Summary
En detaljert protokoll presenteres her for å beskrive en in vitro organoid modell fra menneskelige nese epitelceller. Protokollen har muligheter for målinger som krever standard laboratorieutstyr, med tilleggsmuligheter for spesialutstyr og programvare.
Abstract
Individualisert behandling for cystisk fibrose (CF) pasienter kan oppnås med en in vitro sykdomsmodell for å forstå baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet og restaurering fra små molekylforbindelser. Vår gruppe fokuserte nylig på å etablere en godt differensiert organoidmodell direkte avledet fra primære humane neseepitelceller (HNE). Histologi av seksjonerte organoider, helmontert immunfluorescerende farging og avbildning (ved hjelp av konfomisk mikroskopi, immunfluorescerende mikroskopi og lyst felt) er avgjørende for å karakterisere organoider og bekrefte epiteldifferensiering som forberedelse til funksjonelle analyser. Videre produserer HNE organoider lumen av varierende størrelse som korrelerer med CFTR-aktivitet, som skiller mellom CF og ikke-CF organoider. I dette manuskriptet er metodikken for å dyrke HNE-organoider beskrevet i detalj, med fokus på vurdering av differensiering ved hjelp av avbildningsmodaliteter, inkludert måling av baseline lumenområde (en metode for CFTR-aktivitetsmåling i organoider som ethvert laboratorium med et mikroskop kan bruke) samt den utviklede automatiserte tilnærmingen til en funksjonell analyse (som krever mer spesialisert utstyr).
Introduction
Introduksjon til teknikken
Ex vivo kulturbaserte analyser er et stadig mer brukt verktøy for presisjonsmedisin og studiet av sykdom patofysiologi. Primær human nasal epitel (HNE) cellekultur har blitt brukt i en rekke studier av cystisk fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sykdom som påvirker epitelcellefunksjonen i flere organer. HNE-kulturen gir en fornybar kilde til luftveisepilesi som kan oppnås prospektivt og rekapitulerer elektrofysiologiske og biokjemiske egenskaper for å teste Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan prøves med minimale bivirkninger14, som ligner vanlige virale respiratoriske vattpinner. Forskningsarbeid som beskriver en modell for cystisk fibrosestudie avledet fra HNE børstebiopsier har nylig blitt publisert11,13. Mens ligner på andre modeller som bruker primær HNE 2,3 og tarmvev 15,16,17,18,19, er detaljert karakterisering av differensiering og avbildning av denne modellen beskrevet her for bruk i CF-forskning og for å hjelpe til med studier av andre luftveissykdommer13 . Den organoide modellen er ikke ubegrenset som udødelige cellelinjer, men kan utvides ved betinget omprogrammering (ved hjelp av bestrålede og inaktiverte materfibroblaster og Rho-kinase-hemmere) til en mer stamcellelignende tilstand 20,21,22,23. Behandlingen av HNE børstebiopsier ved hjelp av denne metoden gir et stort antall epitelceller for bruk i flere applikasjoner med høyere gjennomstrømning, samtidig som de beholder evnen til å skille seg helt ut. Mens denne protokollen ble utviklet ved hjelp av materceller, kan andre metoder brukes av etterforskere som ønsker å unngå matercelleteknologi14,24.
Teknikkens betydning for lungebiologien
En betydelig studie har vært viet til å forstå hvordan fraværet av vanlig, fungerende CFTR i cellemembranen til epitelceller resulterer i dysfunksjon i lungene, bukspyttkjertelen, leveren, tarmen eller andre vev. Dysfunksjonell epitelial iontransport, spesielt klorid og bikarbonat, resulterer i et redusert volum av epitelforingsvæsker og endringer i slimete sekreter, noe som fører til slimete stasis og obstruksjon. Ved andre luftveissykdommer, som primær ciliary dyskinesi, svekker endret ciliary bevegelse mucociliary clearance og fører til slimete stasis og obstruksjon25. Derfor er den nåværende HNE organoid-modellen utviklet for ulike bruksområder, avhengig av undersøkerens eksperimentelle design og ressurser. Dette inkluderer levende cellebilder ved hjelp av levende celleflekker; fiksering og seksjonering for å karakterisere morfologien; immunfluorescensfarging med antistoffer og helmontert konføling for å unngå å forstyrre intraluminale strukturer; og lysfeltavbildning og mikrooptisk koherenstomografi for kvantitative målinger av ciliary beatfrekvens og mucociliary transport13. For å lette ekspansjonen til andre etterforskere ble kommersielt tilgjengelige reagenser og forsyninger brukt til dyrking. En funksjonell analyse ble utviklet som brukte vanlige mikroskopteknikker og mer spesialisert utstyr. Totalt sett, mens den nåværende modellen ble designet for å vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som svar på terapeutiske behandlinger, kan teknikkene beskrevet i denne protokollen brukes på andre sykdommer som involverer epitelcellefunksjon, spesielt epitelcellevæsketransport.
