Summary
De gouden standaard in de cardiologie voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten zijn cardiomyocyten. Dit artikel beschrijft aanpassingen aan de niet-Langendorff-techniek om cardiomyocyten bij muizen te isoleren.
Abstract
De behoefte aan reproduceerbare maar technisch eenvoudige methoden die hoogwaardige cardiomyocyten opleveren, is essentieel voor onderzoek in de hartbiologie. Cellulaire en moleculaire functionele experimenten (bijv. Contractie, elektrofysiologie, calciumcyclus, enz.) op cardiomyocyten zijn de gouden standaard voor het vaststellen van mechanismen van ziekte. De muis is de soort bij uitstek voor functionele experimenten en de beschreven techniek is specifiek voor de isolatie van cardiomyocyten van muizen. Eerdere methoden die een Langendorff-apparaat vereisen, vereisen een hoge mate van training en precisie voor aorta-cannulatie, wat vaak resulteert in ischemie. Het veld verschuift naar Langendorff-vrije isolatiemethoden die eenvoudig zijn, reproduceerbaar zijn en levensvatbare myocyten opleveren voor fysiologische gegevensverzameling en cultuur. Deze methoden verminderen de ischemietijd aanzienlijk in vergelijking met aortacannulatie en resulteren in betrouwbaar verkregen cardiomyocyten. Onze aanpassing aan de Langendorff-vrije methode omvat een eerste perfusie met ijskoude reinigingsoplossing, het gebruik van een stabiliserend platform dat zorgt voor een stabiele naald tijdens perfusie en extra verteringsstappen om betrouwbaar verkregen cardiomyocyten te garanderen voor gebruik in functionele metingen en cultuur. Deze methode is eenvoudig en snel uit te voeren en vereist weinig technische vaardigheid.
Introduction
Al tientallen jaren is een essentieel idee in de hartbiologieliteratuur het moleculaire werkingsmechanisme. Het werkingsmechanisme moet worden vastgesteld om betrouwbare studies te kunnen publiceren. Een gevestigde strategie om het moleculaire mechanisme te bepalen is geïsoleerde cardiomyocytenstudies, die cardiomyocyten van hoge kwaliteit vereisen voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens. Cellulaire en moleculaire experimenten uitgevoerd op cardiomyocyten om het werkingsmechanisme te bepalen zijn de gouden standaard voor het onderzoeken van contractie1, elektrofysiologie2, calcium (Ca 2+) cyclus3, myofilament Ca2+ gevoeligheid4, cytoskelet5, metabolisme6, effecten van hormonen7, signaalmoleculen8, geneesmiddelenstudies9 enz. De muis is de voorkeurssoort geworden voor de meeste hartbiologische experimenten vanwege het gemak van genetische manipulatie, zijn kleine formaat, zijn relatief korte levensduur, lage kosten, enz.10. De betrouwbare isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten van muizen is echter niet triviaal met de huidige technieken.
