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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Im lebenden Organismus Drahtlose optogenetische Steuerung des motorischen Verhaltens

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie drahtlose Optogenetik in Kombination mit Hochgeschwindigkeits-Videografie in einer einzigen Pellet-Reach-to-Grasp-Aufgabe verwendet werden kann, um die neuronalen Schaltkreise zu charakterisieren, die an der Leistung eines qualifizierten motorischen Verhaltens in sich frei bewegenden Mäusen beteiligt sind.

Abstract

Feinmotorik ist im Alltag essentiell und kann bei mehreren Erkrankungen des Nervensystems beeinträchtigt werden. Die Erfassung und Durchführung dieser Aufgaben erfordert eine sensorisch-motorische Integration und beinhaltet eine präzise Steuerung bilateraler Gehirnschaltkreise. Die Implementierung unimanueller Verhaltensparadigmen in Tiermodellen wird das Verständnis des Beitrags von Gehirnstrukturen, wie dem Striatum, zum komplexen motorischen Verhalten verbessern, da es die Manipulation und Aufzeichnung der neuronalen Aktivität bestimmter Kerne unter Kontrollbedingungen und Krankheiten während der Ausführung der Aufgabe ermöglicht.

Seit ihrer Entstehung ist die Optogenetik ein dominantes Werkzeug für die Befragung des Gehirns, indem sie eine selektive und gezielte Aktivierung oder Hemmung neuronaler Populationen ermöglicht. Die Kombination von Optogenetik mit Verhaltensassays beleuchtet die zugrunde liegenden Mechanismen spezifischer Gehirnfunktionen. Drahtlose Head-Mounted-Systeme mit miniaturisierten Leuchtdioden (LEDs) ermöglichen die optogenetische Fernsteuerung in einem völlig frei beweglichen Tier. Dadurch wird vermieden, dass die Einschränkungen eines kabelgebundenen Systems für das Verhalten von Tieren weniger einschränkend sind, ohne die Lichtemissionseffizienz zu beeinträchtigen. Das aktuelle Protokoll kombiniert einen drahtlosen optogenetischen Ansatz mit Hochgeschwindigkeits-Videografie in einer unimanuellen Geschicklichkeitsaufgabe, um den Beitrag spezifischer neuronaler Populationen zum feinmotorischen Verhalten zu analysieren.

Introduction

Motorisches geschicktes Verhalten ist bei den meisten von uns ausgeführten Bewegungen vorhanden, und es ist bekannt, dass es bei mehreren Gehirnstörungen beeinflusst wird 1,2,3,4,5,6. Die Durchführung von Aufgaben, die es ermöglichen, die Entwicklung, das Lernen und die Leistung qualifizierter Bewegungen zu untersuchen, ist entscheidend für das Verständnis der neurobiologischen Grundlagen der motorischen Funktion, insbesondere in Modellen von Hirnverletzungen, neurodegenerativen und neurologischen Entwicklungsstörungen 2,7,8,9,10,11,12,13 . Das Greifen nach und das Abrufen von Objekten erfolgt routinemäßig in alltäglichen Handlungen und ist eine der ersten motorischen Fähigkeiten, die während der frühen Entwicklung erworben und dann im Laufe der Jahre 5,6 verfeinert wurden. Es umfasst ein komplexes Verhalten, das sensorisch-motorische Prozesse wie die Wahrnehmung der Objektmerkmale, Bewegungsplanung, Aktionsauswahl, Bewegungsausführung, Körperkoordination und Geschwindigkeitsmodulation 7,14,15,16 erfordert. Daher erfordern unimanuelle Aufgaben mit hoher Geschicklichkeit die Teilnahme vieler Gehirnstrukturen beider Hemisphären 16,17,18,19,20,21,22. Bei Mäusen ist die Einzelpellet-Reach-to-Grasp-Aufgabe für mehrere Phasen charakterisiert, die separat gesteuert und analysiert werden können 7,13,23. Diese Funktion ermöglicht es, den Beitrag spezifischer neuronaler Subpopulationen in verschiedenen Stadien der Akquisition und Verhaltensleistung zu untersuchen und bietet eine Plattform für detaillierte Studien motorischer Systeme 13,23,24. Die Bewegung erfolgt in ein paar Sekunden; Daher sollte die Hochgeschwindigkeits-Videografie für die kinematische Analyse in verschiedenen Stufen der qualifizierten motorischen Trajektorie 7,25 verwendet werden. Aus den Videos können mehrere Parameter extrahiert werden, darunter Körperhaltung, Flugbahn, Geschwindigkeit und Art der Fehler25. Die kinematische Analyse kann verwendet werden, um subtile Veränderungen während der drahtlosen optogenetischen Manipulationzu erkennen 7,23.

