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Bioengineering

Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware

Summary

Apresentamos um método, que utiliza uma abordagem de análise de imagem generalizada baseada em área para identificar a contagem de células. A análise de diferentes populações celulares explorou as diferenças significativas de altura celular e estrutura entre tipos de células distintas dentro de um algoritmo adaptativo.

Abstract

A quantificação das células é necessária para uma ampla gama de estudos biológicos e bioquímicos. A análise convencional de imagens das células normalmente emprega abordagens de detecção de fluorescência, como coloração imunofluorescente ou transfecção com proteínas fluorescentes ou técnicas de detecção de borda, que muitas vezes são propensas a erros devido ao ruído e outras não-idealidades no fundo da imagem.

Projetamos um novo algoritmo que poderia contar com precisão e distinguir macrófagos e fibroblastos, células de diferentes fenótipos que muitas vezes se colocam durante a regeneração tecidual. O MATLAB foi usado para implementar o algoritmo, que diferenciava tipos de células distintas com base em diferenças de altura a partir do fundo. Um algoritmo primário foi desenvolvido usando um método baseado em área para explicar as variações no tamanho/estrutura da célula e condições de semeadura de alta densidade.

As não idealidades nas estruturas celulares foram contabilizadas com um algoritmo iterativo secundário utilizando parâmetros internos, como cobertura celular computada usando dados experimentais para um determinado tipo de célula. Finalmente, foi realizada uma análise dos ambientes de cocultura utilizando-se um algoritmo de isolamento no qual vários tipos de células foram seletivamente excluídos com base na avaliação de diferenças de altura relativas dentro da imagem. Essa abordagem foi encontrada para contar com precisão as células dentro de uma margem de erro de 5% para células monoculturadas e dentro de uma margem de erro de 10% para células coculturadas.

Introduction

O software é implementado rotineiramente durante técnicas de análise de imagens para garantir que os resultados sejam precisos, eficientes e imparcial. Para ensaios baseados em células, um problema comum é a identificação errada das células. Imagens com configurações focais e de contraste inadequadas podem levar à desfoque celular, no qual o limite de células individuais torna-se difícil de identificar1. A presença de características de imagem ímpares, como poros, bolhas ou outros objetos indesejados, pode dificultar a contagem de procedimentos, retardando o processo de contagem e levando à identificação errada. Além disso, a contagem de células pode ser onerosa, e contar centenas de réplicas pode ser extremamente demorado. Além disso, existe um viés subjetivo inerente durante a contagem manual e, portanto, a tomada de decisão sobre a identificação celular é muitas vezes imprecisa2. O software automatizado oferece um potencial empolgante para contornar todos esses problemas, diferenciando rapidamente e precisamente as células de objetos estranhos, incluindo objetos muito além da capacidade humana para detecção precisa, com base em critérios de identificação bem definidos que reduzem a influência do viés do investigador. Técnicas comuns para identificar células usando software automatizado envolvem dois métodos principais: segmentação e limiar3. Aqui, demonstramos um protocolo generalizado baseado em área que permite a contagem rápida, precisa e barata de células dentro de uma estrutura de software amplamente acessível.

Técnicas de segmentação, como a detecção de bordas, buscam isolar células individuais utilizando diferenças de intensidade dentro de uma imagem. As mudanças de intensidade que distinguem uma célula do resto da imagem mais frequentemente consistem em mudanças acentuadas no brilho4. A detecção de bordas envolve uma etapa de filtragem regularizadora, seguida de uma etapa de diferenciação na qual são detectadas alterações de intensidade. O processo de diferenciação identifica bordas e contornos dentro da imagem de mudanças de alta intensidade, e essas bordas e contornos estão correlacionados com a presença celular. Embora imagens com ruído possam ser executadas através de algoritmos de denoizantes4, técnicas de detecção de bordas são idealmente usadas para analisar imagens com baixo ruído de fundo. O processo funciona de forma ideal quando os limites celulares são claramente e facilmente distinguíveis e não são impedidos por contornos de brilho não relacionados à presença celular, desfoque celular, objetos estranhos ou estruturas celulares internas definidas 1,2. Se uma imagem é particularmente ruidosa, as células podem ser ainda mais distinguidas através de coloração fluorescente ou transfecção com proteínas fluorescentes 2,5. Embora isso melhore significativamente a precisão das técnicas de segmentação, requer custos adicionais e investimentos adicionais para preparar culturas celulares para imagens.

