Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לביצוע שברים בעכברים בוגרים ולמעקב אחר תהליך הריפוי.
Abstract
תיקון שבר הוא פונקציה חיונית של השלד שלא ניתן לדגום באופן מהימן במבחנה. מודל פציעה של עכבר הוא גישה יעילה לבחון אם גן, מוצר גן או תרופה משפיעים על תיקון העצם מכיוון שעצמות מורין משחזרות את השלבים שנצפו במהלך ריפוי שברים אנושיים. כאשר עכבר או אדם שוברים עצם, מתחילה תגובה דלקתית, והפריוסטאום, גומחת תאי גזע המקיפה את העצם עצמה, מופעל ומתרחב. תאים השוכנים בפריוסטאום מתמיינים לאחר מכן ויוצרים יבלת רכה וסקולרית. המעבר מהקלוס הרך לקאלוס קשה מתרחש כאשר תאי האב המגויסים מתמיינים לתאי מינרליזציה, והגישור בין הקצוות השבורים גורם לאיחוד העצמות. לאחר מכן, ה-callus המינרלי עובר שיפוץ כדי לשחזר את הצורה והמבנה המקוריים של העצם שנרפאה. ריפוי שברים נחקר בעכברים באמצעות מודלים שונים של פציעה. ובכל זאת, הדרך הטובה ביותר לשחזר את כל התהליך הביולוגי הזה היא לפרוץ את החתך של עצם ארוכה המקיפה את שני הקורטיזים. פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לבצע בבטחה שבר עצם הירך רוחבי מיוצב כדי להעריך ריפוי בעכברים בוגרים. פרוטוקול כירורגי הכולל טכניקות קציר והדמיה מפורטות לאפיון השלבים השונים של ריפוי השברים מסופק גם כן.
Introduction
שברים, שברים בהמשכיות פני העצם, מתרחשים בכל חלקי האוכלוסייה. הם הופכים חמורים אצל אנשים שיש להם עצמות שבריריות עקב הזדקנות או מחלה, ועלויות הטיפול הרפואי של שבריריות שבריריות צפויות לעלות על 25 מיליארד דולר תוך 5 שנים 1,2,3,4,5. הבנת המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתיקון שברים תהיה נקודת מוצא בפיתוח טיפולים חדשים שמטרתם לשפר את תהליך הריפוי. מחקרים קודמים הראו כי עם השבר מתרחשים ארבעה שלבים משמעותיים המאפשרים לעצם להחלים: (1) היווצרות ההמטומה; (2) היווצרות של יבלת פיברוקרטילגינית; (3) מינרליזציה של היבלת הרכה ליצירת עצם; ו-(4) שיפוץ העצם שנרפאה 6,7. תהליכים ביולוגיים רבים מופעלים כדי לרפא את השבר בהצלחה. ראשית, תגובה פרו-דלקתית חריפה מופעלת מיד לאחר שבר 6,7. לאחר מכן, הפריוסטאום הופך להיות מופעל ומתרחב, ותאים פריוסטאליים מתמיינים לכונדרוציטים ויוצרים יבלת סחוס שגדלה כדי למלא את הפער שהותירו מקטעי העצם המופרעים 6,7,8,9. תאים עצביים וסקולריים פולשים ל-callus החדש שנוצר כדי לספק תאים נוספים ומולקולות איתות הדרושות כדי להקל על תיקון 6,7,8,9,10. בנוסף לתרומה להיווצרות קאלוס, תאים פריוסטאליים מתמיינים גם לאוסטיאובלסטים שמניחים עצם ארוגה ביבלת המגשרת. לבסוף, אוסטאוקלסטים משפצים את העצם החדשה שנוצרה כדי לחזור לצורתה המקורית ולמבנה הלמלר 7,8,9,10,11. קבוצות רבות פיתחו מודלים של עכברים לתיקון שברים. אחד ממודלי השבר המוקדמים והנפוצים ביותר בעכברים הוא גישת איינהורן, שבה משקל נשמט על הרגל מגובה מסוים12. חוסר השליטה על הזווית והכוח המופעל כדי לגרום לשבר יוצר שונות רבה במיקום ובגודל של אי-הרציפות של העצם. לאחר מכן, הוא גורם לשינויים בתגובת ריפוי השברים הספציפית שנצפתה. גישות פופולריות אחרות הן התערבות כירורגית ליצירת פגם מונוקורטי או שברי מאמץ טיביאליים, הליכים הגורמים לתגובות ריפוי מתונות יחסית 10,13. השונות במודלים אלה נובעת בעיקר מהאדם המבצע את ההליך14.
