Summary
نقدم طريقة تستخدم نهجا قابلا للتعميم لتحليل الصور القائم على المنطقة لتحديد عدد الخلايا. استغل تحليل مجموعات الخلايا المختلفة ارتفاع الخلية الكبير والاختلافات الهيكلية بين أنواع الخلايا المتميزة داخل خوارزمية تكيفية.
Abstract
القياس الكمي للخلايا ضروري لمجموعة واسعة من الدراسات البيولوجية والكيميائية الحيوية. عادة ما يستخدم تحليل الصور التقليدي للخلايا إما أساليب الكشف عن التألق ، مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي أو النقل باستخدام البروتينات الفلورية أو تقنيات الكشف عن الحافة ، والتي غالبا ما تكون عرضة للخطأ بسبب الضوضاء وغيرها من غير المثالية في خلفية الصورة.
لقد صممنا خوارزمية جديدة يمكنها حساب وتمييز البلاعم والخلايا الليفية بدقة ، وهي خلايا ذات أنماط ظاهرية مختلفة غالبا ما تتعايش أثناء تجديد الأنسجة. تم استخدام MATLAB لتنفيذ الخوارزمية ، التي ميزت أنواع الخلايا المتميزة بناء على الاختلافات في الارتفاع من الخلفية. تم تطوير خوارزمية أولية باستخدام طريقة قائمة على المنطقة لحساب الاختلافات في حجم / بنية الخلية وظروف البذر عالية الكثافة.
تم حساب عدم المثالية في هياكل الخلايا باستخدام خوارزمية ثانوية متكررة تستخدم معلمات داخلية مثل تغطية الخلية المحسوبة باستخدام البيانات التجريبية لنوع معين من الخلايا. وأخيرا، أجري تحليل لبيئات الزراعة المشتركة باستخدام خوارزمية عزل تم فيها استبعاد أنواع مختلفة من الخلايا بشكل انتقائي بناء على تقييم الاختلافات النسبية في الارتفاع داخل الصورة. تم العثور على هذا النهج لحساب الخلايا بدقة ضمن هامش خطأ 5٪ للخلايا أحادية الزراعة وضمن هامش خطأ 10٪ للخلايا المستزرعة.
Introduction
يتم تنفيذ البرنامج بشكل روتيني أثناء تقنيات تحليل الصور لضمان دقة النتائج وكفاءتها وعدم تحيزها. بالنسبة للفحوصات القائمة على الخلايا ، هناك مشكلة شائعة تتمثل في التعرف الخاطئ على الخلايا. قد تؤدي الصور ذات الإعدادات البؤرية والتباين غير المناسبة إلى طمس الخلايا، حيث يصبح من الصعب تحديد حدود الخلايا الفردية1. يمكن أن يؤدي وجود ميزات صور غريبة مثل المسام أو الفقاعات أو غيرها من الأشياء غير المرغوب فيها إلى إعاقة إجراءات العد عن طريق إبطاء عملية العد ويؤدي إلى تحديد الهوية بشكل خاطئ. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون عد الخلايا مرهقا ، ويمكن أن يكون عد مئات النسخ المتماثلة مستهلكا للوقت للغاية. علاوة على ذلك ، يوجد تحيز ذاتي متأصل أثناء العد اليدوي ، وبالتالي فإن اتخاذ القرارات المتعلقة بتحديد الخلايا غالبا ما يكون غير دقيق2. توفر البرامج الآلية إمكانات مثيرة لتجاوز كل هذه القضايا من خلال التمييز السريع والدقيق بين الخلايا والأجسام الدخيلة ، بما في ذلك الأشياء التي تتجاوز القدرة البشرية على الكشف الدقيق ، استنادا إلى معايير تحديد الهوية المحددة جيدا التي تقلل من تأثير تحيز المحققين. تتضمن التقنيات الشائعة لتحديد الخلايا باستخدام البرامج الآلية طريقتين رئيسيتين: التجزئة والعتبة3. هنا ، نعرض بروتوكولا قابلا للتعميم قائما على المنطقة يتيح عد الخلايا بسرعة ودقة وغير مكلفة ضمن إطار برمجي يمكن الوصول إليه على نطاق واسع.
تسعى تقنيات التجزئة ، مثل اكتشاف الحافة ، إلى عزل الخلايا الفردية من خلال استخدام اختلافات الكثافة داخل الصورة. غالبا ما تتكون تغيرات الشدة التي تميز الخلية عن بقية الصورة من تغيرات حادة في السطوع4. يتضمن اكتشاف الحافة خطوة تصفية تنظيمية ، تليها خطوة تمايز يتم فيها اكتشاف تغييرات الكثافة. تحدد عملية التمايز الحواف والخطوط داخل صورة التغييرات عالية الكثافة، وترتبط هذه الحواف والخطوط بوجود الخلية. على الرغم من أنه يمكن تشغيل الصور ذات الضوضاء من خلال خوارزميات إزالة الضوضاء4 ، إلا أن تقنيات اكتشاف الحافة تستخدم بشكل مثالي لتحليل الصور ذات الضوضاء المنخفضة في الخلفية. تعمل العملية على النحو الأمثل عندما تكون حدود الخلايا قابلة للتمييز بوضوح وسهولة ولا تعوقها ملامح السطوع التي لا علاقة لها بوجود الخلية أو ضبابية الخلية أو الكائنات الدخيلة أو هياكل الخلايا الداخلية المحددة 1,2. إذا كانت الصورة صاخبة بشكل خاص ، فقد يتم تمييز الخلايا بشكل أكبر من خلال تلطيخ الفلورسنت أو نقله مع بروتينات الفلورسنت 2,5. على الرغم من أن هذا يحسن بشكل كبير من دقة تقنيات التجزئة ، إلا أنه يتطلب تكاليف إضافية واستثمارات زمنية إضافية لإعداد مزارع الخلايا للتصوير.