Sammenligning med andre metoder
Nylig ble nytten av denne organoidmodellen utviklet ved å korrelere in vitro CFTR-modulatorresponser fra pasientens organoider med deres kliniske respons11. Spesielt er det også demonstrert at den nåværende modellen parallelt kortslutningsstrømresponser, den nåværende gullstandarden for å vurdere CFTR-funksjon, hos de samme pasientene. Kortslutningsstrømmen skiller seg fra hevelsesanalysen fordi førstnevnte måler CFTR-funksjon via iontransport26. Derimot måler denne analysen en mer nedstrøms effekt med væsketransport, og gir ytterligere informasjon om den generelle funksjonen til CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsstrømmålinger har fortsatt å være en vanlig og pålitelig metode for å bestemme CFTR-kloridkanalaktivitet 1,33. Disse elektrofysiologiske analysene krever spesialisert, dyrt utstyr, krever mange ganger flere celler for hver eksperimentelle replikering enn den organoide analysen, kan ikke enkelt automatiseres, og er ikke egnet til å skalere opp for høyere gjennomstrømningsapplikasjoner. En annen organoid modell avledet fra intestinal epithelia har ytterligere fordeler 15,16,17,18, for eksempel mer utmerket replikeringsevne, men er verken avledet fra et luftveisvev eller er universelt tilgjengelig. HNE-børsting oppnås med billige cytologibørster uten behov for sedasjon og med minimal risiko. Å få pusset krever ikke en kliniker og kan utføres av utdannede forskningskoordinatorer og andre forskningspersonell14. HNE organoid-modellen kan dyrkes av ethvert laboratorium med primære cellekulturfunksjoner, og noen av applikasjonene kan utføres med standard mikroskopiteknikker. Til sammen gir disse fordelene ytterligere tilgang til teknologi for å vurdere epitelfunksjon for luftveier som ellers kunne være utilgjengelig for noen laboratorier. Videre kan HNE organoider brukes til å studere andre sykdomstilstander som påvirker luftveiene, for eksempel primær ciliary dyskinesi25 eller virusinfeksjon, som intestinale organoider ikke kan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HNE-prøver ble samlet inn på Children's of Alabama hospital. Alle prosedyrer og metoder beskrevet her er godkjent av IRB University of Alabama i Birmingham (UAB IRB #151030001). For å lette utvidelsen og forbedre funksjonen til humane neseepitelceller (HNEer), er de nåværende dyrkingsmetodene tilpasset fra den velkjente luftvæskegrensesnitt (ALI) kulturmetoden28,34. HNE ble opprinnelig samlet inn av børstebiopsi som tidligere beskrevet 12,14, med den eneste forskjellen er bruk av en cytologi børste. Alle prøvebehandlingstrinn og cellekultur ble utført i biosikkerhetsskapet.
1. Cellekultur og utvidelse av neseepitelceller
- Etter børsting, oppbevar nesebiopsiprøven i 8 ml RPMI-medier i et 15 ml konisk rør på is og overfør det til laboratoriet innen 4 timer (ikke mer enn 24 timer).
- Fjern nesebørstebiopsien til 8 ml RPMI-medier i et 15 ml konisk rør ved å føre cytologibørsten gjennom en 1 ml stor borepipettespiss (kutt av spissen) flere ganger til børsten er fri for vev.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, fjern supernatanten, og suspender deretter cellepelleten i 3 ml celleavløsningsløsning (se Materialfortegnelse) og inkuber ved romtemperatur i 16 minutter for å fordøye.
- Bruk 5 ml ekspansjonsmedier (tabell 1) til å vaske cellene to ganger. Deretter legger du til celler i en T75-kolbe pre-seed med bestrålet og inaktivert 3T3 fibroblaster22 (50% -60% samløp) for å samkulturere cellene og utvide i ekspansjonsmediet i 7-14 dager (se figur 1 for riktig koloni). Før bruk, test de bestrålede 3T3 fibroblaster for å sikre at de ikke kan spre seg, noe som vil påvirke epitelcelleutvidelsen negativt.
MERK: Kast cellene hvis neseepiteringscellen ikke når 70 % innen 14 dager. - For cellene som er avledet fra pasienter med CF, introdusere fire antibiotika (100 μg/ml tobramycin, 2,5 μg/ml amfotericin B, 100 μg/ml ceftazidime, 100 μg/ml vancomycin, se Materialfortegnelse) i ekspansjonsmediene for desinfeksjon av cellene de første 3 dagene av kulturen, og erstatt deretter mediene med antibiotikafrie ekspansjonsmedier som skifter media hver 2.
MERK: Denne begrensede bruken av antibiotika er ment å redusere kulturtap på grunn av bakteriell kolonisering samtidig som det oppmuntrer til spredning etter at de ekstra antibiotika er fjernet. Disse antibiotika kan skreddersys til pasientens spesifikke mikrobiologi resultater, med følsomhet, om nødvendig. - Høst HNEer fra samkultur ved hjelp av dobbel trypsiniseringsmetoden22 når cellene når omtrent 80% samløp. Denne metoden sikrer at de bestrålede og inaktiverte 3T3 fibroblaster fjernes fra kolben, og de forurenser ikke etterfølgende organoid såing.