Die Verwendung miniaturisierter Leuchtdioden (LEDs) zur Lichtabgabe über ein drahtloses Head-Mounted-System ermöglicht eine optogenetische Fernsteuerung, während das Tier die Aufgabe ausführt. Der drahtlose optogenetische Controller akzeptiert Einzelimpuls- oder kontinuierliche Triggerbefehle von einem Stimulator und sendet Infrarotsignale (IR) an einen Empfänger, der an die miniaturisierte LED23,26 angeschlossen ist. Das aktuelle Protokoll kombiniert diesen drahtlosen optogenetischen Ansatz mit der Hochgeschwindigkeits-Videografie einer Geschicklichkeitsaufgabe, um die Rolle spezifischer neuronaler Populationen während der Durchführung des feinmotorischen Verhaltenszu analysieren 23. Da es sich um eine unimanuelle Aufgabe handelt, ermöglicht es die Bewertung der Beteiligung von Strukturen in beiden Hemisphären. Traditionell steuert das Gehirn die Körperbewegung auf sehr asymmetrische Weise; Aufgaben mit hoher Geschicklichkeit erfordern jedoch eine sorgfältige Koordination und Kontrolle von vielen Gehirnstrukturen, einschließlich ipsilateraler Kerne und differentieller Beiträge neuronaler Subpopulationen innerhalb der Kerne 10,20,21,22,23. Dieses Protokoll zeigt, dass subkortikale Strukturen aus beiden Hemisphären die Flugbahn des Vordergliedssteuern 23. Dieses Paradigma kann geeignet sein, andere Gehirnregionen und Modelle von Hirnerkrankungen zu untersuchen.

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Protocol

Die Verfahren zur Verwendung von Tieren wurden nach lokalen und nationalen Richtlinien durchgeführt und vom entsprechenden Institutional Animal Care and Use Committee (Institute of Cellular Physiology IACUC-Protokoll VLH151-19) genehmigt. Drd1-Cre transgene männliche Mäuse27, 35-40 Tage postnatal mit C57BL/6 Hintergrund wurden im aktuellen Protokoll verwendet. Die Mäuse wurden unter folgenden Bedingungen gehalten: Temperatur 22±1 °C; Luftfeuchtigkeit 55%; Lichtplan 12/12 Uhr mit ausgeschaltetem Licht um 19 Uhr und wurden am postnatalen Tag 21 entwöhnt. Entwöhnte Welpen wurden in gleichgeschlechtlichen Gruppen von 2-5 untergebracht. Die Tiere wurden in statischen Gehäusen mit Mikrobarriereplatten untergebracht. Die Bettwäsche bestand aus sterilen Espenspänen. Nagetierpellets und RO-gereinigtes Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt, sofern nicht anders angegeben.