تتضمن تقنيات العتبة تقسيم الصورة إلى فئتين: المقدمة والخلفية ، مع تعيين الخلايا إلى المقدمة3. تستخدم هذه التقنيات تغييرات اللون / التباين لتحديد الارتفاع الظاهري للكائن. يمكن التعرف بسهولة على الكائنات التي تكون "أطول" بشكل روتيني من الخلفية كخلايا. يعمل تحويل مستجمعات المياه بهذه الطريقة عن طريق ربط الأسطح بوحدات البكسل الفاتحة كمقدمة وتلك التي تحتوي على وحدات بكسل داكنة كخلفية 6,7. من خلال التحديد القائم على الارتفاع ، يمكن لتقنيات العتبة التمييز بشكل روتيني بين الضوضاء والأشياء المطلوبة ، شريطة أن تكون موجودة داخل نفس المستوى البؤري. عند إقرانه بقياس كمي قائم على المنطقة ، يمكن لتحويل مستجمعات المياه تحديد مجموعات الكائنات بدقة في البيئات التي تكون فيها تقنيات التجزئة النموذجية مثل اكتشاف الحافة غير دقيقة.
عادة ما تقترن تحويلات مستجمعات المياه بتقنيات التجزئة لإعداد الصور لتحليل أنظف ، مما يؤدي إلى دقة أعلى في عد الخلايا. ولهذه العملية، يستخدم تحويل مستجمعات المياه لتسليط الضوء على المناطق المحتملة ذات الأهمية قبل التقسيم. يوفر تحويل مستجمعات المياه فوائد فريدة من نوعها من خلال تحديد الخلايا في مقدمة الصور ، والتي يمكن أن تحسن دقة تحليل التجزئة عن طريق إزالة الإيجابيات الخاطئة المحتملة للخلايا ، مثل بقع الخلفية غير المستوية. ومع ذلك ، يمكن أن تنشأ صعوبات عند محاولة تكييف الصور القائمة على الخلايا مع تحويل مستجمعات المياه. يمكن أن تعاني الصور ذات الكثافة العالية للخلايا من تجزئة ناقصة ، حيث يتم تحديد مجاميع الخلايا كمجموعة مفردة بدلا من كونها مكونات فردية. يمكن أن يؤدي وجود ضوضاء أو تغيرات حادة في الكثافة أيضا إلى الإفراط في التجزئة ، حيث تفرط الخوارزمية في عزل الخلايا ، مما يؤدي إلى تعداد مفرط وغير دقيق للخلايا8.
في هذا ، نفصل طريقة لتقليل العيوب الأولية لتحويل مستجمعات المياه من خلال دمج مكونات تحليل العتبة ضمن خوارزمية تحديد كمي قائمة على المنطقة ، كما هو موضح في الشكل 1. ومن الجدير بالذكر أن هذه الخوارزمية قد تم تنفيذها باستخدام برامج مفتوحة المصدر و / أو متاحة على نطاق واسع ، وكان تطبيق إطار عد الخلايا هذا ممكنا بدون كواشف باهظة الثمن أو تقنيات تحضير الخلايا المعقدة. تم استخدام البلاعم RAW264.7 لإظهار الطريقة بسبب دورها الحاسم في تنظيم صيانة النسيج الضام وعمليات التئام الجروح9. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل الخلايا الليفية NIH / 3T3 بسبب دورها الرئيسي في صيانة الأنسجة وإصلاحها. غالبا ما تتعايش الخلايا الليفية مع البلاعم وتدعمها، مما يولد الحاجة إلى التمييز بين هذه الأنواع من الخلايا المتميزة ظاهريا في دراسات الزراعة المشتركة.
يمكن تحديد عدد الخلايا من الصور ذات الكثافة الخلوية العالية القابلة للحياة (VCD) بشكل موثوق وفعال عن طريق حساب المساحة التي تغطيها الخلايا ، ومتوسط المساحة التي تشغلها خلية مفردة. كما مكن استخدام العتبة بدلا من التجزئة لتحديد الخلايا من إجراء تحليلات أكثر تعقيدا ، مثل التجارب التي تم فيها تحليل أنواع الخلايا المختلفة في المزارع المشتركة في وقت واحد. تم العثور على الخلايا الليفية NIH / 3T3 ، والتي غالبا ما يتم العثور عليها لتوطينها مع البلاعم RAW264.7 داخل موقع التئام الجروح ، تنمو في مستوى بؤري كان مختلفا عن المستوى البؤري للبلاعم10. وبناء على ذلك، تم تشغيل خوارزميات عتبة متعددة لتحديد الخلفية والمقدمة اعتمادا على نوع الخلية التي يتم تحليلها، مما يتيح العد الدقيق لنوعين مختلفين من الخلايا داخل نفس الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة الخلايا واكتساب الصور
- ثقافة RAW264.7 البلاعم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) المكملة بمصل البقر الجنيني 10٪ (FBS) ، 1٪ البنسلين الستربتومايسين ، 1.5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم ، و 5 ميكرومتر β-mercaptoethanol.
- لتصوير الزراعة الأحادية ، قم بزراعة خلايا RAW264.7 بكثافة 25000 خلية / سم2 في قارورة زراعة خلايا 5 مل مع 1 مل من المتوسط.
- زراعة خلايا NIH / 3T3 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين11.
- بالنسبة للتصوير بالزراعة المشتركة ، استزرع البلاعم RAW264.7 والخلايا الليفية NIH / 3T3 معا بنسب مختلفة ، بكثافة إجمالية تبلغ 25000 خلية / سم2. استخدم وسط الزراعة المشتركة الذي يتكون من 1 جزء من وسط RAW264.7 (DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين ، و 1.5 جم / لتر من بيكربونات الصوديوم ، و 5 ميكرومتر β-mercaptoethanol) وجزء واحد من NIH / 3T3 وسط (DMEM مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين).