- Vask cellene med 1x DPBS, og tilsett deretter 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolben i 4 min ved 37 °C for å fjerne den bestrålede og inaktiverte 3T3 fibroblastomet fra kulturen.
- Skyll T75-kolben med 1x DPBS to ganger for å vaske bort eventuelle gjenværende 3T3 fibroblaster grundig; tilsett 1,5 ml 0,05 % trypsin-EDTA i T75-kolben i 10 minutter ved 37 °C for å løsne HNEer.
- Nøytraliser trypsin med soyabønne trypsinhemmer (se Tabell over materialer) med et forhold på 1:1. Sentrifuger cellene på 500 x g i 5 min, og fjern deretter supernatanten. Etter å ha vasket cellene med 5 ml ekspansjonsmedier en gang, er cellene klare til såing for å vokse organoider.
MERK: HNEer med et passeringsnummer på tre anbefales å brukes til videre eksperimenter.
2. Vekst og differensiering av organoider i lysbilder og kulturinnlegg
- Tine den organoide kulturen ekstracellulær matrise (ECM) over natten ved 4 °C. Avkjøl pipettespisser til 4 °C og 15-brønns angiogeneseskred (se Materialfortegnelse) over natten ved 4 °C.
MERK: ECM skal settes ved 4 °C kvelden før cellehøstingen må gjøres. - Belegge lysbildene med 5 μL kaldt 100% ECM på is (pipette 5 μL kald 100% ECM med en kald pipettespiss i hver brønn av 15-brønns lysbildet), og plasser dem deretter i en cellekulturinkubator ved 37 °C i minst 30 minutter for konsolidering.
- Tell HNEene som høstes fra samkultur ved hjelp av et hemocytometer og fortynn cellene til 500 celler/μL i totalt antall med 20 % ECM fortynnet av differensieringsmedier (tabell 2) på is. Deretter frø 5 μL av den kalde cellen / ECM-blandingen i hver brønn av lysbildene belagt med ECM.
- Overfør umiddelbart lysbildene til en kulturinkubator ved 37 °C i 1 time for å konsolidere celle/ECM-blandingen.
- Fôr cellene i hver brønn av de 15-brønns angiogenese lysbildene med 50 μL differensieringsmedier. Bytt media annenhver dag til organoidene er klare for videre eksperimenter.
MERK: Organoider kan vanligvis visualiseres etter 1-2 dager. Det er 20-90 organoider som vanligvis dannes i hver brønn av lysbildene. Organoidene kan vanligvis overleve i 40-60 dager i ECM med fôring annenhver dag når de holdes i en fuktet inkubator ved 37 °C. - Kultur organoidene i kulturinnleggene (se Materialfortegnelse) for større mengde for spesifikke bruksområder (for eksempel seksjonering for histologi eller immunfluorescens) i henhold til trinnene nevnt nedenfor.
- For å vokse organoider i kulturinnleggene, forberede den organoide kulturen ECM, pipettespisser og innsatser som nevnt i trinn 2.1-2.2. Belegge innsatsene med 100 μL kaldt 100% ECM.
- Frø 60 μL celle/ ECM-blanding (500 celler / μL med 20% ECM i differensieringsmedier) på toppen av ECM-belegget i innsatsen.
MERK: Alle de andre trinnene for å lage organoider i innsatsene er de samme som de som utføres i lysbildene, trinn 2.4-2.5. - Tilsett 600 μL av differensieringsmediet i den nederste delen av innsatsen. Bytt media hver annen dag til organoidene brukes til eksperimenter, vanligvis 2-3 uker.
3. Tilberedning og isolering av organoider for helmontert immunfluorescens
- Isolering og fiksering av organoider
- Forbehandle 8-brønns glassbunnkammersklier med cellelim (se Materialtabell) i 30 minutter etter referanse35. Etter å ha kastet løsningen, lufttørk brønnene i 30 min.
- For å høste organoidene, fjern mediet fra toppen av ECM, og tilsett deretter 50 μL kaldt 1x PBS i hver brønn av 15-brønns lysbildene på is (1:1 med ECM-volum).
- Pipette opp og ned 3-5 ganger ved hjelp av 200 μL av den store pipettespissen, og dispenser deretter løsningen på midten av en brønn av 8-brønns kammersklier.
- Fjern umiddelbart overflødig væske fra brønnene med en finspisspipette. Plasser deretter kammerskuffen i en 37 °C inkubator i 40 minutter for å forbedre organoiden som holder seg til glassbunnen.
- Etter forsiktig vasking med 1x PBS to ganger, fest organoidene med 300 μL 4% paraformaldehyd i hver brønn i 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Vask to ganger med 1x PBS og oppbevar organoidene i 1x PBS ved 4 °C for immunstaining i opptil 2 uker.
- Immunfluorescensfarging
- For å redusere autofluorescens, tilsett 250 μL 50 mM NH4Cl i 1x PBS i hver brønn på lysbildene ved RT i 30 minutter mens du forsiktig rister på en shaker ved 20 rpm.
- Etter vask med 1x PBS to ganger, permeabiliser cellene med 0,1% Triton X-100 i 30 min ved RT mens du forsiktig rister ved 20 rpm.
