así como para la investigación de mecanismos moleculares.
Abstract
El vástago negro, causado por los oomicetos Phytophthora nicotianae, es destructivo para el tabaco, y este patógeno es altamente patógeno para muchos cultivos solanáceos. P. nicotianae está bien adaptado a las altas temperaturas; por lo tanto, la investigación sobre este patógeno está ganando importancia en la agricultura de todo el mundo debido al calentamiento global. Las variedades de plantas de tabaco resistentes a P. nicotianae se examinan comúnmente mediante inoculación con granos de avena colonizados por P. nicotianae y monitoreo de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, es difícil cuantificar la intensidad de la inoculación ya que la inoculación precisa es crucial en este caso. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un método eficiente y confiable para evaluar la resistencia del tabaco a la infección por P. nicotianae. Este método se ha utilizado con éxito para identificar variedades resistentes, y la eficiencia de la inoculación se confirmó mediante PCR en tiempo real. El método de evaluación de la resistencia presentado en este estudio es eficiente y práctico para la cría de precisión, así como para la investigación de mecanismos moleculares.
Introduction
P. nicotianae es destructivo para muchos cultivos solanáceos. Puede causar "vástago negro"1 del tabaco, podredumbre foliar y tubérculo de patata2, podredumbre de la corona y la raíz del tomate y el pimiento dulce3, y podredumbre del collar y la raíz de Goji4. P. nicotianae puede atacar todas las partes de las plantas de tabaco, incluidas las raíces, tallos y hojas en cualquier etapa de crecimiento5. El síntoma más común de la enfermedad es la base negra del tallo. Las raíces son inicialmente visibles como empapadas en agua y luego se vuelven necróticas, y las hojas muestran grandes lesiones circulares5. Esta enfermedad puede ser devastadora para una planta de tabaco en el invernadero, así como en el campo6. El método más práctico y económico para controlar P. nicotianae es el uso de variedades resistentes7. Sin embargo, se requiere un protocolo de detección eficaz para la identificación de accesiones resistentes a P. nicotianae de las colecciones de germoplasma de tabaco.
Se han descrito diversos métodos de identificación para evaluar la resistencia a P. nicotianae en el tabaco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. En general, se han utilizado tres enfoques principales para la identificación de genotipos de tabaco resistentes a P. nicotianae. El primero incluye mezclar micelios con medio agar en placas de Petri que contengan P. nicotianae. Los micelios se cultivan en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 semanas. Se añade 1 L de agua desionizada al micelio y se homogeneiza durante 30 s. El inóculo se mantiene en hielo hasta que sea necesario. Se hacen dos agujeros (1 cm de diámetro y 4-5 cm de profundidad) a cada lado de la planta, y se vierten 10 ml del inóculo en cada agujero. Los agujeros se llenan con el suelo circundante, y el desarrollo de enfermedades se monitorea diariamente durante 2 semanas8,10.
En el segundo método, las plantas se inoculan con palillos de dientes infestados de patógenos. Para este enfoque, las plantas deben usarse aproximadamente 6 semanas después del trasplante y deben tener una altura mínima de 30 cm. Los palillos de dientes en autoclave se colocan en la superficie de cultivos que contienen micelio de P. nicotianae. Los platos de cultivo se almacenan bajo la luz a temperatura ambiente durante 7 días. Luego, los palillos de dientes colonizados se utilizan para inocular las plantas. Los palillos de dientes se insertan en los tallos del tabaco entre el cuarto y quinto ganglio. Las plantas son monitoreadas diariamente durante 5 días9,15. Este método no es aplicable para plántulas pequeñas. Como el inóculo son palillos de dientes infestados de patógenos, la intensidad de la inoculación no se puede controlar con precisión.
