Summary
Dit protocol beschrijft een methode om fracturen uit te voeren bij volwassen muizen en het genezingsproces te volgen.
Abstract
Fractuurherstel is een essentiële functie van het skelet die niet betrouwbaar in vitro kan worden gemodelleerd. Een muisletselmodel is een efficiënte benadering om te testen of een gen, genproduct of medicijn botherstel beïnvloedt, omdat muizenbotten de stadia samenvatten die worden waargenomen tijdens de genezing van menselijke fracturen. Wanneer een muis of mens een bot breekt, wordt een ontstekingsreactie geïnitieerd en wordt het botvlies, een stamcelniche rond het bot zelf, geactiveerd en zet het uit. Cellen die zich in het botvlies bevinden, differentiëren vervolgens om een gevasculariseerd zacht eelt te vormen. De overgang van het zachte eelt naar een hard eelt vindt plaats als de gerekruteerde skeletachtige voorlopercellen differentiëren in mineraliserende cellen, en het overbruggen van de gebroken uiteinden resulteert in de botunie. Het gemineraliseerde eelt ondergaat vervolgens een verbouwing om de oorspronkelijke vorm en structuur van het genezen bot te herstellen. Fractuurgenezing is bestudeerd bij muizen met behulp van verschillende verwondingsmodellen. Toch is de beste manier om dit hele biologische proces samen te vatten, het doorbreken van de doorsnede van een lang bot dat beide cortices omvat. Dit protocol beschrijft hoe een gestabiliseerde, transversale femurfractuur veilig kan worden uitgevoerd om genezing bij volwassen muizen te beoordelen. Een chirurgisch protocol met gedetailleerde oogst- en beeldvormingstechnieken om de verschillende stadia van fractuurgenezing te karakteriseren, wordt ook verstrekt.
Introduction
Fracturen, breuken in de continuïteit van het botoppervlak, komen voor in alle segmenten van de bevolking. Ze worden ernstig bij mensen met fragiele botten als gevolg van veroudering of ziekte, en de kosten van fragiliteitsfracturen in de gezondheidszorg zullen naar verwachting in 5 jaar meer dan $ 25 miljard bedragen 1,2,3,4,5. Het begrijpen van de biologische mechanismen die betrokken zijn bij fractuurherstel zou een startpunt zijn bij het ontwikkelen van nieuwe therapieën gericht op het verbeteren van het genezingsproces. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat bij breuk vier belangrijke stappen optreden die bot in staat stellen te genezen: (1) vorming van het hematoom; (2) vorming van een fibrocartilaginous eelt; (3) mineralisatie van het zachte eelt om bot te vormen; en (4) verbouwing van het genezen bot 6,7. Veel biologische processen worden geactiveerd om de breuk met succes te genezen. Eerst wordt een acute pro-inflammatoire reactie geïnitieerd onmiddellijk na een fractuur 6,7. Vervolgens wordt het botvlies geactiveerd en zet het uit, en periostale cellen differentiëren in chondrocyten om een kraakbeen eelt te vormen dat groeit om het gat te vullen dat is achtergelaten door de verstoorde botsegmenten 6,7,8,9. Neurale en vasculaire cellen dringen het nieuw gevormde eelt binnen om extra cellen en signaalmoleculen te leveren die nodig zijn om reparatiete vergemakkelijken 6,7,8,9,10. Naast het bijdragen aan eeltvorming, differentiëren periostale cellen ook in osteoblasten die geweven bot in het overbruggende eelt leggen. Ten slotte hermodelleren osteoclasten het nieuw gevormde bot om terug te keren naar zijn oorspronkelijke vorm en lamellaire structuur 7,8,9,10,11. Veel groepen ontwikkelden muismodellen voor breukherstel. Een van de eerdere en meest gebruikte fractuurmodellen bij muizen is de Einhorn-benadering, waarbij een gewicht vanaf een specifieke hoogte12 op het been wordt gevallen. Het gebrek aan controle over de hoek en de kracht die wordt uitgeoefend om de fractuur te induceren, creëert veel variabiliteit in de locatie en grootte van de botdiscontinuïteit. Vervolgens resulteert het in variaties in de waargenomen specifieke fractuurgenezingsrespons. Andere populaire benaderingen zijn chirurgische interventie om een tibiaal monocorticaal defect of stressfracturen te produceren, procedures die relatief mildere genezingsreacties induceren10,13. Variabiliteit in deze modellen is voornamelijk te wijten aan de persoon die de procedure uitvoert14.
