Summary
Aquí se presenta un protocolo detallado para describir un modelo organoide in vitro de células epiteliales nasales humanas. El protocolo tiene opciones para mediciones que requieren equipos de laboratorio estándar, con posibilidades adicionales para equipos y software especializados.
Abstract
La terapia individualizada para pacientes con fibrosis quística (FQ) se puede lograr con un modelo de enfermedad in vitro para comprender la actividad basal del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y la restauración a partir de compuestos de moléculas pequeñas. Nuestro grupo se centró recientemente en establecer un modelo organoide bien diferenciado derivado directamente de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE). La histología de organoides seccionados, la tinción inmunofluorescente de montaje completo y las imágenes (utilizando microscopía confocal, microscopía inmunofluorescente y campo brillante) son esenciales para caracterizar organoides y confirmar la diferenciación epitelial en preparación para ensayos funcionales. Además, los organoides HNE producen lúmenes de diferentes tamaños que se correlacionan con la actividad de CFTR, distinguiendo entre organoides CF y no CF. En este manuscrito, se describe en detalle la metodología para el cultivo de organoides HNE, centrándose en la evaluación de la diferenciación utilizando las modalidades de imagen, incluida la medición del área de lúmenes basales (un método de medición de la actividad CFTR en organoides que cualquier laboratorio con un microscopio puede emplear), así como el enfoque automatizado desarrollado para un ensayo funcional (que requiere equipos más especializados).
Introduction
Introducción a la técnica
Los ensayos basados en cultivos ex vivo son una herramienta cada vez más utilizada para la medicina de precisión y el estudio de la fisiopatología de enfermedades. El cultivo primario de células epiteliales nasales humanas (HNE) se ha utilizado en numerosos estudios de fibrosis quística 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , una enfermedad autosómica recesiva que afecta la función de las células epiteliales en múltiples órganos. El cultivo de HNE proporciona una fuente renovable de epitelios de las vías respiratorias que se pueden obtener prospectivamente y recapitula las cualidades electrofisiológicas y bioquímicas para probar la actividad del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Las células HNE se pueden muestrear con efectos secundarios mínimos14, similar a los hisopos respiratorios virales comunes. Recientemente se ha publicado un trabajo de investigación que describe un modelo para el estudio de la fibrosis quística derivado de biopsias con cepillo HNE11,13. Si bien es similar a otros modelos que utilizan HNEprimaria 2,3 y tejido intestinal 15,16,17,18,19, la caracterización detallada de la diferenciación y la obtención de imágenes de este modelo se describen aquí para su uso en la investigación de la FQ y para ayudar en los estudios de otras enfermedades de las vías respiratorias 13 . El modelo organoide no es ilimitado como las líneas celulares inmortalizadas, sino que puede ampliarse mediante reprogramación condicional (utilizando fibroblastos alimentadores irradiados e inactivados e inhibidores de la Rho-quinasa) a un estado más similar al de las células madre 20,21,22,23. El procesamiento de biopsias con cepillo HNE utilizando este método produce un gran número de células epiteliales para su uso en múltiples aplicaciones con un mayor rendimiento, al tiempo que conserva la capacidad de diferenciarse completamente. Si bien este protocolo se desarrolló utilizando células alimentadoras, otros investigadores que deseen evitar la tecnología de células alimentadoraspueden utilizar otras metodologías 14,24.
Importancia de la técnica para la biología pulmonar
Se ha dedicado un estudio significativo a comprender cómo la ausencia de CFTR regular y funcional en la membrana celular de las células epiteliales resulta en una disfunción en los pulmones, el páncreas, el hígado, el intestino u otros tejidos. El transporte disfuncional de iones epiteliales, particularmente el de cloruro y bicarbonato, da como resultado una disminución del volumen de los fluidos del revestimiento epitelial y cambios en las secreciones mucosas, lo que lleva a la estasis mucosa y la obstrucción. En otras enfermedades de las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria, el movimiento ciliar alterado afecta el aclaramiento mucociliar y conduce a estasis mucosa y obstrucción25. Por lo tanto, el modelo organoide HNE actual se ha desarrollado para diversas aplicaciones, dependiendo del diseño experimental y los recursos del investigador. Esto incluye imágenes de células vivas utilizando tinciones de células vivas; fijación y seccionamiento para caracterizar la morfología; tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos e imágenes confocales de montaje completo para evitar la interrupción de las estructuras intraluminales; y imágenes de campo brillante y tomografía de coherencia microóptica para mediciones cuantitativas de la frecuencia de latido ciliar y el transporte mucociliar13. Para facilitar la expansión a otros investigadores, se utilizaron reactivos y suministros disponibles comercialmente para el cultivo. Se desarrolló un ensayo funcional que utilizó técnicas comunes de microscopio y equipos más especializados. En general, si bien el presente modelo fue diseñado para evaluar la actividad de CFTR al inicio o en respuesta a la terapéutica, las técnicas descritas en este protocolo se pueden aplicar a otras enfermedades que involucran la función de las células epiteliales, especialmente el transporte de líquido celular epitelial.