- بعد البذر ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للوصول إلى كثافة خلية قابلة للحياة تبلغ 80٪ من التقاء الخلايا.
- صور الخلايا مع المجهر المقلوب مجهزة بهدف 40x. احصل على جميع الصور بتدرج الرمادي وقم بتصديرها في ملف ".czi" الخام.
- تحديد قدرة الخوارزمية على تقييم الصور بدقة مع مجموعة من صفات الصورة. احصل على صور ذات بؤر مختلفة ، مما ينتج صورا "غير منتفخة" (الشكل 2) وصورا "منتفخة" (الشكل 3).
- قم بتصدير وتحويل صور الخلايا إلى تنسيق صورة tiff (.tiff) 8 بت باستخدام ImageJ باستخدام وظيفة "تحويل الدفعات" على ملفات ".czi" الخام قبل تحليل MATLAB. قم بتخزين الصور المحولة في مجلد محلي ونقل ملفات الصور هذه يدويا إلى حاوية MATLAB ذات الصلة.
2. تحليل الصور - الزراعة الأحادية باستخدام ملف "الزراعة الأحادية" .m في المقام الأول
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام MATLAB. تم استخدام ثلاثة ملفات لبروتوكول MATLAB: "العملية.m" (ملف الترميز التكميلي 1) ، والملف الذي يحتوي على الخوارزمية ، و "الزراعة الأحادية" .m" (ملف الترميز التكميلي 2) ، والملف الذي سيتم تشغيله لتحليل صور الزراعة الأحادية ، و "coculture_modified.m" (ملف الترميز التكميلي 3) ، الملف الذي سيتم تشغيله لتحليل صور الزراعة المشتركة.
- استخدم الطريقة المستندة إلى المنطقة للحصول على صور للخلايا تعرض اختلافات الارتفاع النسبية. مخرجات الصورة لكل خطوة فرعية من خلال استخدام وظيفة "imshow()" لكل صورة فرعية. انسخ ملف الصورة والصقه لتحليله في سلة المهملات وأدخل اسم الملف في الأمر التالي. اضغط على تشغيل لبدء تشغيل البرنامج.
imread('اسم الملف.tiff')- قم بتحليل الصور عن طريق "الفتح عن طريق إعادة الإعمار" متبوعا ب "الإغلاق عن طريق إعادة الإعمار" باستخدام وظائف المصدر8 لتكبير المقدمة من الخلفية. استخدم الأمر الأول للفتح عن طريق إعادة الإعمار والتسلسلين الثاني والثالث للإغلاق عن طريق إعادة الإعمار
'غير مفتوح()'
'imerode()'
'إعادة البناء()'
- قم بتحليل الصور عن طريق "الفتح عن طريق إعادة الإعمار" متبوعا ب "الإغلاق عن طريق إعادة الإعمار" باستخدام وظائف المصدر8 لتكبير المقدمة من الخلفية. استخدم الأمر الأول للفتح عن طريق إعادة الإعمار والتسلسلين الثاني والثالث للإغلاق عن طريق إعادة الإعمار
- قم بتحويل الصور المعاد بناؤها إلى وحدات بكسل سوداء وبيضاء نقية باستخدام نظام تحديد الهوية القائم على النسبة المئوية. لاحظ أنه يتم تحويل الخلايا إلى قيمة بكسل أبيض نقي تبلغ "255" في هذا النظام، في حين يتم تحويل الخلفية والكائنات الدخيلة (غير الخلوية) إلى قيمة بكسل أسود نقي تبلغ "0".
- ميز الخلايا عن الخلفية باستخدام فرق مئوي عن "الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة"، وهي أكبر قيمة بكسل تضم 0.5٪ على الأقل من صورة معينة.
- تحليل وتقييم قيم البكسل للبلاعم RAW264.7. إذا كانت هذه القيم في حدود 4.5٪ من الحد الأقصى للبيكسل ذي الصلة، فقم بوضع علامة على البيكسل كشبكة خلوية.
ملاحظة: يمكن إصدار هذا الأمر باستخدام عبارة بسيطة إذا. - بالنسبة للصور التي تحتوي على ملفات تعريف الخلايا المنتفخة ، مثل تلك الموضحة في الشكل 2 ، قم بتنفيذ إجراء تكراري لتصحيح الثنائيات الخاطئة في مراكز الخلايا (تسمى "الجزر" ؛ انظر أدناه) ، على النحو التالي.
- تحديد تخمين أولي لتغطية الخلية الإجمالية ؛ تم استخدام 60٪ لهذه الدراسة. لاحظ أن عدد الخلايا الموجودة داخل الصورة يجب أن يعتمد على تغطية الخلية - وبالتالي يمكن تحديد العلاقة بين عدد الخلايا وتغطية الخلية تجريبيا. باستخدام هذه العلاقة ، حدد المتغيرات "ألفا" و "كابا".
ملاحظة: يمثل "ألفا" متجها 3 × 1 يحتوي على النسب المئوية للارتفاع النسبية التالية: النسبة المئوية للارتفاع التي تم فيها تحديد الخلايا، والنسبة المئوية للارتفاع التي تم تحديد الخلفية عندها، والنسبة المئوية للارتفاع التي توجد فيها عادة الجزر - المناطق التي كانت فيها قيم الكثافة أقل بكثير من قيم الخلايا. يمثل "كابا" المساحة الإجمالية التي تغطيها الخلايا في الصورة. - قم بتشغيل الخوارزمية ، والتي ستقوم (i) بتحليل الصور باستخدام التقديرات الأولية لألفا وكابا لملء جزء من الجزر ، و (ii) استخدام عدد خلايا ما بعد التحليل والتغطية لإعادة حساب kappa. إذا كانت قيمة kappa في حدود 10٪ من التخمين الأولي ، فانتقل إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: بالنسبة للصور التي تحتوي على خلايا RAW264.7 و NIH/3T3 ، وجد أن ألفا هي [4.3 ، 5.5 ، 10]. وبعبارة أخرى، فإن الفرق بنسبة 4.3٪ عن الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة يحدد النسبة المئوية للارتفاع التي تم فيها تحديد الخلايا، والفرق بنسبة 5.5٪ عن الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة يحدد النسبة المئوية للارتفاع التي تم تحديد الخلفية عندها. حدد الفرق بنسبة 10٪ عن الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة النسبة المئوية للارتفاع التي تقيم فيها الجزر عادة.
