Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لإجراء الكسور على الفئران البالغة ومراقبة عملية الشفاء.
Abstract
إصلاح الكسر هو وظيفة أساسية للهيكل العظمي الذي لا يمكن نمذجته بشكل موثوق في المختبر. نموذج إصابة الفأر هو نهج فعال لاختبار ما إذا كان الجين أو المنتج الجيني أو الدواء يؤثر على إصلاح العظام لأن عظام الفئران تلخص المراحل التي لوحظت أثناء التئام الكسور البشرية. عندما يكسر الفأر أو الإنسان عظما ، تبدأ استجابة التهابية ، ويتم تنشيط السمحاق ، وهو مكان للخلايا الجذعية يحيط بالعظم نفسه ، ويتوسع. ثم تتمايز الخلايا المقيمة في السمحاق لتشكيل الكالس الناعم الوعائي. يحدث الانتقال من الكالس الناعم إلى الكالس الصلب عندما تتمايز الخلايا السلفية الهيكلية المجندة إلى خلايا معدنية ، ويؤدي جسر النهايات المكسورة إلى اتحاد العظام. ثم يخضع الكالس المعدني لإعادة التشكيل لاستعادة الشكل الأصلي وبنية العظم الملتئم. تمت دراسة التئام الكسور في الفئران باستخدام نماذج إصابة مختلفة. ومع ذلك ، فإن أفضل طريقة لتلخيص هذه العملية البيولوجية بأكملها هي اختراق المقطع العرضي لعظم طويل يشمل كلا القشرة. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن إجراء كسر عظم الفخذ المستعرض المستقر بأمان لتقييم الشفاء في الفئران البالغة. كما يتم توفير بروتوكول جراحي يتضمن تقنيات الحصاد والتصوير التفصيلية لتوصيف المراحل المختلفة من التئام الكسور.
Introduction
تحدث الكسور ، والفواصل في استمرارية سطح العظام ، في جميع شرائح السكان. تصبح شديدة في الأشخاص الذين لديهم عظام هشة بسبب الشيخوخة أو المرض ، ومن المتوقع أن تتجاوز تكاليف الرعاية الصحية لكسور الهشاشة 25 مليار دولار في 5 سنوات1،2،3،4،5. سيكون فهم الآليات البيولوجية المشاركة في إصلاح الكسور نقطة انطلاق في تطوير علاجات جديدة تهدف إلى تعزيز عملية الشفاء. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أنه عند الكسر ، تحدث أربع خطوات مهمة تمكن العظام من الشفاء: (1) تكوين الورم الدموي. (2) تشكيل الكالس الغضروفي الليفي. (3) تمعدن الكالس الناعم لتشكيل العظام ؛ و (4) إعادة تشكيل العظام الملتئمة 6,7. يتم تنشيط العديد من العمليات البيولوجية لشفاء الكسر بنجاح. أولا ، تبدأ الاستجابة الحادة المؤيدة للالتهابات مباشرة بعد الكسر 6,7. بعد ذلك ، يتم تنشيط السمحاق ويتوسع ، وتتمايز الخلايا السمحاق إلى خلايا غضروفية لتشكيل الكالس الغضروفي الذي ينمو لملء الفجوة التي خلفتها شرائح العظام المعطلة6،7،8،9. تغزو الخلايا العصبية والوعائية الكالس المتشكل حديثا لتوفير خلايا إضافية وجزيئات إشارات ضرورية لتسهيل الإصلاح6،7،8،9،10. بالإضافة إلى المساهمة في تكوين الكالس ، تتمايز الخلايا السمحاق أيضا إلى خلايا عظمية تضع عظاما منسوجة في الكالس الجسر. وأخيرا، تعيد الخلايا العظمية تشكيل العظم المشكل حديثا للعودة إلى شكله الأصلي وهيكله الرقائقي7،8،9،10،11. طورت العديد من المجموعات نماذج الماوس لإصلاح الكسور. أحد نماذج الكسور السابقة والأكثر استخداما في الفئران هو نهج أينهورن ، حيث يتم إسقاط الوزن على الساق من ارتفاع محدد12. عدم السيطرة على الزاوية والقوة المطبقة للحث على الكسر يخلق الكثير من التباين في موقع وحجم انقطاع العظام. في وقت لاحق ، فإنه يؤدي إلى اختلافات في استجابة التئام الكسور المحددة التي لوحظت. الأساليب الشائعة الأخرى هي التدخل الجراحي لإنتاج عيب أحادي القشرة الظنبوبي أو كسور الإجهاد ، وهي إجراءات تحفز استجابات الشفاء الأكثر اعتدالا نسبيا10,13. يرجع التباين في هذه النماذج في المقام الأول إلى الشخص الذي يجري الإجراء14.