Comparación con otras metodologías
Recientemente se desarrolló la utilidad de este modelo organoide correlacionando in vitro las respuestas moduladoras CFTR de los organoides de los pacientes con su respuesta clínica11. En particular, también se demuestra que el modelo actual era paralelo a las respuestas de corriente de cortocircuito, el estándar de oro actual para evaluar la función CFTR, en los mismos pacientes. La corriente de cortocircuito difiere del ensayo de hinchazón porque el primero mide la función CFTR a través del transporte iónico26. En contraste, este ensayo mide un efecto más aguas abajo con el transporte de fluidos, proporcionando información adicional sobre la función general de CFTR 27,28,29,30,31,32. Las mediciones de corriente de cortocircuito han seguido siendo un método común y fiable para determinar la actividad del canal de cloruro CFTR 1,33. Estos ensayos electrofisiológicos requieren equipos especializados y costosos, requieren muchas veces más células para cada réplica experimental que el ensayo organoide, no se pueden automatizar fácilmente y no son susceptibles de escalar para aplicaciones de mayor rendimiento. Otro modelo organoide derivado de epitelios intestinales tiene ventajas adicionales 15,16,17,18, como una capacidad replicativa más excelente, pero no se deriva de un tejido de las vías respiratorias ni está disponible universalmente. Los cepillados HNE se obtienen con cepillos de citología de bajo costo sin necesidad de sedación y con un riesgo mínimo. Obtener el cepillado no requiere un médico y puede ser realizado por coordinadores de investigación capacitados y otro personal de investigación14. El modelo organoide HNE puede ser cultivado por cualquier laboratorio con capacidades de cultivo celular primario, y algunas de las aplicaciones se pueden realizar con técnicas de microscopía estándar. En conjunto, estas ventajas proporcionan acceso adicional a la tecnología para evaluar la función epitelial de las vías respiratorias que de otro modo podría no estar disponible para algunos laboratorios. Además, los organoides HNE se pueden utilizar para estudiar otros estados de enfermedad que afectan a las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria25 o la infección viral, que los organoides intestinales no pueden.
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Protocol
Las muestras de HNE se recolectaron en el hospital Children's of Alabama. Todos los procedimientos y métodos descritos aquí han sido aprobados por la Universidad IRB de Alabama en Birmingham (UAB IRB #151030001). Para facilitar la expansión y mejorar la función de las células epiteliales nasales humanas (HNE), los métodos de cultivo actuales se adaptan del conocido método de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI)28,34. Los HNE se recogieron inicialmente mediante biopsia con pincel como se describió anteriormente12,14, con la única diferencia de utilizar un cepillo de citología. Todas las etapas de procesamiento de muestras y cultivo celular se realizaron en el gabinete de bioseguridad.
1. Cultivo celular y expansión de células epiteliales nasales
- Después del cepillado, guarde la muestra de biopsia nasal en 8 ml de medios RPMI en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo y transfiérala al laboratorio dentro de las 4 h (no más de 24 h).
- Disociar la biopsia con cepillo nasal en 8 ml de medios RPMI en un tubo cónico de 15 ml pasando el cepillo de citología a través de una punta de pipeta de gran diámetro de 1 ml (cortar la punta) varias veces hasta que el cepillo esté libre de tejido.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y luego volver a suspender el pellet celular en 3 ml de solución de desprendimiento celular (ver Tabla de materiales) e incubar a temperatura ambiente durante 16 min para digerir.
- Utilice 5 ml de medios de expansión (Tabla 1) para lavar las celdas dos veces. Luego, agregue células a un matraz T75 pre-sembrado con fibroblastos 3T3 irradiados e inactivados22 (50% -60% de confluencia) para co-cultivar las células y expandirse en el medio de expansión durante 7-14 días (ver Figura 1 para la colonia apropiada). Antes de su uso, pruebe los fibroblastos 3T3 irradiados para asegurarse de que no puedan proliferar, lo que influirá negativamente en la expansión de las células epiteliales.
NOTA: Deseche las células si la confluencia de células epiteliales nasales no alcanza el 70% dentro de los 14 días. - Para las células derivadas de pacientes con FQ, introducir cuatro antibióticos (100 μg/mL de tobramicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B, 100 μg/mL de ceftazidima, 100 μg/mL de vancomicina, ver Tabla de Materiales) en el medio de expansión para la desinfección de las células durante los primeros 3 días de cultivo, y luego reemplazar los medios con medios de expansión libres de antibióticos que cambien los medios cada 2 días.
NOTA: Este uso limitado de antibióticos está destinado a reducir la pérdida de cultivo debido a la colonización bacteriana al tiempo que fomenta la proliferación después de que se eliminan los antibióticos adicionales. Estos antibióticos se pueden adaptar a los resultados microbiológicos específicos del paciente, con sensibilidades, si es necesario. - Cosechar HNE de cocultivo utilizando el método de tripsinización doble22 una vez que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia. Este método garantiza que los fibroblastos 3T3 irradiados e inactivados se eliminen del matraz y no contaminen la siembra organoide posterior.
- Lave las células con 1x DPBS, y luego agregue 1.5 ml de tripsina-EDTA al 0.05% en el matraz T75 durante 4 min a 37 ° C para eliminar el fibroblasto 3T3 irradiado e inactivado del cultivo.
- Enjuague el matraz T75 con 1x DPBS dos veces para lavar bien los fibroblastos 3T3 restantes; añadir 1,5 ml de tripsina-EDTA al 0,05% en el matraz T75 durante 10 min a 37 °C para separar las HNE.