כאן, מודל פגיעה מפורט בעצם הירך של העכבר מאפשר שליטה על השבר כדי לספק פגיעה הניתנת לשחזור ולאפשר הערכה כמותית ואיכותית של תיקון שבר עצם הירך. באופן ספציפי, פריצת דרך מלאה בעצם הירך של עכברים בוגרים מוצגת ומייצבת את קצוות השבר כדי להסביר את התפקיד שהעומס הפיזי ממלא בריפוי העצם. השיטות לקצירת רקמות והדמיה של השלבים השונים של תהליך הריפוי באמצעות היסטולוגיה וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT) מסופקות גם בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באזור הרפואי של הרווארד. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J בני 12 שבועות (זכרים ונקבות). עכברים זכרים ונקבות C57BL/6J משיגים מסת עצם שיא בסביבות גיל 12 שבועות עם עצם הירך רחבה מספיק כדי להתאים לסיכת מייצבת, מה שהופך אותם לזן מתאים לשימוש בפרוטוקול זה15.
1. הכנה לניתוח
- יש לערוך אוטוקלאציה של הציוד הכירורגי, כולל מספריים כירורגיים, מלקחיים ישרים, מלקחיים מעוקלים, מהדקים כירורגיים וגלגל חיתוך יהלומים (ראו טבלת חומרים) כדי למזער את הסיכון לזיהום.
- הניחו כלוב עכבר נקי על משטח חימום כדי להקל על ההחלמה לאחר הניתוח. הגדר את משטח החום כך שיגיע לטמפרטורה בין 37-45 °C (76 °F).
- מניחים את העכבר תחת הרדמה באמצעות תא איזופלורן. הגדר את זרימת חמצן האינדוקציה על 2 ליטר לדקה, את אינדוקציית האיזופלורן על 2-4%, את חמצן חרוט האף בתחזוקה על 2 ליטר לדקה, ואת איזופלורן התחזוקה הוא 1.4%.
- אשרו כי נשימתו של העכבר יציבה והם אינם מגיבים לצביטת בוהן. יש למרוח שכבה דקה של משחה אופטלמית על כל עין כדי למנוע גירוד בקרנית. מעבירים את העכבר למשטח סטרילי ושומרים על הרדמה באמצעות חרוט אף כדי להעביר איזופלורן באופן רציף באותו קצב כמו בשלב 1.3.
הערה: מומלץ להשתמש בעכברים בני 12 שבועות ומעלה מכיוון שעצם הירך מעכברים צעירים יותר עשויה להיות דקה מדי מכדי להכיל סיכה מייצבת. - הזריקו לעכבר באופן תת-עורי משקל גוף של 0.05 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין בשחרור איטי (ראו טבלת חומרים).
- באמצעות גוזם חשמלי, גילחו ריבוע בגודל 2X2 ס"מ על שתי הירכיים המתאים למיקום עצם הירך.
- יש לחטא את האזור המגולח באמצעות גזה סטרילית או מטושים כדי להפיץ שכבה של יוד ולאחר מכן שטיפה עם 70% אתנול (איור 1A).
2. ניתוח
- באמצעות אזמל סטרילי, יש לבצע חתך של 5 מ"מ באזור המגולח והמחוטא ולקלף את העור כדי לחשוף את החיתולית שמתחת.