As técnicas de limiar envolvem a divisão de uma imagem em duas categorias: o primeiro plano e o fundo, com células atribuídas ao primeiro plano3. Essas técnicas utilizam alterações de cor/contraste para definir a altura aparente de um objeto; objetos que são rotineiramente 'mais altos' do que o fundo podem ser facilmente identificados como células. A transformação da bacia hidrográfica funciona desta forma associando superfícies com pixels de luz como o primeiro plano e aqueles com pixels escuros como o fundo 6,7. Através da identificação baseada em altura, as técnicas de limiar podem distinguir rotineiramente o ruído dos objetos desejados, desde que existam dentro do mesmo plano focal. Quando emparelhado com uma quantificação baseada em área, uma transformação de bacia hidrográfica pode identificar com precisão grupos de objetos em ambientes onde técnicas típicas de segmentação, como detecção de bordas, seriam imprecisas.

As transformações de bacias hidrográficas são comumente acoplada a técnicas de segmentação para preparar imagens para uma análise mais limpa, resultando em maior precisão da contagem celular. Para esse processo, a transformação de bacias hidrográficas é utilizada para destacar potenciais regiões de interesse antes da segmentação. Uma transformação de bacia hidrográfica proporciona benefícios únicos ao identificar células em primeiro plano de imagens, o que pode melhorar a precisão da análise de segmentação, removendo potenciais falsos positivos para células, como patches irregulares de fundo. No entanto, podem surgir dificuldades ao tentar adaptar imagens baseadas em células a uma transformação divisora de águas. Imagens com alta densidade celular podem ser atormentadas com subsegmentação, na qual agregados de células são identificados como um grupo singular e não como componentes individuais. A presença de ruídos ou alterações acentuadas de intensidade também pode resultar em superegmentação, na qual o algoritmo sobreisola as células, resultando em contagem de células excessivas e imprecisas8.

Aqui, detalhamos um método para minimizar as desvantagens primárias da transformação da bacia hidrográfica, incorporando componentes de uma análise de limiar dentro de um algoritmo de quantificação baseado em área, como retratado na Figura 1. Notavelmente, este algoritmo foi implementado com software de código aberto e/ou amplamente disponível, e a aplicação desta estrutura de contagem de células foi possível sem reagentes caros ou técnicas complexas de preparação celular. Os macrófagos RAW264.7 foram utilizados para demonstrar o método devido ao seu papel crítico na regulação dos processos de manutenção de tecidos conjuntivos e cicatrização de feridas9. Além disso, os fibroblastos NIH/3T3 foram analisados devido ao seu papel fundamental na manutenção e reparação de tecidos. As células fibroblastos frequentemente coexistem e apoiam macrófagos, gerando a necessidade de distinguir esses tipos de células fenotipicamente distintas em estudos de cocultura.

As contagens celulares a partir de imagens com alta densidade celular viável (VCD) poderiam ser quantificadas de forma confiável e eficiente calculando a área coberta pelas células, e a área média ocupada por uma célula singular. O uso de limiares em oposição à segmentação para identificação celular também possibilitou análises mais complexas, como experimentos em que diferentes tipos de células em coculturas foram analisados simultaneamente. Os fibroblastos NIH/3T3, que muitas vezes são encontrados para se colocar com macrófagos RAW264.7 dentro de um local de cicatrização de feridas, foram encontrados para crescer em um plano focal que era distinto do plano focal dos macrófagos10. Assim, vários algoritmos de limiar foram executados para definir o fundo e o primeiro plano, dependendo do tipo de célula que está sendo analisado, permitindo uma contagem precisa de dois tipos de células diferentes dentro da mesma imagem.