- Neutralizar la tripsina con el inhibidor de tripsina de soja (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:1. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min, y luego retirar el sobrenadante. Después de lavar las células con 5 ml de medios de expansión una vez, las células están listas para la siembra para cultivar organoides.
NOTA: Se recomienda que los HNE con un número de paso de tres se utilicen para experimentos adicionales.
2. Crecimiento y diferenciación de organoides en diapositivas e insertos de cultivo
- Descongelar la matriz extracelular (ECM) de cultivo de organoides durante la noche a 4 °C. Puntas de pipeta frías a 4 °C y diapositivas de angiogénesis de 15 pocillos (ver Tabla de materiales) durante la noche a 4 °C.
NOTA: La ECM debe colocarse a 4 ° C la noche antes de que se deba realizar la recolección de células. - Cubra los portaobjetos con 5 μL de ECM 100% frío sobre hielo (pipeta 5 μL de ECM 100% frío con una punta de pipeta fría en cada pozo del portaobjetos de 15 pocillos), y luego colóquelos en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C durante al menos 30 min para la consolidación.
- Contar los HNE cosechados del cocultivo utilizando un hemocitómetro y diluir las células a 500 células/μL en número total con un 20% de ECM diluido por medios de diferenciación (Tabla 2) en hielo. Luego, sembra 5 μL de la mezcla de células frías/ECM en cada pocillo de los portaobjetos recubiertos con ECM.
- Transfiera inmediatamente los portaobjetos a una incubadora de cultivo a 37 °C durante 1 h para consolidar la mezcla célula/ECM.
- Alimente las células en cada pocillo de los portaobjetos de angiogénesis de 15 pocillos con 50 μL de medios de diferenciación. Cambie los medios cada dos días hasta que los organoides estén listos para más experimentos.
NOTA: Los organoides generalmente se pueden visualizar después de 1-2 días. Hay 20-90 organoides comúnmente formados en cada pozo de las diapositivas. Los organoides generalmente pueden sobrevivir durante 40-60 días en ECM con alimentación cada dos días cuando se mantienen en una incubadora humidificada a 37 ° C. - Cultive los organoides en los insertos de cultivo (ver Tabla de Materiales) para una mayor cantidad para aplicaciones específicas (como seccionamiento para histología o inmunofluorescencia) según los pasos mencionados a continuación.
- Para cultivar organoides en los insertos de cultivo, prepare el cultivo de organoides ECM, las puntas de la pipeta y los insertos como se menciona en los pasos 2.1-2.2. Cubra los insertos con 100 μL de ECM 100% frío.
- Sembra 60 μL de mezcla de célula/ECM (500 células/μL con 20% de ECM en medios de diferenciación) sobre el recubrimiento de ECM en el inserto.
NOTA: Todos los demás pasos para hacer organoides en los insertos son los mismos que los realizados en las diapositivas, pasos 2.4-2.5. - Agregue 600 μL del medio de diferenciación en la parte inferior del inserto. Cambie los medios cada día alterno hasta que los organoides se utilicen para experimentos, generalmente de 2 a 3 semanas.
3. Preparación y aislamiento de organoides para inmunofluorescencia de montaje completo
- Aislamiento y fijación de organoides
- Pretratar portaobjetos de cámara de fondo de vidrio de 8 pocillos con adhesivo celular (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos siguiendo la Referencia35. Después de desechar la solución, seque al aire los pocillos durante 30 minutos.
- Para cosechar los organoides, retire los medios de la parte superior de la ECM y luego agregue 50 μL de PBS frío 1x en cada pozo de los portaobjetos de 15 pocillos en hielo (1: 1 con volumen de ECM).
- Pipete hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces usando 200 μL de la punta de la pipeta de gran diámetro, y luego dispense la solución en el centro de un pozo de los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos.
- Retire inmediatamente el exceso de líquido de los pozos con una pipeta de punta fina. Luego, coloque el deslizamiento de la cámara en una incubadora de 37 ° C durante 40 minutos para mejorar el organoide que se adhiere al fondo de vidrio.
- Después de lavar suavemente con 1x PBS dos veces, fije los organoides con 300 μL de paraformaldehído al 4% en cada pozo durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavar dos veces con 1x PBS y almacenar los organoides en 1x PBS a 4 °C para inmunotinción durante un máximo de 2 semanas.
- Tinción por inmunofluorescencia
- Para reducir la autofluorescencia, agregue 250 μL de 50 mM NH4Cl en 1x PBS en cada pozo de las diapositivas en RT durante 30 min mientras agita suavemente en un agitador a 20 rpm.
- Después de lavar con 1x PBS dos veces, permeabilice las células con 0.1% Triton X-100 durante 30 min a RT mientras agita suavemente a 20 rpm.
- Después de lavar con 1x PBS dos veces, agregue 300 μL de solución de bloqueo, incluyendo 5% de BSA y 0.1% de Triton X-100 en 1x PBS, en cada pozo durante 1 h en RT.
- Después del lavado, agregue anticuerpos primarios en los pocillos apropiados seguidos de anticuerpos secundarios (ver Tabla de Materiales). Preparar soluciones de anticuerpos primarios y secundarios en 2% de BSA y 0.3% de Triton X-100 en 1x PBS. Incubar todos los anticuerpos primarios a 4 °C durante 2 días y todos los anticuerpos secundarios a 4 °C durante 1 día.