هنا ، يسمح نموذج مفصل لإصابة عظم الفخذ بالتحكم في الكسر لتوفير إصابة قابلة للتكرار والسماح بالتقييم الكمي والنوعي لإصلاح كسر عظم الفخذ. على وجه التحديد ، يتم إدخال اختراق كامل في عظم الفخذ للفئران البالغة ويستقر في نهايات الكسر لحساب الدور الذي يلعبه التحميل البدني في التئام العظام. كما يتم توفير طرق حصاد الأنسجة وتصوير الخطوات المختلفة لعملية الشفاء باستخدام علم الأنسجة والتصوير المقطعي المحوسب (microCT) بالتفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في منطقة هارفارد الطبية. تم استخدام الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا (ذكورا وإناثا) في هذا البروتوكول. C57BL/6J الفئران الذكور والإناث تحقيق ذروة كتلة العظام حوالي 12 أسبوعا من العمر مع عظم الفخذ واسعة بما يكفي لتناسب دبوس الاستقرار، مما يجعلها سلالة مناسبة لاستخدامها لهذا البروتوكول15.
1. التحضير للجراحة
- قم بتعقيم المعدات الجراحية ، بما في ذلك المقص الجراحي ، والملقط المستقيم ، والملقط المنحني ، والمشابك الجراحية ، وعجلة القطع الماسية (انظر جدول المواد) لتقليل خطر العدوى.
- ضع قفص فأر نظيف على وسادة تدفئة لتسهيل التعافي بعد الجراحة. اضبط وسادة الحرارة للوصول إلى درجة حرارة تتراوح بين 37-45 درجة مئوية.
- ضع الفأر تحت التخدير باستخدام غرفة الأيزوفلوران. اضبط تدفق الأكسجين الحثي عند 2 لتر / دقيقة ، وتحريض الأيزوفلوران عند 2-4٪ ، وأكسجين مخروط الأنف عند 2 لتر / دقيقة ، وصيانة الأيزوفلوران هو 1.4٪.
- تأكد من أن تنفس الماوس مستقر ولا يستجيب لقرصة إصبع القدم. ضع طبقة رقيقة من مرهم العيون على كل عين لمنع خدش القرنية. انقل الماوس إلى وسادة معقمة وحافظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف لتوصيل الأيزوفلوران بشكل مستمر بنفس المعدل كما في الخطوة 1.3.
ملاحظة: يوصى باستخدام الفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا أو أكبر لأن عظم الفخذ من الفئران الأصغر سنا قد يكون رقيقا جدا بحيث لا يمكنه استيعاب دبوس التثبيت. - حقن الفأر تحت الجلد بوزن جسم 0.05 مغ/كغ من البوبرينورفين بطيء الإطلاق (انظر جدول المواد).
- باستخدام أداة تشذيب كهربائية ، احلق مربعا 2 × 2 سم على كلا الفخذين يتوافق مع موقع عظم الفخذ.
- قم بتطهير المنطقة المحلوقة باستخدام شاش معقم أو مسحات لنشر طبقة من اليود تليها شطف بنسبة 70٪ من الإيثانول (الشكل 1A).
2. الجراحة
- باستخدام مشرط معقم ، قم بعمل شق 5 مم في المنطقة المحلوقة والمطهرة وقشر الجلد لكشف اللفافة الأساسية.