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Protocol

1. Cultura celular e aquisição de imagens

  1. Cultura RAW264.7 macrófagos a 37 °C e 5% DE CO2 no Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de sódio biato e 5 μM β-mercaptoethanol.
    1. Para imagens de monocultura, cultura RAW264.7 células a uma densidade de 25.000 células/cm2 em um frasco de cultura celular de 5 mL com 1 mL de médio.
  2. Cultura NIH/3T3 células a 37 °C e 5% CO2 em DMEM suplementadas com soro bovino fetal de 10% e 1% penicilina-estreptomicina11.
  3. Para a cocultura, cultura RAW264.7 macrófagos e fibroblastos NIH/3T3 juntos em proporções variadas, a uma densidade total de 25.000 células/cm2. Use meio de cocultura que seja 1 parte RAW264.7 médio (DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L bicarbonato de sódio e 5 μM β-mercaptoetanol) e 1 parte NIH/3T3 médio (DMEM suplementado com soro bovino fetal de 10% e 1% penicilina-estreptomicina).
  4. Após a semeadura, incubar células a 37 °C e 5% de CO2 para atingir uma densidade celular viável de 80% de confluência celular.
  5. Células de imagem com um microscópio invertido equipado com um objetivo de 40x. Adquira todas as imagens em escala de cinza e exporte-as no arquivo '.czi' bruto.
    1. Determine a capacidade do algoritmo de avaliar com precisão imagens com uma gama de qualidades de imagem. Adquira imagens com diferentes focos, produzindo imagens "não bulbosas" (Figura 2) e imagens 'bulbosas' (Figura 3).
    2. Exporte e converta imagens de células para o formato de imagem tiff (.tiff) de 8 bits usando imageJ usando a função 'Batch Convert' nos arquivos '.czi' brutos antes da análise MATLAB. Armazene imagens convertidas em uma pasta local e transfira manualmente esses arquivos de imagem para a caixa MATLAB relevante.

2. Análise de imagem-monocultura utilizando o arquivo "monocultura.m" principalmente

NOTA: As seguintes etapas foram realizadas utilizando-se o MATLAB. Três arquivos foram usados para o protocolo MATLAB: "process.m" (arquivo de codificação suplementar 1), o arquivo contendo o algoritmo, "monocultura.m" (arquivo de codificação suplementar 2), o arquivo para executar para análise de imagens de monocultura, e "coculture_modified.m" (arquivo de codificação suplementar 3), o arquivo a ser executado para analisar imagens de cocultura.

  1. Use o método baseado na área para obter imagens de células que mostrássem variações relativas de altura. Saídas de imagem para cada subpresto utilizando a função 'imshow()' para cada subimagem. Copie e cole o arquivo de imagem para análise no bin e digite o nome do arquivo no comando a seguir. Pressione para iniciar o programa.
    imread ('nome de arquivo.tiff')
    1. Analise imagens por 'abertura por reconstrução' seguida de 'fechamento por reconstrução' usando funções de origem8 para ampliar o primeiro plano a partir do fundo. Use o primeiro comando para abertura por reconstrução e a segunda e terceira sequências para fechar por reconstrução
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. Binarize as imagens reconstruídas para pixels brancos puros e pretos utilizando um sistema de identificação baseado em percentil. Observe que as células são convertidas em um valor de pixel branco puro de '255' neste sistema, enquanto objetos de fundo e estranhos (não celulares) são convertidos em um valor de pixel preto puro de '0'.
    1. Diferencie as células do fundo usando uma diferença percentil do "pixel máximo relevante", o maior valor de pixels que compreende pelo menos 0,5% de uma determinada imagem.
    2. Analise e avalie os valores dos pixels para macrófagos RAW264.7. Se esses valores estiverem dentro de 4,5% do pixel máximo relevante, marque o pixel como celular.
      NOTA: Este comando pode ser emitido usando uma instrução simples se.
    3. Para imagens contendo perfis de células bulbosas, como as vistas na Figura 2, implemente um procedimento iterativo para corrigir a binarização errônea nos centros das células (denominadas 'ilhas', veja abaixo), da seguinte forma.
    4. Determine um palpite inicial para a cobertura total da célula; Para este estudo, 60% foram utilizados 60%. Observe que o número de células presentes na imagem deve depender da cobertura celular - a relação entre o número celular e a cobertura celular pode, portanto, ser determinada experimentalmente. Usando essa relação, determine as variáveis 'Alfa' e 'kappa'.
      NOTA: 'Alfa' representa um vetor 3 x 1 contendo os seguintes percentis de altura relativa: o percentil de altura em que as células foram identificadas, o percentil de altura no qual o fundo foi identificado e o percentil de altura em que as ilhas-regiões em que os valores de intensidade eram significativamente inferiores aos valores das células tipicamente residiam. 'Kappa' representa a área total coberta por células na imagem.
    5. Execute o algoritmo, que irá (i) analisar imagens usando estimativas iniciais de alfa e kappa para preencher uma parte das ilhas, e (ii) usar a contagem de células pós-análise e cobertura para recalcular kappa. Se o valor kappa estiver dentro de 10% do palpite inicial, siga para o próximo passo.
      NOTA: Para imagens contendo células RAW264.7 e NIH/3T3, o alfa foi encontrado [4.3, 5.5, 10]. Em outras palavras, uma diferença de 4,3% do pixel máximo relevante determinou o percentil de altura em que as células foram identificadas, uma diferença de 5,5% do pixel máximo relevante determinou o percentil de altura no qual o fundo foi identificado. Uma diferença de 10% do pixel máximo relevante determinou o percentil de altura em que as ilhas normalmente residiam.
  3. Após a binarização da imagem, determine a área média do celular usando automaticamente o algoritmo de localização de círculo de código aberto, que executa uma transformação de Hough na imagem binarizada 12,13,14. Use o seguinte comando para obter um vetor de todos os locais centrais e raios de círculos encontrados dentro da imagem.
    '[centros, raios] = imindcircle(A, [minradius, maxradius])
    'A' neste comando é a imagem escolhida, e [minradius, maxradius] é o alcance de raios que o algoritmo tentará detectar.
    NOTA: Este procedimento para determinar a área celular média pressupõe que a morfologia das células macrófagos era circular e consistente entre as células10. A partir de dados experimentais, observa-se que os raios de macrófagos são mais comumente entre 30 e 50 pixels a 40x de ampliação. Esta gama de pixels é definida como o alcance aceitável para o algoritmo de localização de círculos. Os raios podem ser significativamente diferentes para outros tipos de células e exigiria determinação usando análise experimental.
    1. Use as saídas de raios para calcular a área média da célula, em média. Analise pelo menos 10 células para garantir a identificação precisa da área.
  4. Determine o número total de células dentro da imagem usando a área celular média.
    1. Entre na matriz de imagens e conte o número total de pixels celulares. Determine a cobertura total do celular dividindo o número de pixels celulares pelo número total de pixels dentro da imagem. Determine o número total de células dentro da imagem dividindo o número de pixels celulares pela área média de uma célula.

