Summary
Här presenteras ett protokoll för effektiv och korrekt screening av tobaksgenotyper för Phytophthora nicotianae motstånd i plantor. Detta är ett praktiskt tillvägagångssätt för precisionsuppfödning, liksom molekylär mekanismforskning.
Abstract
Svart skaft, orsakad av oomycetes Phytophthora nicotianae, är destruktiv för tobak, och denna patogen är högpatogen för många solanaceous grödor. P. nicotianae är väl anpassad till höga temperaturer; Därför blir forskningen om denna patogen allt viktigare inom jordbruket över hela världen på grund av den globala uppvärmningen. P. nicotianae-resistenta sorter av tobaksplantor screenas ofta genom inokulering med havrekorn koloniserade av P. nicotianae och övervakning för sjukdomssymptomen. Det är dock svårt att kvantifiera inokuleringsintensiteten eftersom korrekt inokulering är avgörande i detta fall. Denna studie syftade till att utveckla en effektiv och tillförlitlig metod för att utvärdera tobakens motståndskraft mot infektion med P. nicotianae. Denna metod har framgångsrikt använts för att identifiera resistenta sorter, och inokuleringseffektiviteten bekräftades av PCR i realtid. Den resistensutvärderingsmetod som presenteras i denna studie är effektiv och praktisk för precisionsuppfödning, samt molekylär mekanismforskning.
Introduction
P. nicotianae är destruktiv för många solanaceous grödor. Det kan orsaka tobak "svart skaft"1, potatisfoliering och knölrot2, tomat- och paprikakrona och rotrot3 och Goji krage och rotrot4. P. nicotianae kan attackera alla delar av tobaksplantor, inklusive rötter, stjälkar och löv i alla odlingsstadier5. Det vanligaste symptomet på sjukdomen är stjälkens svarta bas. Rötterna är initialt synliga som vattendränkta och blir sedan nekrotiska, och bladen visar stora cirkulära lesioner5. Denna sjukdom kan vara förödande för en tobaksväxt i växthuset, liksom i fältet6. Den mest praktiska och ekonomiska metoden för att kontrollera P. nicotianae är användningen av resistenta sorter7. Det krävs dock ett effektivt screeningprotokoll för identifiering av P. nicotianae-resistenta anslutningar från tobaksgroddsplasma samlingar.
Olika identifieringsmetoder har beskrivits för att bedöma P. nicotianaresistens hos tobak7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. I allmänhet har tre huvudsakliga metoder använts för identifiering av P. nicotianae-resistenta tobaks genotyper. Den första inkluderar blandning av mycelia med agarmedium på Petri-plattor som innehåller P. nicotianae. Mycelia odlas sedan i mörkret vid rumstemperatur i 2 veckor. 1 L avjoniserat vatten tillsätts mycelia och homogeniseras i 30 s. Inokulat hålls på is tills det behövs. Två hål (1 cm i diameter och 4-5 cm djupa) görs på varje sida av växten, och 10 ml inokulat hälls i varje hål. Hålen fylls sedan med den omgivande jorden och sjukdomsutvecklingen övervakas dagligen i 2 veckor8,10.
I den andra metoden inokuleras växterna med patogeninfekterade tandpetare. För detta tillvägagångssätt bör växterna användas cirka 6 veckor efter transplantation och bör ha en minimihöjd på 30 cm. Autoklaverade tandpetare placeras på ytan av kulturer som innehåller P. nicotianae mycelia. Odlingsfaten förvaras sedan under ljuset i rumstemperatur i 7 dagar. Sedan används koloniserade tandpetare för att inokulera växterna. Tandpetare sätts in i tobaksstammarna mellan den fjärde och femte noderna. Växterna övervakas dagligen i 5 dagar9,15. Denna metod är inte tillämplig för små plantor. Eftersom inokulat är patogeninfekterade tandpetare kan inokuleringsintensiteten inte kontrolleras exakt.
Det vanligaste tillvägagångssättet involverar havrekorn för inokulering. I detta fall bereds havrekorn genom autoklavering 500 ml havre och 300 ml avjoniserat vatten vid 121 °C i 1 timme en gång per dag i 3 dagar. Sedan läggs havrekorn till det patogenkoloniserade odlingsmediet. Rätterna förseglas med paraffinfilm och inkuberas vid 25 °C i ljus i 7-12 dagar. Fyra separata 5 cm djupa hål görs på pottingjorden, 4 cm från varje växt, och en patogeninfekterad havrekorn placeras i varje hål. Inkubationstiden bestäms baserat på när det första symptomet ovan jord inträffar7,11,12,13,14,15,16. Denna metod är effektiv och tillämplig för storskalig resistensscreening. En begränsning av detta tillvägagångssätt är dock att inokulat är patogeninfekterade havrekorn, därför kan inokuleringsintensiteten inte kontrolleras exakt.