Hier zorgt een gedetailleerd muisdijbeenletselmodel voor controle over de breuk om een reproduceerbare verwonding te bieden en een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van het herstel van dijbeenfracturen mogelijk te maken. In het bijzonder wordt een volledige doorbraak in de dijbenen van volwassen muizen geïntroduceerd en stabiliseert de fractuuruiteinden om rekening te houden met de rol die fysieke belasting speelt bij botgenezing. De methoden voor het oogsten van weefsels en het in beeld brengen van de verschillende stappen van het genezingsproces met behulp van histologie en microcomputed tomografie (microCT) worden ook in detail beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Harvard Medical Area. In dit protocol werden 12 weken oude C57BL/6J-muizen (mannetjes en vrouwtjes) gebruikt. C57BL /6J mannelijke en vrouwelijke muizen bereiken een piekbotmassa rond de leeftijd van 12 weken met dijbenen die breed genoeg zijn om een stabiliserende pin te passen, waardoor ze een geschikte stam zijn om te gebruiken voor dit protocol15.
1. Voorbereiding op de operatie
- Autoclaaf de chirurgische apparatuur, inclusief chirurgische schaar, rechte tang, gebogen tang, chirurgische klemmen en diamantsnijwiel (zie Tabel met materialen) om het risico op infectie te minimaliseren.
- Plaats een schone muizenkooi op een verwarmingskussen om postoperatief herstel te vergemakkelijken. Stel het warmtekussen in op een temperatuur tussen 37-45 °C.
- Plaats de muis onder narcose met behulp van een isofluraankamer. Stel de inductiezuurstofstroom in op 2 L/min, de isofluraaninductie op 2-4%, de onderhoudsneusconzuurstof op 2 L/min en het onderhoudsisofluraan op 1,4%.
- Bevestig dat de ademhaling van de muis stabiel is en dat ze niet reageren op een teenknelpunt. Breng een dunne laag oogheelkundige zalf aan op elk oog om krassen op het hoornvlies te voorkomen. Breng de muis over naar een steriele pad en onderhoud de anesthesie met behulp van een neuskegel om isofluraan continu af te geven met dezelfde snelheid als in stap 1.3.
OPMERKING: Het gebruik van muizen van 12 weken oud of ouder wordt aanbevolen omdat dijbenen van jongere muizen mogelijk te dun zijn om een stabiliserende pin te huisvesten. - Injecteer de muis subcutaan met 0,05 mg/kg lichaamsgewicht buprenorfine met langzame afgifte (zie Tabel met materialen).
- Scheer met behulp van een elektrische trimmer een vierkant van 2 x 2 cm op beide dijen die overeenkomen met de locatie van het dijbeen.
- Desinfecteer het geschoren gebied met steriel gaas of wattenstaafjes om een laag jodium te verspreiden, gevolgd door een spoeling met 70% ethanol (figuur 1A).
2. Chirurgie
- Maak met behulp van een steriel scalpel een incisie van 5 mm in het geschoren, gedesinfecteerde gebied en pel de huid af om de onderliggende fascia bloot te leggen.
- Gebruik een rechte tang en een fijne schaar om de fascia die het dijbeen direct bedekt voorzichtig vast te pakken en te knippen om de spier bloot te leggen. Een snede van 5 mm van de fascia is voldoende om toegang te krijgen tot de onderliggende spier.
- Gebruik een rechte tang om de spier voorzichtig van het dijbeen te scheiden met minimale weefselschade.
- Zodra het dijbeen zichtbaar is, schuift u de gebogen tang onder het dijbeen tussen de gescheiden spier en het bot. Laat de tang langzaam opengaan om de spierscheiding te behouden en zet het dijbeen vast om een schone snee te vergemakkelijken.