- استخدم ملقط مستقيم ومقص ناعم للإمساك بدقة باللفافة التي تغطي عظم الفخذ مباشرة وقطعها لفضح العضلات. قطع 5 مم من اللفافة يكفي للوصول إلى العضلات الأساسية.
- باستخدام زوج واحد من الملقط المستقيم ، افصل العضلات بلطف عن عظم الفخذ مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة.
- بمجرد أن يصبح عظم الفخذ مرئيا ، حرك الملقط المنحني أسفل عظم الفخذ بين العضلات والعظم المنفصلين. دع الملقط يفتح ببطء للحفاظ على فصل العضلات وتأمين عظم الفخذ لتسهيل القطع النظيف.
ملاحظة: يجب أن يظل عظم الفخذ مكشوفا ومنفصلا عن العضلات والجلد عندما لا يتم تثبيت الملقط ، كما هو موضح في الشكل 1B. - قم بإجراء قطع عرضي في منتصف عمود عظم الفخذ باستخدام منشار محمول باليد على إعداد الطاقة المنخفضة (انظر جدول المواد للاطلاع على الشفرة ومجموعة الأدوات الدوارة المستخدمة).
ملاحظة: بمجرد قطع عظم الفخذ بالكامل ، يتم إنشاء نهايتين للكسر: القسم القريب (المتصل بعظم الورك) والقسم البعيد (المتصل بالركبة ، المعروف أيضا باسم مفصل الخنق). تجنب قطع عظم الفخذ في حركة واحدة. بدلا من ذلك ، اجعل 3-5 تمريرات حتى يتم قطع عظم الفخذ بالكامل. هذا أمر بالغ الأهمية لتجنب ارتفاع درجة حرارة الأنسجة المحيطة وتوليد حطام عظمي كبير ، مما يؤثر سلبا على الشفاء. - أدخل إبرة توجيه (23 جم × 1 TW IM، 0.6 مم × 25 مم) (انظر جدول المواد) في تجويف النخاع في القسم البعيد. استخدم الأصابع لثني الإبرة بلطف أثناء الدفع للخيط عبر مفصل الركبة (الشكل 1C).
- قم بإزالة إبرة التوجيه من الطرف البعيد وكرر ذلك على الطرف القريب ، باستخدام نفس الحركة الملتوية اللطيفة لدفع إبرة التوجيه عبر مفصل الورك. اترك إبرة الدليل في الطرف القريب ، مع ظهور طرفها من الجلد (الشكل 1D).
ملاحظة: لتحقيق الاستقرار في نهايات الكسر، تم استخدام إبرة توجيه لأول مرة لإنشاء مسار عبر نهايات الكسر، ثم تم ربط دبوس تثبيت عبر هذا المسار لتأمين نهايات الكسر14.
- قم بإزالة إبرة التوجيه من الطرف البعيد وكرر ذلك على الطرف القريب ، باستخدام نفس الحركة الملتوية اللطيفة لدفع إبرة التوجيه عبر مفصل الورك. اترك إبرة الدليل في الطرف القريب ، مع ظهور طرفها من الجلد (الشكل 1D).
- أدخل دبوس التثبيت (إبرة، 27 جم × 1 1/4، 0.4 مم × 30 مم) (انظر جدول المواد) في طرف إبرة التوجيه (الشكل 1E). ادفع بلطف حتى يدخل دبوس التثبيت أثناء خروج إبرة التوجيه من تجويف النخاع في الطرف القريب.
- تخلص من إبرة التوجيه. استخدم الملقط لتثبيت الطرف البعيد ومحاذاته مع الطرف القريب والاستمرار في ربط دبوس التثبيت عبر تجويف النخاع البعيد حتى يخرج من مفصل الركبة باستخدام المسار المصنوع في 2.6 (الشكل 1F).
ملاحظة: يجب أن يكون دبوس التثبيت بارزا الآن من مفاصل الورك والركبة.
- تخلص من إبرة التوجيه. استخدم الملقط لتثبيت الطرف البعيد ومحاذاته مع الطرف القريب والاستمرار في ربط دبوس التثبيت عبر تجويف النخاع البعيد حتى يخرج من مفصل الركبة باستخدام المسار المصنوع في 2.6 (الشكل 1F).
