Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att utföra frakturer på vuxna möss och övervaka läkningsprocessen.
Abstract
Frakturreparation är en väsentlig funktion hos skelettet som inte kan modelleras på ett tillförlitligt sätt in vitro. En musskademodell är ett effektivt tillvägagångssätt för att testa om en gen, genprodukt eller läkemedel påverkar benreparation eftersom murina ben rekapitulerar de stadier som observerats under mänsklig frakturläkning. När en mus eller människa bryter ett ben initieras ett inflammatoriskt svar, och periosteum, en stamcellsnisch som omger själva benet, aktiveras och expanderar. Celler som bor i periosteum differentierar sedan för att bilda en vaskulariserad mjuk callus. Övergången från den mjuka callus till en hård callus sker när de rekryterade skelettstamcellerna differentierar sig till mineraliserande celler, och överbryggningen av de brutna ändarna resulterar i benföreningen. Den mineraliserade callus genomgår sedan ombyggnad för att återställa den ursprungliga formen och strukturen hos det läkta benet. Frakturläkning har studerats hos möss med hjälp av olika skademodeller. Ändå är det bästa sättet att rekapitulera hela denna biologiska process att bryta igenom tvärsnittet av ett långt ben som omfattar båda kortikorna. Detta protokoll beskriver hur en stabiliserad, tvärgående lårbensfraktur säkert kan utföras för att bedöma läkning hos vuxna möss. Ett kirurgiskt protokoll inklusive detaljerade skörde- och avbildningstekniker för att karakterisera de olika stadierna av frakturläkning tillhandahålls också.
Introduction
Frakturer, raster i kontinuiteten i benytan, förekommer i alla segment av befolkningen. De blir allvarliga hos personer som har bräckliga ben på grund av åldrande eller sjukdom, och sjukvårdskostnaderna för bräcklighetsfrakturer förväntas överstiga 25 miljarder dollar om 5 år 1,2,3,4,5. Att förstå de biologiska mekanismerna som är involverade i frakturreparation skulle vara en utgångspunkt för att utveckla nya terapier som syftar till att förbättra läkningsprocessen. Tidigare forskning har visat att vid fraktur inträffar fyra signifikanta steg som gör det möjligt för ben att läka: (1) bildning av hematom; (2) bildning av en fibrobrosk kallus; (3) mineralisering av den mjuka callusen för att bilda ben; och (4) ombyggnad av det läkta benet 6,7. Många biologiska processer aktiveras för att läka frakturen framgångsrikt. Först initieras ett akut proinflammatoriskt svar omedelbart efter en fraktur 6,7. Därefter aktiveras periosteumet och expanderar, och periosteala celler differentieras till kondrocyter för att bilda en broskkallus som växer för att fylla gapet som lämnas av de störda bensegmenten 6,7,8,9. Neurala och vaskulära celler invaderar den nybildade callusen för att ge ytterligare celler och signalmolekyler som behövs för att underlätta reparation 6,7,8,9,10. Förutom att bidra till callusbildning differentieras periosteala celler också till osteoblaster som lägger ner vävt ben i den överbryggande callusen. Slutligen omformar osteoklaster det nybildade benet för att återgå till sin ursprungliga form och lamellära struktur 7,8,9,10,11. Många grupper utvecklade musmodeller av frakturreparation. En av de tidigare och mest använda frakturmodellerna hos möss är Einhorn-metoden, där en vikt tappas på benet från en viss höjd12. Bristen på kontroll över vinkeln och kraften som appliceras för att inducera frakturen skapar mycket variation i placeringen och storleken på bendiskontinuiteten. Därefter resulterar det i variationer i det specifika frakturläkningssvaret som observerats. Andra populära tillvägagångssätt är kirurgisk ingrepp för att producera en tibial monokortikal defekt eller stressfrakturer, procedurer som inducerar relativt mildare läkningssvar10,13. Variabilitet i dessa modeller beror främst på den person som utför proceduren14.