Presenteras här är dock en mer exakt metod som är tillämplig på tillväxtkammare motstånd utvärdering. Jämfört med de andra metoderna är inokulat zoospore suspension, därför är inokuleringsintensiteten kontrollerbar och justerbar. Eftersom tobaksplantorna i denna studie odlas utan jord är resultaten lättare att observera. Dessutom orsakar provtagning av växtrötter från jorden alltid skador på rötterna, vilket inducerar en serie fysiologiska svar17. I denna metod, eftersom växter odlas utan jord, kan störningen i rotskador elimineras. Sammanfattningsvis är denna metod mer praktisk för molekylär mekanismforskning och precisionsuppfödning. Med hjälp av det här protokollet erhålls data vanligtvis inom 5 dagar, med mer än 200 växter utvärderade i ett enda experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Material
- Få tobakssorter.
OBS: För detta experiment erhölls "Beinhart1000-1" (ett urval av Beinhart 1000) (BH) och "Xiaohuangjin1025" (XHJ) från National Medium-term Genbank of the Tobacco Germplasm Resource of China. BH är resistent, medan XHJ är mottaglig för P. nicotianae infektion16. En fältisolat av P. nicotianae race 0, som bevarades i Tobacco Research Institute vid Chinese Academy of Agricultural Sciences, användes för alla vaccinationer under hela studien.
2. Plantering av tobaksgenotyper för P. nicotianaresistensutvärdering
- Blanda tobaksfrön med vermikulit och sänd fröna försiktigt på den steriliserade pottingjorden. Placera krukorna i tillväxtkammaren. Håll en konstant temperatur på 25 °C, under en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod.
- Förbered hydroponiska enheter med brickor och skumplåtar. Efter att fröna gror, pricka plantor ut från pottingjorden, tvätta rötterna försiktigt med sterilt avjoniserat vatten och transplantera dem till de hydroponiska enheterna.
- Placera enheterna i klimatkammare vid 25 °C under en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod i 24 timmar.
- Förbered Hoaglands näringslösning i förväg (tabell 1). Transplantera plantorna till hydroponiska enheter med Hoagland näringslösning (cirka 125 ml per växt).
- Placera enheterna i en klimatkammare vid 25 °C under en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod i 2 veckor.
3. Beredning av suspension av P. nicotianae zoospore
- Förbered havregryn agar medium.
- Väg 33 g havregryn och överför till glas och tillsätt 1000 ml sterilt vatten. Koka på en elektromagnetisk ugn.
- När havregrynet blir klibbigt, spänna den flytande lösningen genom en bit steril gasväv.
- Häll vätskelösningen i en 1000 ml graderad cylinder och justera volymen till 1 000 ml med sterilt vatten.
- Häll vätskelösningen i en glasreagensflaska och tillsätt 18 g agar. Skaka väl och autoklav blandningen (havregryns agar medium) vid 121 °C i 15 min. Låt det vara i rumstemperatur i 30 minuter.
- Häll cirka 20 ml steriliserat havregrynsgarmedel i varje Petri-maträtt. Låt Petri-disken svalna i rumstemperatur för att svalna ordentligt före mycelial odling.
- Utför mycelial odling.
- Förbered 1 cm diameter stansar och tandpetare i förväg genom att autoklavera dem vid 121 °Cfor 15 min.
- Stansa hål i P. nicotianae mycelial agar kulturer för att göra runt mycelial mattor.
- Plocka ut mycelialmattorna, placera mycelialsidan ner på havregrynsagarmediet och inkubera myceliet vid 25 °C i mörkret i 14 dagar.
- Förbered P. nicotianae zoospore suspension.
- Tillsätt 0,1% KNO3-lösning till varje mycelial odling (15 ml/skål), följt av odling vid 4 °C i 20 minuter för att inducera sporangium.
- Håll disken vid 25 °C i 25 minuter för att frigöra zoosporer.
- Samla zoospore suspension i en bägare och mäta zoospore koncentrationen med hjälp av ett mikroskop ochhemocytometer.
- Justera zoosporkoncentrationen till 1 x 104 zoosporer/ml med sterilt vatten.