- Etter vask med 1x PBS to ganger, tilsett 300 μL blokkeringsløsning, inkludert 5% BSA og 0,1% Triton X-100 i 1x PBS, i hver brønn i 1 time ved RT.
- Etter vask, tilsett primært antistoff i de aktuelle brønnene etterfulgt av sekundære antistoffer (se Materialtabell). Forbered primære og sekundære antistoffløsninger i 2% BSA og 0,3% Triton X-100 i 1x PBS. Inkuber alle de primære antistoffene ved 4 °C i 2 dager og alle sekundære antistoffer ved 4 °C i 1 dag.
MERK: De endelige konsentrasjonene avhenger av proteinet som er ønsket for eksperimentet. Kontroller lagerkonsentrasjonen på produsentens dataark. Beregn deretter de endelige konsentrasjonene basert på fortynningene som brukes i materialtabellen. - Etter inkubasjon, vask brønnene grundig med 1x PBS og tilsett DAPI i 2% BSA og 0,3% Triton X-100 i hver brønn for kjernefysisk farging.
- Bilde organoidene ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop, med et 20-60x oljeinnlevelsesmål (se Materialfortegnelse). Bruk Z-stack-modus til å angi øvre og nedre grense for bildet og bruke den anbefalte optimale Z-trinnstørrelsen som bestemmes av den kontrobe programvaren.
MERK: Følgende fire konfektlasereksitasjonsbølgelengder ble brukt: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm og 637,9 nm.
4. Tilberedning og isolering av organoider for histologisk seksjonering
- For å høste organoidene for histologiske studier, fjern media fra kulturen og tilsett 50 μL kald 1x PBS i hver brønn av lysbildene på is.
- Pipette opp og ned tre til fem ganger ved hjelp av en 200 μL storboret pipettespiss, kombinere alle løsningene fra 15-brønns lysbilde- eller kulturinnleggene i et 15 ml konisk rør på is. Juster det totale løsningsvolumet i røret til 10 ml ved å tilsette ekstra kaldt 1x PBS.
- Sentrifuger røret ved 4 °C, 300 x g i 5 minutter; aspirer ut supernatanten og tilsett 60 μL varm histogel (se Materialtabell) for å blande med den organoide pelletsen ved hjelp av en 200 μL av den store pipettespissen.
- Overfør straks suspensjonen til en histologiform. Etter konsolidering av histogelen ved romtemperatur, legg muggblokken i 4% paraformaldehyd for fiksering over natten ved 4 °C.
- Etter innebygging i parafin, kutt histogelblokken i 5 μm tverrsnitt (for eksempel med en mikrotom), fest seksjonene på glasssklier og flekk ved hjelp av hematoksylin og eosin (H&E) eller immunfluorescence-merkede antistoffer. Ta bilder med et lysfeltmikroskop eller invertert epifluorescensmikroskop (se Materialfortegnelse).
5. Avbildning av levende organoider
MERK: Følgende trinn utføres ved hjelp av et automatisert bildebehandlingssystem (se Materialliste). Ulike bildesystemer må tilpasse disse trinnene ved å følge instruksjonene fra produsenten. Uavhengig av utstyret som brukes, krever bildebehandling av levende organoider et temperaturkontrollert og fuktet miljøkammer med en ledsaget CO2-gassregulator .
- For å overvåke differensiering av organoider før du utfører en funksjonell hevelse analyse36, ta hele lysbildene manuelt med ethvert lysfeltmikroskop eller med et automatisert bildebehandlingssystem, som beskrevet nedenfor.
- Slå på strømmen til det automatiserte bildesystemet og CO2/O2-gassregulatoren og la systemet fullføre den automatiserte kalibreringen (~30 min).
- Etter ferdigstillelse, sett bildesystemets temperatur til 37 °C; tilsett 15 ml sterilt vann til luftfuktingsbeholderen, åpne CO2-ventilene , lukk lokkene og la bildesystemet pre-inkubere i minst 30 minutter før avbildning.
- Åpne den automatiserte bildebehandlingsprogramvaren for å sette opp en protokoll for avbildning og velge plasseringen for å lagre rå eksperimentelle data.
MERK: Et eksempel på en protokollfil (Tilleggsfil 1), som er spesifikk for bildesystemet, er gitt som en mal for automatisert avbildning av organoider for å overvåke organoid differensiering. - Når miljøinnstillingene er oppfylt, må du umiddelbart overføre opptil to 15-brønns lysbilder med lokk inn i miljøkammeret i det automatiserte bildesystemets skyveholderinnlegg (se Materialtabell).
- Velg brønnene som skal avbildes, og start avbildningen for å fullføre avbildningen av de ønskede brønnene.
MERK: De grunnleggende anbefalte innstillingene er: 4x og 10x luftmål, lysfeltkanal, 2 x 2 montasje for 4x mål å dekke hele brønnområdet, 4 x 4 montasje for et 10x mål. Z-stack-innstillinger: tre til seks Z-stack-stykker, Z-trinns størrelse = 50-100 μm, en til to stykker under autofokuspunkt og tre til fem stykker ovenfor.