- بعد ثنائية الصورة ، حدد متوسط مساحة الخلية تلقائيا باستخدام خوارزمية البحث عن الدائرة مفتوحة المصدر ، والتي تقوم بإجراء تحويل Hough على الصورة الثنائية 12،13،14. استخدم الأمر التالي للحصول على متجه لجميع مواقع المراكز ونصف قطر الدوائر الموجودة داخل الصورة.
"[المراكز، نصف القطر] = دائرة الاكتشاف (A، [minradius، maxradius])"
"A" في هذا الأمر هي الصورة المفضلة ، و [minradius ، maxradius] هي نطاق نصف القطر الذي ستحاول الخوارزمية اكتشافه.
ملاحظة: يفترض هذا الإجراء لتحديد متوسط مساحة الخلية أن مورفولوجيا خلايا البلاعم كانت دائرية ومتسقة بين الخلايا10. من البيانات التجريبية ، لوحظ أن نصف قطر البلاعم هو الأكثر شيوعا بين 30 و 50 بكسل عند تكبير 40x. يتم تعريف نطاق البكسل هذا على أنه النطاق المقبول لخوارزمية البحث عن الدائرة. قد يكون نصف القطر مختلفا اختلافا كبيرا بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى وسيتطلب التحديد باستخدام التحليل التجريبي.- استخدم مخرجات نصف القطر لحساب متوسط مساحة الخلية عن طريق المتوسط. قم بتحليل 10 خلايا على الأقل لضمان تحديد المنطقة بدقة.
- حدد العدد الإجمالي للخلايا داخل الصورة باستخدام متوسط مساحة الخلية.
- قم بالتكرار عبر مصفوفة الصورة وحساب إجمالي عدد وحدات بكسل الخلية. حدد إجمالي تغطية الخلية بقسمة عدد بيكسلات الخلية على إجمالي عدد البيكسلات داخل الصورة. حدد العدد الإجمالي للخلايا داخل الصورة بقسمة عدد بيكسلات الخلايا على متوسط مساحة الخلية.
3. تحليل الصور - الزراعة المشتركة باستخدام ملف "coculture_modified.m" في المقام الأول
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام MATLAB.
- استخدم الطريقة المستندة إلى المنطقة للحصول على صور للخلايا تعرض اختلافات الارتفاع النسبية. مخرجات الصورة لكل خطوة فرعية من خلال استخدام وظيفة "imshow()" لكل صورة فرعية. انسخ ملف الصورة والصقه لتحليله في سلة المهملات وأدخل اسم الملف في الأمر التالي. اضغط على تشغيل لبدء تشغيل البرنامج.
'imread('filename.tiff')'- قم بتحليل الصور عن طريق "الفتح عن طريق إعادة الإعمار" متبوعا ب "الإغلاق عن طريق إعادة الإعمار" باستخدام وظائف المصدر10 لتكبير المقدمة من الخلفية. استخدم الأمر الأول للفتح عن طريق إعادة الإعمار والتسلسلين الثاني والثالث للإغلاق عن طريق إعادة الإعمار.
'غير مفتوح ()'
'imerode()'
'إعادة البناء()'
- قم بتحليل الصور عن طريق "الفتح عن طريق إعادة الإعمار" متبوعا ب "الإغلاق عن طريق إعادة الإعمار" باستخدام وظائف المصدر10 لتكبير المقدمة من الخلفية. استخدم الأمر الأول للفتح عن طريق إعادة الإعمار والتسلسلين الثاني والثالث للإغلاق عن طريق إعادة الإعمار.
- إجراء تحليل للمزارع المشتركة التي تحتوي على خلايا RAW264.7 و NIH / 3T3 باستخدام اثنين من الثنائيات الانتقائية ، التي تم الحصول عليها عن طريق استغلال اختلافات الارتفاع بين نوعي الخلايا.
- حدد تجريبيا معلمة "phi" باستخدام صور لخلايا RAW264.7 و NIH / 3T3 ، مع تمثيل phi لفرق الارتفاع النسبي بين نوعي الخلايا. خمن قيمة phi الأولية وكرر حتى يتطابق عدد الخلايا وتغطيتها بشكل وثيق مع الأعداد اليدوية ، الخاصة بالزراعة المشتركة RAW264.7 و NIH / 3T3.
ملاحظة: تم العثور على قيمة phi المستخدمة في هذه الدراسات لتكون 3.2. يستخدم Phi لتصفية صورة بشكل انتقائي لتبدو وكأنها تحتوي على خلايا RAW264.7 فقط، كما هو موضح في الشكل 4C. - حدد عدد الخلايا RAW264.7 وإجمالي تغطية الخلايا بطريقة مماثلة لصور الزراعة الأحادية.
- حدد تجريبيا معلمة "phi" باستخدام صور لخلايا RAW264.7 و NIH / 3T3 ، مع تمثيل phi لفرق الارتفاع النسبي بين نوعي الخلايا. خمن قيمة phi الأولية وكرر حتى يتطابق عدد الخلايا وتغطيتها بشكل وثيق مع الأعداد اليدوية ، الخاصة بالزراعة المشتركة RAW264.7 و NIH / 3T3.