Labs isoleren cardiomyocyten al bijna 70 jaar11. Vrijwel alle technieken om cardiomyocyten te isoleren zijn afhankelijk van de vertering van het hart via verschillende enzymen (collagenase, protease, trypsine, enz.). In de vroege perioden (jaren 1950-1960) werd de brokmethode gebruikt, waarbij het hart werd verwijderd, in veel kleinere stukjes werd gesneden en in oplossing werd geïncubeerd met collagenase / protease / trypsine12. In de jaren 1970 implementeerden laboratoria de verbeterde "Langendorff" -methode13, die cardiomyocyten isoleerde met behulp van een op coronaire perfusie gebaseerde isolatietechniek (retrograde perfusie met enzym via het Langendorff-apparaat); Deze techniek blijft de dominante methode van myocytenisolatie in het veld vandaag, ~50 jaar later14,15,16. Recent werk is verschoven naar het in vivo cannuleren van het hart om de hypoxietijd en ischemische schade te beperken, wat resulteert in superieure cardiomyocytenisolaties (betere opbrengsten en hogere kwaliteit)17. Onlangs is dit geëvolueerd naar het uitvoeren van in vivo, Langendorff-vrije hartperfusies 18,19,20,21,22. We hebben de Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek ontwikkeld op basis van de Ackers-Johnson et al.18-techniek en verschillende componenten aangepast van de vele eerdere isolatietechnieken. Deze belangrijke aanpassingen omvatten de injectie van een ijskoude opruimbuffer en de integratie van een ondersteunend platform om de naald te stabiliseren, waardoor minder manipulatie van het hart mogelijk is. Ook gedetailleerd in deze techniek is temperatuurregeling van geïnjecteerde buffers (37 °C), die de tijd tussen in vivo injectie en spijsvertering verkortte als gevolg van minder EDTA-perfusie zoals eerder gepubliceerd18. Door manipulatie van het hart te verminderen en daardoor de grootte van de punctieplaats te minimaliseren, wordt een grondige en constante perfusie van de kransslagaders verkregen. We verfijnden de techniek ook met een secundaire brokmethode vertering, de hoeveelheid EDTA in de geïnjecteerde clearingbuffer en veranderden de pH. Onze beschreven techniek is betrouwbaarder, efficiënter en vereist niet de uitgebreide training / oefening in vergelijking met het gebruik van het Langendorff-apparaat (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Ohio State University in overeenstemming met de NIH-richtlijnen.
1. Bereiding van de oplossing
OPMERKING: Zie tabel 2 voor bufferconcentraties.
- Pre-isolatie (tot 2 weken voor myocytenisolatie)
- Perfusiebufferbasis: Bereid 1 L perfusiebufferbasis (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose en BDM) voor in 1 L ultrazuiver 18,2 MΩ·cm H2O. Stel aan tot pH7,4 vóór 0,22 μm steriele filtratie. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
- Clearing buffer: Bereid 1 L clearing buffer (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA, en BDM) in 1 L ultrapure 18,2 MΩ·cm H2O. Breng aan op pH7,4 voorafgaand aan 0,22 μm steriele filtratie. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
- 100 mM CaCl 2 stockoplossing: Weeg 1,11 g CaCl 2 af en los op in 100 ml ultrapuur 18,2 MΩ·cm H2 O. Bewaren bij kamertemperatuur tot de dag van isolatie.
- Liberase aliquots: Los 5 mg spijsverteringsenzymen op in 5 ml steriel, RNase-vrij water. Bereid 0,8 ml aliquots en bewaar bij -20 °C tot de dag van isolatie.
- Lamineer de gerechten: Breng 100 μL 40 μg/ml muislaminine aan op steriele petrischalen van 30 ml met glazen bodem. Laat 30 minuten zitten en verwijder overtollig laminine. Zet het laminine op een petrischaaltje met UV-incubatie op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie (gelamineerde petrischalen kunnen tot 2 weken worden gebruikt).
- DMEM-media: Voeg in een bioveiligheidskast 2,5 ml FBS, 0,5 ml penicilline-streptomycine (50 U / ml-50 μg) en 1 ml 500 mM BDM toe aan 46 ml DMEM. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie (media kunnen maximaal 2 weken worden gebruikt).
- M199-media: Bereid 1 l M199-media (NaHCO3, HEPES, L-glutathion, M199, BDM en BSA) in 1 l ultrapuur 18,2 MΩ·cm H2O. Stel aan tot pH 7,4 voorafgaand aan steriele filtratie (0,22 μm filter). Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
- 500 mM BDM-voorraad: Voeg 0,5 g BDM toe aan 10 ml ultrazuiver 18,2 MΩ·cm H2O. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
- Stabiliserende platformcreatie: Vorm playdough rond de basis van de naald die in de Luer-stopkraan is geschroefd. Vorm naar de petrischaal die het hart bevat en zorg ervoor dat de naald op de juiste hoogte is voor ventrikelinjectie (~ 5 mm boven de bodem van de schaal).
- De dag van isolatie
- Perfusiebuffer: Voeg op de dag van de isolatie 9,5 mg MgCl2 toe aan 100 ml perfusiebufferbasis. Laat volledig mengen voordat u 30 ml voltooide perfusiebuffer verwijdert en plaats in een schone, brede mond, 100 ml glazen fles met een schroefdopdeksel (digestiebuffer).