- For å avbilde levende organoider for bruk i en forskolinindusert hevelse (FIS) analyse, bruk et mikroskop med et automatisert stadium utstyrt med et miljøkontrollert bildekammer som tillater temperatur og CO2-kontroll .
- Begynn med trinn 5.1.1-5.1.4, erstatt protokollfilen i trinn 5.1.3 med den som finnes i eksempelprotokollfilen (Tilleggsfil 2) som inneholder innstillinger som er spesifikke for å utføre en FIS-analyse.
- Før hvert eksperiment justerer du eksponeringsinnstillingene ved å evaluere minst tre brønner for hvert lysbilde (lengst til venstre, i midten og lengst til høyre). Påfør koordinatforskyvningene X og Y for å sikre at målet vil være i midten av brønnen for alle brønnene.
MERK: De grunnleggende anbefalte innstillingene er: 4x luftmål, Kanal 1 = Lysfelt, Kanal 2 = DAPI, 2 x 2 montasje (fire bildefliser). Z-stack-innstillinger: tre til fire Z-stack-stykker, Z-trinns størrelse = 50-100 μm, ett stykke under autofokuspunkt og to til tre stykker ovenfor. Bildeanskaffelsestid: 8 timer med intervaller på 20 minutter (Totalt antall leseoperasjoner = 25; Les 1 er T = 0). - Når alle innstillingene er valgt på riktig måte, velger du brønnene du vil bilde for begge lysbildene, eller merker alle, og begynner kjøringen i henhold til utstyrets instruksjoner.
- Når du har kjørt, lagrer du eksperimentet, lukker bildebehandlingsprogramvaren og avslutter bildebehandlingssystemet37.
6. Baseline lumen målinger
MERK: Dette gjøres ved hjelp av programvare for manuell bildeanalyse (se Tabell over materialer). En lignende metodikk kan følges ved hjelp av en åpen kildekode-programvare38 eller programvare som kan måle området i et område på et bilde.
- Åpne automatisert målingspanel i programvaren ved å høyreklikke nederst på skjermen, velge Måling og deretter Automatiserte måleresultater. Området for hver region av interesse (ROI) målt vil vises der.
- Åpne det organoide bildet i programvaren og velg 5-10 organoider med synlige lumen.
MERK: Lumen vil være et sirkulært område midt i organoiden som er synlig forskjellig i fargen enn resten av organoiden (figur 2A). - Bruk funksjonen for polygon ROI-måling, hold høyreklikk på bildet for å åpne menyen og velg Polygonal avkastning for å skissere hele organoiden for å oppnå organoidens totale overflateareal (TSA). Deretter skisserer du lumenområdet (LA) (figur 2B).
- Gjenta for de resterende organoidene i brønnen og alle brønnene i analysen.
- Eksporter dataene til Excel. Del LA med TSA og gjennomsnittlig alle organoidene fra prøven for å få Baseline Lumen Ratio (BLR)11,13.
MERK: Vanligvis vil ~ 87% av ikke-CF-organoider ha en BLR over 0,6, og 97% vil være over 0,5, mens bare 14% av CF-organoider vil ha en BLR over 0,6, og 31% vil være over 0,5.
7. Forbehandling og automatisert avbildning av HNE organoider
MERK: Alle forbehandlingstrinn utføres i et rent biosikkerhetsskap. Forhåndsinstaller det automatiserte bildesystemet og programvaren for registrering av analysen før trinn 7.1. Inkubasjonen med DAPI er valgfri, men anbefales som en feilsikker hvis kvaliteten på lyse feltbilder blir kompromittert. I dette tilfellet kan DAPI-kanalen (377 nm) analyseres i stedet.
- Pre-inkubere organoidene i en brønn på 15-brønns lysbilder med 50 μL differensieringsmedier som inneholder DAPI med eller uten 100 μM CFTRinh-172 (se Materialtabell) i en 37 °C inkubator i 1 time. Mens organoidene inkuberer, utfører du trinn 5.2.1 ved hjelp av en spesialprotokoll for hevelseanalyse etter tilleggsfil 2.
- Fjern pre-inkubasjonsmediet ved hjelp av en pasteurpipette i glass med aspirasjon. Tilsett 10 μM forskolin og 100 μM IBMX (stimuleringscocktails) (se Materialbord) for et totalt volum på 50 μL differensieringsmedier i hver brønn.
MERK: Pass på at det ikke innføres bobler i brønnene. Bobler på bildene vil påvirke den automatiserte analysen. - Begynn uten forsinkelse FIS-bildebehandlingsprotokollen etter trinn 5.2.2 til 5.2.4. Skaff bilder hver 20 min i hver brønn, med en total kjøretid på 8 timer.
8. Automatisert analyse av forskolinindusert hevelsesanalyse på HNE organoider
- Åpne den automatiserte bildeanalyseprogramvaren, finn eksperimentet som tidligere ble lagret fra trinn 7.3, og få opp bildene av eksperimentet.
- Velg karvinduet som skal evalueres, og velg alternativet som inneholder de bearbeidede bildene som er sydd og z-projisert. Dette trinnet skal gi et bilde av hele brønnen med alle organoider innenfor bilderammen for maskering av vurdering og målinger.