Här möjliggör en detaljerad modell för lårbensskada för mus kontroll över pausen för att ge en reproducerbar skada och möjliggöra kvantitativ och kvalitativ bedömning av lårbensfrakturreparation. Specifikt introduceras ett fullständigt genombrott i lårbenen hos vuxna möss och stabiliserar frakturändarna för att ta hänsyn till den roll som fysisk belastning spelar i benläkning. Metoderna för att skörda vävnader och avbilda de olika stegen i läkningsprocessen med histologi och mikrodatortomografi (microCT) tillhandahålls också i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of the Harvard Medical Area. 12 veckor gamla C57BL / 6J möss (män och kvinnor) användes i detta protokoll. C57BL/6J han- och honmöss uppnår maximal benmassa runt 12 veckors ålder med lårbenen tillräckligt breda för att passa en stabiliserande stift, vilket gör dem till en lämplig stam att använda för detta protokoll15.
1. Förberedelse för operationen
- Autoklavera den kirurgiska utrustningen, inklusive kirurgisk sax, raka pincett, böjda pincett, kirurgiska klämmor och diamantskärhjul (se materialtabell) för att minimera risken för infektion.
- Placera en ren musbur på en värmedyna för att underlätta återhämtning efter kirurgisk. Ställ in värmedynan så att den når en temperatur mellan 37-45 °C.
- Placera musen under anestesi med hjälp av en isoflurankammare. Ställ in induktionssyreflödet på 2 L/min, isofluraninduktionen på 2-4 %, underhållsnoskonens syre på 2 L/min och underhållsisofluranet är 1,4 %.
- Bekräfta att musens andning är stabil och att de inte svarar på en tåklämma. Applicera ett tunt lager oftalmisk salva på varje öga för att förhindra repor i hornhinnan. Överför musen till en steril dyna och behåll anestesi med hjälp av en näskon för att leverera isofluran kontinuerligt i samma takt som i steg 1.3.
OBS: Att använda 12 veckor gamla möss eller äldre rekommenderas eftersom lårben från yngre möss kan vara för tunna för att rymma en stabiliserande stift. - Injicera musen subkutant med 0,05 mg/kg kroppsvikt buprenorfin med långsam frisättning (se Materialtabell).
- Raka en 2 x 2 cm kvadrat på båda låren som motsvarar lårbenets placering med en elektrisk trimmer.
- Desinficera det rakade området med steril gasväv eller vattpinnar för att sprida ett lager jod följt av en sköljning med 70% etanol (figur 1A).
2. Kirurgi
- Använd en steril skalpell, gör ett 5 mm snitt i det rakade, desinficerade området och skala bort huden för att exponera den underliggande fascian.
- Använd raka pincett och fin sax för att försiktigt ta tag i och klippa fascian som direkt täcker lårbenet för att exponera muskeln. Ett 5 mm snitt av fascian är tillräckligt för att komma åt den underliggande muskeln.
- Använd ett par raka pincett, separera försiktigt muskeln från lårbenet med minimal vävnadsskada.
- När lårbenet är synligt, skjut de böjda pincetterna under lårbenet mellan den separerade muskeln och benet. Låt tången långsamt öppnas för att bibehålla muskelseparationen och säkra lårbenet för att underlätta ett rent snitt.
OBS: Lårbenet måste förbli exponerat och separerat från muskeln och huden när tången inte hålls, som visas i figur 1B. - Gör ett tvärgående snitt i mitten av lårbensaxeln med en handhållen såg på inställningen för låg effekt (se Materialtabell för bladet och Roterande verktygssats som används).
OBS: När lårbenet är helt skuret skapas två sprickändar: den proximala sektionen (fäst vid höftbenet) och den distala sektionen (fäst vid knäet, även känd som kvävleden). Undvik att skära lårbenet i en enda rörelse. Gör istället 3-5 pass tills lårbenet är helt genomskuret. Detta är avgörande för att undvika överhettning av den omgivande vävnaden och generera betydande benskräp, vilket påverkar läkningen negativt. - Sätt i en styrnål (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (se Materialtabell) i märghålan i den distala sektionen. Använd fingrarna för att försiktigt vrida nålen när du trycker för att trä genom knäleden (Figur 1C).
- Ta bort styrnålen från den distala änden och upprepa på den proximala änden, med samma mjuka vridningsrörelse för att trycka styrnålen genom höftleden. Lämna styrnålen i den proximala änden, med spetsen framkom från huden (Figur 1D).
OBS: För att stabilisera sprickändarna användes först en styrnål för att skapa en väg genom sprickändarna, och sedan gängades en stabiliserande stift genom denna väg för att säkra sprickändarna14.