1. Chirurgische Eingriffe

  1. Bereiten Sie eine LED-Kanüle in der gewünschten Länge entsprechend den dorsoventralen Koordinaten der interessierenden Struktur vor (idealerweise 0,5 mm länger, um die Dicke des Schädels zu berücksichtigen, für das dorsolaterale Striatum 3,5 mm) (Abbildung 1).
    1. Schneiden Sie die Glasfaser auf eine Länge, die länger als die endgültige gewünschte Größe ist, schleifen Sie die Faserspitze mit grobem Schleifpapier auf die Ziellänge und polieren Sie schließlich die Faserspitze mit feinem Schleifpapier.
      HINWEIS: LED-Kanüle ist eine optische Glasfaser mit einem Durchmesser von 250 μm, die an einem Infrarotempfänger befestigt ist (siehe Materialtabelle).
  2. Ziehen Sie Glaspipetten (1,14 mm Außendurchmesser, 0,53 mm Innendurchmesser und 3,5 mm Länge) für den Nanoinjektor mit einem horizontalen Abzieher (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie für später. Programmieren Sie den Abzieher in einer Schlaufe, um einen Spitzendurchmesser von 15-20 μm mit einer langen allmählichen Neigungsverjüngung (4-5 mm) zu erhalten.
  3. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie das stereotaktische Gerät, die Haube, den Mikroinjektor (siehe Materialtabelle) und die umgebenden Oberflächen mit 70% Ethanol gründlich desinfizieren.
    HINWEIS: Eine stereotaktische Mausvorrichtung ist unerlässlich, um Adeno Associated Virus (AAVs) präzise zu injizieren und die LED-Kanüle in der Region von Interesse zu platzieren.
  4. Tragen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung für den Eingriff, einschließlich eines sauberen Laborkittels oder eines Einweg-OP-Kittels, steriler Handschuhe, Gesichtsmaske und Einweg-Kopfkappe.
  5. Platzieren Sie die notwendige Ausrüstung in der Nähe des Operationsbereichs, wie sterile chirurgische Werkzeuge, Baumwollspitzen, Lösungen, Mikropipette, Pipettenspitzen, Kapillaren, Mikrofüllung mit Mineralöl und Marker.
  6. Füllen Sie eine Pipette für Mikroinjektionen mit Mineralöl und legen Sie sie in den Mikroinjektor. Stellen Sie sicher, dass der Mikroinjektor korrekt funktioniert, indem Sie etwas Mineralöl ausstoßen.
    HINWEIS: Alle Instrumente, die während der Operation verwendet werden, sollten autoklaviert und steril sein. Es sollte eine aseptische Technik verwendet werden.
  7. Anästhesieren Sie Tiere mit gasförmigem Isofluran 4-5%, um eine Anästhesie zu induzieren, und 1,2% während der gesamten Operation mit 0,5-1 l / min reinem Sauerstoff. Die Operation beginnt erst, nachdem das Tier einen Punkt der Tiefenbetäubung erreicht hat, der durch das Fehlen eines Pfotenentzugs nach einer leichten Prise beurteilt wird.
    1. Überwachen Sie kontinuierlich die Atemfrequenz und Temperatur des Tieres. Halten Sie die Körpertemperatur durch ein Heizkissen auf 34 ° C.
  8. Tragen Sie eine Augensalbe auf. Entfernen Sie Haare von der Kopfhaut mit einer Trimer- und Haarentfernungscreme. Wischen Sie die Kopfhaut mit Wattestäbchen mit 8% Povidon-Jod (siehe Materialtabelle) und 70% Ethanol ab, die jeweils dreimal gewechselt werden.
  9. Legen Sie die Maus in den stereotaktischen Apparat und sichern Sie den Kopf, um sicherzustellen, dass der Schädel in der mediolateralen und anterior-hinteren Achse nivelliert ist.
  10. Machen Sie einen 1 cm großen Schnitt mit einem Skalpell durch die Kopfhaut auf Augenhöhe entlang der Sagittalachse. Ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen, und reinigen Sie das Periost mit Wattestäbchen.
  11. Reinigen Sie die Schädeloberfläche mit Kochsalzlösung und sterilen Wattestäbchen. Lösen Sie Blutungen an der Oberfläche mit sterilen absorbierenden Augenspeeren (siehe Materialtabelle) oder ähnlichem sterilem absorbierendem Material.
  12. Tragen Sie einen Tropfen 2,5% Wasserstoffperoxid mit einem Wattestäbchen auf und lassen Sie es einige Sekunden einwirken, um die Schädelnähte sichtbar zu machen und eine bessere Referenz zu haben. Nach einigen Sekunden gründlich mit einem sauberen Wattestäbchen reinigen.
  13. Lokalisieren Sie mit der Glaspipette (15 μm Endspitzendurchmesser) Bregma und Lambda, um zu überprüfen, ob der Schädel in der vorder-hinteren Achse nivelliert ist.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, ein stereoskopisches Mikroskop oder ein USB-Mikroskop zu haben, um die Spitze der Glaspipette zu sehen. Falls es benötigt wird, passen Sie die Höhe des Mundhalters an, um den Schädel zu nivellieren.
  14. Verschieben Sie die Kapillare in Richtung der ausgewählten anterior-posterioren (AP) und medial-lateralen (ML) Koordinaten (dorsolaterales Striatum, AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Malen Sie einen Referenzpunkt in der Kopfhaut über den ausgewählten Koordinaten mit einem sterilen Marker.
  15. Führen Sie im Referenzpunkt eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von ~ 1 mm durch, indem Sie mit einem sterilen Drehwerkzeug oder Dentalbohrer mit einer niedrigen bis mittleren Geschwindigkeit mit einem kleinen runden Dentalbohrer einen sanften Druck auf den Schädel ausüben (siehe Materialtabelle).
  16. Laden Sie die Kapillare mit 300-400 nL Cre-abhängigem Adeno-assoziiertem Virus (AAV) wie AAV1-dflox-hChR-2-mCherry, um Channelrhodopsin zu exprimieren, oder einem AAV, um nur das Reporterprotein (z. B. mCherry) als Kontrolle in der interessierenden Region zu exprimieren (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht verstopft ist, und führen Sie dann die Glaspipette bei den gewünschten dorsoventralen (DV) Koordinaten (dorsolaterales Striatum DV -3,35 mm) in das Gehirn ein.
    1. Injizieren Sie 200 nL mit einem automatischen Injektor mit einer Rate von 23 nL/s. Warten Sie nach Abschluss der Injektion 10 Minuten und ziehen Sie die Glaspipette langsam zurück, um ein Verschütten zu vermeiden.
      HINWEIS: Es ist möglich, eine 30-G-Nadel zu verwenden, um mit dem entsprechenden Mikroinjektor zu injizieren.
  17. Reinigen und trocknen Sie Rückstände mit Wattestäbchen.
  18. Befestigen Sie die sterile LED-Kanüle aus Glas am stereotaktischen Arm und kalibrieren Sie die Koordinaten mit Bregma als Referenz. Führen Sie die Kanüle sehr langsam ein (300 μm/min), um Gewebeschäden zu vermeiden, und platzieren Sie sie 100 μm über der Injektionsstelle.
  19. Sobald die LED-Kanüle an Ort und Stelle ist, fügen Sie einen Tropfen (100 μL) Gewebekleber am Rand der Kraniotomie hinzu.
  20. Bereiten Sie die Zahnzementmischung (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, um die Faser am Schädel zu befestigen.
    HINWEIS: Verwenden Sie kurz eine gekühlte Porzellanschale, um mehr Arbeitszeit vor dem Zement-Sets zu haben. Fügen Sie 2 Messlöffel Harzklarpulver in die Porzellanschale hinzu, fügen Sie 4 Tropfen schnelle Basis und 1 Tropfen Katalysator hinzu und mischen Sie dann gut. Das Pulver-Flüssigkeits-Verhältnis kann eingestellt werden, wenn eine dünnere oder dickere Viskosität benötigt wird.
  21. Tragen Sie mit einer sterilen Bürste die Zahnzementmischung nach und nach um den Kanülenverbinder auf und bauen Sie Schichten auf, bis der Schädel bedeckt ist und der Verbinder sicher am Schädel befestigt ist, so dass die Stifte völlig frei bleiben. Vermeiden Sie es, Zahnzement auf die Haut der Maus zu bekommen.
  22. Vollständig trocknen lassen.
  23. Schließen Sie die Haut um das Implantat mit Gewebekleber (siehe Materialtabelle).
  24. Legen Sie die Maus in einen Erholungskäfig über einem Heizkissen bei 33 ° C. Überwachen Sie das Vorhandensein eines oder mehrerer der folgenden Anzeichen von Schmerzen / Beschwerden: 1) Bücken, Mangel oder Verringerung der motorischen Aktivität, 2) Versäumnis, sich in einem ungepflegten schmutzigen Mantel zu pflegen, 3) Übermäßiges Lecken oder Kratzen, Rötung in der Inzisionsstelle, 4) aggressives Verhalten, 5) Anorexie oder Dehydrierung und 6) Mangel an Nestbildung.
    HINWEIS: Halten Sie die Maus während aller Eingriffe einzeln eingesperrt, um ein Ablösen des Implantats zu vermeiden. Im Falle einer Ablösung der Kanüle führen Sie Euthanasie durch, indem Sie 150 mg / kg Natriumpentobarbital injizieren, gefolgt von einer Enthauptung nach Erreichen der Tiefenanästhesie.
  25. Injizieren Sie subkutan (SC) Meloxicam 1 mg / kg einmal täglich für drei Tage nach der Operation, um Analgetika zu erhalten.
  26. Warten Sie mindestens 7 Tage auf die vollständige Wiederherstellung und 14 Tage auf den Opsin-Ausdruck, bevor Sie weitere Verfahren durchführen.
    HINWEIS: Führen Sie drei Tage lang alle 12 Stunden eine postoperative Nachsorgeuntersuchung durch und überprüfen Sie dann die Tiere jeden Tag bis zum Tag der Euthanasie am Ende des Experiments.