3. Análise de imagem-cocultura utilizando o arquivo "coculture_modified.m" principalmente

NOTA: As seguintes etapas foram realizadas utilizando-se o MATLAB.

  1. Use o método baseado na área para obter imagens de células que mostrássem variações relativas de altura. Saídas de imagem para cada subpresto utilizando a função 'imshow()' para cada subimagem. Copie e cole o arquivo de imagem para análise no bin e digite o nome do arquivo no comando a seguir. Pressione para iniciar o programa.
    'imread('nome de arquivo.tiff')'
    1. Analise imagens por 'abertura por reconstrução' seguidas de 'fechamento por reconstrução' usando funções de origem10 para ampliar o primeiro plano a partir do fundo. Use o primeiro comando para abertura por reconstrução e a segunda e terceira sequências para fechar por reconstrução.
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. Realizar uma análise das coculturas contendo células RAW264.7 e NIH/3T3 utilizando duas binarizações seletivas, obtidas pela exploração das diferenças de altura entre os dois tipos de células.
    1. Determine experimentalmente um parâmetro 'phi' utilizando imagens de células RAW264.7 e NIH/3T3, com phi representando a diferença de altura proporcional entre os dois tipos de células. Acho que um valor inicial de phi e iterado até que as contagens de células e a cobertura coincidam intimamente com as contagens manuais, específicas da cocultura RAW264.7 e NIH/3T3.
      NOTA: O valor do phi utilizado nestes estudos foi de 3,2. Phi é usado para filtrar seletivamente uma imagem para parecer conter apenas células RAW264.7, como visto na Figura 4C.
    2. Determine a contagem de células RAW264.7 e a cobertura celular total de forma semelhante às imagens de monocultura.
  3. Analise novamente a imagem transformada em bacias hidrográficas sem o parâmetro phi, detectando macrófagos e fibroblastos. Adquira dados de fibroblasto NIH/3T3 subtraindo seletivamente pixels de células RAW264.7, obtidos usando os métodos padrão de limiarização e quantificação baseados em área descritos na etapa 2.
    1. Uma vez analisada toda a imagem, determine o número total de pixels NIH/3T3 subtraindo o número total de pixels de células do número de pixels RAW264.7. Calcule a cobertura das células NIH/3T3 e RAW264.7 dividindo-se pelo número de pixels celulares para cada linha celular pelo número total de pixels de imagem.