- قم بتحليل الصورة التي تم تحويلها إلى مستجمعات المياه مرة أخرى بدون معلمة phi ، واكتشاف كل من البلاعم والخلايا الليفية. احصل على بيانات الخلايا الليفية NIH/3T3 عن طريق طرح وحدات بكسل الخلايا RAW264.7 بشكل انتقائي، والتي تم الحصول عليها باستخدام طرق العتبة القياسية والقياس الكمي القائم على المساحة الموضحة في الخطوة 2.
- بمجرد تحليل الصورة بأكملها، حدد العدد الإجمالي لوحدات البكسل NIH/3T3 عن طريق طرح العدد الإجمالي لوحدات بكسل الخلايا من عدد وحدات بكسل RAW264.7. احسب تغطية خلايا NIH/3T3 وRAW264.7 بقسمة عدد بيكسلات الخلايا لكل سطر خلية على إجمالي عدد بيكسلات الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء تحليل للبلاعم RAW264.7 غير منتفخة في بيئة أحادية الزراعة عند 25000 خلية / سم2. تم التقاط صور تمثيلية لمزرعة الخلايا ومعالجتها في MATLAB بعد التحويل إلى 8 بت tiff في ImageJ. تم تسجيل مخرجات الخوارزمية طوال العملية وتوثيقها في الشكل 2 للصورة التمثيلية. في هذه الصورة، أحصت الخوارزمية 226 خلية، وتم التحقق من عدد الصور هذا بالمقارنة مع عدد يدوي حدد 241 خلية (خطأ بنسبة 6.2٪). كان متوسط خطأ مخرجات الخوارزمية لما لا يقل عن 10 صور لعدد خلايا RAW264.7 4.5 ± 1.9٪.
تم إجراء تحليل للبلاعم RAW264.7 المنتفخة باستخدام خوارزمية تكرارية. في معظم الصور ، كان التأثير المنتفخ الذي لوحظ في المقام الأول نتيجة للتركيز على مستوى بؤري أعلى قليلا من المستوى البؤري للركيزة التي كانت الخلايا ملتصقة بها. وفقا لذلك ، تم الحصول على معظم الصور في شكل غير منتفخ ، والذي كان تحليله أسهل بكثير. تم تطوير الخوارزمية اللازمة لتحليل الصور المنتفخة للسيناريوهات التي كان من المستحيل تجنبها دون المستوى الأمثل بسبب تأثيرات الغضروف المفصلي أو غيرها من التداخل البصري. تم تسجيل مخرجات الخوارزمية النموذجية طوال العملية وتوثيقها في الشكل 3. في هذا التحليل التمثيلي للصور، أحصت الخوارزمية 221 خلية داخل الصورة، والتي تم التحقق منها من خلال العد اليدوي ل 252 خلية (خطأ بنسبة 12.3٪).
تم إجراء تحليل للمزارع المشتركة التي تحتوي على كل من البلاعم RAW264.7 والخلايا الليفية NIH / 3T3 لتحديد القدرة على التمييز بين نوعين متميزين من الخلايا داخل صورة واحدة. نظرا لأشكال الخلايا المتغيرة للغاية للخلايا الليفية NIH / 3T3 ، لم يكن من الممكن الحصول على تعداد الخلايا اليدوي / التلقائي بدقة ، وبدلا من ذلك تمت مقارنة التغطيات الخلوية للخلايا الليفية نوعيا بالصورة الأصلية. تم تسجيل مخرجات الخوارزمية التمثيلية طوال العملية وتوثيقها في الشكل 4. بالنسبة لهذه الصورة، كان عدد البلاعم RAW264.7 137، وتم التحقق من هذا العدد باستخدام عدد يدوي قدره 155 (خطأ بنسبة 11.6٪). كان لمخرجات الخوارزمية لما لا يقل عن 10 أعداد البلاعم RAW264.7 7.8 ± خطأ 3.9٪.
كما تم التحقق من متانة خوارزمية عد الخلايا باستخدام دراسة عمياء لمقارنة التعرف التلقائي على الخلايا مع عدد المستخدمين اليدوي. تم اختيار خمس صور عشوائيا ، مع كثافات خلايا متفاوتة ، وتم حساب هذه الصور بشكل أعمى من قبل ثلاثة مستخدمين مختلفين. تمت مقارنة العد اليدوي مع بعضها البعض ومع نتائج خوارزمية عد الخلايا التلقائية. ويبين الجدول 1 مقارنة نتائج العد اليدوي والآلي. علاوة على ذلك ، تم اختبار دقة التجزئة لهذه الطريقة من خلال استخدام صور "الحقيقة الأرضية" المشتقة باستخدام تقنيات التجزئة التقليدية. تم استخدام معامل DICE 20,21 كمقياس أداء بمتوسط معلمة 0.85 عبر خمس صور. يمكن رؤية مثال على التراكب في الشكل 5.