2. Reach-to-Grasp-Training

  1. Beginnen Sie am Tag 7 nach der Operation mit dem Ernährungsentzugsprotokoll28. Wiegen Sie Mäuse an drei aufeinanderfolgenden Tagen, um ihr durchschnittliches Ad-libitum-Körpergewicht zu bestimmen. Planen Sie dann Futterbeschränkungen so ein, dass die Tiere genügend Nährstoffe erhalten, um etwa 90% und nicht weniger als 85% des Körpergewichts zu halten.
    HINWEIS: Dies wird erreicht, indem täglich 2,5-3 g Nahrung zur Verfügung gestellt werden. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere täglich und bewerten Sie das allgemeine Wohlbefinden, indem Sie das Verhalten und das Aussehen der Tiere beobachten, z. B. Fell und Augen. Verwenden Sie das Body-Condition-Scoring-System aus Referenz29.
  2. Während der Vorschulungs-, Trainings- und Testphasen versorgen Sie jede Maus täglich mit 20 Pellets (20 mg staubfreie Pellets mit Schokoladengeschmack) (siehe Materialtabelle) (gegessen während der Aufgabe oder danach) neben den Standard-Futterpellets.
  3. Streuen Sie drei Tage vor der Gewöhnung 0,4 g / Tier / Tag 20 mg staubfreie Pellets mit Schokoladengeschmack in ihre heimischen Käfige, damit die Mäuse mit den Pellets vertraut gemacht werden, die während der Reach-to-Grasp-Aufgabe als Belohnung dienen.
  4. Gewöhnen Sie die Mäuse daran, indem Sie sie einen Tag vor dem Vortraining mit Pellets, die auf dem Kammerboden verstreut sind, 10 Minuten in die Testkammer legen (Abbildung 1A).
  5. Erlauben Sie Essen täglich nach dem Training und Testen. Halten Sie jeden Tag einen ähnlichen Zeitplan ein.
  6. Legen Sie die Mäuse am ersten Tag des Vortrainings in die Reach-to-Grasp-Kammer und beobachten Sie sie von vorne. Platzieren Sie die Pellets vor der Kammer in der Nähe der Öffnung, so dass sie mit dem Verzehr der Pellets beginnen. In diesem Stadium dürfen Mäuse die Pellets in jeder Form greifen.
  7. Platzieren Sie die Pellets am zweiten Tag des Vortrainings immer weiter von der Öffnung, bis Sie sie zur Vertiefung (1 cm von der Öffnung) bringen, damit die Mäuse ihre Reach-to-Grasp-Bewegung formen können (Abbildung 1C).
  8. Trainieren Sie die Mäuse, um zum hinteren Teil des Käfigs zu rennen und zur Käfigöffnung zurückzukehren, um das nächste Futterpellet als Strategie zur Individualisierung von Versuchen zu erhalten.
    HINWEIS: Dies kann erreicht werden, indem Sie warten, bis sich die Maus im hinteren Teil des Käfigs befindet, bevor Sie für jeden Versuch ein Pellet in die Vertiefung legen.
  9. Legen Sie Pellets, die entweder von ihrer rechten oder linken Pfote gegriffen werden sollen.
    HINWEIS: Mäuse fangen an, vorzugsweise eine Pfote zum Greifen zu verwenden, die an den folgenden Tagen des Trainings und Testens verwendet wird.
  10. Trainieren Sie die Tiere 6 Tage lang in täglichen Sitzungen, die 20 Versuche dauern oder bis maximal 10 Minuten verstreichen. Setzen Sie ab Tag 2 des Trainings den Mock-Empfänger (Abmessungen 12 x 18 x 7 mm, 1 g, siehe Materialtabelle) ein, damit sich die Mäuse während der Ausführung der Aufgabe an das Gewicht gewöhnen (Abbildung 1B). Bewerten Sie jeden Tag die Anzahl der erfolgreichen und verpassten Prüfungen.
  11. Nehmen Sie das Verhalten mit einer normalen Kamera auf und erfassen Sie 30-60 Bilder / s von der Vorderseite der Kammer. Zusätzlich kann man einen Spiegel in einem Winkel von 45° unter der Trainingskammer platzieren, um die Haltung der Tiere zu überwachen (Abbildung 1D,E).
  12. Für die kinematische Post-hoc-Analyse (Abbildung 2) montieren Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera (siehe Materialtabelle) in einem Winkel von 45°, um von der Seite des Käfigs aus aufzunehmen. Wenn eine 3D-Analyse erforderlich ist, platzieren Sie eine zweite Hochgeschwindigkeitskamera, um in einem 35 ° -Winkel von der Vorderseite der Kammer aufzunehmen. Beide Kameras sollten je nach Seitenlage der Tiere auf der rechten oder linken Seite des Käfigs platziert und mit der gleichen Bildrate aufgenommen undmit 7 synchronisiert werden (Abbildung 3D, E).
  13. Stellen Sie die Hochgeschwindigkeitskameras auf 100 Bilder/s mit einer Auflösung von 376 x 252 Pixeln oder mehr ein, wenn möglich. Platzieren Sie weiße Styroporwände hinter den Seiten und der Rückseite der Kammer, um den Hintergrund zu reduzieren und den Kontrast zu erhöhen (Abbildung 1E).
  14. Ersetzen Sie am Testtag die Scheineinheit durch einen Infrarotempfänger zur drahtlosen optogenetischen Stimulation (Abbildung 1B,C).
  15. Wenn Mäuse anfangen zu erreichen, drehen Sie die LED-Kanüle manuell mit der Fernbedienung, um eine kontinuierliche Stimulation für die Zeit des Verhaltens und nicht länger als 2 s zu haben. Die Programmierung eines automatischen Stimulationsparadigmas ist vorzuziehen. Das Stimulationsgerät löst eine LED von 470 nm (blaues Licht) mit einer Intensität an der Spitze von 1,0 mW/mm2 aus.
  16. Sammeln Sie die Videos für weitere Untersuchungen, einschließlich Scoring und kinematischer Analysen.