El enfoque más utilizado involucra granos de avena para la inoculación. En este caso, los granos de avena se preparan en autoclave 500 ml de avena y 300 ml de agua desionizada a 121 °C durante 1 h una vez al día durante 3 días. Luego, los granos de avena se agregan al medio de cultivo colonizado por patógenos. Los platos se sellan con película de parafina y se incuban a 25 °C a la luz durante 7-12 días. Se hacen cuatro agujeros separados de 5 cm de profundidad en el suelo para macetas, a 4 cm de cada planta, y se coloca un grano de avena infestado de patógenos en cada agujero. El período de incubación se determina en función de cuándo se produce el primer síntoma sobre el suelo7,11,12,13,14,15,16. Este método es eficiente y aplicable para el cribado de resistencia a gran escala. Sin embargo, una limitación de este enfoque es que el inóculo son granos de avena infestados de patógenos, por lo tanto, la intensidad de la inoculación no se puede controlar con precisión.
Sin embargo, aquí se presenta un método más preciso que es aplicable a la evaluación de la resistencia de la cámara de crecimiento. En comparación con los otros enfoques, el inóculo es suspensión de zoosporas, por lo tanto, la intensidad de la inoculación es controlable y ajustable. Como las plantas de tabaco en este estudio se cultivan sin tierra, los resultados son más fáciles de observar. Además, el muestreo de las raíces de las plantas del suelo siempre causa daños en las raíces, lo que induce una serie de respuestas fisiológicas17. En este método, como las plantas se cultivan sin tierra, se puede eliminar la interferencia en el daño de la raíz. En conclusión, este método es más práctico para la investigación de mecanismos moleculares y la cría de precisión. Usando este protocolo, los datos generalmente se obtienen dentro de los 5 días, con más de 200 plantas evaluadas en un solo experimento.
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Protocol
1. Materiales
- Obtener variedades de tabaco.
NOTA: Para este experimento se obtuvieron "Beinhart1000-1" (una selección de Beinhart 1000) (BH) y "Xiaohuangjin1025" (XHJ) del Genbank Nacional a Mediano Plazo del Recurso de Germoplasma de Tabaco de China. Bh es resistente, mientras que XHJ es susceptible a la infección por P. nicotianae16. Un aislado de campo de P. nicotianae raza 0, que se conservó en el Instituto de Investigación del Tabaco de la Academia China de Ciencias Agrícolas, se utilizó para todas las inoculaciones a lo largo del estudio.
2. Plantación de genotipos de tabaco para la evaluación de la resistencia a P. nicotianae
- Mezcle las semillas de tabaco con vermiculita y transmita las semillas suavemente sobre el suelo esterilizado para macetas. Coloque las macetas en la cámara de crecimiento. Mantener una temperatura constante de 25 °C, bajo un fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de oscuridad.
- Prepare dispositivos hidropónicos con bandejas y láminas de espuma. Después de que las semillas germinen, pinche las plántulas de la tierra para macetas, lave las raíces suavemente con agua desionizada estéril y trasplantarlas a los dispositivos hidropónicos.
- Coloque los dispositivos en cámaras climáticas a 25 °C bajo un fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de oscuridad durante 24 h.
- Prepare la solución nutritiva de Hoagland de antemano (Tabla 1). Transplante las plántulas a dispositivos hidropónicos con solución nutritiva de Hoagland (aproximadamente 125 ml por planta).
- Coloque los dispositivos en una cámara climática a 25 °C bajo un fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de oscuridad durante 2 semanas.
3. Preparación de la suspensión de zoosporas de P. nicotianae
- Preparar agar de avena medio.
- Pesar 33 g de avena y transferir a cristalería y añadir 1.000 ml de agua estéril. Hervir en un horno electromagnético.
- Después de que la avena se vuelva pegajosa, cuele la solución líquida a través de un trozo de gasa estéril.
- Vierta la solución líquida en un cilindro graduado de 1.000 ml y ajuste el volumen a 1.000 ml con agua estéril.