- Ta bort styrnålen från den distala änden och upprepa på den proximala änden, med samma mjuka vridningsrörelse för att trycka styrnålen genom höftleden. Lämna styrnålen i den proximala änden, med spetsen framkom från huden (Figur 1D).
- Sätt in stabiliseringsstiftet (nål, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (se Materialtabell) i styrnålens spets (figur 1E). Tryck försiktigt så att stabiliseringsstiftet kommer in när styrnålen lämnar märghålan i den proximala änden.
- Kassera styrnålen. Använd pincett för att hålla och rikta in den distala änden med den proximala änden och fortsätt att trä stabiliseringsstiftet genom den distala märghålan tills den lämnar knäleden med hjälp av vägen i 2.6 (Figur 1F).
OBS: Den stabiliserande stiftet ska nu sticka ut från höften och knäleden.
- Kassera styrnålen. Använd pincett för att hålla och rikta in den distala änden med den proximala änden och fortsätt att trä stabiliseringsstiftet genom den distala märghålan tills den lämnar knäleden med hjälp av vägen i 2.6 (Figur 1F).
- Använd den kirurgiska klämman och dra i stiftets spets för att föra de proximala och distala sektionerna nära varandra, så att de knappt rör. Justera frakturändarna med pincett om det behövs och vik ändarna på stabiliseringsstiftet mot sprickstället med hjälp av den kirurgiska klämman (se Materialtabell).
- Ta bort plasten från nålens botten med trådskärare. Vrid båda ändarna av stiftet med hjälp av klämman tills de är trubbiga för att undvika inre vävnadsskador.
OBS: Frakturändarna är nu låsta på plats så att musen kan lägga vikt på det skadade benet. Stiftet är säkrat om sprickändarna inte kan separeras. En trådskärare kan också användas för att trubba av ändarna. Den stabiliserande stiftet måste vara på plats under hela studiens varaktighet tills musen avlivas. Försök att lossa stiftet kommer sannolikt att destabilisera frakturresponsen och orsaka skada på djuret. Stiftet kan tas bort vid dissektion.
- Ta bort plasten från nålens botten med trådskärare. Vrid båda ändarna av stiftet med hjälp av klämman tills de är trubbiga för att undvika inre vävnadsskador.
- Använd raka pincett för att flytta muskeln på lårbenet. Nyp ihop hudens ändar med böjda pincett och stäng öppningen med hjälp av sårklämmor.
OBS: Stäng inte huden för hårt med klämmorna, annars kommer musen att undvika att lägga vikt på detta ben. Att begränsa fysisk belastning under återhämtningen kan fördröja läkningsprocessen. - Upprepa steg 2,2 till 2,4 på det andra benet och stäng såret utan att utföra lårbensfrakturen.
OBS: Detta skamstyrda lårben fungerar som kontralateral kontroll. - Dra tillbaka isofluranexponeringen, placera musen i den uppvärmda buren och se till att de återfår medvetandet inom 10-15 minuter.
- Övervaka musens aktivitet och snittplats dagligen i 5 dagar efter operationen för tecken på nöd eller infektion.
OBS: Om djuret visar tecken på smärta, inte äter och / eller tvekar att gå på bakbenen, rådfråga veterinärpersonal och administrera ytterligare smärtstillande medel. - Ta bort sårklämmorna 10 dagar efter operationen.
OBS: Om såret inte verkar ha stängts efter 10 dagar, kontakta veterinären och IACUC innan du tar bort klämmorna.
3. Vävnadsskörd
- Avliva mössen via CO 2-inandning följt av cervikal dislokation.
OBS: Detta förfarande överensstämmer med panelen för eutanasi från American Veterinary Medical Association. - Använd sax och pincett, ta bort huden från båda musbenen, förflytta lårbenet från höftbenet och skär intilliggande muskler för att frigöra benet.
OBS: Undvik att ta bort för mycket muskler runt lårbenet eftersom förhårdnadsbenet kan lossna eller skadas. - Undvik den stabiliserande stiftet, skär genom knäleden för att separera lårbenet från skenbenet.
- Dissekera runt de distala och proximala delarna av lårbenet för att exponera ändarna på den stabiliserande stiftet.