الشكل 1: خوارزمية معممة قائمة على المنطقة. عملية يتم فيها إعداد صورة لتحليل التجزئة من خلال تحويلات مستجمعات المياه لتحديد الحد الأقصى الإقليمي والحد الأدنى10. تعدل هذه الطريقة المقترحة العملية (العملية الأصلية باللون الأسود) عن طريق تخطي تحديد خط التلال في مستجمعات المياه والخطوات اللاحقة لاعتماد نظام قائم على النسبة المئوية إلى جانب عملية تحديد كمي قائمة على المنطقة (مبرزة باللون الأحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إخراج خوارزمية RAW 264.7 غير منتفخة. يوضح الشكل خطوات معالجة الصور الوسيطة التي تؤدي إلى التحديد الكمي لعدد البلاعم RAW264.7 غير المنتفخة. (أ) المعالجة الأولية للصورة إلى تدرج رمادي في ImageJ. تم تحويل الصورة الأصلية إلى 8 بت tiff وتدرج رمادي في ImageJ. (ب) المعالجة اللاحقة للصورة ذات التدرج الرمادي. صورة ما بعد المعالجة ل A بعد الفتح والإغلاق عن طريق إعادة الإعمار، كما هو موضح في الخطوة 2.1.1. (ج) ما بعد إزالة الصور المعالجة. اللوحة باء بعد الثنائية، التي أجريت على النحو المبين في الخطوة 2.2. (د) صورة نهائية مع خلايا تمثيلية لحسابات متوسط المساحة. الصورة ذات الدوائر الزرقاء التي تشير إلى الخلايا المستخدمة داخل تحويل Hough لتحديد متوسط مساحة الخلية، كما هو موضح في الخطوة 2.3. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إخراج خوارزمية منتفخة RAW264.7. يوضح الشكل خطوات معالجة الصور الوسيطة التي تؤدي إلى التحديد الكمي لعدد البلاعم RAW264.7 منتفخة. (أ) صورة للبلاعم RAW264.7 منتفخة. تم تحويل الصورة الأصلية إلى 8 بت tiff وتدرج رمادي في ImageJ. (ب) المعالجة اللاحقة للصورة ذات التدرج الرمادي. صورة ما بعد المعالجة ل A بعد الفتح والإغلاق عن طريق إعادة الإعمار، كما هو موضح في الخطوة 2.1.1. (ج) بعد ثنائية الصورة المعالجة مع جزر واضحة. الإخراج النموذجي بدون الخوارزمية التكرارية عند تحليل الصور المنتفخة ، مع "جزر" من وحدات البكسل السوداء في مراكز الخلايا. تمثل الدوائر الزرقاء الخلايا المستخدمة داخل تحويل Hough لتحديد متوسط مساحة الخلية ، كما هو موضح في الخطوة 2.3. (د) الصورة النهائية مع الخلايا التمثيلية ، والجزر المملوءة باستخدام خوارزمية ما بعد الجراحة. تنشر الصورة خوارزمية تكرارية، كما هو موضح في الخطوة 2.2.2. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إخراج خوارزمية الزراعة المشتركة RAW264.7 و NIH / 3T3. يوضح الشكل خطوات معالجة الصور الوسيطة التي تؤدي إلى التحديد الكمي لصور الزراعة المشتركة التي تحتوي على البلاعم RAW264.7 والخلايا الليفية NIH / 3T3. (أ) صورة لخلايا NIH/3T3 وRAW264.7. تم تحويل الصورة الأصلية إلى 8 بت tiff وتدرج رمادي في ImageJ. (ب) المعالجة اللاحقة للصورة ذات التدرج الرمادي. صورة ما بعد المعالجة ل A بعد الفتح والإغلاق عن طريق إعادة الإعمار، كما هو موضح في الخطوة 3.1.1. (ج) ما بعد ثنائية الصورة المعالجة مع اختيار واضح للبلاعم على أساس العزل القائم على الارتفاع. العزل الانتقائي للبلاعم RAW264.7 ، كما هو موضح في الخطوة 3.2.2. (د) صورة نهائية مع مجموعات من البلاعم والخلايا الليفية المحددة. تحتوي الصورة بأكملها على كل من البلاعم RAW264.7 والخلايا الليفية NIH/3T3 ، كما هو موضح في الخطوة 3.3. يتم تحديد عينة من خلية البلاعم بدائرة خضراء ، ويتم تحديد عينة خلية الخلايا الليفية ببيضاوية حمراء. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أداء تجزئة معلمات DICE ، البلاعم RAW264.7. تظهر الصورة تراكبا بين نهج تجزئة "الحقيقة الأرضية" وهذه الطريقة. المناطق البيضاء هي خلايا تم اكتشافها بواسطة كل من "الحقيقة الأرضية" وهذه الطريقة ، في حين أن المناطق الأرجوانية والخضراء هي سلبيات كاذبة وإيجابيات كاذبة ، على التوالي. تم الحصول على تجزئة "الحقيقة الأرضية" من خلال تقنيات التجزئة الشائعة وتستخدم أدوات منطقة الاهتمام لتصحيح التقسيم الخاطئ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عداد 1 | عداد 2 | عداد 3 | تلقائي | متوسط الأعداد اليدوية (±STDEV) | خطأ مقارنة بالتلقائي | |
| صورة رقم 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3.0 | 4.22% |
| صورة 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2.0 | 4.05% |
| صورة رقم 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5.3 | 5.02% |
| صورة 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2.6 | 7.22% |
| صورة رقم 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3.0 | 7.20% |
الجدول 1: عدد الخلايا اليدوي / التلقائي واختبار المتانة.
معلومات تكميلية: الاختلافات المورفولوجية في تحليل الصور للبلاعم والخلايا الليفية المشتركة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 1: "العملية.m" ، ملف MATLAB الضروري لتشغيل الخوارزميات. لا توجد إجراءات يدوية مطلوبة ولكنها تحتوي على الخوارزمية في ملف منفصل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 2: "الزراعة الأحادية.m" ، ملف MATLAB المستخدم لتحليل صور الزراعة الأحادية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 3: "coculture_modified.m" ، ملف MATLAB المستخدم لتحليل صور الزراعة المشتركة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد صممنا إجراء عاما قائما على المنطقة يقوم بحساب الخلايا بدقة وكفاءة على أساس ارتفاع الخلية ، مما يسمح بقياس كمية الخلايا الخالية من البقع حتى في أنظمة الزراعة المشتركة. وشملت الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء تنفيذ نظام كثافة نسبية يمكن من خلاله تمييز الخلايا. وقد خدم استخدام تحليل الارتفاع النسبي غرضين: فقد أصبحت الحاجة إلى بارامترات خارجية غير ضرورية، حيث كانت المعلمات النسبية ثابتة لنوع الخلية والمعلمة المحددين، ولم تكن هناك حاجة إلى إدخال مستويات السطوع/التباين المطلقة لكل صورة. وعلاوة على ذلك، مكن استخدام نظام قائم على النسبة المئوية من تحليل أنواع متعددة من الخلايا داخل الصورة نفسها، شريطة أن تكون أنواع الخلايا المختلفة موجودة على ارتفاعات فريدة داخل الصورة.