OPMERKING: Het dijbeen moet bloot en gescheiden blijven van de spier en de huid wanneer de tang niet wordt vastgehouden, zoals weergegeven in figuur 1B. - Maak een dwarssnede in het midden van de dijbeenschacht met behulp van een handzaag op de instelling met laag vermogen (zie materiaaltabel voor het gebruikte blad en de gebruikte roterende gereedschapskist).
OPMERKING: Zodra het dijbeen volledig is doorgesneden, worden twee fractuuruiteinden gemaakt: het proximale gedeelte (bevestigd aan het heupbot) en het distale gedeelte (bevestigd aan de knie, ook bekend als het verstikkingsgewricht). Vermijd het snijden van het dijbeen in één beweging. Maak in plaats daarvan 3-5 passen totdat het dijbeen volledig is doorgesneden. Dit is van cruciaal belang om oververhitting van het omliggende weefsel te voorkomen en aanzienlijk botresten te genereren, wat een negatieve invloed heeft op de genezing. - Steek een geleidernaald (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (zie materiaaltabel) in de mergholte van het distale gedeelte. Gebruik vingers om de naald voorzichtig te draaien terwijl u duwt om door het kniegewricht te rijgen (figuur 1C).
- Verwijder de geleidernaald van het distale uiteinde en herhaal dit op het proximale uiteinde, met dezelfde zachte draaiende beweging om de geleidernaald door het heupgewricht te duwen. Laat de geleidernaald in het proximale uiteinde, waarbij de punt uit de huid komt (figuur 1D).
OPMERKING: Om de breukuiteinden te stabiliseren, werd eerst een geleidernaald gebruikt om een pad door de fractuuruiteinden te creëren en vervolgens werd een stabiliserende pin door dit pad geregen om de breukuiteinden vast te zetten14.
- Verwijder de geleidernaald van het distale uiteinde en herhaal dit op het proximale uiteinde, met dezelfde zachte draaiende beweging om de geleidernaald door het heupgewricht te duwen. Laat de geleidernaald in het proximale uiteinde, waarbij de punt uit de huid komt (figuur 1D).
- Steek de stabiliserende pen (naald, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (zie materiaaltabel) in de punt van de geleidernaald (figuur 1E). Druk zachtjes zodat de stabiliserende pin binnenkomt als de geleidernaald de mergholte van het proximale uiteinde verlaat.
- Gooi de geleidernaald weg. Gebruik een pincet om het distale uiteinde vast te houden en uit te lijnen met het proximale uiteinde en blijf de stabiliserende pin door de distale mergholte rijgen totdat deze het kniegewricht verlaat met behulp van de weg in 2.6 (figuur 1F).
OPMERKING: De stabiliserende pin moet nu uit de heup en de kniegewrichten steken.
- Gooi de geleidernaald weg. Gebruik een pincet om het distale uiteinde vast te houden en uit te lijnen met het proximale uiteinde en blijf de stabiliserende pin door de distale mergholte rijgen totdat deze het kniegewricht verlaat met behulp van de weg in 2.6 (figuur 1F).
- Trek met behulp van de chirurgische klem aan de punt van de pin om de proximale en distale secties dicht bij elkaar te brengen, zodat ze elkaar nauwelijks raken. Richt de breukuiteinden indien nodig opnieuw uit met een tang en vouw de uiteinden van de stabiliserende pen naar de breukplaats met behulp van de chirurgische klem (zie Tabel met materialen).
- Verwijder het plastic van de basis van de naald met behulp van draadsnijders. Draai met behulp van de klem beide uiteinden van de pin totdat ze stomp zijn om interne weefselschade te voorkomen.
OPMERKING: De breukuiteinden zijn nu op hun plaats vergrendeld, zodat de muis gewicht op het gewonde been kan zetten. De pin wordt vastgezet als de breukuiteinden niet kunnen scheiden. Een draadsnijder kan ook worden gebruikt om de uiteinden af te stompen. De stabiliserende pin moet gedurende de gehele duur van het onderzoek op zijn plaats blijven totdat de muis is geëuthanaseerd. Pogingen om de pin te ontwrichten zullen waarschijnlijk de fractuurreactie destabiliseren en schade toebrengen aan het dier. De pin kan bij dissectie worden verwijderd.