- השתמש במלקחיים ישרים ומספריים עדינים כדי לתפוס ולחתוך בעדינות את החיתולית המכסה ישירות את עצם הירך כדי לחשוף את השריר. חתך של 5 מ"מ של החיתולית מספיק כדי לגשת לשריר הבסיסי.
- באמצעות זוג אחד של מלקחיים ישרים, מפרידים בעדינות את השריר מעצם הירך עם נזק מינימלי לרקמות.
- ברגע שעצם הירך נראית לעין, החליקו את המלקחיים המעוקלים מתחת לעצם הירך בין השריר המופרד לעצם. תנו למלקחיים להיפתח לאט כדי לשמור על הפרדת שרירים ולאבטח את עצם הירך כדי להקל על חתך נקי.
הערה: עצם הירך חייבת להישאר חשופה ומופרדת מהשריר והעור כאשר המלקחיים אינם מוחזקים, כפי שמוצג באיור 1B. - בצע חתך רוחבי באמצע פיר עצם הירך באמצעות מסור כף יד בהגדרת ההספק הנמוך (ראה טבלת חומרים עבור הלהב וערכת הכלים הסיבובית המשמשת).
הערה: לאחר כריתת עצם הירך לחלוטין, נוצרים שני קצוות שבר: החלק הפרוקסימלי (המחובר לעצם הירך) והחלק הדיסטלי (המחובר לברך, הידוע גם בשם מפרק המחניק). הימנעו מחיתוך עצם הירך בתנועה אחת ויחידה. במקום זאת, בצע 3-5 מעברים עד שעצם הירך נחתכת לחלוטין. זה קריטי כדי למנוע התחממות יתר של הרקמה הסובבת ויצירת פסולת עצם משמעותית, המשפיעה לרעה על הריפוי. - הכנס מחט מנחה (23 G x 1 TW IM, 0.6 מ"מ x 25 מ"מ) (ראה טבלת חומרים) בחלל המוח של החלק הדיסטלי. השתמשו באצבעות כדי לסובב בעדינות את המחט בזמן שאתם דוחפים להשחיל דרך מפרק הברך (איור 1C).
- הסר את מחט ההנחיה מהקצה הדיסטלי וחזור על הקצה הפרוקסימלי, תוך שימוש באותה תנועת פיתול עדינה כדי לדחוף את מחט ההנחיה דרך מפרק הירך. השאירו את המחט המנחה בקצה הפרוקסימלי, כשקצהו מגיח מתוך העור (איור 1D).
הערה: כדי לייצב את קצוות השבר, מחט מכוונת שימשה תחילה ליצירת מסלול דרך קצות השבר, ולאחר מכן הושחלה סיכת ייצוב דרך מסלול זה כדי לאבטח את קצות השבר14.
- הסר את מחט ההנחיה מהקצה הדיסטלי וחזור על הקצה הפרוקסימלי, תוך שימוש באותה תנועת פיתול עדינה כדי לדחוף את מחט ההנחיה דרך מפרק הירך. השאירו את המחט המנחה בקצה הפרוקסימלי, כשקצהו מגיח מתוך העור (איור 1D).
- הכנס את הפין המייצב (מחט, 27 גרם x 1 1/4, 0.4 מ"מ x 30 מ"מ) (ראו טבלת חומרים) לקצה מחט ההנחיה (איור 1E). דוחפים בעדינות כך שהסיכה המייצבת נכנסת כאשר המחט המנחה יוצאת מחלל המוח של הקצה הפרוקסימלי.
- השליכו את מחט המדריך. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק וליישר את הקצה הדיסטלי עם הקצה הפרוקסימלי ולהמשיך להשחיל את הסיכה המייצבת דרך חלל המוח הדיסטלי עד שהיא יוצאת ממפרק הברך באמצעות המסלול שנעשה ב-2.6 (איור 1F).
הערה: סיכת הייצוב צריכה להיות בולטת כעת ממפרקי הירך והברך.