- Skär de vikta trubbiga ändarna av stiftet med en hård trådskärare så att endast den raka delen av stiftet återstår. Använd pincett för att långsamt och försiktigt skjuta ut stabiliseringsstiftet ur lårbenet.
OBS: Om stiftet inte lätt glider ut, använd inte kraft eftersom det kan lossna förhårdnadsförhårdnad och skada provet. Försök istället att rotera stiftet och ta bort det försiktigt. Avlägsnande av stiftet kan också vara lättare efter fixering.
4. Histologi - Alcian Blue / Eosin / Orange G-färgning
OBS: Alcian Blue / Orange G / Eosin färgning används rutinmässigt för att visualisera brosk (blå) och benet (rosa). Broskarealen kan kvantifieras som en andel av den totala förhårdnaden (figur 2A,B).
- Fixera lårbenen i 10% neutralt buffrat formalin över natten vid 4 °C.
- Tvätta de fasta proverna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Placera prover i 0,5M EDTA, pH 8,0 på en långsamt roterande shaker i 2 veckor. Byt EDTA-lösning varannan dag för att säkerställa effektiv avkalkning.
OBS: Inget specifikt varvtal krävs för skakaren; se till att vätskan flyter i behållaren för att täcka alla prover. Fullständig avkalkning kan testas med röntgen av lårbenen. - För att bearbeta proverna för paraffininbäddning inkubera dem i följande lösningar (1 timme vardera): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xylen, Xylen, Paraffin, Paraffin.
- Bädda in proverna i paraffin för sektionering.
- Skär 5-7 μm tjocka längsgående sektioner av de brutna lårbenen med en mikrotom.
- Deparaffinisera sektionerna genom att inkubera dem i 2 bad xylen (5 min vardera).
- Rehydrera sektionerna genom att inkubera i följande etanolgradient (2 min vardera): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
- Placera rutschkanor i kranvatten i 1 min.
- Gör lösningarna av Alcian blå, Sur alkohol, Ammoniumvatten och Eosin / Orange G för histologi som nämns i tilläggsfil 1.
OBS: De föreslagna volymerna för varje lösning bör vara tillräckliga för att helt nedsänka bilderna för färgningen. - Placera diabilder i Syraalkohol i 30 s och inkubera i Alcianblått i 40 min.
- Tvätta försiktigt under den rinnande kranen tills vattnet är klart i ca 2 min.
- Doppa rutschkanorna snabbt i Syraalkohol i 1 s.
- Skölj enligt beskrivningen i steg 4.9.
- Inkubera i ammoniumvatten i 15 s.
- Skölj enligt beskrivningen i steg 4.9.
- Placera i 95% EtOH i 1 min och inkubera i Eosin/Orange G i 90 s.
- Dehydrera bilderna snabbt med ett enda dopp i 70% EtOH, 80% EtOH och 100% EtOH.
- Placera diabilder i xylen i 1 min för att rensa bilderna.
- Applicera monteringsmedia och en täckglas för avbildning.
OBS: För molekylär analys kan RNA och protein isoleras från callus. Dissekera försiktigt muskeln under ett dissekerande omfång och separera callus från det underliggande benet med hjälp av en skalpell.
5. MikroCT
OBS: I de senare stadierna av läkning kan mikroCT utföras för att avbilda och kvantifiera mineraliseringen i den hårda callusen och frakturgapet. Hos C57BL/6J-möss mineraliseras förhårdnaden vanligtvis och kan detekteras av mikroCT efter 10 dagar efter fraktur (dpf) (figur 2C).
- Fixera lårbenen i 10% neutralt buffrat formalin över natten vid 4 °C.
OBS: MicroCT kan utföras på samma lårben som används för histologi så länge det görs före EDTA-avkalkning (steg 4.3). När du använder samma lårben för båda teknikerna, utför microCT, hämta proverna och gå till steg 4.3. - Tvätta de fasta proverna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvara i 70% EtOH.
- Utför microCT med en isotrop voxelstorlek på 7 μm vid en energinivå på 55 kVP och en intensitet på 145 μA (se Materialtabell).
- Konturera mikroCT-skivorna för att inkludera callus och utesluta det kortikala benet.
OBS: När callus blir mer mineraliserad med tiden kan tröskeln justeras för att visualisera och mäta callusvolymen i olika steg. - Få benvolymen i calluskonturerna som en mätning av callusvolymen.