NOTA: Las concentraciones finales dependen de la proteína deseada para el experimento. Compruebe la concentración de existencias en la ficha técnica del fabricante. A continuación, calcule las concentraciones finales en función de las diluciones utilizadas en la Tabla de Materiales. - Después de la incubación, lave bien los pocillos con 1x PBS y agregue DAPI en BSA al 2% y Triton X-100 al 0.3% en cada pozo para la tinción nuclear.
- Tome imágenes de los organoides utilizando un microscopio de barrido láser confocal, con un objetivo de inmersión en aceite de 20-60x (ver Tabla de materiales). Utilice el modo Z-stack para establecer los límites superior e inferior de la imagen y utilice el tamaño óptimo de paso Z recomendado determinado por el software confocal.
NOTA: Se utilizaron las siguientes cuatro longitudes de onda de excitación láser confocal: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm y 637,9 nm.
4. Preparación y aislamiento de organoides para seccionamiento histológico
- Para cosechar los organoides para estudios histológicos, retire los medios del cultivo y agregue 50 μL de PBS frío 1x en cada pozo de los portaobjetos en hielo.
- Pipetee hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando una punta de pipeta de gran diámetro de 200 μL, combine todas las soluciones de los insertos de deslizamiento o cultivo de 15 pocillos en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo. Ajuste el volumen total de solución en el tubo a 10 ml agregando 1x PBS frío adicional.
- Centrifugar el tubo a 4 °C, 300 x g durante 5 min; aspire el sobrenadante y agregue 60 μL de histogel caliente (ver Tabla de Materiales) para mezclar con el pellet organoide usando un 200 μL de la punta de la pipeta de gran diámetro.
- Transfiera inmediatamente la suspensión a un molde histológico. Después de la consolidación del histogel a temperatura ambiente, coloque el bloque de molde en paraformaldehído al 4% para su fijación durante la noche a 4 ° C.
- Después de incrustar en parafina, corte el bloque de histogel en secciones transversales de 5 μm (por ejemplo, con un microtomo), fije las secciones en portaobjetos de vidrio y manche con hematoxilina y eosina (H & E) o anticuerpos marcados con inmunofluorescencia. Tome imágenes con un microscopio de campo brillante o un microscopio de epifluorescencia invertida (consulte la Tabla de materiales).
5. Imágenes de organoides vivos
NOTA: Los siguientes pasos se llevan a cabo utilizando un sistema de imágenes automatizado (consulte la Tabla de materiales). Los diferentes sistemas de imagen deben adaptar estos pasos siguiendo las instrucciones específicas de su fabricante. Independientemente del equipo utilizado, los organoides vivos de imágenes requieren una cámara ambiental humidificada y con temperatura controlada con un controlador de gas CO2 acompañado.
- Para monitorear la diferenciación de organoides antes de realizar un ensayo de hinchazón funcional36, capture las imágenes completas de la diapositiva manualmente con cualquier microscopio de campo brillante o con un sistema de imágenes automatizado, como se detalla a continuación.
- Encienda la alimentación del sistema de imágenes automatizado y del controlador de gas CO2/O2 y permita que el sistema complete la calibración automatizada (~30 min).
- Después de completar, ajuste la temperatura del sistema de imágenes a 37 ° C; agregue 15 ml de agua estéril al depósito de humidificación, abra las válvulas de CO2 , cierre las tapas y deje que el sistema de imágenes se predicueste durante un mínimo de 30 minutos antes de la toma de imágenes.
- Abra el software de imágenes automatizadas para configurar un protocolo para la creación de imágenes y elija la ubicación para guardar los datos experimentales sin procesar.
NOTA: Se ha proporcionado un archivo de protocolo de ejemplo (Archivo complementario 1), específico para el sistema de imágenes, como plantilla para la obtención automatizada de imágenes de organoides para monitorear la diferenciación de organoides. - Una vez que se cumplan los ajustes ambientales, transfiera inmediatamente hasta dos diapositivas de 15 pocillos con tapas a la cámara ambiental en el inserto del soporte de diapositivas del sistema de imagen automatizado (consulte la Tabla de materiales).
- Seleccione los pozos a los que se va a tomar una imagen y comience a tomar imágenes para completar la obtención de imágenes de los pozos deseados.
NOTA: Los ajustes básicos recomendados son: objetivo de aire 4x y 10x, canal de campo brillante, montaje de 2 x 2 para objetivo de 4x para cubrir toda el área del pozo, montaje de 4 x 4 para un objetivo de 10x. Configuración de la pila Z: de tres a seis segmentos de pila Z, tamaño del paso Z = 50-100 μm, uno o dos segmentos por debajo del punto de enfoque automático y de tres a cinco segmentos por encima.
- Para obtener imágenes de organoides vivos para su uso en un ensayo de hinchazón inducida por forskolina (FIS), use un microscopio con una etapa automatizada equipada con una cámara de imágenes controlada ambientalmente que permite el control de la temperatura y el CO2 .
- Comience con los pasos 5.1.1-5.1.4, sustituya el archivo de protocolo en el paso 5.1.3 por el proporcionado en el archivo de protocolo de ejemplo (Archivo complementario 2) que contiene la configuración específica para realizar un ensayo FIS.