- השליכו את מחט המדריך. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק וליישר את הקצה הדיסטלי עם הקצה הפרוקסימלי ולהמשיך להשחיל את הסיכה המייצבת דרך חלל המוח הדיסטלי עד שהיא יוצאת ממפרק הברך באמצעות המסלול שנעשה ב-2.6 (איור 1F).
- באמצעות המהדק הכירורגי, משכו את קצה הסיכה כדי לקרב את החלקים הפרוקסימליים והדיסטליים זה לזה, כך שהם בקושי נוגעים זה בזה. יישרו מחדש את קצוות השבר עם מלקחיים במידת הצורך, וקפלו את קצות הפין המייצב לכיוון אתר השבר באמצעות המהדק הכירורגי (ראו טבלת חומרים).
- הסר את הפלסטיק מבסיס המחט באמצעות חותכי חוטים. באמצעות המהדק, סובבו את שני קצוות הסיכה עד שהם קהים כדי למנוע נזק פנימי לרקמות.
הערה: קצות השבר נעולים כעת במקומם, כך שהעכבר יכול לשים משקל על הרגל הפצועה. הסיכה מאובטחת אם קצות השבר אינם מסוגלים להיפרד. חותך חוט יכול לשמש גם כדי להקהות את הקצוות. הסיכה המייצבת חייבת להישאר במקומה במשך כל תקופת המחקר עד להמתת העכבר. ניסיונות לעקור את הסיכה עלולים לערער את תגובת השבר ולגרום נזק לבעל החיים. ניתן להסיר את הסיכה בעת הנתיחה.
- הסר את הפלסטיק מבסיס המחט באמצעות חותכי חוטים. באמצעות המהדק, סובבו את שני קצוות הסיכה עד שהם קהים כדי למנוע נזק פנימי לרקמות.
- השתמש במלקחיים ישרים כדי למקם מחדש את השריר על עצם הירך. באמצעות מלקחיים מעוקלים, צובטים את קצות העור זה לזה וסוגרים את הפתח באמצעות קליפסים לפצע.
הערה: אין לסגור את העור בצורה הדוקה מדי עם הקליפסים או שהעכבר ימנע מהטלת משקל על רגל זו. הגבלת ההעמסה הפיזית במהלך ההחלמה עלולה לעכב את תהליך הריפוי. - חזרו על שלבים 2.2 עד 2.4 ברגל השנייה וסגרו את הפצע מבלי לבצע את שבר עצם הירך.
הערה: עצם הירך המופעלת על ידי בושה זו משמשת כבקרה קונטרלטרלית. - משכו את החשיפה לאיזופלורן, הניחו את העכבר בכלוב המחומם וודאו שהוא חוזר להכרה תוך 10-15 דקות.
- עקוב אחר פעילות העכבר ואתר החתך מדי יום במשך 5 ימים לאחר הניתוח לסימני מצוקה או זיהום.
הערה: אם בעל החיים מפגין סימני כאב, אינו אוכל ו/או מהסס ללכת על אחוריו, יש להתייעץ עם הצוותים הווטרינריים ולתת משכך כאבים נוסף. - הסר את קליפס הפצע 10 ימים לאחר הניתוח.
הערה: אם נראה שהפצע לא נסגר לאחר 10 ימים, יש להתייעץ עם הווטרינר ו-IACUC לפני הסרת הקליפסים.
3. קצירת רקמות
- המתת חסד את העכברים באמצעות שאיפת CO2 ולאחר מכן פריקה של צוואר הרחם.
הערה: הליך זה עולה בקנה אחד עם הפאנל על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית. - באמצעות מספריים ומלקחיים, הסר את העור משתי רגלי העכבר, נקע את ראש הירך מעצם הירך וחתך את השריר הסמוך כדי לשחרר את הרגל.
הערה: הימנע מהסרת שריר רב מדי סביב עצם הירך מכיוון שהקלוס עלול להיות מנותק או פגום. - הימנעות מהסיכה המייצבת, חותכים דרך מפרק הברך כדי להפריד את עצם הירך מהטיביה.
- נתחו את החלקים הדיסטליים והפרוקסימליים של עצם הירך כדי לחשוף את קצות הסיכה המייצבת.