OPMERKING: Deze toevoegingen kunnen worden gedaan op de dag van isolatie zonder extra pH-aanpassingen, omdat hun toevoeging de pH verwaarloosbaar verandert.- Verwijder 12 ml perfusiebuffer en zet opzij (stopbuffer). Giet de resterende 58 ml perfusiebuffer in een andere schone, brede mond, 100 ml glazen fles met een schroefdopdeksel. Bewaar de resterende perfusiebuffer bij 37 °C gedurende de isolatie.
- Digestiebuffer: Voeg 7,5 μL CaCl2 toe aan 30 ml perfusiebuffer voor een eindconcentratie van 25 μM. Voeg onmiddellijk voorafgaand aan de isolatie 770 μL Liberase toe aan de digestiebuffer voor een eindconcentratie van 26 μg/ml.
- Stopbuffer: Los 240 mg BSA op in 12 ml perfusiebuffer. Bewaren bij 37 °C gedurende de gehele isolatie.
- Buffer opruimen: Bereid een spuit van 3 ml met opruimbuffer voor en verwijder de naald van bubbels. Bewaren op ijs tot isolatie.
- Perfusiebuffer: Voeg op de dag van de isolatie 9,5 mg MgCl2 toe aan 100 ml perfusiebufferbasis. Laat volledig mengen voordat u 30 ml voltooide perfusiebuffer verwijdert en plaats in een schone, brede mond, 100 ml glazen fles met een schroefdopdeksel (digestiebuffer).
2. Spruitstukvoorbereiding
- Wis het temperatuurgeregelde spruitstuk met vers voorbereide perfusiebuffer en zorg ervoor dat er geen bubbels achterblijven. Gebruik een Luer-vergrendelingsconnector, schroef een naald van 27 G in en ontdoe je van bubbels. Een vrij spruitstuk is essentieel voor een succesvolle isolatie.
3. Voorbereiding van dieren
- Injecteer de muis intraperitoneaal met 100 mg/kg ketamine en 20 mg/kg xylazine naar lichaamsgewicht onmiddellijk voorafgaand aan de isolatie. Deze procedure gebruikte een mannelijke, 4 maanden oude C57Bl / 6-muis.
- Plaats de muis indien nodig op een verwarmd chirurgisch kussen om sedatie aan te moedigen. Tent de armen van de muis en plak de ledematen en de basis van de staart vast aan een blauwe labluier. Zorg ervoor dat het dier volledig wordt verdoofd door het terugtrekken van de teen-knijpreflex. Breng een steriel gordijn aan rond het operatiegebied.
4. Cardiomyocyten isolatie procedure
- Stel het borstbeen van de muis bloot en snijd, lateraal naar de middellijn, proximaal door de ribben en naar de oksel. Snijd voorzichtig volledig door het middenrif en zorg voor ondiepe snijwonden om het hart te vermijden. Klem het borstbeen vast met een hemostat en vouw de ribben naar achteren om de borstholte bloot te leggen.
- Verwijder voorzichtig het hartzakje uit het hart en snijd volledig door de inferieure vena cava, onmiddellijk distaal van het hart. Gebruik een spuit van 3 ml met een naald van 27 G om snel 3 ml ijskoude opruimbuffer in de rechterkamer van het hart te injecteren gedurende 1 minuut.
- Houd het hart voorzichtig vast met een pincet en trek weg van het lichaam, waarbij zoveel mogelijk van de aorta wordt blootgesteld. Gebruik een hemostat, klem de opstijgende aorta, zorg ervoor dat je de boezems niet klemt en snijd het hart uit de borst.
- Breng het geklemde hart snel over naar het deksel van een polypropyleen petrischaaltje met ongeveer 10 ml warme perfusiebuffer. Plaats het geklemde hart in het ondersteunende platform en gebruik een gestabiliseerde naald van 27 G die aan het spruitstuk is bevestigd om gedurende 5 minuten 10 ml temperatuurgecontroleerde 37 °C perfusiebuffer in de linkerkamer te injecteren.