تم تعريف النظام القائم على النسبة المئوية على أنه اختلاف عن الحد الأقصى لقيمة البكسل بدلا من المتوسط. تم ذلك لمنع انحراف الخوارزمية بناء على متوسط قيمة الكثافة ، والتي كانت تعتمد على عدد الخلايا الموجودة في الصورة والتقائها. علاوة على ذلك ، تم تنفيذ "الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة" لمنع القيم المتطرفة القصوى للكثافة من التأثير بشكل كبير على البيانات - يجب أن تمثل وحدات البكسل القصوى ذات الصلة 0.5٪ على الأقل من السكان - وهي قيمة تجريبية. وشملت الخطوات الإضافية استخدام نظام للقياس الكمي قائم على أساس المناطق بدلا من حساب فرادى الكيانات. وقد ضمن ذلك تقليل تجزئة الخلايا أو الثنائيات الخاطئة إلى أدنى حد عند عد الخلايا، حيث أن إجمالي المساحة المصابة كان ضئيلا مقارنة بمساحة الخلية.
تم تنفيذ طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها المختلفة داخل هذه الخوارزمية. تطلبت الجهود الأولية لتحديد صور الزراعات الأحادية الخلوية طرقا لتحديد كل من الخلايا المنتفخة وغير المنتفخة بدقة. لوحظت ظاهرة فريدة من نوعها لصور الخلايا المنتفخة ، حيث تم تحديد مراكز الخلايا كخلفية بعد تحول مستجمعات المياه ، وظهرت هذه المناطق كجزر داخل الخلية. كشف تحليل شامل أن نقص مراكز الخلايا كان يحدث بسبب بنية محدبة بشكل مفرط داخل الصورة ، مما أدى إلى انعكاس في تحول مستجمعات المياه. تم تنفيذ حل خصيصا للصور المنتفخة ، والتي تضمنت عملية تكرارية تعرف باسم التوصيل ، حيث تم ملء الجزر كقيم خلية حقيقية. وقد عمل ذلك من خلال إجراء استخدمت فيه تغطية الخلية ومدى تكوين الجزيرة لتحديد دقة الصورة. وعموما، استخدمت التغطية الخلوية لتحديد مدى تكوين الجزر، حيث أن التغطية الخلوية المنخفضة بشكل غير عادي كانت تحدث عادة بسبب ارتفاع مستوى تكوين الجزر. تم تحديد العلاقة بين تغطية الخلايا ومدى تكوين الجزيرة من خلال البيانات التجريبية.
كان من الضروري استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل إضافي استنادا إلى ملاحظة أن استخدام عتبة "متوسط البكسل" (التي تعرف بأنها متوسط كثافة البكسل داخل الصورة) لتمييز الخلايا ، بدلا من الحد الأقصى للبكسل ، أدى إلى عدم الاتساق. وجد أن متوسط كثافة الصورة يزداد كدالة لعدد الخلايا في الصورة ، مما قد يؤدي إلى انحراف النتائج بناء على كثافة الخلايا داخل الصورة. تم تصميم تكرار بديل للخوارزمية باستخدام معيار أقصى كثافة. ومع ذلك ، كانت هذه القيمة أيضا غير متسقة ، حيث أن القيم المتطرفة عالية الكثافة شوهت البيانات بشكل كبير وأدت إلى نتائج غير موثوقة. في نهاية المطاف ، تم اعتماد استخدام الحد الأقصى من البكسل ذي الصلة. تم العثور على الحد الأقصى من البكسل ذي الصلة لحساب القيم المتطرفة عالية الكثافة بدقة ، مما يؤدي إلى النتائج الأكثر اتساقا عند التمييز بين صور الزراعة الأحادية والزراعة المشتركة.
تم تحديد العديد من القيود على الخوارزمية عند تحليل صور الزراعة المشتركة باستخدام النظام القائم على النسبة المئوية لتحديد أنواع متميزة من الخلايا بشكل انتقائي. في بعض الأحيان ، تظهر خلايا NIH / 3T3 بشكل مستمر مع خلايا RAW 264.7 في مجموع متعدد الطبقات ، مما جعل من الصعب للغاية تحليل الصورة. على الرغم من أن هذا لوحظ في الغالب لصور الزراعة المشتركة ، إلا أن صور الزراعة الأحادية للخلايا ذات ظروف الزراعة غير الطبيعية أو مستويات الالتقاء العالية يمكن أن تؤدي أيضا إلى مجاميع خلايا متعددة الطبقات. في حين أن الخوارزمية يمكن أن تكتشف بنجاح المجاميع متعددة الطبقات باعتبارها فريدة من نوعها من الخلفية ، لم يكن من الممكن الحصول على تحديد كمي دقيق للخلية باستخدام تحليل الصورة 2D هذا على الطبقات المتعددة للخلايا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يعوق حطام الخلايا داخل الصورة دقة الخوارزمية. وأدى استخدام خوارزمية تحليل قائمة على المناطق إلى التقليل إلى أدنى حد من الخطأ المرتبط بالكشف الخاطئ، لأن المناطق الصغيرة من حطام الخلايا ستؤثر على عدد الخلايا باستخدام تحليل قائم على المنطقة أقل من التجزئة.