3. Post-hoc-histologische Bestätigung

  1. Bestätigen Sie nach Abschluss eines Experiments die virale Expression und die Platzierung der LED-Kanüle. Betäuben Sie das Tier mit einem Cocktail aus Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg. Sobald die Maus Anzeichen einer tiefen Anästhesie zeigt (Schritt 1.7), Perfusion mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 4% PFA.
  2. Entfernen Sie die implantierte Kanüle vorsichtig, indem Sie den Stecker mit einer Pinzette fest greifen und vorsichtig hochziehen.
  3. Extrahieren und postfixieren Sie das Gehirn für 24 h in 4% PFA23.
  4. Führen Sie 3-10 min Wäschen mit PBS durch.
  5. Schneiden Sie das Gehirn in 50-μm-Abschnitte mit einem Mikrotom (siehe Materialtabelle).
  6. Montieren Sie die Abschnitte in Dias mit fest eingestellten Montagemedien mit DAPI, um Kerne zu färben und Dias abzudecken.
  7. Beobachten Sie nach dem Trocknen die Abschnitte unter dem konfokalen Mikroskop und überprüfen Sie die implantierte Kanülenposition und die Expression von Ch2R, die mit einem fluoreszierenden Protein verschmolzen sind.

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Representative Results

Die Reach-to-Grasp-Aufgabe ist ein Paradigma, das häufig verwendet wird, um Formgebung, Lernen, Leistung und Kinematik der feinen Skill-Bewegung unter verschiedenen experimentellen Manipulationen zu untersuchen. Mäuse lernen, die Aufgabe in ein paar Tagen auszuführen und erreichen eine Genauigkeit von mehr als 55%, die nach 5 Tagen Training ein Plateau erreicht (Abbildung 2A, B). Ähnlich wie zuvor berichtet, erfüllt ein Prozentsatz der Tiere die Aufgabe nicht angemessen (29,62%), und diese sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossenwerden 30. Dazu gehört eine Untergruppe von nicht lernenden Mäusen (6/54 Mäuse, 11,1%), die von Beginn des Trainings an das Ziel, das zu weit vom Pellet entfernt zielt, verfehlen oder die Greifbewegung ausführen, bevor sie sich in der richtigen Position über dem Pellet befinden. Während der ersten Trainingstage führte eine andere Gruppe die Aufgabe mit hoher Genauigkeit aus, begann aber schlechte Leistungen zu erbringen, indem sie am Tag 3-4 zu weit vom Pellet zielte (10/54 Mäuse, 18,51%). Innerhalb dieser Gruppe beginnen einige Mäuse mit dem Training mit einer bevorzugten Pfote, ändern aber nach ein paar Tagen ihre Präferenz; dies wurde zuvor von Chen et al., 201430, diskutiert.