- Breng het geklemde hart en het steunplatform over in een petrischaaltje met ongeveer 5 ml verteringsbuffer. Wissel invoerspuiten in voor een spuit van 50 ml met 25 ml verteringsbuffer.
- Verwijder het spruitstuk van eventuele bubbels en de resterende perfusiebuffer vóór injectie. Vervang de naald voorzichtig in dezelfde naaldpositie in de linkerventrikeltop.
- Gebruik een perfusiepomp om de temperatuurgecontroleerde 37 °C verteringsbuffer gedurende 15 minuten in de linker ventrikel te injecteren met behulp van een spuit van 50 ml. Regel de temperatuur van de oplossing met een watermantel die vooraf is gekalibreerd om een oplossing van 37 °C aan het einde van de naald uit te werpen.
- Verwijder de ventrikels uit de boezems en breng over in een bekerglas van 10 ml. Voeg 3 ml verteringsbuffer toe aan het bekerglas en snijd met een scherpe schaar de ventrikels in grote stukken. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en plaats gedurende 5 minuten in een schudwaterbad voorverwarmd tot 37 °C.
- Gooi het supernatant weg en zorg ervoor dat er geen brokken weefsel worden verwijderd. Resuspendeer de weefselbrokken in 3 ml verteringsbuffer en trituleer gedurende ongeveer 4 minuten of totdat een homogeen mengsel is bereikt.
- Filter de cellen door een 70 μm nylon celzeef in een polypropyleenbuis van 50 ml.
- Breng het filtraat terug naar een 14 ml polypropyleenbuis met ronde bodem en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 100 tpm. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 3 ml stopbuffer.
- Voeg 54 μL CaCl 2-voorraad van 100 mM toe aan de geresuspendeerde cellen voor een uiteindelijke CaCl2-concentratie van 1,8 mM. Deze stap kan ook stapsgewijs worden uitgevoerd om de celopbrengst te verhogen.
- Laat levende cellen 10 minuten bezinken door de zwaartekracht voordat u het supernatant met dode cellen verwijdert. Resuspendie van de pellet in opslagoplossing (perfusieoplossing met 200 μM CaCl2). Deze cellen kunnen nu worden gebruikt voor functionele experimenten (d.w.z. calciumbeeldvorming / -contractie, patchklem, enz.), Cultuur, enz.
OPMERKING: De cellen kunnen ook worden geresuspendeerd in laboratorium- of experimentafhankelijke oplossingen.
5. Celkweek
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of door een veldweergave te tellen met behulp van een gerasterde afdeklaag. Omdat myocyten erg groot zijn, is tellen met behulp van een hemocytometer niet altijd nauwkeurig. Dit wordt gebruikt om een idee te krijgen van hoeveel cellen er ongeveer uit de isolatie zijn gehaald.
- Verdun de cellen tot ~ 25.000 cellen / ml met DMEM-media. Voeg 1 ml celoplossing toe aan elk putje.
- Incubeer bij 37 °C, 95% O 2, 5% CO 2 gedurende2 uur.
- Zuig voorzichtig DMEM-media uit elke put en voeg 2 ml M199-media toe.
- Incubeer bij 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 gedurende maximaal 24 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn een paar elementen om te onderzoeken bij het bepalen van het succes van een isolatie. Ten eerste moeten de cardiomyocyten staafvormig zijn zonder membraanblebs, zoals de cellen geïsoleerd in figuur 1. Een typische isolatie levert ~80% op van de myocyten die staafvormig zijn. Als de isolatie iets minder dan 50% staafvormige cellen oplevert, wordt het beschouwd als een mislukte isolatie en worden cardiomyocyten niet gebruikt. Ten slotte moeten de cardiomyocyten rustig zijn. Spontane samentrekkingsmyocyten vertonen Ca2+ intolerantie en zullen onbetrouwbare gegevens produceren. Van alle isolaties die met de bovenstaande techniek worden uitgevoerd, worden bijna alle isolaties als succesvol beschouwd. Gekweekte cardiomyocyten worden als succesvol beschouwd als ze staafvormig zijn zonder membraanblebs of afgeronde randen met hoge overlevingskansen (figuur 2).