OBS: Frakturgap kan mätas direkt på mikroCT-skivorna som det avstånd som upptas av pausen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hos C57BL/6J-möss fullbordar en framgångsrik operation de tidigare nämnda läkningsstegen med liten eller ingen lokal inflammatorisk respons eller periosteal inblandning i det skamdrivna kontralaterala lårbenet. Ett hematom bildas några timmar efter operationen, och periosteum aktiveras för att rekrytera skelettprogenitorer för kondrogenes. Olika cellpopulationer, såsom Prx1+ mesenkymala förfäder, kan spåras under reparationsprocessen med hjälp av kommersiellt tillgängliga fluorescerande reportermusmodeller (Figur 3). Vid 5 dagar efter fraktur (dpf) kan Alcian Blue-färgning användas för att visualisera den mjuka förhårdnaden och därefter kvantifiera broskområdet (figur 2A,B). Mineralisering kan detekteras med mikroCT vid 28 dpf (figur 2C). Volymen av den mineraliserade callusen, avståndet till sprickgapet och benstyrkan mätt genom mekanisk testning används vanligtvis som kvantifierbara resultat av frakturreparation. Genetisk modifiering eller läkemedelsintervention kan förändra återhämtningsförloppet, så det rekommenderas att utföra en tidsstudie för att karakterisera frakturer i olika stadier av reparation. Hela callus kan dissekeras för molekylär analys och den kontralaterala benaxeln kan användas som kontroll. Om sprickändarna inte är inriktade eller tillräckligt säkrade med stiftet, kommer de resulterande bilderna att visa en brist på callusbildning på hela eller ena sidan av sprickstället (figur 4).
Figur 1: Fraktur och insättning av stabiliseringsstiftet. (A) En fyrkant rakas på höger ben på en C57BL/6J-mus. (B) Efter att ett snitt har gjorts i huden och fascian, säkras böjda pincett under lårbenet för att separera muskeln, huden och benet. (C) Efter att snittet har gjorts skapas två sprickändar: den proximala delen av lårbenet fäst vid höftbenet och den distala delen fäst vid knäet. Styrnålen (grön) sätts in i den distala sektionen och skjuts genom knäleden. (D) Styrnålen avlägsnas från den distala sektionen, sätts in i den proximala sektionen och skjuts genom höftleden. (E) Den stabiliserande stiftet (grå nålen) sätts in i styrnålen som sticker ut från höftleden. (F) Den stabiliserande stiftet skjuts genom den proximala sektionen, in i den distala sektionen och genom knäleden med hjälp av den väg som styrnålen gör i C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Histologi och mikroCT av lårbensfraktur. (A) Formalin-fixerade paraffinsektioner av lårbensfrakturer samlades in vid 5, 10 och 28 dpf och färgades med Alcian Blue / Eosin / Orange G. Skalstång = 500 μm. (B) Broskarealen kvantifierades med hjälp av ImageJ-programvaran vid 5, 10 och 28 dpf. (C) Vid 28 dpf observerades mineralisering, och callusvolymen och sprickgapet kunde mätas med mikroCT. Skalstång = 1 000 μm. Data som visas som Mean ± SEM. Den mineraliserade callusvolymen mättes genom konturering runt det kortikala benet vid sprickstället. Den mörkgrå ytan avgränsar den mineraliserade förhårdnaden på bilden, medan det kortikala benet (ljusgrått) inte ingår i mätningen. Data som visas som Mean ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fluorescerande reportermodell som används för att visualisera expansion av Prx1+ periosteala celler efter fraktur. Prx1CreER; Rosa26tdTomatomöss injicerades dagligen i fem dagar med 80 mg/kg kroppsvikt tamoxifen för att inducera tdTomato-uttryck. Tre dagar efter den slutliga injektionen initierades lårbensfraktur och möss offrades vid 7 eller 14 dpf för att spåra var Prx1-uttryckande celler och deras avkomma (Prx1+) ligger inom frakturkallus och expanderat periosteum. Skalstång = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på oregelbunden läkning på grund av kirurgiska problem. Sprickändarna var inte ordentligt inriktade och stabiliseringsstiftet genomborrade genom lårbenets proximala sektion i detta exempel. Dessa fel resulterade i callusbildning där lårbenet genomborrades (gul låda) snarare än på skärplatsen. Skalstång = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Sammansättning av de lösningar som krävs för histologi. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skademodellen som beskrivs i detta protokoll omfattar alla fyra signifikanta steg som observerats under läkning av spontana frakturer, inklusive (1) proinflammatoriskt svar med bildandet av hematom, (2) rekrytering av skelettstamfäder från periosteum för att bilda den mjuka callusen, (3) mineralisering av callus genom osteoblaster och (4) ombyggnad av benet med osteoklaster.