- Antes de cada experimento, ajuste la configuración de exposición evaluando al menos tres pocillos para cada diapositiva (extremo izquierdo, medio y extremo derecho). Aplique las compensaciones de coordenadas X e Y para asegurarse de que el objetivo estará en el centro del pozo para todos los pozos.
NOTA: Los ajustes básicos recomendados son: objetivo de aire 4x, Canal 1 = Campo brillante, Canal 2 = DAPI, montaje 2 x 2 (cuatro mosaicos de imagen). Configuración de la pila Z: de tres a cuatro segmentos de pila Z, tamaño del paso Z = 50-100 μm, un segmento por debajo del punto de enfoque automático y dos o tres segmentos por encima. Tiempo de adquisición de la imagen: 8 h con intervalos de 20 min (Lecturas totales = 25; La lectura 1 es T = 0). - Una vez que todos los ajustes estén seleccionados adecuadamente, elija los pozos a los que desea crear imágenes para ambas diapositivas, o seleccione todos, y comience la ejecución según las instrucciones del equipo.
- Después de ejecutarlo, guarde el experimento, cierre el software de imágenes y apague el sistema de imágenes37.
6. Mediciones de lúmenes de referencia
NOTA: Esto se hace utilizando un software de análisis de imágenes manual (consulte la Tabla de materiales). Se puede seguir una metodología similar utilizando un software de código abierto38 o cualquier software que pueda medir el área de una región en una imagen.
- En el software, abra el Panel de medición automatizada haciendo clic con el botón secundario en la parte inferior de la pantalla, seleccione Medición y, a continuación, Resultados de medición automatizada. El área de cada región de interés (ROI) medida aparecerá allí.
- Abra la imagen organoide en el software y seleccione 5-10 organoides con lúmenes visibles.
NOTA: Los lúmenes serán un área circular en el centro del organoide que es visiblemente diferente en color que el resto del organoide (Figura 2A). - Usando la función de medición de ROI de polígono, mantenga presionado el botón derecho en la imagen para abrir el menú y seleccione ROI poligonal para delinear el organoide completo para obtener el área de superficie total (TSA) del organoide. Luego, usando la misma característica, delinee el área de lúmenes (LA) (Figura 2B).
- Repita para los organoides restantes en el pozo y todos los pozos en el ensayo.
- Exporte los datos a Excel. Divida el LA por la TSA y promedie todos los organoides de la muestra para obtener la Relación de Lúmenes Basales (BLR)11,13.
NOTA: Por lo general, ~ 87% de los organoides sin FQ tendrán un BLR superior a 0.6, y el 97% será superior a 0.5, mientras que solo el 14% de los organoides con FQ tendrán un BLR superior a 0.6, y el 31% será superior a 0.5.
7. Pretratamiento e imágenes automatizadas de organoides HNE
NOTA: Todos los pasos previos al tratamiento se llevan a cabo en un gabinete de bioseguridad limpio. Preconfigure el sistema de imágenes automatizado y el software para registrar el ensayo antes del paso 7.1. La incubación con DAPI es opcional, pero se recomienda como a prueba de fallos si la calidad de las imágenes de campo brillante se ve comprometida. En este caso, el canal DAPI (377 nm) se puede analizar en su lugar.
- Preincubar los organoides en un pozo de portaobjetos de 15 pocillos con 50 μL de medios de diferenciación que contengan DAPI con o sin 100 μM de CFTRinh-172 (ver Tabla de Materiales) en una incubadora de 37 °C durante 1 h. Mientras los organoides se incuban, realice el paso 5.2.1 utilizando un protocolo personalizado de ensayo de hinchazón siguiendo el Archivo Suplementario 2.
- Retire el medio de preincubación con una pipeta Pasteur de vidrio con aspiración. Añadir 10 μM de forskolina y 100 μM de IBMX (cócteles de estimulación) (ver Tabla de Materiales) para un volumen total de medios de diferenciación de 50 μL en cada pozo.
NOTA: Asegúrese de que no se introduzcan burbujas en los pozos. Las burbujas en las imágenes afectarán el análisis automatizado. - Sin demora, comience el protocolo de imágenes FIS siguiendo los pasos 5.2.2 a 5.2.4. Adquiere imágenes cada 20 min en cada pozo, con un tiempo de ejecución total de 8 h.
8. Análisis automatizado del ensayo de hinchazón inducida por forskolina en organoides HNE
- Abra el software de análisis automatizado de imágenes, busque el experimento previamente guardado en el paso 7.3 y abra las imágenes del experimento.
- Elija la ventana del recipiente que se va a evaluar y seleccione la opción que contiene las imágenes procesadas que han sido cosidas y proyectadas en z. Este paso debe proporcionar una imagen de todo el pozo con todos los organoides dentro del marco de imágenes para enmascarar la evaluación y las mediciones.
- Elija la imagen de pozo para evaluar. Seleccione Analizar. Repita este proceso para otras imágenes a fin de garantizar un enmascaramiento adecuado para todas las imágenes incluidas en las mediciones automatizadas. Guarde los parámetros de configuración.
- Después de completar la configuración de análisis, aplique los cambios. El software cambiará las mediciones en función de la configuración.