- Velg brønnbildet du vil vurdere. Velg Analyser. Gjenta denne prosessen for andre bilder for å sikre riktig maskering for alle bilder som er inkludert i de automatiserte målingene. Lagre innstillingsparameterne.
- Når du har fullført analyseinnstillingene, bruker du endringene. Programvaren vil endre målingene basert på innstillingene.
MERK: Etter at den første forhåndsbehandlingen av bildet er fullført, bør det utføres kvalitetskontrolltiltak (QC) for å sikre konsekvent maskering. Disse inkluderer manuell gjennomgang av alle brønner for å sikre at organoider er innenfor bilderammen, bobler eller rusk ikke er upassende maskert, og kontroll av maskeringen i lyse felt og DAPI-kanaler. - Eksporter dataene for sammendragsanalysen (inkludert grafer og statistisk analyse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNEs ekspansjon er avgjørende for en blomstrende organoidkultur. HNEer fra en vellykket utvalgssamling bør utvides til over 70% samløp rundt 10 dager. Et eksempel på vellykkede og mislykkede prøver vises i henholdsvis figur 1A og figur 1B. Cellene må kastes hvis de ikke kan nå 70% samløp med 14 dager etter samkultur med bestrålede 3T3 celler. Eventuelle forurensede celler skal umiddelbart kastes hvis de ikke kan reddes med ytterligere antimikrobielle midler raskt.
Veksten av organoidene ble sammenlignet i 15-brønns lysbilder og kulturinnlegg. Kulturinnleggene er tykkere og lenger fra målet enn de optisk optimaliserte lysbildene, noe som påvirker bildet og oppløsningen. Til tross for dette ble det ikke observert noen signifikant forskjell i morfologien i disse to kulturmetodene, som vist i figur 2. Morfologiske forskjeller kan ses mellom ikke-CF- og CF-organoider, som vist i figur 3A. Ikke-CF organoider har en tendens til å ha en større lumen som inneholder mer væske i den. I motsetning har CF organoider vanligvis en mindre lumen med mindre væske og noen ganger er fylt med slim og rusk. Lumenstørrelsen ble målt manuelt (figur 3B), og lumenforholdet for baseline ble beregnet og vist i figur 3C. Tverrsnittsorganoider ble karakterisert ved hjelp av H&E og immunfluorescensfarging. De representative bildene vises i figur 4A,B. Epitelmarkører for luftveier som cilia, slim og tett veikryss er demonstrert i organoider ved helmontert immunfluorescerende farging vist i figur 5A-D. Avhengig av bruksområdet kan seksjonert eller helmontert immunfluorescens brukes. Hele mount-metoden opprettholder organoidens tredimensjonale natur, og holder organoidens interiør intakt, som vist i det tidligere publiserte arbeidet13.
CFTR-funksjonen ble vurdert ved forskolinindusert hevelse (FIS)-analyse ved hjelp av et automatisert bildebehandlingssystem. Bare 15-brønns lysbilder brukes til funksjonelle analyser på grunn av bedre bildeoppløsning. Et representativt forskolin dose-respons eksperiment av ikke-CF frivillige (n = 5 forsøkspersoner) er vist i figur 6A for å illustrere begrunnelsen for optimalisert bildetid og analyse. Data som sammenligner ikke-CF- og CF-organoidresponser er beskrevet i tidligere publikasjoner11,13. En doserespons viser den trinnvise endringen i CFTR-aktiviteten for å demonstrere den beste tilnærmingen til målinger. Analysevarighet på 1 t og 8 t ble evaluert (figur 6B,C) samt analyse ved bruk av gjennomsnittlig brøkdelsendring (AFC) kontra areal under kurven (AUC) ses i figur 6C,D. Basert på vår tidligere erfaring, hevelse for de fleste og forhold platå etter 8 timer, og i noen tilfeller resulterer i sprengning av organoider over den tiden. Derfor var analysene begrenset til bare 8 timer. Ved denne utvidede analyselengden blir hevelse ikke-lineær. Bruken av AUC vurderer også både endringene i størrelse og endringshastighet. Derfor ble AUC over 8 timer brukt til alle FIS-analysene i den endelige metodikken.