- בעזרת חותך חוט קשיח, חתכו את הקצוות הקהים המקופלים של הסיכה כך שיישאר רק החלק הישר של הסיכה. השתמש במלקחיים כדי להחליק לאט ובעדינות את הסיכה המייצבת מתוך עצם הירך.
הערה: אם הסיכה אינה מחליקה בקלות החוצה, אל תפעיל כוח מכיוון שהדבר עלול לנתק את ה- callus ולפגוע במדגם. במקום זאת, נסו לסובב את הסיכה ולהסיר אותה בעדינות. הסרת הסיכה עשויה להיות קלה יותר גם לאחר הקיבוע.
4. היסטולוגיה - כחול אלקיאני / Eosin / כתום G צביעה
הערה: צביעת G/Eosin כחולה/כתומה אלקיאנית משמשת באופן שגרתי להדמיית סחוס (כחול) והעצם (ורודה). ניתן לכמת את שטח הסחוס כשיעור משטח ה-callus הכולל (איור 2A,B).
- תקן את עצם הירך בפורמלין נייטרלי ב-10% נייטרלי ב-4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הדגימות הקבועות במלח בעל מאגר פוספט (PBS).
- מניחים דגימות ב-0.5M EDTA, pH 8.0 על שייקר שמסתובב באיטיות במשך שבועיים. שנה את פתרון EDTA כל יומיים כדי להבטיח דקאלציפיקציה יעילה.
הערה: אין צורך בסל"ד ספציפי עבור השייקר; ודא שהנוזל זורם במיכל כדי לכסות את כל הדגימות. ניתן לבדוק את ההפחתה המלאה על ידי צילום רנטגן של עצם הירך. - כדי לעבד את הדגימות עבור הטמעת פרפין הדגירה אותם בתמיסות הבאות (1 שעה כל אחת): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, קסילן, קסילן, פרפין, פרפין.
- הטבע את הדוגמאות בפרפין לצורך חתך.
- חותכים מקטעי אורך בעובי 5-7 מיקרומטר של עצם הירך השבורה באמצעות מיקרוטום.
- Deparaffinize את החלקים על ידי דגירה אותם ב 2 אמבטיות של קסילן (5 דקות כל אחד).
- לייבש את החלקים על ידי דגירה בשיפוע האתנול הבא (2 דקות כל אחד): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
- מניחים מגלשות במי ברז למשך דקה אחת.
- הפוך את הפתרונות של כחול אלקיאני, אלכוהול חומצי, מי אמוניום ו- Eosin / Orange G להיסטולוגיה כפי שצוין בקובץ משלים 1.
הערה: הנפחים המוצעים של כל פתרון צריכים להספיק כדי להטביע לחלוטין את השקופיות לצורך הכתם. - מניחים שקופיות באלכוהול אסיד במשך 30 שניות ודגירה בכחול אלקי למשך 40 דקות.
- יש לשטוף בעדינות מתחת לברז הרץ עד שהמים צלולים למשך כ-2 דקות.
- טבלו את המגלשות במהירות באלכוהול חומצי במשך 1 שניות.
- יש לשטוף כמתואר בשלב 4.9.
- דגירה במי אמוניום במשך 15 שניות.
- יש לשטוף כמתואר בשלב 4.9.
- ממקמים ב-95% EtOH למשך דקה אחת ודגירה ב-Eosin/Orange G למשך 90 שניות.
- מייבשים את השקופיות במהירות עם ירידה אחת ב-70% EtOH, 80% EtOH ו-100% EtOH.
- מקם את השקופיות בקסילן למשך דקה אחת כדי לנקות את השקופיות.
- החל מדיית הרכבה וכיסוי להדמיה.
הערה: לצורך אנליזה מולקולרית, ניתן לבודד RNA וחלבון מהקלוס. נתחו בזהירות את השריר תחת היקף ניתוח והפרידו את היבלת מהעצם הבסיסית באמצעות אזמל.