- Vierta la solución líquida en una botella de reactivo de vidrio y agregue 18 g de agar. Agitar bien y autoclave la mezcla (medio de agar de avena) a 121 °C durante 15 min. Déjalo a temperatura ambiente durante 30 min.
- Vierta alrededor de 20 ml del medio de agar de avena esterilizado en cada placa de Petri. Deje que las placas de Petri a temperatura ambiente se enfríen completamente antes del cultivo micelial.
- Realizar cultivos miceliales.
- Prepare de antemano punzones y palillos de dientes de 1 cm de diámetro poniéndolos en autoclave a 121 °C durante 15 min.
- Perfora agujeros en los cultivos de agar micelio de P. nicotianae para hacer esteras miceliales redondas.
- Escoja las esteras miceliales, coloque el lado micelio hacia abajo en el medio de agar de avena e incube el micelio a 25 ° C en la oscuridad durante 14 días.
- Preparar la suspensión de la zoospora P. nicotianae .
- Añadir una solución de KNO3 al 0,1% a cada cultivo micelio (15 ml/plato), seguido de un cultivo a 4 °C durante 20 min para inducir el esporangio.
- Mantenga los platos a 25 °C durante 25 minutos para liberar zoosporas.
- Recoja la suspensión de zoosporas en un vaso de precipitados y mida la concentración de zoosporas utilizando un microscopio y un hemocitómetro.
- Ajuste la concentración de zoosporas a 1 x 104 zoosporas/ml con agua estéril.
4. Identificación de variedades de tabaco resistentes a las enfermedades
- Tome las plántulas de la solución nutritiva de Hoagland e inocule sumergiendo las raíces en 20 ml de suspensión de zoosporas de P. nicotianae en una placa de Petri (90 mm) a 25 ° C durante 3 h en la oscuridad.
- Después de la inoculación, coloque las plántulas de tabaco en nuevas placas de Petri con 10 ml de agua estéril sumergiendo las raíces. Mantenga las raíces húmedas cubriendo con dos trozos de papel de filtro. Mantenga los platos a 25 °C con un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad.
- Después de 2-3 días, observe la gravedad de la enfermedad.
- Para el tratamiento de control, coloque las plántulas de tabaco directamente en las placas de Petri con 10 ml de agua estéril sumergiendo las raíces y cubra las raíces con dos trozos de papel de filtro.
NOTA: Cada tratamiento tuvo tres replicaciones, con 8 plantas por experimento.
- Para el tratamiento de control, coloque las plántulas de tabaco directamente en las placas de Petri con 10 ml de agua estéril sumergiendo las raíces y cubra las raíces con dos trozos de papel de filtro.
5. Evaluación de la infección por P. nicotianae
- Evaluar la gravedad de la enfermedad 4-5 días después de la inoculación. Basado en la norma nacional china18, puntúe la gravedad de las enfermedades de las plantas individuales en una escala de 0 a 9 (Tabla 2, Figura 1).
- Calcule el índice de enfermedad utilizando la siguiente fórmula18:
Índice de enfermedad =
donde a, b, c, d, e y f son el número de plantas en cada grado de gravedad de la enfermedad.
NOTA: La gravedad de la enfermedad se dividió en 6 grados18 (Tabla 3).
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Representative Results
Las plantas de 4 semanas de edad de la variedad resistente BH y la variedad susceptible XHJ fueron desafiadas con P. nicotianae utilizando el método presentado en este artículo. El experimento fue diseñado con tres réplicas, cada una con 8 plantas por grupo. La infección por P. nicotianae de las dos variedades de tabaco, BH y XHJ, se presenta en la Figura 2. A los 3 días después de la inoculación, para XHJ, las lesiones del tallo cubrieron aproximadamente la mitad de la circunferencia del tallo, y la mitad de las hojas estaban ligeramente marchitas; en la variedad resistente BH, no se observaron síntomas. A los 4 días después de la inoculación, se produjeron marchitamiento de las hojas y lesiones graves en el tallo en XHJ, mientras que estos síntomas no aparecieron en BH.