NOTA: Una vez completado el preprocesamiento inicial de la imagen, se deben realizar medidas de control de calidad (QC) para garantizar un enmascaramiento consistente. Estos incluyen la revisión manual de todos los pozos para garantizar que los organoides estén dentro del marco de la imagen, que las burbujas o los escombros no estén enmascarados de manera inapropiada, y verificar el enmascaramiento en el campo brillante y los canales DAPI. - Exporte los datos para el análisis resumido (incluidos los gráficos y el análisis estadístico).
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Representative Results
La expansión de los HNE es esencial para un cultivo de organoides próspero. Las HNE de una recolección de muestra exitosa deben expandirse a más del 70% de confluencia alrededor de 10 días. Un ejemplo de muestras exitosas y no exitosas se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B, respectivamente. Las células deben descartarse si no pueden alcanzar el 70% de confluencia a los 14 días después del cocultivo con células 3T3 irradiadas. Cualquier célula contaminada debe desecharse inmediatamente si no puede rescatarse rápidamente con agentes antimicrobianos adicionales.
El crecimiento de los organoides se comparó en diapositivas de 15 pocillos e insertos de cultivo. Las inserciones de cultivo son más gruesas y están más lejos del objetivo que las diapositivas optimizadas ópticamente, lo que afecta la imagen y la resolución. A pesar de esto, no se observaron diferencias significativas en la morfología en estos dos métodos de cultivo, como se muestra en la Figura 2. Se pueden observar diferencias morfológicas entre los organoides sin FQ y CF, como se muestra en la Figura 3A. Los organoides sin FQ tienden a tener una luz más grande que contiene más líquido en su interior. En contraste, los organoides de la FQ generalmente tienen una luz más pequeña con menos líquido y, a veces, están llenos de moco y escombros. El tamaño del lumen se midió manualmente (Figura 3B), y la relación de lúmenes basales se calculó y se mostró en la Figura 3C. Los organoides de sección transversal se caracterizaron mediante tinción de H&E e inmunofluorescencia. Las imágenes representativas se muestran en la Figura 4A,B. Los marcadores epiteliales de las vías respiratorias como los cilios, el moco y la unión estrecha se demuestran en organoides mediante tinción inmunofluorescente de montaje completo que se muestra en la Figura 5A-D. Dependiendo de la aplicación, se puede emplear inmunofluorescencia seccionada o de montaje completo. El método de montaje completo mantiene la naturaleza tridimensional del organoide, manteniendo intacto el interior del organoide, como se muestra en el trabajo publicado anteriormente13.
La función cfTR se evaluó mediante un ensayo de hinchazón inducida por forskolina (FIS) utilizando un sistema de imágenes automatizado. Solo se utilizan diapositivas de 15 pocillos para ensayos funcionales debido a la mejor resolución de la imagen. En la Figura 6A se muestra un experimento representativo de dosis-respuesta de forskolina de voluntarios sin FQ (n = 5 sujetos) para ilustrar la justificación del tiempo de imagen y el análisis optimizados. Los datos que comparan las respuestas organoides sin FQ y CF se detallan en publicaciones anteriores11,13. Una dosis-respuesta muestra el cambio incremental en la actividad de CFTR para demostrar el mejor enfoque para las mediciones. Se evaluó la duración del ensayo de 1 h y 8 h (Figura 6B, C), así como el análisis utilizando el cambio fraccional promedio (AFC) versus el área bajo la curva (AUC) se ve en las Figuras 6C, D. Según nuestra experiencia previa, la hinchazón para la mayoría de los sujetos y las condiciones se estancan después de 8 h, y en algunos casos, resulta en el estallido de los organoides durante ese tiempo. Por lo tanto, los ensayos se limitaron a 8 h solamente. A esta longitud de ensayo extendida, la hinchazón se vuelve no lineal. El uso de las AUC también considera tanto los cambios en el tamaño como la tasa de cambio. Por lo tanto, el AUC de más de 8 h se utilizó para todos los ensayos FIS en la metodología final.