- باستخدام المشبك الجراحي ، اسحب طرف الدبوس لتقريب الأقسام القريبة والبعيدة من بعضها البعض ، بحيث بالكاد تلمس. أعد محاذاة نهايات الكسر بملقط إذا لزم الأمر، وقم بطي نهايات دبوس التثبيت باتجاه موقع الكسر باستخدام المشبك الجراحي (انظر جدول المواد).
- قم بإزالة البلاستيك من قاعدة الإبرة باستخدام قواطع الأسلاك. باستخدام المشبك ، قم بلف طرفي الدبوس حتى يكونا حادين لتجنب تلف الأنسجة الداخلية.
ملاحظة: يتم الآن قفل نهايات الكسر في مكانها بحيث يمكن للفأر وضع وزن على الساق المصابة. يتم تأمين الدبوس إذا كانت نهايات الكسر غير قادرة على الانفصال. يمكن أيضا استخدام قاطع الأسلاك لتخفيف النهايات. يجب أن يبقى دبوس التثبيت في مكانه طوال مدة الدراسة حتى يتم القتل الرحيم للماوس. من المرجح أن تؤدي محاولات إزاحة الدبوس إلى زعزعة استقرار استجابة الكسر والتسبب في ضرر للحيوان. يمكن إزالة الدبوس عند التشريح.
- قم بإزالة البلاستيك من قاعدة الإبرة باستخدام قواطع الأسلاك. باستخدام المشبك ، قم بلف طرفي الدبوس حتى يكونا حادين لتجنب تلف الأنسجة الداخلية.
- استخدم ملقط مستقيم لإعادة وضع العضلات على عظم الفخذ. باستخدام ملقط منحني ، قرصة نهايات الجلد معا وإغلاق الفتحة باستخدام مشابك الجرح.
ملاحظة: لا تغلق الجلد بإحكام شديد باستخدام المشابك وإلا فإن الماوس سيتجنب وضع وزن على هذه الساق. الحد من التحميل المادي أثناء الشفاء يمكن أن يؤخر عملية الشفاء. - كرر الخطوات من 2.2 إلى 2.4 على الساق الأخرى وأغلق الجرح دون إجراء كسر عظم الفخذ.
ملاحظة: يعمل عظم الفخذ الذي يتم تشغيله بشكل صوري كعنصر تحكم مضاد. - اسحب التعرض للإيسوفلوران ، وضع الماوس في القفص الساخن ، وتأكد من استعادة وعيه في غضون 10-15 دقيقة.
- راقب نشاط الماوس وموقع شقه يوميا لمدة 5 أيام بعد الجراحة بحثا عن علامات الضيق أو العدوى.
ملاحظة: إذا أظهر الحيوان علامات الألم ، ولا يأكل ، و / أو يتردد في المشي على أطرافه الخلفية ، فاستشر الموظفين البيطريين وإعطاء مسكن إضافي. - قم بإزالة مقاطع الجرح بعد 10 أيام من الجراحة.
ملاحظة: إذا لم يبدو أن الجرح قد أغلق بعد 10 أيام ، فاستشر الشخص البيطري و IACUC قبل إزالة المقاطع.
3. حصاد الأنسجة
- القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق CO2 يليه خلع عنق الرحم.
ملاحظة: يتسق هذا الإجراء مع الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية. - باستخدام المقص والملقط ، قم بإزالة الجلد من ساقي الفأر ، وخلع رأس الفخذ من عظم الورك ، وقطع العضلات المجاورة لتحرير الساق.
ملاحظة: تجنب إزالة الكثير من العضلات حول عظم الفخذ حيث يمكن إزاحة الكالس أو تلفه. - تجنب دبوس التثبيت ، وقطع من خلال مفصل الركبة لفصل عظم الفخذ عن الساق.
- تشريح حول الأجزاء البعيدة والقريبة من عظم الفخذ لفضح نهايات دبوس التثبيت.
- باستخدام قاطع سلك صلب ، قم بقطع الأطراف الحادة المطوية للدبوس بحيث يبقى الجزء المستقيم فقط من الدبوس. استخدم الملقط لتحريك دبوس التثبيت ببطء ولطف خارج عظم الفخذ.