5. מיקרו-CT
הערה: בשלבים מאוחרים יותר של הריפוי, ניתן לבצע microCT כדי לדמות ולכמת את המינרליזציה ביבלת הקשה ואת פער השבר. בעכברי C57BL/6J, ה-callus בדרך כלל עובר מינרליזציה וניתן לזיהוי על-ידי microCT לאחר 10 ימים לאחר השבר (dpf) (איור 2C).
- תקן את עצם הירך בפורמלין נייטרלי ב-10% נייטרלי ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה : ניתן לבצע MicroCT על אותם עצם הירך המשמשים להיסטולוגיה כל עוד זה נעשה לפני דקלקיפיקציה של EDTA (שלב 4.3). בעת שימוש באותן עצם הירך עבור שתי הטכניקות, בצע microCT, לאחזר את הדגימות ולעבור לשלב 4.3. - שטפו את הדגימות הקבועות במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) ואחסנו ב-70% EtOH.
- בצע microCT עם גודל ווקסל איזוטרופי של 7 מיקרומטר ברמת אנרגיה של 55 kVP ועוצמה של 145 μA (ראה טבלת חומרים).
- מתארים את פרוסות ה-microCT כך שיכללו את ה-callus ולא יכללו את עצם קליפת המוח.
הערה: ככל שה-callus נעשה יותר מינרליזציה עם הזמן, ניתן להתאים את הסף כדי להמחיש ולמדוד את נפח ה-callus בשלבים שונים. - קבל את נפח העצם הכלול בקווי המתאר של ה- callus כמדידה של נפח ה- callus.
הערה: ניתן למדוד את פער השבר ישירות על פרוסות ה- microCT כמרחק שתופסת ההפסקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעכברי C57BL/6J, ניתוח מוצלח משלים את שלבי הריפוי שהוזכרו קודם לכן, ללא כמעט תגובה דלקתית מקומית או מעורבות פריוסטאלית בעצם הירך הקונטרה-צדדית המופעלת על ידי בושה. המטומה נוצרת כמה שעות לאחר הניתוח, והפריוסטאום מופעל כדי לגייס אבות שלד לכונדרוגנזה. ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות תאים שונות, כגון Prx1+ mesenchymal progenitors, במהלך תהליך התיקון באמצעות מודלים של עכברי דיווח פלואורסצנטיים הזמינים באופן מסחרי (איור 3). לאחר 5 ימים לאחר השבר (dpf), ניתן להשתמש בכתם כחול אלקיאני כדי לדמיין את היבלת הרכה ולאחר מכן לכמת את אזור הסחוס (איור 2A,B). מינרליזציה ניתנת לזיהוי על ידי microCT ב-28 dpf (איור 2C). נפח היבלת המינרלית, המרחק של מרווח השבר וחוזק העצם הנמדד על ידי בדיקות מכניות משמשים בדרך כלל כתוצאות הניתנות לכימות של תיקון השבר. שינוי גנטי או התערבות תרופתית יכולים לשנות את מהלך ההחלמה, ולכן מומלץ לבצע מחקר במסלול זמן לאפיון שברים בשלבים שונים של תיקון. ניתן לנתח את כל הקאלוס לצורך אנליזה מולקולרית ופיר העצם הקונטרהלטרלי יכול לשמש כבקרה. אם קצות השבר אינם מיושרים או מאובטחים כראוי עם הסיכה, התמונות המתקבלות יציגו חוסר בהיווצרות יבלות בכל או בצד אחד של אתר השבר (איור 4).