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Representative Results

A análise dos macrófagos RAW264.7 não bulbosos foi realizada em um cenário de monocultura a 25.000 células/cm2. Imagens representativas foram tiradas da cultura celular e processadas no MATLAB após a conversão para uma tiff de 8 bits no ImageJ. As saídas de algoritmos ao longo do processo foram registradas e documentadas na Figura 2 para a imagem representativa. Nesta imagem, o algoritmo contava 226 células, e essa contagem de imagens foi verificada em comparação com uma contagem manual que identificou 241 células (6,2% de erro). As saídas de algoritmos para pelo menos 10 imagens da contagem de células RAW264.7 tiveram um erro médio de 4,5 ± 1,9%.

A análise dos macrófagos RAW264.7 bulbosos foi realizada utilizando-se um algoritmo iterativo. Na maioria das imagens, o efeito bulboso observado foi principalmente resultado do foco em um plano focal que estava ligeiramente acima do plano focal do substrato ao qual as células eram aderentes. Assim, a maioria das imagens foi adquirida de forma não bulbosa, para a qual a análise foi significativamente mais fácil. O algoritmo necessário para analisar imagens bulbosas foi desenvolvido para cenários em que subótimos eram impossíveis de evitar devido a efeitos menisco ou outras interferências ópticas. Saídas típicas de algoritmos ao longo do processo foram registradas e documentadas na Figura 3. Nesta análise de imagem representativa, o algoritmo contabilizou 221 células dentro da imagem, o que foi verificado com uma contagem manual de 252 células (erro de 12,3%).

A análise das coculturas contendo tanto macrófagos RAW264.7 quanto fibroblastos NIH/3T3 foram realizadas para determinar a capacidade de diferenciar entre dois tipos de células distintas dentro de uma única imagem. Devido às morfologias celulares altamente variáveis dos fibroblastos NIH/3T3, a contagem manual/automática de células não pôde ser obtida com precisão, e as coberturas celulares para fibroblastos foram comparadas qualitativamente à imagem original. As saídas representativas de algoritmos ao longo do processo foram registradas e documentadas na Figura 4. Para esta imagem, a contagem de macrófagos RAW264.7 foi de 137, sendo essa contagem verificada com uma contagem manual de 155 (erro de 11,6%). As saídas de algoritmos para pelo menos 10 contagens de macrófagos RAW264,7 tiveram uma média de 7,8 ± erro de 3,9%.

A robustez do algoritmo de contagem de células também foi verificada usando um estudo cego para comparar a identificação automática de células com contagem manual de usuários. Cinco imagens foram selecionadas aleatoriamente, com densidades celulares variadas, e essas imagens foram contadas cegamente por três usuários diferentes. As contagens manuais foram comparadas entre si e com os resultados do algoritmo automático de contagem de células. A comparação dos resultados de contagem manual e automatizada é mostrada na Tabela 1. Além disso, a precisão de segmentação deste método foi testada utilizando imagens de "verdade terrestre" derivadas utilizando técnicas convencionais de segmentação. O coeficienteDICE 20,21 foi utilizado como métrica de desempenho com um parâmetro médio de 0,85 em cinco imagens. Uma sobreposição de exemplo pode ser vista na Figura 5.