Die Reach-to-Grasp-Bewegung ist von Versuch zu Versuch und innerhalb von Tieren stark stereotyp (Abbildung 2). Die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Videografie ermöglicht die Verfolgung der Flugbahn von Bewegungen, wodurch es möglich ist, die Kinematik in verschiedenen Phasen des Kontrollzustands und während der optogenetischen Stimulation zu analysieren (Abbildung 1E und Abbildung 2C). Diese Annäherung führt zu einer quantifizierbaren Bewertung von Parametern wie zurückgelegte Strecke, Geschwindigkeit, Beschleunigung, Endpunkt und Trajektorie (Abbildung 2 C-E). Es ist möglich, sowohl Multi-Reach-Versuche zu analysieren, bei denen die Maus mehrmals erreicht, bevor sie das Pellet abruft, als auch Einzelversuchsereignisse, bei denen die Maus das Pellet in einer einzigen Reaching-Bewegung zurückholt. Der Versuch ist beendet, wenn Tiere das Pellet wegschieben oder den Versuch wieder beginnen, indem sie in den hinteren Teil des Käfigs gehen. Ein quantitativer Vergleich der Trajektorien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen wird mit der Hauptkomponentenanalyse (PCA) erreicht, gefolgt von k-Mittelwert-Clustering (Abbildung 3J-K)23,25.

Während der meisten Trainingseinheiten können Mäuse das Pellet manchmal nicht greifen (verpasste Versuche). Einige Manipulationen ändern die Anzahl der verpassten Versuche und damit die Genauigkeit der Aufgabe. Dann ist es wichtig, die Unterschiede zwischen erfolgreichen und verpassten Versuchen zu analysieren. In unseren Händen resultieren verpasste Versuche aus Veränderungen in drei verschiedenen Phasen der Bewegung: (1) Die Pfote ändert ihre Flugbahn, bevor sie die Kammeröffnung überquert (Anfangsfehler), (2) die Pfote ändert ihre Flugbahn, nachdem die Pfote die Öffnung überquert hat (letzter Fehler), und (3) Versäumnis, das Pellet zu sammeln (Greiffehler) (Abbildung 2 I,J)13 . Ein allgemeines Merkmal verpasster Versuche ist, dass Mäuse die Greifbewegung weiter weg vom Pellet (Endpunkt) im Vergleich zu Hit-Versuchen starten (Abbildung 2G). Darüber hinaus werden Fehlschüsse, die mit der Maushaltung verbunden sind, als signifikante Unterschiede im Körperwinkel zwischen Treffer- und verpassten Versuchen gemessen (Abbildung 2H).

Abhängig von der Struktur oder der neuronalen Population, die mit Optogenetik anvisiert wird, kann man differentielle Effekte über das Verhaltenerwarten 7,19,23,31,32,33. Das aktuelle Protokoll beschreibt den Einfluss der Aktivierung von Stachelprojektionsneuronen (SPNs) im Striatum in kontralateralen oder ipsilateralen Hemisphären auf die bevorzugte Pfote, die von der Maus während der Reichweitenbewegung verwendet wird (Abbildung 3). Die kontralaterale Aktivierung von D1-Dopamin-exprimierenden SPNs, die den direkten Weg der Basalganglien hervorbringen, reduzierte den Greiferfolg im Vergleich zu den Kontrollbedingungen auf 64,9±8,8% (Abbildung 3B). Kinematische Analysen zeigen, dass die Pfotentrajektorie während der optogenetischen Stimulation ein oszillatorisches Muster beschrieb, das durch eine Zunahme der zurückgelegten Entfernung auf 218,4±19,2% der Kontrolle gezeigt wurde, was zu der Unfähigkeit führte, das Pellet anzuvisieren, und zu einer Zunahme des anfänglichen Fehlertyps I (Abbildung 3F). Die PCA-Analyse zeigt, dass sich die Trajektorien aller Studien während der kontralateralen D1-SPNs-Aktivierung in einem Cluster mit nahezu keiner Überlappung mit einem Kontrollcluster getrennt haben, was auf eine geringe Ähnlichkeit hinweist (Abbildung 3J-K).