Tabel 1. Een tabel met opgemerkte verschillen tussen onze methode, Langendorff-methoden, en eerder gepubliceerde Langendorff-vrije methoden voor het isoleren van cardiomyocyten bij muizen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Buffermediaconcentraties. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1. (A) 4 maanden oude C57Bl/6 muis cardiomyocyten in beeld gebracht met behulp van heldere veldmicroscopie. Opbrengst: ~80%; 20x vergroting. (B) Helder veldbeeld van een 4 maanden oude C57Bl/6 muis cardiomyocyt. Cardiomyocyten zijn rustig en vertonen staafvorm zonder membraanblebs. Schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. (A) De 4 maanden oude C57Bl/6 muis cardiomyocyten gekweekt gedurende 24 uur in M199 media. Levensvatbaarheid: ~80%; 20x vergroting. (B) Myocyten gekweekt gedurende 24 uur. Na 24 uur vertonen cardiomyocyten staafvorm zonder membraanblebs. (C) % overlevingscurve voor cardiomyocyten gekweekt gedurende 24 uur met behulp van de beschreven methode. Schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste voordeel van onze Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek is dat het hypoxie en ischemische tijd beperkt door geen cannulatie naar een Langendorff-apparaat te vereisen. Als alternatief voor klassieke Langendorff-technieken die enkele minuten nodig hebben om het hart te verwijderen, te reinigen en op te hangen, wat vaak resulteert in ischemische schade aan de myocyt, omvat onze methode een in vivo zuivering van bloed via een ijskoude reinigingsoplossing. De ijskoude zuiveringsbuffer bevat ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), cheleert onomkeerbaar tweewaardige kationen om calcium efficiënt te verwijderen, waardoor het een uitstekend antistollingsmiddel is en daarom de contractie stopt23. Het gebruik van ijskoude oplossingen remt contractie door de ionenuitwisseling en de cellulaire stofwisseling te vertragen, waardoor schade door ischemie wordt voorkomen24. Door de noodzaak van aortacannulatie weg te nemen, produceren Langendorff-vrije technieken robuuste myocyten, wat resulteert in een betrouwbaarder preparaat om betrouwbare gegevens op te leveren, wat niet altijd het geval is voor Langendorff-isolatiemethoden.
Dit is een variatie op een eerder gepubliceerde Langendorff-vrije isolatietechniek18 met aanpassingen zoals aangegeven in tabel 1. Het belangrijkste is dat deze techniek een stabiliserend platform introduceert dat het aantal keren beperkt dat de naald moet worden verwijderd en vervangen uit het hart. Elke onnodige beweging die in de naald wordt geïntroduceerd terwijl deze in de ventrikel wordt ingebracht, verbreedt de prikplaats. Een bredere punctieplaats resulteert in terugstroom uit de ventrikel van de punctieplaats, verminderde druk in het hart en verminderde stroom naar de kransslagaders. Dit probleem wordt opgelost met behulp van het stabilisatieplatform. Door de beweging van de naald te beperken en het aantal keren dat de naald wordt verwijderd en vervangen (één in vergelijking met drie keer zoals eerder beschreven18), handhaven we een consistente stroom naar de kransslagaders en bereiken we consequent de spijsvertering. Een andere belangrijke aanpassing was de toevoeging van een temperatuurgecontroleerde mantel om enzymoplossingen bij binnenkomst in het hart op 37 °C te houden (het temperatuurbad werd gekalibreerd om bij 37 °C uit de naald te werpen). Het gebruikte verteringsenzym heeft een optimale reactieactiviteit bij 37 °C en de toevoeging van temperatuurregeling verhoogt de enzymactiviteit, waardoor de verteringstijd afneemt. Liberase heeft ook minimale lot-to-lot variabiliteit en heeft een hogere reproduceerbaarheid in vergelijking met andere enzymen. Een andere aanpassing van eerdere technieken is een verminderde hoeveelheid geïnjecteerde clearingoplossing. Het verminderen van de hoeveelheid opruimbuffer om het hart binnen te komen en het mogelijk maken dat meer bloed wordt gezuiverd door perfusiebuffer vermindert de inactivatie van