Figure 1
Figura 1: Algoritmo generalizado baseado em área. Um processo em que uma imagem é preparada para análise de segmentação através das bacias hidrográficas-transforma para determinar maxima regional e minima10. Este método proposto modifica o processo (processo original em preto) pulando a determinação da linha de cume da bacia hidrográfica e etapas subsequentes para adotar um sistema baseado em percentil, juntamente com um processo de quantificação baseado em área (destacado em vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: RAW 264.7 saída de algoritmo não bulboso. A figura mostra as etapas intermediárias de processamento de imagem que levam à quantificação de contagens de macrófagos RAW264.7 não bulbosos. (A) Processamento inicial da imagem para escala de cinza no ImageJ. A imagem original convertida em tiff de 8 bits e escala de cinza no ImageJ. (B) Pós-processamento da imagem em escala de cinza. A imagem pós-processamento de A após abertura e fechamento por reconstrução, conforme descrito na etapa 2.1.1. (C) Pós-binarização da imagem processada. Binarização pós painel B , realizada conforme descrito na etapa 2.2. (D) Imagem final com células representativas para cálculos de área média. A imagem com círculos azuis indicando as células utilizadas dentro do Hough-transform para identificar a área média de uma célula, conforme descrito na etapa 2.3. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: SAÍDA DE ALGORITMO BULBOSO RAW264.7. A figura mostra as etapas intermediárias de processamento de imagem que levam à quantificação das contagens de macrófagos RAW264.7 bulbosos. (A) Imagem de macrófagos RAW264.7 bulbosos. A imagem original convertida em tiff de 8 bits e escala de cinza no ImageJ. (B) Pós-processamento da imagem em escala de cinza. A imagem pós-processamento de A após abertura e fechamento por reconstrução, conforme descrito na etapa 2.1.1. (C) Pós-binarização de imagem processada com ilhas claras. A saída típica sem o algoritmo iterativo ao analisar imagens bulbosas, com "ilhas" de pixels pretos nos centros das células. Os círculos azuis representam as células utilizadas dentro da hough-transform para identificar a área média de uma célula, conforme descrito na etapa 2.3. (D) Imagem final com células representativas, ilhas preenchidas usando algoritmo pós-operatório. A imagem posta algoritmo iterativo, conforme descrito na etapa 2.2.2. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Saída do algoritmo de cocultura RAW264.7 e NIH/3T3. A figura mostra as etapas intermediárias de processamento de imagem que levam à quantificação de imagens de cocultura contendo macrófagos RAW264.7 e fibroblastos NIH/3T3. (A) Imagem das células NIH/3T3 e RAW264.7. A imagem original convertida em tiff de 8 bits e escala de cinza no ImageJ. (B) Pós-processamento da imagem em escala de cinza. A imagem pós-processamento de A a seguir abrindo e fechando por reconstrução, conforme descrito na etapa 3.1.1. (C) Pós-binarização da imagem processada com seleção clara de macrófagos com base no isolamento baseado em altura. O isolamento seletivo dos macrófagos RAW264.7, conforme descrito na etapa 3.2.2. (D) Imagem final com aglomerados de macrófagos e fibroblastos identificados. Toda a imagem contendo macrófagos RAW264.7 e fibroblastos NIH/3T3, conforme descrito na etapa 3.3. Uma célula de macrófago amostrada é delineada com um círculo verde, e uma célula de fibroblasto amostra é delineada com um oval vermelho. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Desempenho de segmentação de parâmetros dice, macrófagos RAW264.7. A imagem mostra uma sobreposição entre a abordagem de segmentação da "verdade terrestre" e este método. As regiões brancas são células detectadas tanto pela "verdade terrestre" quanto por esse método, enquanto as regiões roxa e verde são falsos negativos e falsos positivos, respectivamente. A segmentação da "verdade básica" foi obtida por técnicas comuns de segmentação e utiliza ferramentas de região de interesse para corrigir a segmentação errônea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Contador 1 Contador 2 Contador 3 Automático Média da contagem manual (±STDEV) Erro comparado com automático
Imagem 1 151 148 145 142 148 ± 3.0 4.22%
Imagem 2 164 166 168 173 166 ± 2.0 4.05%
Imagem 3 255 253 245 239 251 ± 5.3 5.02%
Imagem 4 153 152 157 166 154 ± 2,6 7.22%
Imagem 5 103 106 100 111 103 ± 3.0 7.20%

Tabela 1: Contagem manual/automática de células e teste de robustez.

Informações suplementares: Diferenças morfológicas na análise de imagem de coculturas de macrófago e fibroblasto. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: "process.m", o arquivo MATLAB necessário para executar os algoritmos. Nenhuma ação manual é necessária, mas contém o algoritmo em um arquivo separado. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: "monocultura.m", o arquivo MATLAB utilizado para analisar imagens de monocultura. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 3: "coculture_modified.m", o arquivo MATLAB utilizado para analisar imagens de cocultura. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Projetamos um procedimento geral baseado em área que contava com precisão e eficiência as células com base na altura celular, permitindo a quantitação livre de manchas de células mesmo em sistemas de cocultura. As etapas críticas para este procedimento incluíram a implementação de um sistema de intensidade relativa pelo qual as células poderiam ser diferenciadas. O uso de uma análise relativa da altura serviu a dois propósitos: a necessidade de parâmetros externos tornou-se desnecessária, uma vez que parâmetros relativos eram constantes para o tipo e parâmetro celular dado, e os níveis absolutos de brilho/contraste não precisavam ser inseridos para cada imagem. Além disso, o uso de um sistema baseado em percentil permitiu a análise de vários tipos de células dentro da mesma imagem, desde que os diferentes tipos de células residiam em alturas únicas dentro da imagem.