Auf der anderen Seite führte die Aktivierung von dSPNs auf der ipsilateralen Seite zu einer Zunahme der Trajektoriendispersion, die durch die PCA-Analyse gezeigt wurde (Abbildung 3K), ohne den Erfolg zu beeinträchtigen (120,7±23,6%, n = 4), die zurückgelegte Gesamtstrecke (136,3±3,5%) oder die maximale Geschwindigkeit während der Erreichensphase (117,3±10,3%) (Abbildung 3C), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung ipsilateraler D1-SPNs die Zielbahn in gewissem Maße verändert hat, ohne das Verhaltensergebnis zu ändern (Abbildung 3G-I ). Die kinematische Analyse zeigt subtile Veränderungen in der Bewegungssteuerung durch ipsilaterale Manipulation an. Schließlich zeigt die Körperhaltungsanalyse eine Verschiebung des Körperwinkels während der kontralateralen D1SPNs-Aktivierung (Abbildung 3L). Es wird hervorgehoben, dass selbst diese einfache Aufgabe viele Komponenten enthält, die eine ordnungsgemäße Bewegungsausführung ermöglichen, um ein Ziel zu erreichen.

Figure 1
Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Schematische Darstellung der Verhaltenskammer. Eine Kammer aus Acrylplatte mit folgenden Abmessungen in cm: 18,5 (H) x 8,5 (B) x 20 (T) mit einer Frontscheibe 1 (B) x 5 (H) und einem kleinen Regal 8,5 (B) x 4 (T). (B) Foto der LED-Kanüle (links) und des drahtlosen Empfängers (rechts). (C) Seitenansicht einer Maus mit der implantierten LED-Kanüle, die mit dem Empfänger verbunden ist, während sie die Reach-to-Grasp-Aufgabe ausführen (die weiße Pfeilspitze zeigt den Empfänger, das Sternchen zeigt den Zahnzement, der die Kanüle hält, und die leere Pfeilspitze zeigt das Pellet). (D) Skizze des Versuchsaufbaus. Zwei Hochgeschwindigkeitskameras erfassen die Reichweite in zwei Dimensionen, während eine dritte eine Panoramaansicht der Aufgabe aufnahm, einschließlich der Position der Maus vom Spiegel unter der Kammer. Die Tiere konnten ihre bevorzugte Pfote frei wählen, und die Stimulationsseiten beziehen sich immer auf die Seite der bevorzugten Pfote. (E) Die genaue Position der Kameras und das repräsentative Bild jeder Kamera während einer Prüfung. Diese Zahl wurde der Fundstelle23 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Kinematische Analyse des Reichweitenverhaltens. (A) Zeitleiste des Experiments von Tag-0 (d0) bis Tag-25 (d25). (B) Leistung während der Reach-to-Grasp-Aufgabe im Laufe der Zeit, gemessen als Genauigkeit der Pelletentnahme (Gesamtzahl der erfolgreichen Greifer/Gesamtzahl der Versuche x 100). (C) Beispiel für die Verfolgung von Flugbahnen aus einem Hochgeschwindigkeitsvideo. (D) Individuelle Flugbahnen der Pfote während der getroffenen und verpassten Prüfungen. (E) Gesamtstrecke, die die Pfote während der Treffer- und verpassten Prüfungen zurückgelegt hat. (F) Beschleunigung der Pfote durch die Flugbahn in den getroffenen und verpassten Versuchen, dargestellt als Entfernung vs. Geschwindigkeit. (G) Zusammenfassung der Endpunktentfernung in Treffern = 3,16 mm, verfehlt 6,08 mm (Mann-Whitney-Wilcoxon-Testverpasst vs. Treffer U = 4184, p<0,0001, n = 28 Mäuse). (H) Unterschiede im Körperwinkel in den beiden Arten von Versuchen, Fehlschläge = 8,4±5,3°, Treffer 6,7±4° (Mann-Whitney-Wilcoxon-Test U = 6437, P = 0,0243, n = 28 Mäuse). (I) Schematische Darstellung der drei Arten von Fehlern. (J) Anteile der drei Arten von Fehlern, die von den Mäusen unter Kontrollbedingungen gemacht werden. Diese Zahl wurde der Fundstelle23 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Optogenetische Aktivierung von kontralateralen und ipsilateralen D1-SPNs während des Reach-to-Grasp-Verhaltens . (A) Schematische Darstellung des Stimulationsparadigmas. (B) Erfolgsquote im Vergleich zu Nicht-Stimulationsstudien. (C) Änderung der zurückgelegten Strecke im Vergleich zu den Kontrollbedingungen. (D), (G) Zweidimensionale Plots von Wegen, die von der Pfote mit und ohne optogenetische Stimulation gemacht werden. (E) , (H) Gesamtstrecke, die die Pfote während der Reichweitenbewegungen zurückgelegt hat. f) , (I) Zusammenfassung der Verteilungen der verschiedenen Arten von Fehlern. D1 kontralateral: Anfangsfehler oder Typ I (Kontrolle = 18,2±11,6 %, Stimulation = 79,9±8,2 % Fishers exakter Test, S<0,0001). (J) Beispiel für eine PCA-Analyse der Trajektorien unter Kontrollbedingungen im Vergleich zur kontralateralen Aktivierung von D1SPNs. Der schattierte Bereich stellt den Cluster jeder Bedingung dar, und der Stern ist der Cluster-Schwerpunkt. (K) Zusammenfassung der Überschneidung zwischen den Clustern der verschiedenen Versuchsbedingungen. (L) Änderungen des Körperwinkels. Diese Zahl wurde gegenüber Referenz23 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die Verwendung der optogenetischen Manipulation neuronaler Populationen in klar definierten Verhaltensparadigmen erweitert unser Wissen über die Mechanismen, die der motorischen Kontrolle zugrunde liegen 7,23. Drahtlose Methoden eignen sich besonders für Aufgaben, die Tests an mehreren Tieren oder freie Bewegung erfordern34,35. Da jedoch Techniken und Geräte verfeinert werden, sollte es die erste Wahl für jede Verhaltensaufgabe in Kombination mit Optogenetiksein 34,36.