بالإضافة إلى ذلك ، أدى تحويل صور czi إلى TIFF 8 بت ، الذي تم إجراؤه لضمان البساطة والتوحيد ، إلى أنواع بكسل من uint8 ، وهي مجموعة من الأرقام الصحيحة من 0 إلى 255. وبالتالي ، لا يمكن تحديد الاختلافات إلا بدقة قصوى تبلغ 1/256 أو 0.39٪. بشكل عام ، يغطي انتشار البكسل فقط ما بين 210 و 250 بكسل ، مما يؤدي إلى دقة واقعية تبلغ 2.5٪. على الرغم من أنه وجد أن هذا مناسب لتحليل الزراعة الأحادية الذي تكون فيه الخلايا متميزة للغاية عن الخلفية ، إلا أن خطوة الطرح الانتقائي في تحليل الزراعة المشتركة تتطلب دقة أكبر بكثير. وعلى الرغم من أنه لا يزال من الممكن الحصول على بيانات دقيقة بشكل معقول من صور الزراعة المشتركة، فقد انخفضت الدقة الإجمالية لتحليل الزراعة المشتركة مقارنة بدقة التحليل من صور الزراعة الأحادية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نظام تحديد الهوية القائم على المنطقة يتطلب مساحة خلية متوسطة للحصول على تعداد الخلايا. هذه المعلمة مفيدة عند التعامل مع الصور الصاخبة أو مع خلايا ذات هندسة موحدة ولكنها ستعيق القياس الكمي للخلايا المتغيرة المساحة.
تكمن أهمية هذه الخوارزمية على عكس الطرق الحالية في استخدام طرق مطورة مثل عمليات تحويل مستجمعات المياه والصور المورفولوجية لتحليل الخلايا الأحادية والمستزرعة دون إجراءات تلطيخ التألق. على الرغم من أن العديد من الدراسات السابقة قد أبلغت عن طرق لتمييز الخلايا وحسابها بنجاح في غياب التلطيخ ، إلا أن هذه الأساليب البديلة غالبا ما تتطلب مناهج استزراع معقدة أو برامج يتعذر الوصول إليها16. على سبيل المثال ، استخدم يلماز وزملاؤه تقنيات تحليل العد الآلي لتحديد كمية الخلايا المناعية من خلال الرقائق الحيوية مع الخرز المغناطيسي المناعي على micropads15.
كما صممنا أساليب جديدة ومؤثرة لمعالجة أنماط الضوضاء غير العشوائية، مثل "الجزر"، التي ظهرت في مراكز الخلايا. وكان من الممكن أيضا تحديد خطوط الخلايا المختلفة من خلال استخدام قيم "الارتفاع" المختلفة للخلايا، والتي يمكن تحديدها من وحدات بكسل الكثافة. وفر استخدام المعلمات النسبية بدلا من المعلمات المطلقة العديد من المزايا من خلال تمكين أتمتة الخوارزمية وتوفير المزيد من المرونة للحصول على الصور ، حيث لم تكن هناك حاجة إلى الحفاظ على إعدادات السطوع أو التباين أو اللون الدقيقة. وقدم تحديد الهوية القائم على المنطقة نتائج دقيقة حتى عندما كانت الخلايا مجمعة، كما هو شائع مع العديد من أنواع الخلايا. في المقابل، يعد العد اليدوي والتقسيم أمرا صعبا، ومعرضا للخطأ، وقد يتطلب مستخدما مدربا لتحديد الخلايا بدقة وكفاءة.
ستركز التطبيقات المستقبلية وتطوير الخوارزمية على ضبط إجراء عد الخلايا وزيادة تحسينه. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من استخدام بارامترات تجريبية للتمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا حسب الكثافة النسبية عن طريق اختبار المزيد من عمليات الزرع المشترك؛ على سبيل المثال ، تحديد الخلايا العصبية / الخلايا النجمية لتحليل السمية العصبية17. يمكن إجراء المزيد من التطبيقات في مجال التئام الجروح ، حيث يمكن أن تلعب النسب التمثيلية للخلايا المناعية دورا بارزا في العمليات الالتهابية والمضادة للالتهابات. يمكن أن توفر التحسينات في القياس الكمي للخلايا للبلاعم والخلايا الليفية نظرة ثاقبة إضافية على تأثيرات إشارات الخلايا الباراكرين مقابل الجوكستراكرين ذات الصلة بتقييم نتائج استجابة الأجسام الغريبة18,19. في المعلومات التكميلية ، نستكشف الآليات الممكنة لدمج المعلمات المورفومترية في الخوارزمية للمساعدة في دقة تحديد الخلايا داخل أنظمة الزراعة المشتركة.
يمكن أيضا إجراء امتدادات للمزارع المشتركة الأكثر تعقيدا ، والتي من شأنها أن تركز على 3 أنواع مختلفة أو أكثر من الخلايا داخل الصور ، بدلا من المخاليط الثنائية فقط. نظرا للدقة المحدودة المتاحة للصور 8 بت، قد تكون هناك حاجة إلى صور 16 بت، والتي توفر معلومات إضافية ولكنها قد تعقد التحليل بشكل كبير بسبب نطاقات الكثافة والتوزيعات الأكثر ديناميكية. كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير بروتوكول قوي للعد الآلي للخلايا تم تحسينه لبيئات زراعة الخلايا المتنوعة. تسمح الخوارزمية بتعداد دقيق للخلايا حتى في عمليات اكتساب صور الخلايا المنتفخة. يعد رمزها التكراري ذاتي التصحيح مفيدا للتصوير المجهري الساطع الخالي من البقع لأنظمة زراعة الخلايا ذات الصلة بالمناعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AR067247) وجزئيا من قبل برنامج ديلاوير INBRE ، بدعم من منحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة - NIGMS (P20 GM103446) من المعاهد الوطنية للصحة وولاية ديلاوير. ولا تعكس محتويات المخطوطة بالضرورة آراء وكالات التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T.
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D.
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