- Verwijder het plastic van de basis van de naald met behulp van draadsnijders. Draai met behulp van de klem beide uiteinden van de pin totdat ze stomp zijn om interne weefselschade te voorkomen.
- Gebruik een rechte tang om de spier op het dijbeen te verplaatsen. Knijp met een gebogen tang de uiteinden van de huid samen en sluit de opening met wondclips.
OPMERKING: Sluit de huid niet te strak met de clips, anders voorkomt de muis dat er gewicht op deze poot komt. Het beperken van fysieke belasting tijdens het herstel kan het genezingsproces vertragen. - Herhaal stap 2.2 tot en met 2.4 op het andere been en sluit de wond zonder de dijbeenfractuur uit te voeren.
OPMERKING: Dit schijnbeen dient als de contralaterale controle. - Trek de blootstelling aan isofluraan terug, plaats de muis in de verwarmde kooi en zorg ervoor dat ze binnen 10-15 minuten weer bij bewustzijn komen.
- Controleer de activiteit en incisieplaats van de muis dagelijks gedurende 5 dagen na de operatie op tekenen van nood of infectie.
OPMERKING: Als het dier tekenen van pijn vertoont, niet eet en / of aarzelt om op zijn achterpoten te lopen, raadpleeg dan het veterinaire personeel en dien extra pijnstillers toe. - Verwijder de wondclips 10 dagen na de operatie.
OPMERKING: Als de wond na 10 dagen nog niet gesloten lijkt te zijn, raadpleeg dan de dierenarts en IACUC voordat u de clips verwijdert.
3. Weefseloogst
- Euthanaseer de muizen via CO 2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Deze procedure is in overeenstemming met het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association. - Verwijder met een schaar en een tang de huid van beide muizenpoten, ontwricht de heupkop van het heupbot en snijd aangrenzende spieren om het been te bevrijden.
OPMERKING: Vermijd het verwijderen van te veel spieren rond het dijbeen, omdat het eelt kan worden losgemaakt of beschadigd. - Vermijd de stabiliserende pin, snijd door het kniegewricht om het dijbeen van het scheenbeen te scheiden.
- Ontleed rond de distale en proximale delen van het dijbeen om de uiteinden van de stabiliserende pin bloot te leggen.
- Knip met een harde draadsnijder de gevouwen stompe uiteinden van de pin af, zodat alleen het rechte deel van de pin overblijft. Gebruik een tang om de stabiliserende pin langzaam en voorzichtig uit het dijbeen te schuiven.
OPMERKING: Als de pin niet gemakkelijk naar buiten schuift, oefen dan geen kracht uit, omdat dit het eelt kan losmaken en het monster kan beschadigen. Probeer in plaats daarvan de pin te draaien en voorzichtig te verwijderen. Het verwijderen van de pin kan ook gemakkelijker zijn na fixatie.
4. Histologie - Alcian Blue / Eosin / Orange G kleuring
OPMERKING: Alcian Blue / Orange G / Eosin-kleuring wordt routinematig gebruikt om kraakbeen (blauw) en het bot (roze) te visualiseren. Het kraakbeenoppervlak kan worden gekwantificeerd als een percentage van het totale eeltoppervlak (figuur 2A,B).
- Fixeer dijbenen in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende een nacht bij 4 °C.
- Was de vaste monsters in fosfaatbuffered saline (PBS).
- Plaats monsters in 0,5 M EDTA, pH 8,0 op een langzaam roterende shaker gedurende 2 weken. Verander de EDTA-oplossing om de dag om een efficiënte ontkalking te garanderen.
OPMERKING: Er is geen specifiek toerental vereist voor de shaker; ervoor zorgen dat de vloeistof in de container stroomt om alle monsters te bedekken. Volledige ontkalking kan worden getest door röntgenfoto's van de dijbenen. - Om de monsters voor paraffine inbedding te verwerken, incubeer je ze in de volgende oplossingen (elk 1 uur): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xyleen, Xyleen, Paraffine, Paraffine.
- Sluit de monsters in paraffine in voor sectie.
- Snijd 5-7 μm dikke longitudinale secties van de gebroken dijbenen met behulp van een microtoom.
- Deparaffiniseer de secties door ze te incuberen in 2 baden xyleen (elk 5 minuten).