ملاحظة: إذا لم ينزلق الدبوس بسهولة، فلا تستخدم القوة لأن ذلك قد يؤدي إلى إزاحة الكالس وإتلاف العينة. بدلا من ذلك ، حاول تدوير الدبوس وإزالته بدقة. قد تكون إزالة الدبوس أسهل أيضا بعد التثبيت.
4. علم الأنسجة - ألسيان الأزرق / Eosin / البرتقالي G تلطيخ
ملاحظة: يستخدم تلطيخ Alcian Blue / Orange G / Eosin بشكل روتيني لتصور الغضروف (الأزرق) والعظم (الوردي). يمكن تحديد مساحة الغضروف كميا كنسبة من إجمالي مساحة الكالس (الشكل 2A ، B).
- إصلاح عظم الفخذ في 10٪ محايد الفورمالين المخزن مؤقتا بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- اغسل العينات الثابتة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- ضع العينات في 0.5M EDTA ، الرقم الهيدروجيني 8.0 على شاكر دوار ببطء لمدة 2 أسابيع. قم بتغيير حل EDTA كل يومين لضمان إزالة الكلس بكفاءة.
ملاحظة: لا يلزم وجود دورة محددة في الدقيقة للشاكر. تأكد من تدفق السائل في الحاوية لتغطية جميع العينات. يمكن اختبار إزالة الكلس الكاملة عن طريق الأشعة السينية لعظم الفخذ. - لمعالجة عينات تضمين البارافين ، احتضنها في المحاليل التالية (1 ساعة لكل منها): 70٪ EtOH ، 95٪ EtOH ، 100٪ EtOH ، 100٪ EtOH ، Xylene ، Xylene ، Paraaffin ، Paraffin.
- تضمين العينات في البارافين للتقسيم.
- قطع 5-7 ميكرومتر أقسام طولية سميكة من عظم الفخذ المكسور باستخدام ميكروتوم.
- إزالة paraffinize الأقسام عن طريق احتضانها في 2 حمامات من Xylene (5 دقائق لكل منهما).
- أعد ترطيب الأقسام عن طريق احتضان تدرج الإيثانول التالي (2 دقيقة لكل منهما): 100٪ EtOH ، 100٪ EtOH ، 80٪ EtOH ، 70٪ EtOH.
- ضع الشرائح في ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
- اصنع محاليل من الأزرق السياني والكحول الحمضي وماء الأمونيوم والإيوسين / البرتقالي G لعلم الأنسجة كما هو مذكور في الملف التكميلي 1.
ملاحظة: يجب أن تكون الأحجام المقترحة لكل حل كافية لغمر الشرائح بالكامل للتلطيخ. - ضع الشرائح في الكحول الحمضي لمدة 30 ثانية واحتضنها باللون الأزرق السياني لمدة 40 دقيقة.
- اغسل بلطف تحت الصنبور الجاري حتى يصبح الماء صافيا لمدة 2 دقيقة.
- اغمس الشرائح بسرعة في الكحول الحمضي لمدة 1 ثانية.
- شطف كما هو موضح في الخطوة 4.9.
- حضانة في ماء الأمونيوم لمدة 15 ثانية.
- شطف كما هو موضح في الخطوة 4.9.
- ضع في 95٪ EtOHلمدة 1 دقيقة واحتضنه في Eosin/Orange G لمدة 90 ثانية.
- جفف الشرائح بسرعة مع انخفاض واحد في 70٪ EtOH، 80٪ EtOH و 100٪ EtOH.
- ضع الشرائح في Xylene لمدة 1 دقيقة لمسح الشرائح.
- قم بتطبيق وسائط التركيب وغطاء للتصوير.
ملاحظة: بالنسبة للتحليل الجزيئي ، يمكن عزل الحمض النووي الريبي والبروتين من الكالس. تشريح العضلات بعناية تحت نطاق تشريح وفصل الكالس عن العظم الأساسي باستخدام مشرط.