Det kirurgiska ingreppet som beskrivs i detta manuskript är optimerat för vuxna möss som är minst 12 veckor gamla. En 27 G x 1 1/4 (0,4 mm x 30 mm) nål används som stabiliserande stift eftersom det är den perfekta storleken för bredden på märghålan vid denna ålder. Vid behov kan protokollet ändras för yngre djur om en tunnare stabiliseringsstift används. Den stabiliserande stiftet är en viktig del av operationens framgång eftersom instabilitet är känd för att signifikant påverka frakturläkning16. Andra stabiliseringsmetoder har granskats och alla har sina fördelar och begränsningar 17,18,19. Den ideala stabiliseringen bör väljas utifrån forskningsfrågan och det experimentella målet. En begränsning av den beskrivna stabiliseringen här är att stiftet går genom tillväxtplattorna och lederna. Om bidraget från led- eller tillväxtplattbrosket är oroande, föreslår vi att man överväger en annan stabiliserande metod.
Variabilitet i kirurgisk teknik och mellan djur är ett problem vid utförandet av denna operation. Därför rekommenderas att använda rikliga siffror, särskilt för kvantitativa avläsningar, och att jämföra liknande typer av frakturer mellan grupper. Det är viktigt att fästa lårbenssektionerna nära varandra för att undvika luckor över 2 mm. Variabilitet i mellanrum mellan sektioner kan avsevärt påverka storleken på callus och tidpunkten för reparation. Sektionerna bör också vara ordentligt inriktade. Lösa och feljusterade frakturer kommer att orsaka mer signifikant variation mellan prover och kan försämra läkningen.
Viktbärande är också avgörande för tidpunkten för benläkning och kan införa variation mellan möss. De flesta möss lägger minimal vikt på det skadade benet några timmar efter operationen men bör gå normalt nästa dag. Att verifiera att musen rör sig normalt och belastningen fördelas jämnt på båda benen är avgörande, särskilt när man använder det kontralaterala lårbenet som en skamstyrd kontroll. Dessutom kan operationen utlösa en systemisk inflammation som påverkar det kontralaterala benet. Det rekommenderas därför att jämföra skendrivna lårben med icke-opererade möss när man etablerar denna teknik. Att ha icke-opererade kontroller kan också vara att föredra för kvantifierbara resultat såsom effekter på RNA eller proteinuttryck.
Konsistensen av sprickgeometrin kan vara utmanande med andra metoder20, men att använda en såg möjliggör mer kontroll för kirurgen och lindrar variationen i efterföljande frakturer. Sågmetoden har också använts för att skapa metafyseala frakturer i de proximala musbenen framgångsrikt21.
Skillnader mellan manliga och kvinnliga möss i deras svar på frakturläkning observeras sällan. Kön kan dock bli en faktor med ålder och drogintervention, så att jämföra djur av samma kön eller utföra statistik för att förhöra könsskillnader innan du kombinerar prover rekommenderas starkt. Dessutom designades detta protokoll för C57BL6 / J-möss. Utredare som använder andra musstammar bör jämföra läkning hos manliga och kvinnliga möss för att identifiera eventuella könsskillnader.
Vi tror att denna lårbensfrakturkirurgi är en effektiv modell för att rekapitulera de signifikanta läkningsstegen hos möss och kan användas för att testa effekterna av genetiska modifieringar eller terapeutiska ingrepp på frakturåterhämtning hos människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Vicki Rosen för ekonomiskt stöd och vägledning med projektet. Vi vill också tacka veterinär- och IACUC-personalen vid Harvard School of Medicine för samråd om steril teknik, djurs välbefinnande och de material som används för att utveckla detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J.
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation. , Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019).
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V.
- Holmes, D.
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al.
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