- Rehydrateer de secties door te broeden in de volgende ethanolgradiënt (elk 2 min): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
- Plaats glijbanen in kraanwater gedurende 1min.
- Maak de oplossingen van Alcian blue, Acid alcohol, Ammonium water en Eosin/Orange G voor histologie zoals vermeld in Aanvullend Dossier 1.
OPMERKING: De voorgestelde volumes van elke oplossing moeten voldoende zijn om de dia's volledig onder te dompelen voor de kleuring. - Plaats dia's in zure alcohol voor 30 s en incubeer in Alcian blue gedurende 40 min.
- Was voorzichtig onder de lopende kraan totdat het water ongeveer 2 minuten helder is.
- Doop de glaasjes snel in Zure alcohol gedurende 1 s.
- Afspoelen zoals beschreven in stap 4.9.
- Incubeer in ammoniumwater gedurende 15 s.
- Afspoelen zoals beschreven in stap 4.9.
- Plaats in 95% EtOHvoor 1 min en incubeer in Eosin/Orange G gedurende 90 s.
- Droog de dia's snel uit met een enkele dip in 70% EtOH, 80% EtOH en 100% EtOH.
- Plaats dia's gedurende 1 minuut in Xyleen om de dia's te wissen.
- Breng montagemedia en een coverslip aan voor beeldvorming.
OPMERKING: Voor moleculaire analyse kunnen RNA en eiwit worden geïsoleerd uit het eelt. Ontleed de spier zorgvuldig onder een ontleedafstand en scheid het eelt van het onderliggende bot met behulp van een scalpel.
5. MicroCT
OPMERKING: In de latere stadia van genezing kan microCT worden uitgevoerd om de mineralisatie in het harde eelt en de breukkloof in beeld te brengen en te kwantificeren. Bij C57BL/6J-muizen is het eelt meestal gemineraliseerd en detecteerbaar door microCT na 10 dagen na fractuur (dpf) (figuur 2C).
- Fixeer dijbenen in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: MicroCT kan worden uitgevoerd op dezelfde dijbenen die worden gebruikt voor histologie, zolang dit gebeurt vóór EDTA-ontkalking (stap 4.3). Wanneer u voor beide technieken dezelfde dijbenen gebruikt, voert u microCT uit, haalt u de monsters op en gaat u naar stap 4.3. - Was de vaste monsters in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar in 70% EtOH.
- Voer microCT uit met een isotrope voxelgrootte van 7 μm bij een energieniveau van 55 kVP en een intensiteit van 145 μA (zie Materialentabel).
- Contour de microCT-plakjes om het eelt op te nemen en sluit het corticale bot uit.
OPMERKING: Naarmate het eelt met de tijd meer gemineraliseerd wordt, kan de drempel worden aangepast om het eeltvolume in verschillende stadia te visualiseren en te meten. - Verkrijg het botvolume in de eeltcontouren als een meting van het eeltvolume.
OPMERKING: Breukspleet kan direct op de microCT-plakjes worden gemeten als de afstand die door de breuk wordt ingenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij C57BL/6J-muizen voltooit een succesvolle operatie de eerder genoemde genezingsstappen met weinig tot geen lokale ontstekingsreactie of periostale betrokkenheid bij het door sham geopereerde contralaterale dijbeen. Een hematoom wordt een paar uur na de operatie gevormd en het botvlies wordt geactiveerd om skeletachtige voorlopers te werven voor chondrogenese. Verschillende celpopulaties, zoals Prx1+ mesenchymale voorlopercellen, kunnen tijdens het reparatieproces worden getraceerd met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescerende reportermuismodellen (figuur 3). 5 dagen na de fractuur (dpf) kan Alcian Blue-kleuring worden gebruikt om het zachte eelt te visualiseren en vervolgens het kraakbeengebied te kwantificeren (figuur 2A,B). Mineralisatie is detecteerbaar door microCT bij 28 dpf (figuur 2C). Het volume van het gemineraliseerde eelt, de afstand van de breukkloof en de botsterkte gemeten door mechanische tests worden vaak gebruikt als kwantificeerbare uitkomsten van fractuurherstel. Genetische modificatie of medicamenteuze interventie kan het verloop van het herstel veranderen, dus het uitvoeren van een tijdsverloopstudie om fracturen in verschillende stadia van herstel te karakteriseren, wordt aanbevolen. Het hele eelt kan worden ontleed voor moleculaire analyse en de contralaterale botschacht kan worden gebruikt als controle. Als de fractuuruiteinden niet zijn uitgelijnd of voldoende zijn vastgezet met de pen, tonen de resulterende beelden een gebrek aan eeltvorming aan alle of één kant van de breukplaats (figuur 4).