A los 5 días después de la inoculación, se registró y calculó la gravedad de la enfermedad de las plantas individuales sobre la base de la norma nacional china para el "Grado y método de investigación de enfermedades del tabaco y plagas de insectos"18 (Tabla 4). El índice medio de enfermedad de BH fue de 6,48, que se consideró resistente (R) según el estándar, y el índice medio de enfermedad de XHJ fue de 76,85, que se consideró susceptible (S) según el estándar.
Para confirmar la eficiencia de la inoculación, la biomasa relativa del patógeno se cuantificó mediante PCR en tiempo real (Figura 3). El ADN genómico de plantas y patógenos se aisló de BH y XHJ infectados y se recolectó a las 24 h, 72 h y 168 h después de la infección utilizando el protocolo CTAB19. La biomasa relativa de patógenos se cuantificó utilizando los pares de cebadores Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCCTCTTCAG-3'), amplificando la proteína ribosómica 40S S3A (WS21) de P. nicotianae20, y Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'), amplificando el gen de referencia del tabaco 26S rRNA gen21. Los cambios en el pliegue de expresión entre el patógeno y el gDNA del tabaco se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCT Ct. Los resultados de la PCR en tiempo real confirmaron las observaciones fenotípicas.
Se evaluaron cinco progenies de la población BC4F2 de un cruce entre BH y XHJ y dos variedades de resistencia intermedia, K326 y Yunyan87, utilizando el método de inoculación en suspensión de zoosporas y el método de inoculación de granos de avena (Tabla 5). El método de suspensión de zoosporas se realizó en plántulas pequeñas, y el método de inoculación de granos de avena se realizó en plantas adultas. Para las cinco progenies de la población BC4F2, el índice de enfermedad varió de 16.49 a 77.60 para el método de suspensión de zoosporas y de 10.33 a 83.08 para el método de granos de avena. Las clasificaciones de resistencia entre los dos métodos de infección fueron en su mayoría consistentes entre sí. Con las dos variedades de resistencia intermedia, K326 y Yunyan87, la evaluación mostró "resistente" en ambos métodos. Estos datos ilustran la correlación entre los dos métodos de inoculación, a pesar de que se realizan en plantas de tabaco en diferentes períodos de crecimiento.
| Licor original | Proporción | Volumen de licor original (ml) | Elementos nutritivos | Contenido (g) |
| OL 1 | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| OL 3 | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | 1000× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| OL 5 | 1000× | 500 | (NH4) número arábigo SO4 | 123.75 |
| OL 6 | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| Cuso4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tabla 1: Solución nutritiva de Hoagland.
| Grado | Aparición del fenotipo |
| Grado 0 | Sin síntomas en toda la planta |
| Grado 1 | Lesiones del tallo < 1/3 de la circunferencia del tallo o <1/3 de las hojas marchitarse |
| Grado 3 | Lesiones del tallo entre 1/3 y 1/2 de la circunferencia del tallo o entre 1/3 y 1/2 de las hojas ligeramente marchitas |
| Grado 5 | Las lesiones del tallo >1/2 de la circunferencia del tallo, pero no completamente alrededor de la circunferencia, o entre 1/2 y 2/3 de las hojas marchitando |
| Grado 7 | Lesiones del tallo alrededor de la circunferencia completa del tallo o >2/3 de las hojas marchitarse |
| Grado 9 | Las plantas parecen muertas |
Tabla 2: Clasificación de la gravedad de la enfermedad del vástago negro. Sobre la base de la norma nacional china para el "Grado y método de investigación de enfermedades del tabaco y plagas de insectos" (GB/ T 23222-2008), la gravedad de la enfermedad de las plantas individuales se calificó en una escala de 0 a 9.