איור 1: שבר והחדרה של הסיכה המייצבת. (A) ריבוע מגולח על רגלו הימנית של עכבר C57BL/6J. (B) לאחר ביצוע חתך בעור ובחיתולית, מלקחיים מעוקלים מאובטחים מתחת לעצם הירך כדי להפריד בין השריר, העור והעצם. (C) לאחר ביצוע החתך נוצרים שני קצוות שבר: החלק הפרוקסימלי של עצם הירך המחובר לעצם הירך והחלק הדיסטלי המחובר לברך. מחט ההנחיה (ירוקה) מוכנסת לחלק הדיסטלי ונדחפת דרך מפרק הברך. (ד) מחט ההנחיה מוסרת מהחלק הדיסטלי, מוכנסת לחלק הפרוקסימלי, ונדחפת דרך מפרק הירך. (E) הסיכה המייצבת (מחט אפורה) מוכנסת לתוך המחט המנחה הבולטת ממפרק הירך. (F) הסיכה המייצבת נדחפת דרך החלק הפרוקסימלי, לתוך החלק הדיסטלי, ודרך מפרק הברך באמצעות הנתיב שנעשה על ידי מחט ההנחיה ב- C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: היסטולוגיה ומיקרו-CT של שבר עצם הירך. (A) מקטעי פרפין קבועים פורמלין של שברים בעצם הירך נאספו ב-5, 10 ו-28 dpf והוכתמו ב-Alcian Blue/Eosin/Orange G. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) שטח הסחוס כומת באמצעות תוכנות ImageJ ב-5, 10 ו-28 dpf. (C) ב-28 dpf נצפתה מינרליזציה, וניתן היה למדוד את נפח היבלות ואת פער השבר על ידי microCT. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר. הנתונים מוצגים כ- SEM ממוצע ±. נפח היבלות המינרלי נמדד על ידי קווי מתאר סביב עצם קליפת המוח באתר השבר. האזור האפור הכהה תוחם את היבלת המינרלית בתמונה, בעוד שעצם קליפת המוח (אפור בהיר) אינה נכללת במדידה. הנתונים מוצגים כ- Mean ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מודל כתב פלואורסצנטי המשמש להדמיית התרחבות של תאי Prx1+ פריוסטאליים לאחר השבר. Prx1CreER; עכברי Rosa26tdTomato הוזרקו מדי יום במשך חמישה ימים עם משקל גוף של 80 מ"ג/ק"ג טמוקסיפן כדי לגרום לביטוי tdTomato. שלושה ימים לאחר הזריקה הסופית, החל שבר בעצם הירך, ועכברים הוקרבו ב-7 או 14 dpf כדי לעקוב אחר המקומות שבהם תאים המבטאים Prx1 וצאצאיהם (Prx1+) ממוקמים בתוך קלוס השבר והפריוסטאום המורחב. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: דוגמה לריפוי לא סדיר עקב בעיות כירורגיות. קצות השבר לא היו מיושרים כראוי והסיכה המייצבת נוקבה דרך החלק הפרוקסימלי של עצם הירך בדוגמה זו. טעויות אלה גרמו להיווצרות קאלוס שבה עצם הירך נוקבה (תיבה צהובה) ולא באתר החתך. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ משלים 1: הרכב הפתרונות הנדרשים להיסטולוגיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל הפציעה המפורט בפרוטוקול זה מקיף את כל ארבעת השלבים המשמעותיים שנצפו במהלך ריפוי שברים ספונטניים, כולל (1) תגובה פרו-דלקתית עם היווצרות ההמטומה, (2) גיוס אבות השלד מהפריוסטאום ליצירת הקלוס הרך, (3) מינרליזציה של הקלוס על ידי אוסטאובלסטים ו-(4) שיפוץ העצם על ידי אוסטאוקלסטים.
ההליך הכירורגי המתואר בכתב יד זה מותאם לעכברים בוגרים בני 12 שבועות לפחות. מחט בגודל 27 גרם x 1/4 (0.4 מ"מ x 30 מ"מ) משמשת כסיכה המייצבת מכיוון שהיא הגודל האידיאלי לרוחב חלל מח העצם בגיל זה. במידת הצורך, ניתן לתקן את הפרוטוקול עבור בעלי חיים צעירים יותר אם נעשה שימוש בסיכת מייצב דקה יותר. סיכת הייצוב היא חלק חיוני בהצלחת הניתוח, שכן ידוע כי חוסר יציבות משפיע באופן משמעותי על ריפוי השברים16. שיטות ייצוב אחרות נבדקו וכולן מגיעות עם יתרונותיהן ומגבלותיהן 17,18,19. יש לבחור את הייצוב האידיאלי על סמך שאלת המחקר ומטרת הניסוי. מגבלה אחת של הייצוב המתואר כאן היא שהסיכה עוברת דרך לוחות הצמיחה והמפרקים. אם התרומה של סחוס המפרק או צלחת הגדילה מדאיגה, אנו מציעים לשקול שיטה מייצבת אחרת.