Figuur 1: Breuk en inbrengen van de stabiliserende pin. (A) Een vierkant wordt geschoren op het rechterbeen van een C57BL/6J muis. (B) Nadat een incisie in de huid en fascia is gemaakt, worden gebogen tangen onder het dijbeen vastgezet om de spier, huid en bot te scheiden. (C) Nadat de snede is gemaakt, worden twee fractuuruiteinden gecreëerd: het proximale gedeelte van het dijbeen dat aan het heupbeen is bevestigd en het distale gedeelte dat aan de knie is bevestigd. De geleidingsnaald (groen) wordt in het distale gedeelte ingebracht en door het kniegewricht geduwd. (D) De geleidingsnaald wordt uit het distale gedeelte verwijderd, in het proximale gedeelte ingebracht en door het heupgewricht geduwd. (E) De stabiliserende pin (grijze naald) wordt ingebracht in de geleidingsnaald die uit het heupgewricht steekt. (F) De stabiliserende pin wordt door het proximale gedeelte, in het distale gedeelte en door het kniegewricht geduwd met behulp van het pad dat is gemaakt door de geleidernaald in C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histologie en microCT van femurfracturen. (A) Formaline-gefixeerde paraffinesecties van femurfracturen werden verzameld bij 5, 10 en 28 dpf en gekleurd met Alcian Blue / Eosin / Orange G. Scale bar = 500 μm. (B) Kraakbeengebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software bij 5, 10 en 28 dpf. (C) Bij 28 dpf werd mineralisatie waargenomen en het eeltvolume en de breukkloof konden worden gemeten met microCT. Schaalbalk = 1.000 μm. Gegevens weergegeven als Gemiddelde ± SEM. Het gemineraliseerde eeltvolume werd gemeten door contouren rond het corticale bot op de breukplaats. Het donkergrijze gebied bakent het gemineraliseerde eelt op de afbeelding af, terwijl het corticale bot (lichtgrijs) niet is opgenomen in de meting. Gegevens weergegeven als Mean ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fluorescerend reportermodel dat wordt gebruikt om de expansie van Prx1+ periostale cellen na fractuur te visualiseren. Prx1CreER; Rosa26tdTomato-muizen werden dagelijks gedurende vijf dagen geïnjecteerd met 80 mg/kg lichaamsgewicht tamoxifen om tdTomato-expressie te induceren. Drie dagen na de laatste injectie werd een dijbeenfractuur geïnitieerd en muizen werden geofferd met 7 of 14 dpf om te volgen waar Prx1-tot expressie brengende cellen en hun nakomelingen (Prx1 +) zich bevinden in het fractuur eelt en uitgebreid periosteum. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld van onregelmatige genezing door chirurgische problemen. Fractuuruiteinden waren niet goed uitgelijnd en de stabiliserende pin doorboorde in dit voorbeeld het proximale gedeelte van het dijbeen. Deze fouten resulteerden in eeltvorming waarbij het dijbeen werd doorboord (gele doos) in plaats van op de snijplaats. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Samenstelling van de oplossingen die nodig zijn voor histologie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het letselmodel dat in dit protocol wordt beschreven, omvat alle vier belangrijke stappen die worden waargenomen tijdens de genezing van spontane fracturen, waaronder (1) pro-inflammatoire respons met de vorming van het hematoom, (2) rekrutering van skeletachtige voorlopers uit het botvlies om het zachte eelt te vormen, (3) mineralisatie van het eelt door osteoblasten en (4) remodellering van het bot door osteoclasten.