Figur 1: Lysfeltbilder av HNEer i samkultur. HNEer ekspanderer i ekspansjonsmedier med bestrålede og inaktiverte 3T3 fibroblaster i 10 dager. Et invertert lysfeltmikroskop brukes til å avbilde cellene. (A) HNEene vokser godt i en stor klynge (svart pil). I (B) vokser HNE-ene derimot dårlig i to små klynger (svarte piler) rundt bestrålede 3T3-celler. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: HNE organoiddannelse i en 15-brønns sklie- og kulturinnsats. Lysfeltbilder av organoider ble tatt ved hjelp av et invertert lysfeltmikroskop over 21 dager. Organoider i 15-brønns lysbildet (A) har mer presise og skarpere bilder enn de i kulturinnsatsen (B). Det ble ikke observert noen morfologiske forskjeller mellom organoidene som ble dyrket i lysbildet og innsatsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Organoid lumenstørrelse (panel A) og lumenmålinger (panel B og C). (A) Ikke-CF organoider har vanligvis en større lumen og mer væske enn CF (F508del/F508del) organoider. (B) En metode for å måle det totale overflatearealet (TSA) som er angitt av det røde omrisset og lumenområdet (LA) som er angitt av det grønne omrisset manuelt i en enkelt organoid. (C) Et eksempel for bruk av det totale overflatearealet og lumenområdet for å beregne baseline Lumen Ratio (LA: TSA) i organoider fra et ikke-CF vs. et CF-emne. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tverrsnitt av organoidene som er innebygd i parafin. (A) Et eksempel på H&E-farging i organoider fra et emne som ikke er CF og CF (F508del/F508del). (B) Immunfluorescent farging av cilia i en organoid. Grønn er cilia (hvit pil) farget med acetylert-tubulin og FITC merket sekundært antistoff, og blått er kjernen merket med DAPI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Konfiskere bilder av helmontert immunfluorescens hos organoider. (A,C) Maksimalt antall projeksjonsbilder av de to representative organoidene. (B,D) Tredimensjonale rekonstruksjonsbilder av henholdsvis (A) og (C). En 8-brønns glassbunnsklie ble montert på plattformen til et konfokalt mikroskop, og 40x-linsen ble brukt til å lage fotomikrografene. Bildeanalyseprogramvare ble brukt til avbildning og rekonstruksjon av bildene. Hvite piler indikerer slim (i B) og cilia (i C) innenfor lumen av organoidene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Begrunnelse for hevelsesanalyselengden og analysemetodene. Forskolin (FSK)-indusert hevelse (FIS) analyse for å teste CFTR-funksjon på de primære neseepitelcellene. Forskjellig dose forskolin indikert i tallene ble administrert i 21-dagers gamle organoider i differensieringsmediene; organoid hevelse ble umiddelbart registrert med den automatiserte imager i 8 timer. Etter 8 timer vises hevelse i (A) (n = 5, ikke-CF-forsøkspersoner) ved bruk av gjennomsnittlig brøkdelsendring (AFC). FSK dose-respons sammenlignes med AFC ved 1 t (B) vs. ved 8 h (C), noe som antyder at 8 h analysen kan produsere en mer signifikant hevelse forskjell mellom ulike FSK doser enn de ved 1 h. AFC (C) vs. området under kurven, AUC (D) på 8 h sammenlignes, noe som indikerer AUC kan gjenspeile en mindre hevelse forskjell enn AFC. X-aksen i paneler (B-D) representerer de forskjellige behandlingsforholdene som tilsvarer symbolene i figurforklaringen. Alle feilfelt i tallene angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Alle komponentene for å lage ekspansjonsmediet. Detaljert informasjon om reagenslagerkonsentrasjon, lagerlagring, mengde lager for å lage et 500 ml media, og endelig konsentrasjon er beskrevet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Alle komponentene for å lage differensieringsmedier. Detaljert informasjon om reagenslagerkonsentrasjon, lagerlagring, mengde lager for å lage et 500 ml media, og endelig konsentrasjon er beskrevet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Et eksempel på en protokollfil som er spesifikk for bildesystemet, leveres som en mal for automatisert avbildning av organoider for å overvåke organoid differensiering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Et eksempel på en protokollfil som inneholder innstillinger som er spesifikke for å utføre en FIS-analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet gir detaljerte metoder for omfattende levende og fast avbildning av luftveis epitelorganoider avledet fra HNE børstebiopsi. Den beskriver funksjonelle analyser som kan bestemme CFTR-aktivitet hos en person. HNEer gir et minimalt invasivt, primært vev for en rekke bruksområder. Ekspansjonsteknikkene som tilbys her kan brukes til modellering av luftveissykdom, inkludert organoider. Organoider kan brukes til presisjonsterapeutiske tilnærminger og for å overvåke stabiliteten til gen- eller mRNA-baserte terapier over tid, for presisjonsstudiedesign og for å hjelpe til med å løse inkonklusive diagnoser39. Den nåværende forskningen er på CF, men disse modellene har anvendelser for andre sykdommer som påvirker epitelfunksjonen.
Den første utvidelsen av HNE etter biopsi er viktig. Det har blitt observert at cytologibørster gir større startcelletall og bedre resultater enn andre biopsiverktøy14. Fra tidligere erfaringer har vi konkludert med at å kombinere børstinger fra begge nares i en enkelt prøve og behandling som prøver innen 4 timer gir de beste resultatene. Andre etterforskere har brukt mer utvidede tidsrammer fra biopsi til behandling med suksess3. Riktig innledende samling av biopsier er avgjørende for etterfølgende ekspansjon og såing som organoider. Høy kvalitet bestrålet og inaktivert fibroblaster for samkultur er nødvendig, som dyrkes og behandles internt i vårt laboratorium, men kan også kjøpes kommersielt. Etterforskere anbefales at ikke alle 3T3 fibroblaster er samme cellelinje og bør valideres før bruk.