4. Identifiering av sjukdomsresistenta tobakssorter
- Ta plantorna från Hoagland näringslösning och vaccinera dem genom att nedsänka rötterna i 20 ml P. nicotianae zoospore suspension i en Petri-maträtt (90 mm) vid 25 °C i 3 timmar i mörkret.
- Efter inokulering, sätt tobaksplantorna i nya Petri-rätter med 10 ml sterilt vatten som nedsänker rötterna. Håll rötterna fuktiga genom att täcka med två bitar filterpapper. Håll disken vid 25 °C med en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod.
- Efter 2-3 dagar, observera sjukdomens svårighetsgrad.
- För kontrollbehandlingen, lägg tobaksplantorna direkt i Petri-disken med 10 ml sterilt vatten som nedsänker rötterna och täck rötterna med två bitar filterpapper.
OBS: Varje behandling hade tre replikationer, med 8 växter per experiment.
- För kontrollbehandlingen, lägg tobaksplantorna direkt i Petri-disken med 10 ml sterilt vatten som nedsänker rötterna och täck rötterna med två bitar filterpapper.
5. Utvärdering av P. nicotianaeinfektion
- Utvärdera sjukdomens svårighetsgrad 4-5 dagar efter inokulering. På grundval av den kinesiska nationella standarden18 får du poäng individuella växtsjukdomar på en skala från 0 till 9 (tabell 2, figur 1).
- Beräkna sjukdomsindexet med följande formel18:
Sjukdomsindex =
där a, b, c, d, e och f är antalet växter i varje sjukdoms allvarlighetsgrad.
OBS: Sjukdomens svårighetsgrad delades in i 6 årskurser18 (tabell 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 veckor gamla växter av den resistenta sorten BH och mottagliga sorten XHJ utmanades med P. nicotianae med hjälp av metoden som presenteras i denna artikel. Experimentet utformades med tre replikat, var och en med 8 växter per grupp. P. nicotianae infektion av de två tobakssorterna, BH och XHJ, presenteras i figur 2. Vid 3 dagar post inokulering, för XHJ, stamskador täckte ungefär hälften av stjälk omkretsen, och hälften av bladen var något vissna. i den resistenta sorten BH observerades inga symtom. Vid 4 dagar post inokulering inträffade blad vissnande och allvarliga stamskador i XHJ, medan dessa symtom inte uppträdde i BH.
Vid 5 dagar efter inokulering registrerades och beräknades den individuella växtsjukdomens svårighetsgrad på grundval av den kinesiska nationella standarden för "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests"18 (tabell 4). Medelvärdet för sjukdom index för BH var 6,48, som ansågs vara resistenta (R) enligt standarden, och medelvärdet sjukdom index för XHJ var 76,85, som ansågs mottagliga (S) enligt standarden.
För att bekräfta inokuleringseffektiviteten kvantifierades relativ patogenbiomassa med pcr i realtid (figur 3). Växt- och patogengenomisk DNA isolerades från infekterade BH och XHJ och samlades in vid 24 h, 72 h och 168 h efter infektion med ctab protokollet19. Relativ patogen biomassa kvantifierades med hjälp av primerparen Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCTCCTCAG-3'), vilket förstärker 40S ribosomproteinet S3A (WS21) av P. nicotianae20 och Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'), vilket förstärker tobaksreferensgenen 26S rRNA-gen21. Uttryck vikning förändringar mellan patogen och tobak gDNA beräknades med hjälp av 2-ΔΔCT Ct metoden. Resultaten av realtid PCR bekräftade fenotypiska observationer.
Fem avkommor från BC4F2-populationen av en korsning mellan BH och XHJ och två mellanliggande resistenssorter, K326 och Yunyan87, utvärderades med hjälp av metoden för inokulering av zoospore suspension och metoden för havrekornsinokulering (tabell 5). Zoospore suspensionsmetoden utfördes på små plantor, och havrekornens inokuleringsmetod utfördes på vuxna växter. För de fem avkomman från BC4F2-populationen varierade sjukdomsindexet från 16,49 till 77,60 för zoospore suspensionsmetoden och från 10,33 till 83,08 för havrekornsmetoden. Resistens klassificeringar mellan de två infektionsmetoderna var mestadels förenliga med varandra. Med de två mellanliggande resistensvarianterna, K326 och Yunyan87, visade utvärderingen "resistent" i båda metoderna. Dessa data illustrerar sambandet mellan de två inokuleringsmetoderna, trots att de utförs på tobaksplantor under olika tillväxtperioder.