het spijsverteringsenzym door EDTA. Een andere reden dat onze methode consequent succesvolle myocytenisolaties bereikt, is door het gebruik van BDM. BDM is een myosineremmer die het power stroke-mechanisme van het sarcomeer voorkomt, waardoor contractie wordt geremd en reoxygenatieletsel tijdens de spijsvertering wordt beperkt. Door contractie te beperken, voorkomen we calciumcycli en inherente reactieve zuurstofsoortenproductie bij het samentrekken van myocyten in cultuur. Omdat het kweekmedium calcium bevat, is het mogelijk dat de myocyten samentrekken en de daaropvolgende opbrengst na kweek verminderen. We kiezen ervoor om de myocyten in BDM te kweken om contractie te voorkomen en de opbrengst25,26 te verhogen. BDM kan altijd met groot succes uit myocyten worden gewassen voor functionele metingen na kweek. Als alternatief kunnen alle stappen van deze procedure worden uitgevoerd zonder de toevoeging van BDM, maar isolaties kunnen niet als "succesvol" worden beschouwd op BDM-vrije geïsoleerde myocyten.
Naast ischemische tijd zijn er nog vele andere factoren die bepalen of een isolatie robuuste myocyten zal produceren. Omdat er verschillende omstandigheden zijn in de individuele laboratoria, moeten de personen die de isolatie uitvoeren mogelijk de hoeveelheid enzym en / of calcium, de perfusietijd en / of pompsnelheid en de snelheid en / of tijd van het schommelende waterbad wijzigen. Deze parameters zijn afhankelijk van het gebruikte muismodel, zoals gezond of ziek, veroudering, enz.
Hoewel deze techniek niet de chirurgische vaardigheid vereist die nodig is voor de op Langendorff gebaseerde technieken, zijn er nog steeds kritieke stappen om de techniek succesvol te maken. Het meest voorkomende probleem dat slechte myocyten oplevert met deze techniek is te wijten aan bellen die het perfusiesysteem binnendringen en het myocardiale weefsel blokkeren voor toegang tot de perfusiebuffer. De oplossing voor dit probleem is zorgvuldig oefenen om bubbels te vermijden (via de juiste spuitklaringstechniek, de juiste naaldklaringstechniek, het opboeren van het spruitstuk van bellen bij het verwisselen van spuiten, enz.), Evenals meerdere uitgangen van het perfusiesysteem in het geval dat een bel zich in het spruitstuk bevindt. Zonder bubbels krijgen we in onze ervaring bijna 100% succesvolle myocytenisolaties (gedefinieerd als boven 50% staafvormige myocyten; het gemiddelde is ~ 80%).
Hoewel de methode is vereenvoudigd door het verwijderen van de chirurgische vaardigheid die vereist is voor de Langendorff-methode, is deze aangepaste methode alleen bij muizen uitgeprobeerd. Een ander voordeel van de Langendorff-vrije methode is dat deze voor veel muizenmodellen kan worden gebruikt (d.w.z. van pasgeborene tot senescentie), zoals eerder beschreven19. Helaas zullen grotere zoogdieren (bijv. Honden, varkens, enz.) niet geschikt zijn voor deze techniek vanwege de grootte van hun hart. Het zou onmogelijk zijn om het hart te doordrenken met voldoende oplossing om betrouwbare myocyten te verkrijgen.
Onze aanpassing van de Langendorff-vrije methode is een betrouwbare methode voor de succesvolle isolatie van cardiomyocyten bij muizen. In vergelijking met de Langendorff-methode vereist deze alternatieve aanpak weinig technische vaardigheid om consequent cardiomyocyten te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) en T32 HL134616 (Sturgill en Salyer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
- Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
- Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
- Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
- Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
- Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
- Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
- Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
- Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
- Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
- Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).