De chirurgische procedure die in dit manuscript wordt beschreven, is geoptimaliseerd voor volwassen muizen van ten minste 12 weken oud. Een naald van 27 G x 1 1/4 (0,4 mm x 30 mm) wordt gebruikt als stabiliserende pin omdat dit de ideale maat is voor de breedte van de mergholte op deze leeftijd. Indien nodig kan het protocol voor jongere dieren worden aangepast als een dunnere stabiliserende pin wordt gebruikt. De stabiliserende pin is een essentieel onderdeel van het succes van de operatie, omdat bekend is dat instabiliteit de genezing van fracturen aanzienlijk beïnvloedt16. Andere stabilisatiemethoden zijn herzien en komen allemaal met hun voordelen en beperkingen 17,18,19. De ideale stabilisatie moet worden geselecteerd op basis van de onderzoeksvraag en het experimentele doel. Een beperking van de hier beschreven stabilisatie is dat de pin door de groeischijven en de gewrichten gaat. Als de bijdrage van het gewrichts- of groeischijfkraakbeen van belang is, raden we aan een andere stabiliserende methode te overwegen.
Variabiliteit in chirurgische techniek en tussen dieren is een zorg bij het uitvoeren van deze operatie. Daarom wordt aanbevolen om voldoende getallen te gebruiken, vooral voor kwantitatieve uitlezingen, en om vergelijkbare soorten fracturen tussen groepen te vergelijken. Het is van cruciaal belang om de dijbeensecties dicht bij elkaar te houden om openingen van meer dan 2 mm te voorkomen. Variabiliteit in openingen tussen secties kan de grootte van het eelt en de timing van reparatie aanzienlijk beïnvloeden. De secties moeten ook goed worden uitgelijnd. Losse en verkeerd uitgelijnde fracturen veroorzaken een grotere variabiliteit tussen monsters en kunnen de genezing belemmeren.
Gewichtdragen is ook cruciaal voor de timing van botgenezing en kan variabiliteit tussen muizen introduceren. De meeste muizen leggen een paar uur na de operatie een minimaal gewicht op het gewonde been, maar zouden de volgende dag normaal moeten lopen. Controleren of de muis normaal beweegt en de belasting gelijkmatig over beide benen wordt verdeeld, is cruciaal, vooral bij gebruik van het contralaterale dijbeen als een schijnbediende controle. Bovendien kan de operatie een systemische ontsteking veroorzaken die het contralaterale been beïnvloedt. Het wordt daarom aanbevolen om schijngeoperatieerde dijbenen te vergelijken met niet-geopereerde muizen bij het vaststellen van deze techniek. Het hebben van niet-bediende controles kan ook de voorkeur hebben voor kwantificeerbare uitkomsten zoals effecten op RNA of eiwitexpressie.
Consistentie van de breukgeometrie kan een uitdaging zijn met andere methoden20, maar het gebruik van een zaag zorgt voor meer controle voor de chirurg en verlicht de variabiliteit in de daaropvolgende fracturen. De zaagbenadering is ook gebruikt om metafysische fracturen van de proximale muisdijben met succeste creëren 21.
Verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke muizen in hun reactie op fractuurgenezing worden zelden waargenomen. Geslacht kan echter een factor worden met leeftijd en medicamenteuze interventie, dus het vergelijken van dieren van hetzelfde geslacht of het uitvoeren van statistieken om geslachtsverschillen te ondervragen voordat monsters worden gecombineerd, wordt sterk aanbevolen. Verder is dit protocol ontworpen voor C57BL6/J muizen. Onderzoekers die andere muizenstammen gebruiken, moeten genezing bij mannelijke en vrouwelijke muizen vergelijken om eventuele geslachtsverschillen te identificeren.
Wij geloven dat deze femurfractuurchirurgie een efficiënt model is om de belangrijke genezingsstappen bij muizen samen te vatten en kan worden gebruikt om de effecten van genetische modificaties of therapeutische interventies op fractuurherstel bij mensen te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Vicki Rosen voor de financiële steun en begeleiding bij het project. We willen ook de veterinaire en IACUC-medewerkers van de Harvard School of Medicine bedanken voor het overleg over steriele techniek, dierenwelzijn en de materialen die zijn gebruikt om dit protocol te ontwikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation. , Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019).
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V.
- Holmes, D.
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al.
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