| Ursprunglig sprit | Andel | Ursprunglig spritvolym (ml) | Näringsämnen | Innehåll (g) |
| OL 1 | 1000× | 500 | MgSO4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| OL 3 | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | 1000× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| OL 5 | 1000× | 500 | (NH4) 2 SO4 | 123.75 |
| OL 6 | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tabell 1: Hoaglands näringslösning.
| Gradera | Utseende av fenotyp |
| Årskurs 0 | Inga symtom på hela växten |
| Årskurs 1 | Stamskador < 1/3 av stjälkomkrets eller <1/3 av blad som vissnar |
| Årskurs 3 | Stamskador mellan 1/3 och 1/2 av stjälkomkrets eller mellan 1/3 och 1/2 av bladen något vissnande |
| Årskurs 5 | Stamskador >1/2 av stjälkomkrets, men inte helt runt omkretsen, eller mellan 1/2 och 2/3 av bladen vissnande |
| Årskurs 7 | Stamskador runt hela stjälkens omkrets eller >2/3 av löv vissnande |
| Årskurs 9 | Växter ser döda ut |
Tabell 2: Rankning av svårighetsgraden av svarta skaftsjukdomar. Baserat på den kinesiska nationella standarden för "Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests" (GB/T 23222-2008) poängsattes individuell växtsjukdomens svårighetsgrad på en skala från 0 till 9.
| Sjukdomsindex | Utvärdering av resistens |
| 0 | Mycket resistent eller immun (I) |
| 0.1 till 20 | Resistent (R) |
| 20.1 till 40 | Måttligt resistent (MR) |
| 40.1 till 60 | Måttligt mottaglig (MS) |
| 60.1 till 80 | Mottaglig (S) |
| 80.1 till 100 | Mycket mottaglig (HS) |
Tabell 3: Utvärdering av resistens enligt sjukdomsindex. Sjukdomens svårighetsgrad delades in i 6 grader enligt sjukdomsindexet. 0 betyder mycket resistent eller immun (I), 0,1 till 20 betyder resistent (R), 20,1 till 40 betyder måttligt resistent (MR), 40,1 till 60 betyder måttligt mottagliga (MS), 60,1 till 80 betyder mottagliga (S), 80,1 till 100 betyder mycket mottagliga (HS).
| Sorten | Upprepa | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Sjukdomsindex | Betyda | Utvärdering av resistens | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| XHJ | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tabell 4: Sjukdomsindex och resistens i BH och XHJ. Medelvärdet för sjukdom index för BH var 6,48, vilket visar resistens (R) enligt standarden, och medelvärdet sjukdom index för XHJ var 76,85, vilket visar mottaglighet (S) enligt standarden.
| Genotyp | Zoospore suspension | Havrekornsmetod | ||||||
| Experiment 1 | Experiment 2 | Betyda | Klassificering | Experiment 1 | Experiment 2 | Betyda | Klassificering | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Jag |
| XHJ | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 | 21.28 | 21.89 | 21.59 | HR | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | HR |
| C9-5 | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 | 55.56 | 51.11 | 53.34 | MS | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tabell 5: P. nicotianae infektion svar i olika genotyper med zoospore suspension inokulering metod och havre korn inokulering metod. Zoospore suspension inokuleringsmetoden utfördes på små plantor, och havrekorn inokuleringsmetoden utfördes på vuxna växter. Dessa data illustrerar korrelationen mellan zoospore suspension inokulering metod och havre korn inokulering metod. K326 och Yunyan87 har mellanliggande nivåer av resistens, och C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9 är avkom från BC4F2-befolkningen i en korsning mellan BH och XHJ. Växterna klassificerades som immuna, resistenta, måttligt resistenta, måttligt mottagliga, mottagliga eller hög mottagliga.