O sistema baseado em percentil foi definido como uma diferença do valor máximo do pixel em oposição à média. Isso foi feito para evitar a distorção do algoritmo com base no valor médio de intensidade, que dependia do número e confluência das células presentes na imagem. Além disso, o "pixel máximo relevante" foi implementado para evitar que os outliers de intensidade máxima afetassem significativamente os pixels relevantes máximos de dados precisariam representar pelo menos 0,5% da população - um valor experimental. Etapas adicionais incluíram o uso de um sistema de quantificação baseado em áreas em vez de contar entidades individuais. Isso garantiu que a fragmentação celular ou a binarização errônea fossem minimizadas na contagem das células, uma vez que a área total afetada era mínima em comparação com a área de uma célula.

Vários métodos de solução de problemas foram implementados dentro deste algoritmo. Os esforços iniciais para quantificar imagens de monoculturas celulares exigiram métodos para identificar com precisão as células bulbosas e não bulbosas. Observou-se um fenômeno único para as imagens bulbosas das células, na medida em que os centros das células foram identificados como pano de fundo após a transformação da bacia hidrográfica, e essas regiões apareceram como ilhas dentro da célula. Uma análise minuciosa revelou que a falta de centros celulares estava ocorrendo devido a uma estrutura excessivamente convexa dentro da imagem, o que resultou em uma inversão na transformação da bacia hidrográfica. Uma solução foi implementada especificamente para imagens bulbosas, que envolviam um processo iterativo conhecido como pluging, no qual as ilhas eram preenchidas como verdadeiros valores celulares. Isso funcionou por um procedimento no qual a cobertura celular e a extensão da formação da ilha foram utilizadas para determinar a precisão da imagem. Geralmente, a cobertura celular foi usada para determinar a extensão da formação da ilha, uma vez que uma cobertura celular extraordinariamente baixa foi mais tipicamente causada por um alto nível de formação de ilhas. A relação entre a cobertura celular e a extensão da formação da ilha foi determinada por meio de dados experimentais.

Foi necessária uma solução adicional de problemas com base na observação de que o uso de um limiar de 'pixel médio' (definido como a intensidade média média do pixel dentro da imagem) para diferenciar as células, em vez de um pixel máximo, levou a inconsistências. A intensidade média da imagem foi encontrada para aumentar em função do número de células na imagem, o que poderia distorcer resultados com base na densidade das células dentro da imagem. Uma iteração alternativa do algoritmo foi projetada empregando um benchmark de intensidade máxima; no entanto, esse valor também foi inconsistente, uma vez que os outliers de alta intensidade distorceram significativamente os dados e levaram a resultados não confiáveis. Em última análise, foi adotado o uso de um pixel máximo relevante. O pixel máximo relevante foi encontrado para explicar com precisão os outliers de alta intensidade, levando aos resultados mais consistentes ao diferenciar imagens de monocultura e cocultura.

Várias limitações do algoritmo foram identificadas ao analisar imagens de cocultura usando o sistema baseado em percentil para identificar seletivamente tipos distintos de células. Ocasionalmente, as células NIH/3T3 aparecem continuamente com células RAW 264.7 em um agregado multicamadas, o que tornou a imagem extremamente difícil de analisar. Embora isso tenha sido observado principalmente para imagens de cocultura, imagens de monocultura de células com condições de cultura anormal ou altos níveis de confluência também poderiam resultar em agregados de células multicamadas. Embora o algoritmo pudesse detectar com sucesso agregados multicamadas como únicos a partir do fundo, não foi possível obter quantificação celular precisa usando esta análise de imagem 2D em multicamadas celulares. Além disso, detritos celulares dentro da imagem podem dificultar a precisão do algoritmo. O uso de um algoritmo de análise baseado em área serviu para minimizar o erro associado à detecção errônea, pois pequenas áreas de detritos celulares influenciariam menos a contagem de células usando uma análise baseada em área do que a segmentação.

Além disso, a conversão de imagens czi para TIFF de 8 bits, realizada para garantir simplicidade e uniformidade, resultou em tipos de pixels de uint8, uma coleção de números inteiros de 0 a 255. Assim, as diferenças só poderiam ser quantificadas a uma precisão máxima de 1/256 ou 0,39%. Geralmente, a propagação de pixels só cobria entre 210 e 250 pixels, resultando em uma precisão realista de 2,5%. Embora isso tenha sido adequado para a análise da monocultura em que as células são extremamente distintas do fundo, a etapa de subtração seletiva dentro da análise da cocultura exigiu muito mais precisão. Embora os dados razoavelmente precisos ainda pudessem ser obtidos a partir de imagens de cocultura, a precisão geral da análise da cocultura foi reduzida em comparação com a precisão da análise a partir de imagens de monocultura. Além disso, o uso de um sistema de identificação baseado em área exigia uma área celular média para obter contagem celular. Este parâmetro é útil ao lidar com imagens ruivas ou com células de geometrias uniformes, mas dificultaria a quantificação para células variáveis de área.