5. ميكرو سي تي
ملاحظة: في المراحل اللاحقة من الشفاء ، يمكن إجراء microCT لتصوير وقياس التمعدن في الكالس الصلب وفجوة الكسر. في الفئران C57BL/6J ، عادة ما يتم تمعدن الكالس ويمكن اكتشافه بواسطة microCT بعد 10 أيام بعد الكسر (dpf) (الشكل 2C).
- إصلاح عظم الفخذ في 10٪ محايد الفورمالين المخزن مؤقتا بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن إجراء التصوير المقطعي المحوسب المجهري على نفس عظم الفخذ المستخدم في علم الأنسجة طالما أنه يتم قبل إزالة الكلس من EDTA (الخطوة 4.3). عند استخدام نفس عظم الفخذ لكلتا التقنيتين ، قم بإجراء microCT ، واسترجع العينات وانتقل إلى الخطوة 4.3. - اغسل العينات الثابتة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وخزنه في 70٪ EtOH.
- قم بإجراء microCT بحجم فوكسل متساوي الخواص يبلغ 7 ميكرومتر عند مستوى طاقة 55 kVP وكثافة 145 μA (انظر جدول المواد).
- حدد ملامح شرائح microCT لتشمل الكالس واستبعاد العظم القشري.
ملاحظة: عندما يصبح الكالس أكثر تمعدنا مع مرور الوقت، يمكن تعديل العتبة لتصور وقياس حجم الكالس في مراحل مختلفة. - الحصول على حجم العظام الموجود في ملامح الكالس كقياس لحجم الكالس.
ملاحظة: يمكن قياس فجوة الكسر مباشرة على شرائح microCT كمسافة يشغلها الكسر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الفئران C57BL/6J ، تكمل الجراحة الناجحة خطوات الشفاء المذكورة سابقا مع استجابة التهابية محلية قليلة أو معدومة أو مشاركة سمحاق في عظم الفخذ المضاد الذي يتم تشغيله بشكل صوري. يتشكل ورم دموي بعد ساعات قليلة من الجراحة ، ويتم تنشيط السمحاق لتجنيد أسلاف الهيكل العظمي لتكوين الغضروف. يمكن تتبع مجموعات الخلايا المختلفة ، مثل أسلاف اللحمة المتوسطة Prx1 + ، أثناء عملية الإصلاح باستخدام نماذج فأر مراسل الفلورسنت المتاحة تجاريا (الشكل 3). في 5 أيام بعد الكسر (dpf) ، يمكن استخدام تلطيخ Alcian Blue لتصور الكالس الناعم وبالتالي تحديد مساحة الغضروف (الشكل 2A ، B). يمكن الكشف عن التمعدن بواسطة microCT عند 28 dpf (الشكل 2C). يشيع استخدام حجم الكالس المعدني ومسافة فجوة الكسر وقوة العظام التي تم قياسها بواسطة الاختبارات الميكانيكية كنتائج قابلة للقياس الكمي لإصلاح الكسر. يمكن أن يؤدي التعديل الوراثي أو التدخل الدوائي إلى تغيير مسار الشفاء ، لذلك يوصى بإجراء دراسة زمنية لتحديد خصائص الكسور في مراحل مختلفة من الإصلاح. يمكن تشريح الكالس بأكمله للتحليل الجزيئي ويمكن استخدام عمود العظام المقابل كعنصر تحكم. إذا لم تكن نهايات الكسر محاذاة أو مؤمنة بشكل كاف مع الدبوس ، فستظهر الصور الناتجة عدم وجود تكوين الكالس على كل أو جانب واحد من موقع الكسر (الشكل 4).