For prøver som ikke forventes å ha patogen bakterie- eller soppkultur, er antibiotikabehandling begrenset til standard penicillin- og streptomycinbehandling for forsøkene beskrevet i dette manuskriptet. For de som er kjent for å ha kronisk kolonisering av øvre luftvei, brukes en antibiotikacocktail beskrevet ovenfor i bare 3 dager fordi antibiotika ser ut til å bremse epitelutvidelsen og gi dårligere resultater i forsøkene beskrevet her. Tre dager ble valgt for å balansere forurensningsrisiko med å gi en lignende ekspansjonsrate for både CF- og ikke-CF-prøver. For personer med uvanlige patogener kan skreddersydd antimikrobiell behandling redde forurensede kulturer hvis de gjenkjennes tidlig eller initieres a priori. For innledende biopsier som er uvanlig trege å vokse, vil resultatene vanligvis være dårlige for organoidstudier. Etterforskere må overvåke både vekstrate og morfologi daglig. De interne kulturmediene og reagensene som brukes er mest nyttige for funksjonelle hevelsesanalyser, men andre kommersielt tilgjengelige medier kan være til nytte for andre applikasjoner 12,25,40,41 avhengig av eksperimentell design. Typen ECM som brukes kan føre til forskjellig morfologi og forskjellige resultater, og reproduserbare resultater er kritiske. Alle reagenser som brukes i denne protokollen testes rutinemessig før bruk for eksperimenter. Til tross for denne erfaringen vil noen kulturer ikke utvide eller generere organoider av uforklarlige grunner. Etterforskere oppfordres til å vurdere disse faktorene når de optimaliserer denne protokollen for applikasjonene sine.
En bestemt type 15-brønns lysbilde brukes i denne protokollen optimalisert for optisk bildebehandling, ved hjelp av minimale volumer og maksimering av replikeringer samtidig som kostnadene reduseres. Disse lysbildene har et nedre og øvre kammer festet på en polymer coverlip som minimerer menisci (som ellers ville svekke bildebehandling) og også media erstatning uten risiko for å løsne matrisen og ødelegge organoid kulturer. Disse lysbildene gjør lysfeltavbildning og levende flekkmikroskopi grei, med innledende såing, vekst og avbildning i samme tallerken. Organoider vil gå tapt under innsamlings-, fikserings- og fargingsprosessen, så omhyggelig forsiktighet må tas under hvert trinn, og tilstrekkelige startnumre må oppnås for å sikre suksess. Voksende organoider i kulturinnlegg kan hjelpe etter hvert som disse teknikkene utvikles.
Avbildningsteknikker som benytter vanlige laboratoriemikroskoper er inkludert. De automatiserte funksjonsanalysene bruker imidlertid et bildebehandlingssystem som er komplekst og krever en godt opplært bruker. Denne protokollen er utviklet for brukere med et grunnleggende nivå av erfaring ved hjelp av dette mikroskopet og dets programvare. Det anbefales å først trene individene på den primære bruken av instrumentet og programvaren av representanter for produsenten; den samme praksisen følges i laboratoriet vårt. Minst 4 ukers trening var nødvendig for å bruke dette mikroskopet effektivt til eksperimenter.
Som beskrevet ovenfor har denne metoden noen begrensninger. Ekspertise innen biopsisamling, rask behandlingstid og anlegg med materfibroblaster er nødvendig for å lykkes med å utvide og dyrke HNE organoider. Denne metoden ble utviklet ved hjelp av spesifikke reagenser og utstyr som kanskje ikke er universelt tilgjengelig. Metodikken har vist seg nyttig for forskning på cystisk fibrose 3,11,13 og kan ikke være like aktuelt for andre sykdomsprosesser 25. Andre metoder og utstyr kan imidlertid brukes til å utvikle lignende strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JSG er oppført som oppfinner på en patentsøknad 20170242033 fra University of North Carolina som beskriver en lignende modell. Når lisensiert teknologi fra UNC produserer royalties, får oppfinnerne en andel av inntektene. Ellers erklærer forfatterne ingen interessekonflikter. Finansiører hadde ingen rolle i studiens design, i innsamling, analyser eller tolkning av data, i manuskriptets skriving, eller i beslutningen om å publisere resultatene.
Acknowledgments
Vi anerkjenner takknemlig bidragene fra alle deltakerne som donerte HNE børstebiopsier for å utvikle denne protokollen. Vi takker Latona Kersh og children's Research Unit ansatte for koordinering av studiens frivillige rekruttering og prøvesamlinger. Vi takker Lily Deng, Johnathan Bailey og Stephen Mackay, tidligere praktikanter i laboratoriet vårt, for teknisk assistanse. Vi takker Zhong Liu og Rui Zhao for deres tekniske hjelp. Steven M. Rowe, direktør for CF Research Center ved UAB, gir lederskap og ressurser, uten hvilket dette arbeidet ikke ville være mulig. Vi vil også takke Sarah Guadiana i Biotek for hjelp med instrumentopplæring, Robert Grabski for konfiskert mikroskopihjelp ved UAB High-Resolution Imaging Facility, og Dezhi Wang for histologisk hjelp ved UAB Histology Core. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (til JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (til JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 og DK072482 og CFF University of Alabama ved Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], og UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