Figur 1: Symptom för varje klass. B) Grad 1, stamskada <1/3 av stjälkomkrets eller <1/3 blad vissnande. C) Grad 3, stamskador mellan 1/3 och 1/2 av stjälkomkrets eller mellan 1/3 och 1/2 av bladen något vissnande. (D) Grad 5, stamskador >1/2 av stjälkomkrets, men inte helt runt omkretsen, eller mellan 1/2 och 2/3 av bladen vissnande. (E) Grad 7, stamskador runt hela stjälkomkretsen eller >2/3 av bladen vissnande. (F) Grad 9, växter ser döda ut. Röda pilar indikerar stamskadorna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Variation observerad i två tobaksgenotyper. (A) Hela växtsymptom fritt i resistent sort BH 3 dagar efter inokulering. (B) Stamskador är cirka 1/2 av stjälkomkrets och 1/2 av bladen något vissnande i XHJ 3 dagar efter inokulering. (C) Hela växtsymptom fritt i resistent sort BH 4 dagar efter inokulering. (D) Stamskador >1/2 av stjälkomkrets, men inte helt runt omkretsen, och mellan 1/2 och 2/3 av bladen vissnar i mottaglig sort XHJ 4 dagar efter inokulering. Röda pilar indikerar stamskadorna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Relativ kvantifiering av P. nicotianae biomassa i infekterade BH och XHJ vid 24 timmar, 72 timmar och 168 timmar efter inokulering. Detta beräknas som förhållandet mellan P. nicotianae WS21 genförstärkning i jämförelse med tobak 26S rRNA genen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera resistenskällor har använts för att förbättra P. nicotianae resistensen i odlad tobak. Endominerande R gener, Php och Phl, har introgressed från Nicotiana plumbaginifolia respektive Nicotiana longiflora, respektive10. Cigarrtobakssorten Beinhart 1000 har den högsta rapporterade nivån av kvantitativ resistens mot P. nicotianae13. Flera intervall mappning experiment har föreslagit att minst sex kvantitativa drag lokus (QTLs) kan bidra till motståndet i denna linje13,22. Förutom de resistenta källorna som nämns ovan har en annan främmande gen, Wz, också visat sig ge en hög resistens mot ras 0 och ras 123,24. Med tanke på de flera resistenta källorna och den komplicerade genetiska bakgrunden av resistenta sorter krävs en exakt och tillförlitlig metod för resistensutvärdering för 1) identifiering av P. nicotianae-resistenta tobaksgenotyper, 2) avelsresistenta sorter och 3) molekylära mekanismstudier av växtpatogeninteraktioner. De tidigare metoderna som användes för att bedöma P. nicotianae infektion allvarlighetsgrad var tidskrävande eller inokulering intensiteterna var svåra att kontrollera. Därför är det angeläget att fastställa en ny metod för P. nicotianae resistensutvärdering.
Att imitera naturliga infektionsprocesser är den viktigaste punkten i vår nya metod. För det första, under den typiska livscykeln för P. nicotianae, zoosporer är de viktigaste smittsamma medel som initierar växtsjukdomar. När zoosporerna når växtytan blir de orörliga cystor, gror därefter och bildar bakterierör. Sedan produceras appressoria vid spetsen av bakterierören25. I vårt protokoll användes zoospor suspension som inokulat, vilket imiterar den naturliga infektionssituationen. För det andra, på Nicotiana benthamiana blad, cystor groddar och koloniserade epidermal celler vid 3 h26. I Arabidopsis rötter, alla encysted zoospores framgångsrikt penetrerade rötterna vid 6 h post inokulering27. I vårt tillvägagångssätt innebar inokuleringsprocessen nedsänkning av rötter i en P. nicotianae zoospore suspension för 3 h i mörkret, vilket imiterar den naturliga miljön och främjar koloniseringen av patogenen, vilket leder till stabil och effektiv infektion.
Det vanligaste tillvägagångssättet för att bedöma P. nicotianae-resistens i tobak, havrekornsmetoden, är effektivt och enkelt för att vaccinera ett stort antal växter7,11,12,13,14,15,16. Det har dock vissa nackdelar. Den största nackdelen är den okontrollerade inokulatintensiteten, som begränsar dess tillämpning i precisionsuppfödning. Jämfört med havrekornsmetoden och de andra två befintliga metoderna används i detta nya tillvägagångssätt zoospor suspension som inokulat, så inokulat intensitet är kontrollerbar och justerbar. Eftersom växterna odlas i en hydroponisk miljö elimineras jordens interferens, vilket ökar utvärderingsnoggrannheten. Det finns dock en begränsning för denna metod, som är att den inte kan användas på vuxna växter. Havrekornsmetoden är däremot tillämplig vid storskalig resistensscreening av vuxna växter7,13. Därför kan denna metod och havrekornsmetoden komplettera varandra under olika tillväxtperioder av tobaksplantan och i olika situationer.
Protokollet som beskrivs här är en effektiv och tillförlitlig metod för att utvärdera resistensen av tobak mot infektion av P. nicotianae på plantstadiet. Detta protokoll kan användas för avel och för molekylär mekanismforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av National Natural Science Foundation of China (31571738) och Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' × 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , China Standard Press. Beijing. (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