A importância deste algoritmo em oposição aos métodos existentes está no uso de métodos desenvolvidos, como as operações de transformação de bacias hidrográficas e morfológicas para analisar células mono e coculturadas sem procedimentos de coloração de fluorescência. Embora vários estudos anteriores tenham relatado métodos para distinguir e contar com sucesso as células na ausência de coloração, essas abordagens alternativas muitas vezes exigiam abordagens complexas de cultura ou softwareinacessível 16. Por exemplo, Yilmaz e colegas usaram técnicas automatizadas de análise de contagem para quantificar células imunes através de bióquicos com contas imunomagnéticas em micropads15.

Também projetamos novas e impactantes abordagens para abordar padrões de ruído não aleatórios, como "ilhas", que apareceram nos centros das células. A identificação de diferentes linhas celulares também foi possível utilizando os variados valores de "altura" das células, que poderiam ser identificados a partir de pixels de intensidade. O uso de parâmetros relativos em vez de parâmetros absolutos proporcionou várias vantagens ao permitir a automação do algoritmo e proporcionar mais flexibilidade para a aquisição de imagens, já que o brilho exato, contraste ou configurações de cores não precisavam ser preservados. A identificação baseada na área forneceu resultados precisos mesmo quando as células foram agrupadas, como é comum em muitos tipos de células. Em contraste, a contagem manual e a segmentação são difíceis, propensas a erros e podem exigir que um usuário treinado identifique as células com precisão e eficiência.

Futuras aplicações e desenvolvimento do algoritmo se concentrarão em ajuste fino e otimização do procedimento de contagem de células. Além disso, o uso de parâmetros experimentais para distinguir diferentes tipos celulares por intensidade relativa pode ser verificado por meio de testes de coculturas adicionais; por exemplo, a identificação de neurônios/astrócitos para análise neurotoxicidade17. Outras aplicações podem ser feitas no campo de cicatrização de feridas, onde proporções representativas de células imunes podem desempenhar um papel proeminente nos processos inflamatórios e anti-inflamatórios. Melhorias na quantificação celular de macrófagos e fibroblastos poderiam fornecer informações adicionais sobre os efeitos de sinalização celular paracrígico versus juxtracrina relevantes para avaliar os resultados de resposta do corpo estranho18,19. Em Informações Suplementares, exploramos os possíveis mecanismos de incorporação de parâmetros morfométricos no algoritmo para auxiliar na precisão da identificação celular dentro dos sistemas de cocultura.

Extensões também podem ser feitas para coculturas mais complexas, que se concentrariam em 3 ou mais tipos de células diferentes dentro das imagens, em oposição apenas a misturas binárias. Devido à precisão limitada disponível para imagens de 8 bits, imagens de 16 bits podem ser necessárias, que fornecem informações adicionais, mas podem complicar significativamente a análise devido a faixas e distribuições mais dinâmicas. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo robusto para a contagem automatizada de células que seja otimizado para diversos ambientes de cultura celular. O algoritmo permite contagem de células precisas mesmo em aquisições de imagens de células bulbosas. Seu código iterativo auto-corretivo é útil para imagens de microscopia de campo brilhante sem manchas de sistemas de cultura celular imunologicamente relevantes.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 AR067247) e em parte pelo programa Delaware INBRE, apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais-NIGMS (P20 GM103446) dos Institutos Nacionais de Saúde e do Estado de Delaware. As opiniões dos usuários não refletem necessariamente a opinião da iCarros.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope Zeiss 1028290770
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
Cell Scrapers CellTreat 229310
Dublecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 12430047
Dublecco's PBS Fisher Scientific 14190144
MATLAB Software MathWorks 2021A
NIH/3T3 Cells ATCC ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin Sigma Aldrich P4333-20ML
RAW264.7 Cells ATCC ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S6014-25G
T75 Cell Culture Flask Corning CLS3814-24EA

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References

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Bioengenharia Edição 180
Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto
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Borjigin, T., Boddupalli, A., Sullivan, M. O. Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures. J. Vis. Exp. (180), e63058, doi:10.3791/63058 (2022).

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