שונות בטכניקה כירורגית ובין בעלי חיים היא דאגה בעת ביצוע ניתוח זה. לכן, מומלץ להשתמש במספרים רבים, במיוחד עבור קריאות כמותיות, ולהשוות סוגים דומים של שברים בין קבוצות. חשוב מאוד לאבטח את מקטעי עצם הירך הקרובים זה לזה כדי למנוע מרווחים של יותר מ-2 מ"מ. השתנות הפערים בין המקטעים יכולה להשפיע במידה ניכרת על גודל היבלת ועל עיתוי התיקון. גם הסעיפים צריכים להיות מיושרים כראוי. שברים רופפים ולא מתואמים יגרמו לשונות משמעותית יותר בין דגימות ועלולים לפגוע בריפוי.
נשיאת משקל היא גם חיונית לתזמון ריפוי העצם ויכולה לגרום לשונות בין עכברים. רוב העכברים שמים משקל מינימלי על הרגל הפצועה כמה שעות לאחר הניתוח, אך אמורים ללכת כרגיל עד למחרת. אימות שהעכבר נע כרגיל והעומס מפוזר באופן שווה על שתי הרגליים הוא חיוני, במיוחד כאשר משתמשים בעצם הירך הקונטרה-צדדית כבקרה המופעלת על ידי שיימינג. בנוסף, הניתוח יכול לגרום לדלקת מערכתית המשפיעה על הרגל הקונטרה-צדדית. לכן מומלץ להשוות את עצם הירך המופעלת על ידי שומה לעכברים שאינם מופעלים בעת ביסוס טכניקה זו. בקרות שאינן מופעלות עשויות להיות עדיפות גם לתוצאות הניתנות לכימות כגון השפעות על RNA או על ביטוי חלבונים.
עקביות של גיאומטריית השבר יכולה להיות מאתגרת עם שיטות אחרות20, אך שימוש במסור מאפשר שליטה רבה יותר על המנתח ומקל על השונות בשברים הבאים. גישת המסור שימשה גם ליצירת שברים מטאפיזיים של עצם הירך של העכבר הפרוקסימלי בהצלחה21.
לעתים רחוקות נצפים הבדלים בין עכברים זכרים ונקבות בתגובתם לריפוי שברים. עם זאת, מין עשוי להפוך לגורם עם גיל והתערבות בסמים, ולכן מומלץ מאוד להשוות בעלי חיים מאותו המין או לבצע נתונים סטטיסטיים כדי לחקור הבדלי מין לפני שילוב דגימות. יתר על כן, פרוטוקול זה תוכנן עבור עכברי C57BL6/J. חוקרים המשתמשים בזני עכברים אחרים צריכים להשוות ריפוי בעכברים זכרים ונקבות כדי לזהות הבדלים בין המינים.
אנו מאמינים שניתוח שבר עצם הירך הזה הוא מודל יעיל לסיכום שלבי הריפוי המשמעותיים בעכברים וניתן להשתמש בו כדי לבחון את ההשפעות של שינויים גנטיים או התערבויות טיפוליות על התאוששות משברים בבני אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ויקי רוזן על התמיכה הכספית וההכוונה בפרויקט. אנו רוצים גם להודות לצוות הווטרינרי וה-IACUC בבית הספר לרפואה של הרווארד על התייעצות בנוגע לטכניקה סטרילית, רווחת בעלי חיים והחומרים המשמשים לפיתוח פרוטוקול זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation. , Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019).
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V.
- Holmes, D.
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al.
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