| Índice de enfermedad | Evaluación de la resistencia |
| 0 | Altamente resistente o inmune (I) |
| 0,1 a 20 | Resistente (R) |
| 20,1 a 40 | Moderadamente resistente (MR) |
| 40,1 a 60 | Moderadamente susceptible (EM) |
| 60,1 a 80 | Susceptible (S) |
| 80,1 a 100 | Altamente susceptible (SA) |
Tabla 3: Evaluación de la resistencia según índice de enfermedad. La gravedad de la enfermedad se dividió en 6 grados de acuerdo con el índice de enfermedad. 0 significa altamente resistente o inmune (I), 0.1 a 20 significa resistente (R), 20.1 a 40 significa moderadamente resistente (MR), 40.1 a 60 significa moderadamente susceptible (MS), 60.1 a 80 significa susceptible (S), 80.1 a 100 significa altamente susceptible (HS).
| Cultivar | Repetir | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Índice de enfermedad | Significar | Evaluación de la resistencia | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tabla 4: Índice de enfermedad y resistencia en BH y XHJ. El índice medio de enfermedad de BH fue de 6,48, que muestra resistencia (R) según el estándar, y el índice medio de enfermedad de XHJ fue de 76,85, lo que muestra susceptibilidad (S) según el estándar.
| Genotipo | Suspensión de zoosporas | Método de granos de avena | ||||||
| Experimento 1 | Experimento 2 | Significar | Clasificación | Experimento 1 | Experimento 2 | Significar | Clasificación | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Yo |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | SR | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | SR |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | SRA. | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tabla 5: Respuesta a la infección por P. nicotianae en diferentes genotipos con el método de inoculación en suspensión de zoosporas y el método de inoculación de granos de avena. El método de inoculación en suspensión de zoosporas se realizó en plántulas pequeñas, y el método de inoculación de granos de avena se realizó en plantas adultas. Estos datos ilustran la correlación entre el método de inoculación en suspensión de zoosporas y el método de inoculación de granos de avena. K326 y Yunyan87 tienen niveles intermedios de resistencia, y C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 son progenies de la población BC4F2 de un cruce entre BH y XHJ. Las plantas se clasificaron como inmunes, resistentes, moderadamente resistentes, moderadamente susceptibles, susceptibles o altamente susceptibles.
Figura 1: Síntoma de cada grado. (A) Grado 0, planta entera libre de síntomas. (B) Grado 1, lesión del tallo <1/3 de la circunferencia del tallo o <1/3 hojas marchitadas. (C) Grado 3, lesiones del tallo entre 1/3 y 1/2 de la circunferencia del tallo o entre 1/3 y 1/2 de las hojas ligeramente marchitas. (D) Grado 5, las lesiones del tallo >1/2 de la circunferencia del tallo, pero no completamente alrededor de la circunferencia, o entre 1/2 y 2/3 de las hojas marchitándose. (E) Grado 7, lesiones del tallo alrededor de la circunferencia de todo el tallo o >2/3 de las hojas marchitando. (F) Grado 9, las plantas parecen muertas. Las flechas rojas indican las lesiones del tallo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Variación observada en dos genotipos de tabaco. (A) Planta entera libre de síntomas en la variedad resistente BH 3 días después de la inoculación. (B) Las lesiones del tallo son alrededor de 1/2 de la circunferencia del tallo y 1/2 de las hojas ligeramente marchitas en XHJ 3 días después de la inoculación. (C) Planta entera libre de síntomas en la variedad resistente BH 4 días después de la inoculación. (D) Las lesiones del tallo >1/2 de la circunferencia del tallo, pero no completamente alrededor de la circunferencia, y entre 1/2 y 2/3 de las hojas marchitándose en la variedad susceptible XHJ 4 días después de la inoculación. Las flechas rojas indican las lesiones del tallo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación relativa de la biomasa de P. nicotianae en BH y XHJ infectados a las 24 h, 72 h y 168 h después de la inoculación. Esto se calcula como la relación de amplificación del gen P. nicotianae WS21 en comparación con el gen 26S rRNA del