الشكل 1: كسر وإدخال دبوس التثبيت . (أ) يتم حلق مربع على الساق اليمنى للماوس C57BL/6J. (ب) بعد إجراء شق في الجلد واللفافة ، يتم تثبيت ملقط منحني أسفل عظم الفخذ لفصل العضلات والجلد والعظام. (ج) بعد إجراء القطع ، يتم إنشاء نهايتين للكسر: القسم القريب من عظم الفخذ المتصل بعظم الورك والقسم البعيد المتصل بالركبة. يتم إدخال إبرة التوجيه (الخضراء) في القسم البعيد ودفعها عبر مفصل الركبة. (د) تتم إزالة إبرة التوجيه من القسم البعيد ، وإدخالها في القسم القريب ، ودفعها عبر مفصل الورك. (ه) يتم إدخال دبوس التثبيت (الإبرة الرمادية) في إبرة التوجيه البارزة من مفصل الورك. (F) يتم دفع دبوس التثبيت عبر القسم القريب ، إلى القسم البعيد ، ومن خلال مفصل الركبة باستخدام المسار الذي تقوم به إبرة التوجيه في C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: علم الأنسجة والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق لكسر عظم الفخذ. (أ) تم جمع أقسام البارافين الثابتة بالفورمالين من كسور عظم الفخذ عند 5 و 10 و 28 dpf وملطخة بشريط مقياس Alcian Blue / Eosin / Orange G. Scale = 500 ميكرومتر. (ب) تم تحديد مساحة الغضروف كميا باستخدام برنامج ImageJ عند 5 و 10 و 28 dpf. (ج) عند 28 نقطة في الدقيقة، لوحظ التمعدن، ويمكن قياس حجم الكالس وفجوة الكسر بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الميكروي. شريط المقياس = 1000 ميكرومتر. البيانات المعروضة على أنها متوسط ± SEM. تم قياس حجم الكالس المعدني عن طريق الالتفاف حول العظم القشري في موقع الكسر. تحدد المنطقة الرمادية الداكنة الكالس المعدني على الصورة ، بينما لا يتم تضمين العظم القشري (الرمادي الفاتح) في القياس. البيانات المعروضة على أنها متوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نموذج مراسل الفلورسنت المستخدم لتصور توسع الخلايا السمحاق Prx1+ بعد الكسر. Prx1CreER; تم حقن الفئران Rosa26 tdTomato يوميا لمدة خمسة أيام مع 80 ملغ / كغ من وزن الجسم من تاموكسيفين للحث على التعبيرtdTomato . بعد ثلاثة أيام من الحقن النهائي ، بدأ كسر عظم الفخذ ، وتم التضحية بالفئران عند 7 أو 14 dpf لتتبع مكان وجود الخلايا المعبرة عن Prx1 وذريتها (Prx1 +) داخل الكالس المكسور والسمحاق الموسع. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على الشفاء غير المنتظم بسبب المشكلات الجراحية. لم تتم محاذاة نهايات الكسر بشكل صحيح واخترق دبوس التثبيت القسم القريب من عظم الفخذ في هذا المثال. أدت هذه الأخطاء إلى تكوين الكالس حيث تم ثقب عظم الفخذ (الصندوق الأصفر) بدلا من موقع القطع. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: تكوين الحلول المطلوبة لعلم الأنسجة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يشمل نموذج الإصابة المفصل في هذا البروتوكول جميع الخطوات الأربع الهامة التي لوحظت أثناء التئام الكسور التلقائية ، بما في ذلك (1) الاستجابة المؤيدة للالتهابات مع تكوين الورم الدموي ، (2) تجنيد أسلاف الهيكل العظمي من السمحاق لتشكيل الكالس الناعم ، (3) تمعدن الكالس بواسطة الخلايا العظمية و (4) إعادة تشكيل العظام بواسطة الخلايا العظمية.
تم تحسين الإجراء الجراحي الموصوف في هذه المخطوطة للفئران البالغة التي لا يقل عمرها عن 12 أسبوعا. يتم استخدام إبرة 27 جم × 1 1/4 (0.4 مم × 30 مم) كدبوس تثبيت لأنها الحجم المثالي لعرض تجويف النخاع في هذا العمر. إذا لزم الأمر ، يمكن تعديل البروتوكول للحيوانات الأصغر سنا إذا تم استخدام دبوس تثبيت أرق. دبوس التثبيت هو جزء أساسي من نجاح الجراحة حيث من المعروف أن عدم الاستقرار يؤثر بشكل كبير على التئام الكسور16. تمت مراجعة طرق الاستقرار الأخرى وكلها تأتي مع مزاياها وقيودها 17،18،19. يجب اختيار الاستقرار المثالي بناء على سؤال البحث والهدف التجريبي. أحد قيود الاستقرار الموصوف هنا هو أن الدبوس يمر عبر لوحات النمو والمفاصل. إذا كانت المساهمة من غضروف الصفائح المفصلية أو المرشحة للنمو مثيرة للقلق ، فإننا نقترح التفكير في طريقة أخرى للاستقرار.