Figura 1: Imágenes de campo brillante de HNEs en co-cultivo. Los HNE se expanden en medios de expansión con fibroblastos 3T3 irradiados e inactivados durante 10 días. Se utiliza un microscopio de campo brillante invertido para obtener imágenes de las células. (A) Las HNE crecen bien en un grupo grande (flecha negra). En contraste, en (B), los HNE crecen mal en dos pequeños grupos (flechas negras) que rodean las células 3T3 irradiadas. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Formación de organoides HNE en un portaobjetos de 15 pocillos e inserto de cultivo. Las imágenes de campo brillante de organoides se capturaron utilizando un microscopio de campo brillante invertido durante 21 días. Los organoides en la diapositiva de 15 pocillos (A) tienen imágenes más precisas y nítidas que las del inserto de cultivo (B). No se observaron diferencias morfológicas entre los organoides cultivados en el portaobjetos y el inserto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tamaño de lúmenes organoides (panel A) y medidas de lúmenes (Panel B y C). (A) Los organoides sin FQ suelen tener una luz más grande y más líquido que los organoides CF (F508del/F508del). (B) Un método para medir manualmente el área de superficie total (TSA) indicada por el contorno rojo y el área de lúmenes (LA) indicados por el contorno verde en un solo organoide. (C) Un ejemplo para usar el área de superficie total y el área de lúmenes para calcular la relación de lúmenes de referencia (LA: TSA) en organoides de un sujeto sin FQ frente a un sujeto con FQ. Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Sección transversal de los organoides incrustados en la parafina. (A) Un ejemplo de tinción de H&E en organoides de un sujeto sin FQ y CF (F508del/F508del). (B) Tinción inmunofluorescente de cilios en un organoide. El verde es el cilio (flecha blanca) teñido con acetilado-tubulina y el anticuerpo secundario marcado con FITC, y el azul es el núcleo marcado con DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes confocales de inmunofluorescencia de montaje completo en organoides. (A,C) Imágenes de máxima proyección de los dos organoides representativos. (B,D) Imágenes de reconstrucción tridimensional de (A) y (C), respectivamente. Se instaló una diapositiva de fondo de vidrio de 8 pocillos en la plataforma de un microscopio confocal, y se utilizó la lente 40x para crear las fotomicrografías. Se aplicó un software de análisis de imágenes para la obtención de imágenes y la reconstrucción de las imágenes. Las flechas blancas indican moco (en B) y cilios (en C) dentro de la luz de los organoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Justificación de la longitud del ensayo de hinchazón y los métodos de análisis. Ensayo de hinchazón inducida por forskolina (FSK) (FIS) para probar la función de CFTR en las células epiteliales nasales primarias. La diferente dosis de forskolina indicada en las figuras se administró en organoides de 21 días de edad en los medios de diferenciación; La hinchazón organoide se registró inmediatamente con el generador de imágenes automatizado durante 8 h. Después de 8 h, la hinchazón se muestra en (A) (n = 5, sujetos sin FQ) utilizando el cambio fraccional promedio (AFC). La dosis-respuesta de FSK se compara con AFC a 1 h (B) vs. a 8 h (C), lo que sugiere que el ensayo de 8 h puede producir una diferencia de hinchazón más significativa entre las diferentes dosis de FSK que las de 1 h. AFC (C) vs. el área bajo la curva, AUC (D) a 8 h se comparan, lo que indica que AUC puede reflejar una diferencia de hinchazón menor que AFC. El eje X en paneles (B-D) representa las diferentes condiciones de tratamiento correspondientes con los símbolos en la leyenda de la figura. Todas las barras de error en las figuras indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Todos los componentes para la fabricación de los medios de expansión. Se ha descrito la información detallada sobre la concentración de existencias de reactivos, el almacenamiento de existencias, la cantidad de existencias para la fabricación de un medio de 500 ml y la concentración final. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Todos los componentes para hacer medios de diferenciación. Se ha descrito la información detallada sobre la concentración de existencias de reactivos, el almacenamiento de existencias, la cantidad de existencias para la fabricación de un medio de 500 ml y la concentración final. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Archivo complementario 1: Se proporciona un archivo de protocolo de ejemplo específico para el sistema de imágenes como plantilla para la obtención automatizada de imágenes de organoides para monitorear la diferenciación de organoides. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: un archivo de protocolo de ejemplo que contiene configuraciones específicas para realizar un ensayo FIS. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este manuscrito proporciona metodologías detalladas para imágenes completas en vivo y fijas de los organoides epiteliales de las vías respiratorias derivados de la biopsia con cepillo HNE. Describe ensayos funcionales que pueden determinar la actividad de CFTR en un individuo. Los HNE proporcionan un tejido primario mínimamente invasivo para una variedad de aplicaciones. Las técnicas de expansión ofrecidas aquí se pueden utilizar para modelar la enfermedad de las vías respiratorias, incluidos los organoides. Los organoides se pueden utilizar para enfoques terapéuticos de precisión y para monitorear la estabilidad de las terapias basadas en genes o ARNm a lo largo del tiempo, para el diseño de ensayos de precisión y para ayudar a resolver diagnósticos no concluyentes39. La investigación actual es sobre la FQ, pero estos modelos tienen aplicaciones para otras enfermedades que afectan la función epitelial.
La expansión inicial de HNE después de la biopsia es esencial. Se ha observado que los cepillos de citología producen un mayor número de células iniciales y mejores resultados que otras herramientas de biopsia14. A partir de experiencias anteriores, hemos concluido que la combinación de cepillados de ambas narinas en una sola muestra y el procesamiento de esa muestra dentro de las 4 h produce los mejores resultados. Otros investigadores han utilizado marcos de tiempo más prolongados desde la biopsia hasta el procesamiento con éxito3. La recolección inicial adecuada de biopsias es vital para la posterior expansión y siembra como organoides. Se requieren fibroblastos irradiados e inactivados de alta calidad para el cocultivo, que se cultivan y tratan internamente en nuestro laboratorio, pero también se pueden comprar comercialmente. Se aconseja a los investigadores que no todos los fibroblastos 3T3 son la misma línea celular y deben validarse antes de su uso.