tabaco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se han utilizado múltiples fuentes de resistencia para mejorar la resistencia de P. nicotianae en el tabaco cultivado. Los genes R dominantes individuales, Php y Phl, han sido introgresados a partir de Nicotiana plumbaginifolia y Nicotiana longiflora, respectivamente10. La variedad de tabaco de cigarro Beinhart 1000 tiene el nivel más alto reportado de resistencia cuantitativa a P. nicotianae13. Múltiples experimentos de mapeo de intervalos han sugerido que al menos seis loci de rasgos cuantitativos (QTL) pueden contribuir a la resistencia en esta línea13,22. Además de las fuentes resistentes mencionadas anteriormente, también se ha encontrado que otro gen alienígena, Wz, confiere un alto nivel de resistencia a la raza 0 y la raza 123,24. Teniendo en cuenta las múltiples fuentes resistentes y los complicados antecedentes genéticos de las variedades resistentes, se requiere un método preciso y confiable para la evaluación de la resistencia para 1) la identificación de genotipos de tabaco resistentes a P. nicotianae, 2) el mejoramiento de variedades resistentes y 3) estudios de mecanismos moleculares de interacciones planta-patógeno. Los métodos anteriores utilizados para evaluar la gravedad de la infección por P. nicotianae consumían mucho tiempo o las intensidades de inoculación eran difíciles de controlar. Por lo tanto, es urgente establecer un nuevo método para la evaluación de la resistencia de P. nicotianae.
Imitar los procesos de infección naturales es el punto clave en nuestro nuevo método. En primer lugar, durante el ciclo de vida típico de P. nicotianae, las zoosporas son los principales agentes infecciosos que inician las enfermedades de las plantas. Una vez que las zoosporas alcanzan la superficie de la planta, se convierten en quistes inmóviles, posteriormente germinan y forman tubos germinales. Luego, los appressoria se producen en la punta de los tubos germinales25. En nuestro protocolo, la suspensión de zoosporas se utilizó como inóculo, que imita la situación de infección natural. En segundo lugar, en las hojas de Nicotiana benthamiana, los quistes germinaron y colonizaron las células epidérmicas a 3 h26. En las raíces de Arabidopsis, todas las zoosporas enquistadas penetraron con éxito en las raíces a las 6 h después de la inoculación27. En nuestro enfoque, el proceso de inoculación implicó sumergir las raíces en una suspensión de zoosporas de P. nicotianae durante 3 h en la oscuridad, que imita el entorno natural y promueve la colonización del patógeno, lo que lleva a una infección estable y efectiva.
El enfoque más utilizado para evaluar la resistencia de P. nicotianae en el tabaco, el método de los granos de avena, es eficiente y fácil para inocular un gran número de plantas7,11,12,13,14,15,16. Sin embargo, tiene algunos inconvenientes. La principal desventaja es la intensidad incontrolada de la inoculación, que limita su aplicación en la cría de precisión. En comparación con el método de granos de avena y los otros dos enfoques existentes, en este nuevo enfoque, la suspensión de zoosporas se utiliza como inóculo, por lo que la intensidad de la inoculación es controlable y ajustable. Como las plantas se cultivan en un ambiente hidropónico, se elimina la interferencia del suelo, lo que aumenta la precisión de la evaluación. Sin embargo, existe una limitación para este método, que es que no se puede utilizar en plantas adultas. El método del grano de avena, por otro lado, es aplicable para el cribado de resistencia a gran escala de plantas adultas7,13. Por lo tanto, este método y el método del grano de avena pueden complementarse entre sí para diferentes períodos de crecimiento de la planta de tabaco y en diferentes situaciones.
El protocolo descrito aquí es un método eficiente y confiable para evaluar la resistencia del tabaco a la infección por P. nicotianae en la etapa de plántula. Este protocolo se puede utilizar para la cría y para la investigación de mecanismos moleculares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31571738) y el Programa de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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