التباين في التقنية الجراحية وبين الحيوانات هو مصدر قلق عند إجراء هذه الجراحة. لذلك ، يوصى باستخدام أرقام وافرة ، خاصة بالنسبة للقراءات الكمية ، ومقارنة أنواع مماثلة من الكسور عبر المجموعات. من الأهمية بمكان تأمين أقسام عظم الفخذ بالقرب من بعضها البعض لتجنب الفجوات التي تزيد عن 2 مم. يمكن أن يؤثر التباين في الفجوات بين الأقسام بشكل كبير على حجم الكالس وتوقيت الإصلاح. وينبغي أيضا مواءمة الأقسام بشكل صحيح. ستسبب الكسور الفضفاضة وغير المحاذاة تباينا أكبر عبر العينات وقد تضعف الشفاء.
حمل الوزن أمر بالغ الأهمية أيضا لتوقيت التئام العظام ويمكن أن يؤدي إلى التباين بين الفئران. تضع معظم الفئران الحد الأدنى من الوزن على الساق المصابة بعد ساعات قليلة من الجراحة ولكن يجب أن تمشي بشكل طبيعي بحلول اليوم التالي. يعد التحقق من أن الماوس يتحرك بشكل طبيعي ويتم توزيع الحمل بالتساوي على كلا الساقين أمرا بالغ الأهمية ، خاصة عند استخدام عظم الفخذ المقابل كعنصر تحكم يعمل بشكل صوري. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي الجراحة إلى التهاب جهازي يؤثر على الساق المقابلة. لذلك يوصى بمقارنة عظم الفخذ الذي يتم تشغيله بشكل صوري بالفئران غير العاملة عند إنشاء هذه التقنية. يمكن أن يكون وجود ضوابط غير عاملة أيضا أفضل للنتائج القابلة للقياس الكمي مثل التأثيرات على الحمض النووي الريبي أو تعبير البروتين.
يمكن أن يكون اتساق هندسة الكسر تحديا مع الطرق الأخرى20 ، ولكن استخدام المنشار يسمح بمزيد من التحكم للجراح ويخفف من التباين في الكسور اللاحقة. كما تم استخدام نهج المنشار لإنشاء كسور ميتافيزيقية في عظم الفخذ الفأر القريب بنجاح21.
نادرا ما تلاحظ الاختلافات بين الفئران الذكور والإناث في استجابتها لالتئام الكسور. ومع ذلك ، قد يصبح الجنس عاملا مع العمر والتدخل الدوائي ، لذلك يوصى بشدة بمقارنة الحيوانات من نفس الجنس أو إجراء إحصاءات لاستجواب الاختلافات بين الجنسين قبل الجمع بين العينات. علاوة على ذلك ، تم تصميم هذا البروتوكول للفئران C57BL6 / J. يجب على الباحثين الذين يستخدمون سلالات الفئران الأخرى مقارنة الشفاء في الفئران الذكور والإناث لتحديد أي اختلافات بين الجنسين.
نعتقد أن جراحة كسر عظم الفخذ هذه هي نموذج فعال لتلخيص خطوات الشفاء المهمة في الفئران ويمكن استخدامها لاختبار آثار التعديلات الجينية أو التدخلات العلاجية على استعادة الكسور لدى البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتورة فيكي روزن على الدعم المالي والتوجيه في المشروع. نود أيضا أن نشكر الموظفين البيطريين و IACUC في كلية الطب بجامعة هارفارد على التشاور بشأن التقنية المعقمة ، ورفاهية الحيوان ، والمواد المستخدمة لتطوير هذا البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation. , Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019).
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V.
- Holmes, D.
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al.
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