Para los especímenes que no se espera que tengan cultivo bacteriano o fúngico patógeno, el tratamiento con antibióticos se limita al tratamiento estándar con penicilina y estreptomicina para los experimentos descritos en este manuscrito. Para aquellos que se sabe que tienen colonización crónica de las vías respiratorias superiores, se utiliza un cóctel de antibióticos descrito anteriormente durante solo 3 días porque los antibióticos parecen ralentizar la expansión epitelial y producir resultados más pobres en los experimentos descritos aquí. Se seleccionaron tres días para equilibrar el riesgo de contaminación con la provisión de una tasa de expansión similar para las muestras de FQ y no CF. Para las personas con patógenos inusuales, el tratamiento antimicrobiano personalizado puede rescatar cultivos contaminados si se reconoce temprano o se inicia a priori. Para las biopsias iniciales que son inusualmente lentas de crecimiento, los resultados generalmente serán pobres para los estudios de organoides. Los investigadores necesitan monitorear tanto la tasa de crecimiento como la morfología diariamente. Los medios de cultivo internos y los reactivos utilizados son más útiles para los ensayos de hinchazón funcional, pero otros medios disponibles comercialmente pueden beneficiar a otras aplicaciones 12,25,40,41 dependiendo del diseño experimental. El tipo de ECM utilizado puede conducir a una morfología diferente y resultados diferentes, y los resultados reproducibles son críticos. Todos los reactivos utilizados en este protocolo se prueban rutinariamente antes de su uso para experimentos. A pesar de esta experiencia, algunas culturas no lograrán expandirse o generar organoides por razones inexplicables. Se alienta a los investigadores a considerar estos factores a medida que optimizan este protocolo para sus aplicaciones.
En este protocolo se utiliza un tipo específico de diapositiva de 15 pocillos optimizada para imágenes ópticas, utilizando volúmenes mínimos y maximizando las réplicas al tiempo que reduce los costos. Estas diapositivas tienen una cámara inferior y superior fijada en una cubierta de polímero que minimiza los meniscos (que de otro modo perjudicarían las imágenes) y también el reemplazo de medios sin riesgo de desalojar la matriz y destruir los cultivos organoides. Estas diapositivas hacen que las imágenes de campo brillante y la microscopía de tinción en vivo sean sencillas, con siembra inicial, crecimiento e imágenes en el mismo plato. Los organoides se perderán durante el proceso de recolección, fijación y tinción, por lo que se debe tener un cuidado meticuloso durante cada paso, y se deben obtener números iniciales suficientes para garantizar el éxito. El cultivo de organoides en insertos de cultivo puede ayudar a medida que se desarrollan estas técnicas.
Se incluyen técnicas de imagen que utilizan microscopios de laboratorio comunes. Sin embargo, los ensayos funcionales automatizados utilizan un sistema de imágenes que es complejo y requiere un usuario bien entrenado. Este protocolo ha sido desarrollado para usuarios con un nivel básico de experiencia utilizando este microscopio y su software. Se recomienda capacitar primero a las personas sobre el uso principal del instrumento y el software por parte de representantes del fabricante; esta misma práctica se sigue en nuestro laboratorio. Se necesitó un mínimo de 4 semanas de entrenamiento para usar este microscopio de manera efectiva para experimentos.
Como se describió anteriormente, esta metodología tiene algunas limitaciones. Se necesita experiencia en la recolección de biopsias, un tiempo de procesamiento rápido y una instalación con fibroblastos alimentadores para expandir y cultivar con éxito los organoides HNE. Este método se desarrolló utilizando reactivos y equipos específicos que pueden no estar disponibles universalmente. La metodología ha demostrado ser útil para la investigación en fibrosis quística 3,11,13 y puede no ser tan aplicable a otros procesos de la enfermedad25. Sin embargo, se pueden utilizar otros métodos y equipos para desarrollar estrategias similares.
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Disclosures
JSG figura como inventor en una solicitud de patente 20170242033 de la Universidad de Carolina del Norte que describe un modelo similar. Cuando la tecnología licenciada de la UNC produce regalías, los inventores reciben una parte de los ingresos. De lo contrario, los autores declaran que no hay conflictos de intereses. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, en la recopilación, análisis o interpretación de datos, en la redacción del manuscrito o en la decisión de publicar los resultados.
Acknowledgments
Agradecemos las contribuciones de todos los participantes que donaron biopsias con cepillo HNE para desarrollar este protocolo. Agradecemos a Latona Kersh y al personal de la Unidad de Investigación Infantil por coordinar el reclutamiento de voluntarios del estudio y la recolección de muestras. Agradecemos a Lily Deng, Johnathan Bailey y Stephen Mackay, ex aprendices en nuestro laboratorio, por su asistencia técnica. Agradecemos a Zhong Liu y Rui Zhao por su ayuda técnica. Steven M. Rowe, director del Centro de Investigación de CF de la UAB, aporta liderazgo y recursos, sin los cuales este trabajo no sería posible. También nos gustaría agradecer a Sarah Guadiana de Biotek por su ayuda con la formación de instrumentos, a Robert Grabski por la asistencia en microscopía confocal en el Centro de Imágenes de Alta Resolución de la UAB y a Dezhi Wang por la asistencia histológica en el Núcleo de Histología de la UAB. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Subvención K23HL143167 (a JSG), Subvención de la Fundación de Fibrosis Quística (CFF) GUIMBE18A0-Q (a JSG), el Centro de Fibrosis Quística Gregory Fleming James [NIH Grants R35HL135816 y DK072482 y el Programa de Investigación y Desarrollo de la Universidad CFF de Alabama en Birmingham (UAB) (Rowe19RO)], y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la UAB (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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