Die aktuelle Methode hat viele Vorteile, da miniaturisierte LEDs eine zuverlässige Lichtquelle mit hoher Intensität bieten und Implantate in Studien verwendet werden können, die eine Stimulation über mehrere Tage erfordern. Dennoch kann das Einsetzen einer optischen Faser zur Opsinstimulation das Hirngewebe mechanisch schädigen, Infektionen und gelegentlich Entzündungen an der Stelle der Kanüleverursachen 37. Es wurde gezeigt, dass eine lang anhaltende hochfrequente optogenetische Stimulation Wärme erzeugt und Phototoxieverursachen könnte 37. Es ist möglich, die Phototoxizität durch die Verwendung von rotverschobenen Effektor-Optinen zu reduzieren, die mit rotem oder sogar nahem Infrarotlicht aktiviert werden, was die Wärmeerzeugungreduziert 38.

Da die Stifte zum Anschließen des Empfängers außerhalb des Schädels verbleiben, können Mäuse manchmal eine Verschiebung oder Ablösung der Kanüle verursachen, wenn Zahnzement nicht richtig aufgetragen wird. Dies führt häufig zu einer Schädigung des Hirngewebes und verringert die Anzahl der Probanden, die für die weitere Analyse berücksichtigt werden müssen. Jüngste Entwicklungen haben die faserlose Optogenetik eingeführt, die Partikel verwendet, die sichtbares Licht durch Up-Conversion-Lumineszenz als Reaktion auf Nahinfrarotlicht emittieren können, das tief in das Hirngewebe eindringt36. Faserlose Geräte bieten die Möglichkeit, optogenetisch über längere Zeiträume bei sich frei verhaltenden Tieren mit unmerklichen Implantatenzu stimulieren 35. Dies ermöglicht eine hemmungslose Bewegung auch in Wasserlabyrinthen, die gemeinsame Unterbringung mehrerer Tiere (um die Auswirkungen sozialer Isolation zu vermeiden) und die Untersuchung von Tieren in naturalistischeren Umgebungen35,36.

Trotz aller Vorteile, die die faserlose Optogenetik bietet, steht sie immer noch vor Herausforderungen der Biokompatibilität und Wärmeerzeugung. Die Effizienz der Photonenumwandlung schränkt sie ebenfalls ein. Schließlich sind weitere Verbesserungen für einen hohen Emissionswirkungsgraderforderlich 34,36.

Die Kombination dieses Paradigmas mit Hochgeschwindigkeits-Videografie ermöglicht eine kinematische Analyse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Dies bietet eine empfindliche Erkennung selbst subtiler Effekte über verschiedene Komponenten des Verhaltens und der motorischen Kontrolle. Da sich immer mehr Analysewerkzeuge entwickeln, ist es möglich, eine kinematische Online-Analyse und eine eingehende Charakterisierung des motorischen Verhaltens in verschiedenen Kontexten durchzuführen. Eine gründliche Quantifizierung der Maus-Erreichen-Bewegungskinematik wurde kürzlich von Becker et al.25 veröffentlicht.

Die Möglichkeit, neuronale Populationen in frei beweglichen Tieren mit minimalinvasiven Techniken selektiv zu manipulieren, ermöglicht es, den Beitrag spezifischer neuronaler Typen zu präzisen Verhaltensaufgaben zu sezieren23. Die Reach-to-Grasp-Aufgabe ist ein übersetzbares Paradigma für das motorische Verhalten13,19. Es ist bekannt, dass konservierte Gehirnstrukturen an den verschiedenen Phasen des Erwerbs, des Lernens und der Ausführung der Aufgabe teilnehmen 7,12,23. Die Aufdeckung der neuronalen Schaltkreise, die diesem Verhalten zugrunde liegen, wird das Verständnis der motorischen Kontrolle verbessern. Mehrere Studien unterstreichen die Bedeutung der bi-hemisphärischen Kontrolle über unimanuelle Aufgaben, insbesondere wenn eine hohe Geschicklichkeit erforderlich ist20,21,22. Die kinematische Analyse in Kombination mit optogenetischen Manipulationen ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen Mechanismen dieses komplexen Verhaltens. Es könnte helfen, den Beitrag von sensorisch-motorischem Feedback unter normalen Bedingungen und Krankheitsmodellen zu analysieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Offenlegungen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das UNAM-PAPIIT-Projekt IA203520 unterstützt. Wir danken der IFC-Tieranlage für ihre Hilfe bei der Wartung von Mauskolonien und der Recheneinheit für die IT-Unterstützung, insbesondere Francisco Perez-Eugenio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

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References

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Neuroscience Ausgabe 177
<em>Im lebenden Organismus</em> Drahtlose optogenetische Steuerung des motorischen Verhaltens
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Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

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